Автор: Кузнецов С.Л. Мушкамбаров Н.Н.
Теги: патология сердечно-сосудистой системы сердечно-сосудистые заболевания внутренние болезни биология молекулярная биология
ISBN: 5-89481-140-6
Год: 2003
Текст
Н.Н. МУШКАМБАРОВ
С.Л. КУЗНЕЦОВ
МОЛЕКУЛЯРНАЯ
БИОЛОГИЯ
МЕДИЦИНСКОЕ
ИНФОРМАЦИОННОЕ
АГЕНТСТВО
УДК 616.12-008.331.1
ББК 54.10
М74
Н.Н. Мушкамбаров, С.Л. Кузнецов
М 74 Молекулярная биология. Учебное пособие для сту-
дентов медицинских вузов. — М.:ООО «Медицинское ин-
формационное агентство», 2003. — 544с.: ил.
ISBN 5-89481-140-6
В книге в максимально доступной форме рассматривается
целый ряд фундаментальных вопросов молекулярной биоло-
гии. При этом в каждой главе сочетается изложение, во пер-
вых, уже устоявшихся фактов, а во-вторых, связанной с ними
новейшей научной проблемы. Таким образом, книга объединя-
ет в себе свойства информативного учебного руководства и ана-
литической научной монографии. Тем самым она дает необхо-
димый базис для последующего изучения патологии.
Книга предназначена для студентов и преподавателей меди
цинскнх и биологических специальностей вузов, научных ра
ботников, а также для врачей, интересующихся излагаемыми
здесь вопросами.
УДК 616.12 008 331.1
ББК 54.10
ISBN 5-89481-140 6
©Н.Н. Мушкамбаров, 2003
© С.Л. Кузнецов, 2003
© ООО «Медицинское информацион-
ное агентство». Оформление. 2003
Все права защищены. Никакая часть
данной книги не может быть воспро
изведена в какой бы то ни было форме
без письменного разрешения владель-
цев авторских прав.
ПРЕДИСЛОВИЕ
Молекулярная биология — крайне современная наука с по-
лувековой историей. Т. е., с одной стороны, она накопила огром-
ный запас уже устоявшихся фактов, — когда-то поражавших
воображение и порой переворачивавших прежние догмы. А с
другой стороны, она продолжает столь же стремительно разви-
ваться, поднимая новые проблемы и рождая новые идеи.
Уследить за этим потоком, не потеряться в нем и понять, в
чем действительно принципиальная новизна, а где — неизбеж-
ный «информационный шум», гиперболы журналистов или
просто рекламная кампания, — все это подчас не под силу (за не-
имением времени) и квалифицированным вузовским преподава-
телям, и тем более студентам-медикам и биологам.
В полной мере эти трудности авторы относят также к себе.
Поэтому, приступая к работе над данной книгой, мы приняли
следующие решения
Во-первых, ограничиться относительно небольшим количе-
ством фундаментальных тем, а следовательно и глав.
Во-вторых, рассматривая каждую тему, в соответствии с
упомянутой двойственностью молекулярной биологии,
- дать изложение достаточно известных и устоявшихся
фактов (т. е. «старых истин»)
— а затем, отталкиваясь от этого, выити на ту или иную
актуальную научную проблему получившую широкий
резонанс в последние годы.
Вместе с тем, все эти вопросы, естественно, должны быть
связаны единой логикой изложения.
Эти задачи и предопределили набор рассматриваемых тем.
Глава 1. Ядро: синтез ДНК и теломераза.
Глава 2. Ядро: экспрессия генов и транскрипционные фак
торы
Глава 3. Цитоплазма: образование белков — трансляция,
фолдииг, модификация.
Глава 4. Биомембраны: структура и участие в межклеточ-
ных взаимодействиях.
Глава 5. Передача внешнего сигнала в клетку и внутрикле-
точные медиаторы
Глава 6. Узел проблем клеточный цикл, апоптоз и онкогенез.
Выделенные в этих названиях слова указывают на ключе-
вую проблему соответствующей главы. Соотношение между
♦непроблемным» и «проблемным» материалом в разных главах,
конечно, не одинаково, но, в среднем, варьирует в районе 1:1.
Это означает, что мы одинаково внимательно подходили и к то-
му, и к другому, не пренебрегая ни бесспорными фактами, ни
новыми идеями вместе с их критическим осмыслением.
Вместе с тем, данная книга — не скрупулезный обзор затро-
нутых тем. Преследуя, в первую очередь, педагогические цели,
мы избрали достаточно простую форму изложения и остана-
вливаемся, в основном, лишь на существе вопросов. Мы не при-
водим в книге практически ни одной химической или матема-
тической формулы и оставляем за скобками тонкий химизм
рассматриваемых процессов, ограничиваясь только самыми
необходимыми схемами.
Главная наша задача — сориентировать читателя в рассма-
триваемых вопросах, в связи с тем большим вниманием, кото-
рое им уделяется в современной науке. Мы будем очень рады,
если нам удалось решить эту задачу.
Списки использованной литературы приводятся в конце
каждой главы. Мы особо хотели бы отметить большую роль, ко
торую сыграли в качестве информационных источников тема-
тические номера журнала «Биохимия».
Книга предназначена для студентов и преподавателей ме-
дицинских и биологических специальностей вузов, научных ра-
ботников, а также для врачей, интересующихся излагаемыми
здесь вопросами.
Авторы, май 2001 года
Глава 1. ЯДРО: СИНТЕЗ ДНК
И ТЕЛОМЕРАЗА
Прежде чем приступить к рассмотрению внутриядерных
процессов, кратко охарактеризуем структуры ядра.
1.1. КОМПОНЕНТЫ ЯДРА
Ядра клеток содержат следующие компоненты:
а) ядерную оболочку,
б) ядерный белковый матрикс,
в) хромосомы,
г) связанные с хромосомами ядрышки,
д) ядерный сок.
1.1.1. Ядерная оболочка и ядерный матрикс
Ядерная оболочка включает две мембраны — внутреннюю
и наружную. Между ними находится перинуклеарное простран-
ство шириной 20-50 нм.
В основе каждой мембраны лежит, как обычно, липидный
бислой. Мембранные же белки могут быть интегральными (про-
низывают липидный бислой насквозь) и периферическими (свя-
заны с какой-нибудь из поверхностей мембраны).
Наружная ядерная мембрана со стороны цитоплазмы не
редко покрыта рибосомами. При этом она может непосредствен-
но переходить в мембраны эндоплазматической сети.
С внутренней поверхностью внутренней мембраны связа-
на тонкая пластинка (ядерная ламина) белковой природы. Эта
пластинка образована т.н. промежуточными филаментами
(с1=10нм) и рассматривается как компонент ядерного ма-
трикса.
Кроме того, матрикс включает внутриядерную фибрилляр-
ную сеть. К ядерной ламине и внутриядерной сети крепятся хро-
мосомы, а также разнообразные белковые комплексы с фермен-
тативной или регуляторной функцией.
Для обеспечения транспорта крупных макромолекул (как
в одну, так и в другую сторону) в ядерной оболочке имеются по-
ры. В области каждой поры внутренняя и наружная оболочки
сливаются, а в отверстие встроен т. н. комплекс поры.
Один из компонентов такого комплекса — тонкая диафраг-
ма, закрывающая отверстие. По периферии поры, с обеих сто-
рон от диафрагмы, расположены белковые гранулы, превосхо-
6
Глава 1
дящие по размеру рибосомы. Еще одна гранула находится в цен-
тре поры и связана фибриллами с периферическими. В итоге
структура напоминает велосипедное колесо.
В самой же дифрагме, закрывающей пору, видимо, могут
образовываться временные цилиндрические каналы, через ко-
торые происходит транспорт веществ.
Количество пор в ядерной оболочке тем больше, чем интен
сивней идут в клетке синтетические процессы.
1 1.2. Хромосомы
В ядре диплоидной клетки человека — 46 хромосом (22 па-
ры аутосом и 2 половые хромосомы).
В пресинтетический (постмитотический) период жизненно-
го цикла делящихся клеток, а также всегда в неделящихся
клетках каждая хромосома содержит лишь одну молекулу ДНК.
Последняя связана с основными (гистоновыми) и кислыми
(негистоновыми) белками. Также в составе хромосом обнаружи-
ваются молекулы РНК, которые либо являются незавершенны
ми продуктами транскрипции, либо выполняют регуляторные,
структурные или иные функции.
1.1.2.1. ДНК хромосом
Общая длина всех 46 молекул ДНК, находящихся в ядре че-
ловеческой клетки, — около 190 см. Эти молекулы существенно
различаются по размеру; средняя же длина одной из них, как
нетрудно найти, — примерно 4 см.
Каждая из этих столь протяженных молекул включает 2
полинуклеотидные цепи, образующие двойную спираль.
В свою очередь, каждая цепь — это линейная последова-
тельность нуклеотидов (точнее, дезоксирибонуклеотидов) четы-
рех видов: дАМФ, дГМФ, дЦТФ и дТМФ.
Любой из названных нуклеотидов имеет 3 компонента
(рис. 1.1):
1>м<; t.1. Комплменты нуклеотид* в*А»«щегов ДНК
ЯДРО синтез ДНК и теломераза
7
а) азотистое основание — пуриновое: аденин (А) или гуанин
(Г), — либо пиримидиновое: цитозин (Ц) или тимин (Т);
б) дезоксирибозу;
в) один фосфатный остаток.
Азотистое основание, связанное с пентозой, называется ну-
клеозидом для ДНК это, соответственно, д-аденозин, д-гуано-
зин, д-цитидин и д-тимидин.
Исходя из этого, и составляются названия нуклеотидов
ДНК:
дАМФ —.дезоксиаденозинмонофосфат,
дГМФ дезоксигуанозинмонофосфат,
дЦМФ дезоксицитидинмонофосфат,
дТМФ — дезокситимидинмонофосфат.
В цепи ДНК нуклеотиды связываются с помощью фосфат-
ных групп (рис. 1.2).
'V. , • •---------
Рис. t.2. Ст; уитупй цнк
Как видно из рис. 1.2, остов цепей образуется чередуюгци
мися остатками пентозы и фосфата. При этом фосфатные остат-
ки расположены между 5‘- и 3 -положениями пентоз соседних
нуклеотидов. (В нумерации атомов углерода пентозы использу-
ются штрихи.)
Азотистые же основания цепей обращены друг к другу, спа-
риваясь по принципу комплементариости: А с Т, а Г с Ц.
Принципиальное значение для протекающих на ДНК про
цессов имеет полярность цепей.
8
Глава 1
На т. и. 5'-конце цепи свободно (не участвует в образовании
межнуклеотиднои связи) 5'-положение концевого нуклеотида.
Соответственно, на З'-конце в образовании межнуклеоти-
дной связи не участвует З’-положение крайнего нуклеотида.
Из представленной схемы также видно, что цепи в молеку-
ле ДНК являются антипараллельными
При «горизонтальном» изображении ДНК принято распо-
лагать ее так, чтобы у верхней цепи слева находился 5'-конец;
например:
(5) —-АТТГАЦАГГЦ--(3 )
(3 ) —ТААЦТГТЦЦГ ---(5 )
В двойной спирали на 1 виток приходится 10 нуклеотидных
пар. Длина витка — 3,4 нм.
1 1 2.2. Гистоны и организация ДНК в хромосомах
Примерно 60-80 % хромосомных белков представлены ги-
стонами. Последние обогащены аминокислотами с основными
(аргинин, лизин) и гидрофобными (валин и т. п.) радикалами.
Благодаря основным радикалам, гистоны взаимодействуют
с ДНК, а благодаря гидрофобным радикалам — друг с другом.
Эти взаимодействия приводят к образованию нуклеосом
Основа нуклеосомы — глобула из 8 белковых молекул (окта-
мер): она включает по 2 молекулы гистонов четырех видов
(Н2А, Н2В, НЗ и Н4). Вокруг одной такой глобулы молекула
ДНК делает примерно 2 оборота, что и образует в итоге нуклео-
сому (рис. 1.3).
Н1 nDNA
HNH
10nm
Рис 1.3. <--*0МЫ
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
9
Участки ДНК, «намотанные» на гистоновые октамеры,
имеют длину в 140 нуклеотидных пар (н. п.) и называются коро-
выми (core-ДНК, или nDNA).
Нуклеосомы расположены на молекуле ДНК не вплотную:
между ними имеются линкерные (соединительные) участки
(1DNA) длиной 60 н. п. С каждым линкерным участком связана
1 молекула еще одного вида гистонов — Н1.
Следовательно, всего в хромосомах встречаются гистоны 5 ви
дов, а период нуклеосомной организации составляет 200 н. п.
Молекула ДНК участвует в образовании очень большого чи
ела нуклеосом (в среднем 600 000). В результате на данном уров-
не организации каждая хромосома (не считая негистоновых бел-
ков) представляет собой длинную нить «бусинок» — нуклеосом
диаметром 10 нм. По сравнению с молекулой ДНК, длина ну-
клеосомной нити примерно в 6,2 раза меньше.
В интерфазном ядре хромосомы не различимы, а восприни-
маются все вместе как хроматин. При этом выделяют гетеро-
и эухроматин.
Гетерохроматин — сильно конденсированные и потому
функционально неактивные участки хромосом. Они имеют вид
плотных глыбок и интенсивно красятся базофильными красите-
лями. Многие глыбки находятся на периферии ядра и прилежат
к ядерной оболочке.
Напротив, эухроматин — функционально активные, прак-
тически деконденсированные и потому светлые участки хромо-
сом, расположенные между глыбками гетерохроматина.
Нуклеосомный уровень организации имеется, видимо,
и в гетеро-, и в эухроматине. Но в тех локусах эухроматина,
на которых в данный момент времени функционируют фермент-
ные комплексы (репликации, репарации или транскрипции),
как полагают, ДНК высвобождается из взаимодействия с гисто-
нами. Т. е. здесь нуклеосомная организация временно исчеза-
ет — с тем, чтобы впоследствии вновь восстановиться.
В отличие от этого, в гетерохроматине к нуклеосомному
уровню добавляются последующие уровни укладки хромосомы.
Считается, что нуклеосомная нить закручивается в спираль ти-
па соленоида, а та, возможно, образует суперспираль. В этих
процессах, видимо, ключевую роль играет гистон Н1 В итоге
формируется хроматиновая нить диаметром 30 нм.
Хроматиновая нить короче нуклеосомной примерно в 18
раз и короче упакованной в ней молекулы ДНК в 6,2 х 18 ~
= 100 раз.
В свою очередь, хроматиновые нити образуют петли, кото-
рые собираются в розетки, где основания петель крепятся к бел-
10 Глава 1
. fhnc. 1.4. Моа*ль сила- <
} дывзни« *рвматииов<й'
[ шпм
кам ядерного матрикса. В гетерохро
матине такие группы петель более или
менее плотно прилежат друг к другу.
Наибольшей компактизации хро-
мосомы достигают в процессе митоза
(на стадии метафазы). Точная укладка
хромосомных нитей при этом неиз-
вестна.
По одной из версий, хроматино-
вая иить многократно складывается
подлине хромосомы (рис. 1.4). Поэто-
му при микроскопии на поперечном
срезе обнаруживается около 100 хро-
матиновых нитей (представляющих
собой сечения одной и той же нити).
Кроме того, петли хроматиновой
нити имеют длину не всей хромосомы,
а лишь отдельных ее сегментов — хро
момеров. Это объясняет возможность
сегментации хромосом при тех или
иных воздействиях.
1 1.2.3 Метафазные хромосомы
Морфологию хромосом обычно характеризуют по их со-
стоянию на стадии метафазы митоза (рис. 1.5).
Общая длина всех 46 метафазных хромосом примерно
в 100 000 раз меньше общей длины (-190 см) содержащихся
Рис. 1.5. Хг>-»мос/»м*л>*|
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза 11
в них молекул ДНК и составляет около 180 мкм.
Это следует и из вышеприведенного описания: как переход
от ДНК к хроматиновой нити, так и сворачивание последней
в метафазную хромосому дает 100-кратное сокращение длины.
Почти у каждой хромосомы обнаруживаются следующие
части:
а) центромера (первичная перетяжка),
б) плечи — части хромосомы по сторонам от центромеры,
в) теломеры - конечные участки плеч.
В области центромеры находится кинетохор — место при-
крепления клеточного веретена.
По положению центромеры хромосомы делятся на 3 вида:
а) метацентрические — с равными плечами,
б) субметацентрические — с плечами неодинаковой длины,
в) акроцентрические — одно плечо практически отсутствует.
В целом же по размеру и форме хромосомы человека по-
дразделяются на 7 групп, показанных на приведенном ри-
сунке.
1. 1.2.4. Негистоновые белки хромосом
Общее массовое содержание кислых (негистоновых) белков
в хромосомах существенно меньше, чем гистонов. Однако эти
белки чрезвычайно разнообразны (включают, по крайней мере,
несколько сотен различных представителей)
Вероятно, некоторые из кислых белков играют структур-
ную роль, участвуя в образовании наднуклеосомных уровней
укладки хромосом.
Другую группу составляют многочисленные ферменты,
обеспечивающие процессы репликации, модификации, репара-
ции и транскрипции.
Наконец, самой разнообразной по составу, видимо, являет
ся группа регуляторных белков. Они контролируют активность
вышеуказанных ферментов, а также доступность тех или иных
участков ДНК для этих ферментов.
С конкретными представителями двух последних групп не-
гистоновых белков хромосом мы неоднократно будем сталки-
ваться в последующем изложении.
1.1.3. Ядрышко
Ядрышко (нуклеола) является самой плотной структурой
ядра и обычно имеет округлую форму. В ядре может содержать-
ся как одно, так и несколько ядрышек.
12
Глава 1
В то же время ядрышко — это не отдельная от хроматина
структура, а его производная. Оно формируется в связи с опре-
деленными участками хромосом — т. н. ядрышковыми органи-
заторами.
Каждый такой организатор содержит несколько десятков
или сотен копий генов рибосомной РНК (рРНК). На этих генах
активно происходит синтез предшественников рРНК.
Последние тут же (в ядре) подвергаются созреванию и, свя-
зываясь с рибосомальными белками, образуют субъединицы ри-
босом.
В соответствии с вышесказанным, при электронной микро-
скопии (рис. 1.6) возле ядрышка выявляется связанный с ним уча-
сток хроматина (Chr). В самом же ядрышке обнаруживаются фи-
бриллярные компоненты (FC) (пре-рРНК, рРНК и их гены на
ДНК), а также гранулярные структуры (G) (субъединицы рибо-
сом).
А при световой микроскопии ядрышки отличаются базофи-
лией (из-за большой концентрации РНК) и положительной
окраской по Браше (на РНК).
От ядрышка субъединицы рибосом перемещаются к порам
ядерной оболочки, через которые проходят в цитоплазму.
Рис 1.6. ЙДрЫШКА! СХ^ма (слегд)м электронная МШЦ »с*»:ТОГрЛ-
*ия (спр ’»а) (ПО Я-V,
_ ----.......................
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
13
1.2. РЕПЛИКАЦИЯ ОСНОВНОЙ ЧАСТИ ДНК
Один из важнейших внутриядерных процессов — реплика-
ция, или удвоение количества, ДНК. Часто этот процесс называ-
ют также репликативным синтезом ДНК (имея в виду, что бы-
вает еще репаративный синтез; см. п. 1.7).
Именно репликация ДНК обеспечивает воспроизведение
наследственной информации при образовании новых клеток.
Примерно в то же время происходит удвоение количества
и хромосомных белков. Следовательно, репликация ДНК — со-
ставная часть более сложного процесса — репликации хромосом.
1.2.1. Место репликации ДНК в клеточном цикле
1.2.1.1. Схемы митоза и мейоза
Итак, репликативный синтез ДНК тесно связан с делением
клетки.
Как известно, клеточные деления бывают двух типов: мей-
оз и митоз. Мейоз используется лишь в одном случае: так прохо-
дит последнее деление предшественников половых клеток.
Остальные деления осуществляются путем митоза; это все пре-
дыдущие деления предшественников половых клеток, а также
все деления соматических клеток.
Если обозначить количество ДНК в одинарном наборе хро-
мосом через п, то его изменение в ходе указанных двух типов де-
ления отразится рис. 1.7.
2п
2п -► 4п
2п
s>*k . 1.7. Сю -мы миг к. и мейоза управа)
В обоих случаях ядро исходной клетки содержит обычный
Двойной набор хромосом и в нем — диплоидное (2п) количество
ДНК; при подготовке к делению это количество путем репликации
возрастает до тетраплоидного (4п), а в ходе последующего деле-
ния распределяется поровну между двумя дочерними клетками.
14
Глава 1
Но при мейозе добавляется еще одно деление, причем без
предшествующей репликации ДНК; так что в итоге образуются
четыре клетки с одинарным, или гаплоидным (п), количеством
ДНК.
Следовательно, среди всех делений эукариотических кле-
ток лишь в одном случае (во втором делении мейоза) не происхо-
дит предшествующего удвоения ДНК.
Отличным является и тот период клеточного цикла, когда
совершается репликация ДНК.
В мейотических клетках (сперматоцитах и ооцитах) синтез
ДНК считают началом профазы первого деления, а именно —
прелептотенной стадией профазы. Затем следует лептотенная
стадия профазы (конденсация хромосом). Причем в целом про-
фаза мейоза (включающая шесть стадий) длится очень долго —
около месяца в сперматоцитах и до нескольких десятилетий
(включая длительный период покоя) в ооцитах.
В митотических же клетках, наоборот, между репликацией
ДНК и началом профазы различают определенный промежуток
времени, а сама профаза проходит достаточно быстро (не более
нескольких часов).
1.2.1.2. Митотический цикл
В итоге жизненный цикл митотически делящейся клетки
(или, проще говоря, митотический цикл) подразделяют следую-
щим образом (рис. 1.8).
Т.5. Схем» миги! иче<жЪ~ ’
гоцикла
S период: тот самый период,
когда в ядре происходит реплика-
ция практически всей ДНК. Не-
реплицированными, по-видимо-
му, остаются лишь центромер-
ные участки ДНК: они удваива-
ются в начале анафазы митоза.
В сперматогониях S-период
продолжается около 15 ч; в дру-
гих клетках он может быть суще-
ственно меньше (8 ч) или больше.
Для сравнения: в мейотических
клетках сперматоцитах —
удвоение ДНК занимает около
100 ч.
На протяжении S-периода
количество ДНК в ядре постепен-
но возрастает от 2п до 4п
ЯДРО' синтез ДНК и теломераза
15
В S-период удваивается также количество хромосомных
белков в ядре, а возле ядра происходит дупликация центриолей.
G2-пер иод — постсинтетнческий, или премитотический.
Обычно он не очень продолжителен и включает синтез ряда дру-
гих веществ, необходимых для прохождения митоза В частно-
сти, в это время активно синтезируется белок микротрубочек
тубулин, используемый для формирования веретена деления.
Содержание ДНК в этот период — 4п.
Затем происходит митотическое деление (на схеме — М),
включающее четыре фазы (профазу, метафазу, анафазу, телофа-
зу) и приводящее к образованию двух диплоидных клеток.
Наконец, G период — постсинтетнческий, или премитоти
ческнй. Это некоторый интервал времени от окончания митоза
до начала синтеза ДНК (и ядерных белков) в дочерней клетке.
В этот период восстанавливается содержание цитоплазматиче
ских белков и, как следствие, происходит рост клетки (до разме-
ра материнской). Содержание ДНК в клетке — 2п.
Стадии Gj, S и G2 вместе составляют интерфазу.
1.2.1.3. Типы клеток по способности к делению
Перечисленные стадии жизненного цикла относятся лишь
к регулярно делящимся клеткам.
Вообще же по способности к делению все клетки взрослого ор-
ганизма (кроме спермато- или ооцитов) подразделяются на 3 типа.
а) Митотические, т. е. постоянно делящиеся клетки:
- многие клетки базального слоя эпителия,
- гемопоэтические клетки начальных стадий созревания,
- сперматогонии и некоторые другие клетки.
б) Условно постмитотические клетки. Это неделящиеся
клетки, сохранившие способность к делению при действии опре-
деленных стимулов. Чаще всего деления возобновляются при
регенерации соответствующего органа или ткани.
Сюда относятся клетки печени, а также стволовые клетки
костных, скелетных мышечных и некоторых других тканей.
в) Постмитотические клетки неделящиеся клетки,
окончательно потерявшие способность делиться.
Примеры — клетки всех слоев эпидермиса кожи, кроме ба
зального; нервные клетки, клетки сердечной мышцы, симпла-
сты (волокна) скелетных мышц.
Некоторые цитологи предпочитают подразделять по спо-
собности к делениям не клетки, а популяции клеток.
В частности, клетки мозга и симпласты (волокна) скелет
ных мышц обозначаются как стационарные популяции.
16
Глава 1
Клетки всех слоев эпидермиса (включая базальный), гемо-
поэтические и т. п. клетки именуются обновляющимися попу-
ляциями.
А клетки железистых органов (например, печени) рассма-
триваются как растущие популяции.
В подобной терминологии есть принципиальный недоста-
ток: она совершенно искажает суть дела.
Например, именно т. н. обновляющиеся популяции нахо-
дятся в стационарном состоянии.
Действительно, стационарным является такое динамиче-
ское состояние, при котором за счет равенства в системе о прито-
ка» и «оттока» содержание каждого компонента остается на по-
стоянном уровне. И популяция гемопоэтических клеток, и по-
пуляция эпидермальных клеток — типичные представители
стационарных систем.
Напротив, те популяции, которые названы стационарны-
ми, как раз нестационарны. Например, в мозге численность
нейронов, хотя и медленно, но монотонно снижается. Так что
скорее подошел бы термин «квазистационарные» или «статиче-
ские» популяции.
Наконец, т. н. растущая популяция клеток печени в обыч-
ных условиях вовсе не растет.
Поэтому мы считаем более предпочтительным подразделе-
ние клеток иа митотические, условно постмитотические и пост-
митотические.
1 2.1 4 Выход клеток из митотического цикла
Про клетки, выходящие из митотического цикла, говорят,
что они вступили в С„-период своего жизненного цикла. Если не
считать «спящих» стволовых клеток, такой выход обычно про-
исходит в результате дифференцировки. Это можно представить
следующими схемами:
М—> G <-> G «—» Go (D ) —> G (D ) —> G(l (D );
М —> G «—» G G (D ) —> G (D2) —> G D ) —> F —> гибель.
Здесь G(I(D,) - различные стадии дифференцировки; при
чем, на всех этих стадиях клетки не делятся (находятся в Go-пе-
риоде). Однако клетки Go и G0(D,) являются условно постмито-
тическими, т. е. способны вернуться в митотический цикл и ре-
плицировать ДНК У клеток же последующих стадий дифферен-
цировки такая способность утрачена.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
17
В первом примере зрелые клетки функционируют в организ-
ме большую часть его жизни (нервные клетки, кардиомиоциты).
Во втором примере имеет место терминальная дифференциров-
ка, заканчивающаяся гибелью клеток и сменой их другими гене-
рациями таких же клеток (кератиноциты, клетки крови).
Из вышеизложенного следует, что репликативный синтез
ДНК происходит в S фазе цикла митотических клеток, а при не-
которых обстоятельствах совершается в условно постмитотиче-
ских клетках. Кроме того, в список синтезирующих ДНК клеток
надо добавить сперматоциты и ооциты на стадии прелептотены.
1.2.2. Общая характеристика репликации ДНК
1 2 2.1 Основные принципы
Репликация ДНК имеет ряд принципиальных особенностей.
а) Во-первых, субстратами, из которых синтезируются но-
вые цепи ДНК, являются дезоксинуклеозидтрифосфаты
(дНТФ), а не дезоксинуклеозидмонофосфаты (дНМФ), входя-
щие в состав ДНК (п. 1.1.2.1).
Поэтому в ходе включения в цепь ДНК от каждого нуклео-
тида отщепляются 2 фосфатных остатка (в виде пирофосфата,
который вскоре гидролизуется до фосфатов):
свободные __ остатки дНМФ пиро-
дНТФ в новых цепях ДНК фосфат
Использование именно дНТФ, а ие дНМФ, объясняется
энергетическими причинами: образование межнуклеотидной
связи требует энергии; источником ее и служит разрыв межфос-
фатной связи.
б) Во-вторых, репликация ДНК — матричный процесс:
каждая синтезируемая (дочерняя) цепь ДНК строится, исполь-
зуя в качестве матрицы одну из цепей исходной (родитель-
ской) ДНК.
Основой при этом является принцип комплементарности:
из четырех возможных нуклеотидов (дАТФ, дГТФ дЦТФ,
дТТФ) в состав растущей цепи включается в данный момент тот,
который комплементарен нуклеотиду в соответствующем поло
жении родительской цепи.
в) В третьих, процесс (в отличие, например, от синтеза
РНК) является симметричным: матрицами служат обе цепи ро-
дительской ДНК (рис. 1.9).
18
Глава 1
Исходная ДНК
3-----------------------5’
I
Дочерние ДНК
5-----------------------3'
3' .....................5'
5....................* 3'
3-----------------------5
5......................* 3'
3--------------------------5
Также его можно наз-
вать полукоисерватнвным:
по завершении процесса ис-
ходные молекулы ДНК ока-
зываются наполовину обно-
вленными. В каждой из до-
черних молекул одна
цепь — родительская (на
рис. 1.9 показана сплошной
линией), а вторая — новос-
интезированная (пунктир-
ная линия).
г) Наконец, очень важ-
ный момент касается напра-
вления роста и полярности
цепей ДНК.
Удлинение цепи ДНК
(или отдельного ее фрагмента) всегда происходит в направлении
от 5'-конца к 3' концу. Это означает, что очередной новый ну-
клеотид присоединяется к 3'-концу растущей цепи.
Кроме того, поскольку в любой молекуле ДНК комплемен-
тарные цепи антипараллельны (п. 1.1.2.1), то и растущая цепь
антипараллельна матричной цепи. Следовательно, последняя
считывается в направлении 3’ —?5'.
1.2.2.2. Особенности механизма
Отметим еще несколько менее принципиальных, но доста-
точно важных особенностей, которые можно отнести к механиз-
му репликации ДНК.
а) Процесс репликации осуществляется сложным фер-
ментным комплексом (насчитывающим до 15-20 различных
белков). Ключевые компоненты этого комплекса мы укажем
позднее. Сейчас же подчеркнем, что при репликации ДНК у эу-
кариот на каждой хромосоме работает не один, а сразу большое
количество таких комплексов
Иными словами, на хромосоме имеется много точек начала
репликации ДНК. И удвоение ДНК совершается не последова-
тельно от одного конца до другого, а одновременно во многих ме-
стах сразу.
Это значительно сокращает продолжительность процесса.
Так, по нашим оценкам, в сперматогониях на одной хромосо-
ме — в среднем около 40 точек начала репликации, и S-фаза со-
ставляет, как уже отмечалось, 15 ч. В отличие от этого, в пре-
ЯДРО синтез ДНК и теломераза
19
лептотенных сперматоцитах хромосомы имеют в среднем всего
по 5-6 таких точек, отчего репликация удлиняется до 100 ч.
б) В каждой указанной точке начинают работать два фер-
ментных комплекса: один перемещается по молекуле ДНК в од-
ну сторону, второй — в противоположную.
При этом каждый комплекс реплицирует не только одну
цепь ДНК, но и другую. Самый сложный вопрос: как при этом
удается для обеих родительских цепей (несмотря на их антипа-
раллельность) соблюдать принцип считывания в направлении
3‘—»5'? Возможные механизмы мы кратко обсудим ниже.
Но каков бы ии был механизм, репликация распространяет-
ся в обе стороны от каждой точки начала репликации (рис. 1.10).
Говорят, что при этом образуются две репликативные вилки, дви-
жущиеся в противоположных направлениях. Между данными
вилками появляется постепенно расширяющееся «вздутие»,
или «глазок»: это уже реплицированные отделы ДНК.
В конечном счете соседние зоны репликации («вздутия»)
сливаются и вся молекула ДНК оказывается удвоенной.
в) Ферментный комплекс функционирует так, что одна из
двух синтезируемых им цепей растет с некоторым опережением
по сравнению с другой цепью. Соответственно, первая цепь на-
зывается лидирующей, а вторая — запаздывающей
Важнейшее обстоятельство состоит в том, что лидирующая
цепь образуется ферментным комплексом в виде непрерывного
очень длинного фрагмента. Его длина (в нуклеотидах), очевид-
но, равна половине расстояния между двумя соседними точками
начала репликации. Для сперматогоний это около 1 600 000 ну-
клеотидов. На рис. 1 10 такие фрагменты показаны длинными
прерывистыми стелками.
20
Глава 1
Запаздывающая же цепь образуется в виде серии относи-
тельно коротких фрагментов — примерно по 1500 нуклеотидов.
Это т. н. фрагменты Оказаки (на рисунке изображены коротки-
ми прерывистыми стрелками).
Из рис. 1.10 нетрудно заключить: в виде фрагментов Оказа-
ки синтезируется ферментным комплексом та цепь, направле-
ние образования которой про ивоположно направлению дви
жения соответствующей репликативной вилки.
Так, крайняя левая на рисунке вилка перемещается тоже
влево. Для верхней из растущих цепей это совпадает с направле-
нием ее роста: 5' —> 3’. Поэтому эта цепь является лидирующей
и растет в виде длинного непрерывного фрагмента.
А для нижней из растущих цепей то же, единственно разре-
шенное, направление роста (5‘ —> 3’) противоположно направле-
нию движению левой вилки. Соответственно, данная цепь —
запаздывающая и формируется в виде коротких фрагментов
Оказаки. Очевидно, таким образом ферментной системе легче
преодолеть затруднения, связанные с несовпадением указанных
направлений.
Заметим, что в случае соседней репликативной вилки поло-
жение лидирующей и запаздывающей цепей обратно предыдуще-
му. Здесь уже нижняя цепь является лидирующей, а верхняя
запаздывающей и представленной фрагментами Оказаки.
г) Наконец, последнее в этой группе обстоятельство.
Образованию каждого фрагмента ДНК (как длинного, так
и любого из фрагментов Оказаки) предшествует синтез короткой
последовательности (из 10 15 нуклеотидов) РНК-затравки
Дело в том, что основной фермент, синтезирующий ДНК
(ДНК-полимераза), не может начинать процесс «с нуля», т. е.
в отсутствие олигонуклеотидной последовательности. В проти-
воположность этому, фермент синтеза РНК (РНК-полимераза)
такой способностью обладает. Потому то данному ферменту
и «приходится» начинать образование каждого нового фрагмен-
та ДНК.
Для синтеза РНК-затравки требуются рибонуклеозидтри
фосфаты (рНТФ), а их включение происходит тоже по принципу
комплементарности соответствующему участку ДНК.
PH К-последовательности отличаются от ДНК-последова-
тельностей лишь двумя обстоятельствами: в нуклеотидах пенто-
за содержит в положении 2' гидроксильную группу, а в четвер
ке азотистых оснований тимин заменен на урацил (лишенный,
по сравнению с тимином, метильной группы).
Но эти два отличия существенно сказываются на способно-
сти образовывать двухцепочечную структуру. Поэтому последо-
ЯДРО' синтез ДНК и теломераза
21
вательности РНК-затравки после завершения синтеза фрагмен-
тов ДНК удаляются. Вместо них происходит достраивание (пу-
тем удлинения предыдущего фрагмента ДНК) образующихся
«брешей».
И, наконец, все многочисленные фрагменты ДНК, об-
разованные на одной родительской цепи, сшиваются в еди-
ные цепи.
1.2.3. Компоненты ферментного комплекса
Как уже отмечалось, в процессе репликации ДНК участву
ет сложный ферментный комплекс, включающий, по некото-
рым оценкам, 15 20 белков.
Но функция и механизм действия пока выявлены не для
всех этих белков, поэтому в нижеследующем описании фигури-
рует «лишь» 12 наименований.
Для удобства изложения разделим перечисляемые белки на
3 группы (рис. 1.11).
1 -------------------------------------------!-—
Рис. 1.11. Компоненты Днк-цнпгицивук щтго комплекс*
-узнающийьбеиок, Г-г»лик*за, И rotutt-i м»; a.’a, S — SSB Зело*
Р прайыаза, 4П аюнве’-орорлймгаы.а,?иЛ-а-,6-и8-ДН1<-по-
пиморазы, р - рсМД -беячк, И -нуклоаза. Л - ДНК лш-аэа
1.2.3.1. Белки, подготавливающие родительскую ДНК
к репликации
а) Точки начала репликации на молекуле ДНК имеют специ-
фическую последовательность оснований, богатую парами А-Т.
Процесс начинается с того, что с каждой такой последова-
тельностью связывается несколько молекул специальных уз-
нающих белков. В случае бактерий такие белки называются
22
Глава 1
DnaA (как первые белки, инициирующие репликацию). Поэто-
му на рис. 1.11 узнающий белок обозначен буквой А
Можно представить различные причины, по которым ста-
новится возможным взаимодействие узнающих белков с точка-
ми начала репликации. Среди этих причин:
— само появление в ядре узнающих белков или их опреде-
ленная модификация;
- освобождение точек начала репликации от неких блоки-
рующих элементов;
— появление в ядре каких-то третьих факторов, необходи-
мых для рассматриваемого взаимодействия; и т. д.
Имеющиеся данные свидетельствуют в пользу первого ва-
рианта (см. п. 6.1.2.4). Но в любом случае ясно, что здесь — од
но из ключевых звеньев, контролирующих начало репликации.
Узнающие белки, обеспечив связывание ДНК-реплицирую-
щего комплекса, видимо, далее не перемещаются вместе с ним
по ДНК.
б) Одним же из «первопроходцев» выступает фермент ге-
ликаза (от helix — спираль; на рис. 1.11 обозначен буквой Г). Он
обеспечивает расплетение в районе репликативной вилки двой-
ной спирали родительской ДНК: последняя разъединяется на
одноцепочечные участки.
На это затрачивается энергия гидролиза АТФ — по 2 моле-
кулы АТФ на разделение 1 пары нуклеотидов.
Видимо, одновременно происходит также вытеснение дан-
ного участка ДНК из связи с гистонами и другими хромосомны-
ми белками.
в) Однако расплетение спирали на некотором участке соз-
дает суперспирализацию перед этим участком.
Дело в том, что каждая молекула ДНК в целом ряде мест за
фиксирована на ядерном матриксе (п. 1.1.1). Поэтому она не мо-
жет свободно вращаться при расплетении какого-то своего
участка. Это и вызывает суперспирализацию, а с ней — образо-
вание структурного напряжения, блокирующего дальнейшее
расплетение двойной спирали.
Проблема решается с помощью ферментов топоизомераз
(И на рис. 1.11). Очевидно, они функционируют на еще нерас-
плетенном участке ДНК, т. е. там, где возникает суперспирали-
зация.
Т. н. топоизомераза I разрывает одну из цепей ДНК, перено-
ся ее проксимальный конец на себя (рис. 1.12). Это позволяет
дистальному участку ДНК (от места расплетения до места раз-
рыва) вращаться вокруг соответствующей связи целой цепи, что
и предупреждает образование супервитков. Впоследствии кон-
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
23
I VC. 1, f2. Дв^стым» топоизомеразы I
цы разорванной цепи вновь замыкаются: один из них перено-
сится с фермента на второй конец. Так что процесс разрыва це-
пи топоизомеразой легко обратим.
Имеется также топоизомераза II (бактериальная топоизо-
мераза II называется гиразой). Этот фермент разрывает сразу
обе цепи ДНК, опять-таки перенося соответствующие концы на
себя. Это еще более эффективно позволяет решать проблему су-
первитков при расплетении ДНК.
г) Итак, «поддерживаемый» топоизомеразами, фермент
геликаза осуществляет локальное расплетение двойной спирали
ДНК на две отдельные нити.
С каждой из этих нитей сразу связываются специальные
SSB-белки (от англ. Single Strand Binding Proteins; S на
рис. 1.11). Последние обладают повышенным сродством к одноце-
почечным участкам ДНК и стабилизируют их в таком состоянии.
Заметим: тем самым данные белки отличаются от гистонов,
которые связываются в первую очередь с двухцепочечными
участками ДНК.
12 3 2. Ферменты полимеризации
а) Специальный белок выполняет функции активатора
праймазы (АП на рис. 1.11). После чего праймаза (П), исполь-
зуя в качестве матрицы соответствующий участок одноцепочеч-
НОИ ДНК, синтезирует короткую РНК-затравку, или праймер.
б) Далее в дело вступают ДНК-полимеразы. У эукариот из-
вестно 5 разных ДНК полимераз. Из них 0 и Е-полимеразы уча
ствуют в репарации ДНК, у-полимераза в репликации мито-
хондриальной ДНК, а а- и S-полимеразы — в репликации ядер-
24
Глава 1
При этом, по некоторым предположениям, а-полимераза
связана и с праймазой, и с 8-полимеразой, а последняя, в свою
очередь, — с белком PCNA (от англ. Proliferating Cell Nuclear
Antigen; P на рис. 1.11).
Данный белок выполняет роль «прищепки», которая кре-
пит комплекс полимераз к реплицируемой цепи ДНК. Считает-
ся, что в «застегнутом» состоянии он, как кольцо, обхватывает
цепь ДНК (рис. 1.13). Тем самым предупреждается преждевре-
менная диссоциация полимераз от данной цепи.
Понятно, что ДНК-полимеразы осуществляют последова-
тельное включение дезоксирибонуклеотидов в строящуюся цепь
ДНК — комплементарно нуклотидам родительской цепи.
PCNA
цепь
дик
Но, кроме того, эти ферменты,
видимо, имеют и ряд других важных
активностей. Правда, для эукарио-
тических ДНК-полимераз распреде-
ление данных активностей еще не
вполне ясно. Поэтому приведем све-
дения относительно аналогичных
бактериальных ферментов.
У бактерий основную «работу»
по репликации ДНК выполняет
Рис, 1Л 3. Взл^мсютно
имения бедка PCNA и ц ли
ДНК
ДНК-полимераза III, имеющая
структуру димера. Именно с ней свя-
зан «зажим» типа белка PCNA.
Так вот, помимо ДНК-полиме-
разной активности, ДНК-полимераза III обладает еще одной —
3 —>5 -экзонуклеазнои. Последняя срабатывает в тех случаях,
когда допущена ошибка и в строящуюся цепь включен «непра
вильный» нуклеотид. Тогда, распознав дефект спаривания осно-
ваний, фермент отщепляет с растущего (3’ ) конца последний
нуклеотид, после чего опять начинает работать как ДНК-поли-
мераза.
Таким образом, происходит постоянный контроль системы
за результатом своей деятельности.
в) Как мы знаем, новые цепи ДНК образуются вначале
в виде фрагментов — относительно коротких (фрагментов Ока-
заки) и весьма длинных. И каждый из них начинается с прай-
мерной РНК.
Когда ферментный комплекс, движущийся по родитель-
ской цепи, доходит до РНК затравки предыдущего фрагмен
та, «зажим», связывающий ДНК-полимеразу III с родитель
ской цепью ДНК, раскрывается, и данный фермент прекраща-
ет работу.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
25
В действие вступает ДНК полимераза I (речь по-прежнему
идет о бактериальных ферментах). Она присоединяется к З'-концу
растущего фрагмента (рис. 1.14). При этом фермент уже не имеет
устойчивой связи с данным фрагментом и с родительской цепью,
но зато обладает даже не двумя, а тремя активностями.
Первая из них — «передняя», или 5 —>3'-экзонуклеазная
активность: последовательное отщепление нуклеотидов с
5’-конца РНК-затравки предшествующего фрагмента.
Растущий ДНК-полимераза
фрагмент ДНК /
Рис. 1.14. «Стыки- межд) смит*виру»мн1«м нт< ми
На освобождающееся место фермент включает дезоксири-
бонуклеотиды, присоединяя их, как обычно, к З’-концу «свое
го» фрагмента (ДНК полимеразная активность).
И, наконец, подобно ДНК-полимеразе III, он «не забывает»
проверять и при необходимости корректировать свою деятель-
ность с помощью «задней», или 3‘—>5'-экзонуклеазной, актив
ности, направленной на удлиняемый фрагмент.
Функция ДНК-полимеразы I исчерпывается, когда расту-
щий фрагмент вплотную доходит до дезоксирибонуклеотидов
предыдущего фрагмента.
Что касается эукариот, то здесь функциональным аналогом
бактериальной ДНК-полимеразы III является, видимо, ком-
плекс а- и 8-ДНК-полимераз; при этом корректирующая 3'->
5 -экзонуклеазная активность присуща 8 ДНК-полимеразе.
Функции ДНК-полимеразы I тоже распределены между
двумя ферментами: 5'—>3'-экзонуклеазная активность (удале-
ние РНК затравки) осуществляется, вероятно, специальной ну
клеазой (Н на рис. 1.11), а ДНК-полимеразная активность (за-
страивание «брешей») — ДНК-полимеразой Р (той, что участву-
ет и в репарации).
26
Глава 1
г) Говоря о ферментах полимеризации, нельзя не сказать
о самой трудной из связанных с ними проблем. Речь идет о син-
тезе запаздывающей цепи ДНК: как мы знаем (п. 1.2.2.2), на-
правление этого синтеза противоположно общему направлению
распространения репликативной вилки.
Имеются, по крайней мере, две гипотезы, объясняющее это
противоречие.
По одной из них (рис. 1.15, А), ферментный комплекс пе-
риодически прекращает образование лидирующей цепи, пере-
ходит на вторую родительскую цепь и синтезирует очередной
фрагмент Оказаки запаздывающей цепи. Затем вновь возвраща-
ется на первую родительскую цепь и продолжает удлинять ли-
дирующую цепь строящейся ДНК.
По другой версии (рис. 1.15, Б), на второй цепи родитель-
ской ДНК (матрице запаздывающей цепи) в процессе реплика-
ции формируется петля. Поэтому направление образования
фрагмента Оказаки на внутреннем участке петли начинает сов-
падать с направлением движения полимеразного комплекса.
Тогда последний может практически одновременно образовы-
вать сразу обе цепи ДНК — и лидирующую, и запаздывающую.
Возможно, с этим связан тот факт, что бактериальная ДНК
полимераза III является димером, а у эукариот а- и 8-ДНК поли
меразы образуют единый комплекс. Но и при таком механизме
запаздывающая цепь, как нетрудно убедиться, не может образо-
вываться непрерывно, а только в виде фрагментов.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза 27
1.2.3.3. Ферменты, завершающие репликацию ДНК
В результате действия всех предыдущих ферментов каждая
новоеинтезированная цепь оказывается состоящей из фрагмен-
тов, вплотную примыкающих друг к другу.
«Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-
лигазой (Л на рис. 1.11). Как и ДНК-полимеразы, этот фермент
образует межнуклеотидную (фосфодиэфирную) связь.
Но если в полимеразной реакции одним из участников яв-
ляется свободный дНТФ (дезоксирибонуклеозидтрифосфат),
то в ДНК лигазной реакции оба участника — концевые дНМФ
(дезоксирибонуклеозидмонофосфаты) в составе «сшиваемых»
фрагментов.
По этой причине энергетика реакции иная, и требуется со-
пряженный гидролиз молекулы АТФ.
Заметим также, что ДНК-лигаза «сшивает» только такие
одноцепочечные фрагменты, которые находятся в составе двух-
цепочечной ДНК.
Но и это еще не все. Молекула ДНК окажется реплициро-
ванной не полностью, если не произойдет специальный процесс
репликации ее концов, или теломерных участков
В этом процессе ключевую роль играет фермент теломера-
за, к которому в последние годы оказалось прикованным внима
ние очень многих исследователей. Поэтому рассмотрим этот
фермент и связанные с ним вопросы более подробно.
1.3. РЕПЛИКАЦИЯ ТЕЛОМЕРНЫХ ОТДЕЛОВ ДНК
1.3.1. Основные представления
1 3 1.1. Суть проблемы концевой недорепликации
Впервые данную проблему сформулировал А. М. Оловников
в 1971 г. Причем проблема относится только к линейным ДНК.
Дело в том, что ДНК полимеразная система, описанная вы-
ше, оставляет недореплицированными 3’-концы материнских
цепей ДНК, т. е. новые цепи оказываются укороченными (при
Действии только данной системы) с 5 -концов
Это показано на рис. 1.16. В каждой новой цепи фрагмент
казаки, находящийся у 5'-конца, как и обычно, начинается
с короткой РНК-затравки, которая (тоже как обычно) затем уда-
ляется специальной нуклеазой.
28
Глава 1
Рис- ! ,1_-, Ук'лр-лчиии» ДНК при уч*стим» репликации телик»
ДНК-п лим»раэ»« А <*.и t«wh
____-____________________________________«->К»__________-____
Но застроиться дезоксинуклеотидами образующаяся
«брешь» не может, поскольку любая из ДНК-полимераз, как
уже отмечалось, не способна действовать «с нуля», а лишь удли-
няет З'-конец уже имеющегося полинуклеотида. Здесь же тако-
го конца просто нет, отчего и получается, что новая цепь должна
быть несколько короче старой.
Подобные концы ДНК (где одна цепь длиннее другой) назы-
ваются острыми, или оверхенгами
Но, в свою очередь, острые концы вряд ли стабильны: они,
видимо, атакуются экзонуклеазами, которые понуклеотидно
«отстригают» выступающие одноцепочечные участки. Концы
ДНК становятся «тупыми». Хотя, по другим данным, у челове-
ка молекулы ДНК сохраняют острые концы.
Как бы то ни было, при отсутствии теломеразы деления
клетки приводят к укорочению хромосом. Из двух дочерних
хромосом одна короче, чем исходная, с одной теломеры, а вто-
рая — с противоположной.
Можно было бы думать, что укорочение молекулы ДНК,
в соответствии с длиной РНК-затравки, составляет 10-15 ну-
клеотидных пар. Однако в реальности оно заметно больше
(около 50—65 н. и.). Вероятно, это связано с пространственны-
ми размерами ДНК полимеразного комплекса: для его эффек-
тивного связывания при синтезе очередного фрагмента Оказа
ки требуется участок родительской цепи в несколько десятков
нуклеотидов.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
29
Среднее количество нуклеотидных пар в одной молекуле
ядерной ДНК у человека — 120 млн. Таким образом, укороче-
ние ДНК при отсутствии теломеразы составляет за одно кле-
точное деление всего около 0,00005 %. Казалось бы, это нич-
тожно мало.
Но если бы в природе совсем отсутствовал механизм восста-
новления длины теломер, то через обозримое количество кле-
точных делений хромосомы вообще бы исчезли!
Таким образом, хотя бы только поэтому проблема концевой
недорепликации хромосом имеет большое биологическое значе-
ние. Но оказывается, что она прямо связана и с такими «вечны-
ми» темами, как старение и канцерогенез (о чем будет сказано
позднее).
1.3.1.2. Буферные теломерные последовательности
Как же решается в клетке проблема концевой недореплика-
ции? — Используются оба возможных способа.
Один состоит в расположении на концах хромосомных ДНК
специальных гексануклеотидных последовательностей, не несу-
щих генетической информации:
(5) ЦТААЦЦ-... ЦТААЦЦ----------ГГТТАГ -...-ГГТТАГ (3 )
(3 ) ГАТТГГ-..- ГАТТГГ---....--ЦЦААТЦ-...-ЦЦААТЦ (5 )
Нетрудно видеть, что данная схема выводится из структу-
ры лишь одного гексануклеотида:
(5 ) ГГТТАГ (3 ).
Его многочисленные повторы располагаются у З'-конца
каждой цепи ДНК.
По составу этих повторов в каждой теломерной области
ДНК различают G- (или Г-) цепь и С (Ц ) цепь. Очевидно, одна
и та же цепь ДНК в одной теломерной области выступает как G-
цепь, а в другой теломерной области как С-цепь.
Всего теломерные отделы ДНК включают тысячи указан-
ных теломерных повторов. Их общая протяженность на одном
конце ДНК составляет в клетках эмбриона человека 10—15 ты-
сяч н. и. Таким образом, на обе теломерные области приходится
около 0,02 % от средней длины молекулы ядерной ДНК челове-
ка (120 млн н. п.). У мышей теломерные последовательности го-
раздо длиннее — около 100 тысяч н. п.
Как уже было сказано, теломерные повторы не несут гене-
тической информации. Поэтому если в отсутствие теломеразы
происходит потеря некоторой части данных повторов, это не
30
Глава 1
отражается на функционировании генома. В этом-то и состоит,
видимо, основная роль теломер: своим существованием они пре-
дохраняют от недорепликации более значимые области ДНК,
т. е. выполняют роль своеобразного буфера.
1.3.1.3. Удлинение теломер с помощью теломеразы
Но совсем обойтись без теломеразы все равно нельзя, по-
скольку в процессе клеточных делений теломерные участки
ДНК рано или поздно могут кончиться. Кроме того, о чем мы
скажем ниже, теломерные участки имеют и ряд специальных
функций, отчего их укорочение допустимо лишь до некоторого
предела.
Поэтому второй очевидный способ решить проблему — во
всех клетках или только в начальных клетках (зародышевых,
стволовых и т. п.) достраивать недореплицированные участки
ДНК. Этим-то и занимается теломераза.
Но принцип ее действия чрезвычайно остроумен (если та-
кой термин применим к биологическому явлению). Теломераза
удлиняет не новую, укороченную, цепь, а старую — более длин-
ную (рис. 1.17)! (Это происходит до того, как экзонуклеазы успе-
вают «подравнять» старую цепь под размер новой.)
~ с—„ F ' ‘ »
•Рис’.. Л Л 7. Удлинение теломерного учэстнгГДНК* учэдздмдо
ЯДРО синтез ДНК и теломераза
31
К З'-концу старой (родительской) цепи теломераза последо-
вательно пристраивает несколько десятков или сотен указанна-
ых выше повторов — ГГТТАГ Можно сказать, теломераза удли-
няет G-цепь той или иной теломеры.
После чего значительно удлиненная старая цепь становится
способной выступать в качестве матричной для образования еще
одного фрагмента Оказаки новой цепи (являющейся, очевидно,
С-цепью). Это происходит практически так же, как описыва
лось в п. 1.2.3.2.
Вначале в районе З'-конца старой цепи праймаза синтези-
рует РНК-затравку, а затем ДНК полимераза (3 последовательно
присоединяет к затравке дезоксинуклеотиды — комплементар-
но теломерным повторам старой цепи.
Рост фрагмента происходит в обычном направлении (5 —>3 )
и прекращается по достижении стыка с прежним 5'-концом но-
вой цепи. «Сшивание» фрагмента с цепью осуществляется (тоже
как обычно) ДНК-лигазой. Наконец, экзонуклеаза удаляет
РНК-затравку на новой цепи.
В итоге конец двухцепочечной ДНК приобретает ту же кон-
фигурацию, что и до действия теломеразы (новая цепь немного
короче старой), но становится длинней на серию теломерных
повторов.
Таков основной способ восстановления длины теломер, об-
наруженный практически у всех исследованных организмов.
1.3.1 4. Механизм ALT
Но иногда могут встречаться и т. н. альтернативные меха
низмы удлинения теломер (ALT — Alternative Lengthening of
Telomeres): они обходятся без теломеразы. Видимо, ALT реали
зуются у дрозофилы, а также в линиях некоторых опухолевых
клеток.
В частности, один из таких механизмов — рекомбинация
между теломерными участками разных хромосом (рис. 1.18).
В этом случае две молекулы ДНК взаимодействуют своими тело-
мерными концами, образуя гибридные теломеры. В последних
цепь от одной ДНК должна быть существенно длиннее, чем цепь
от другой ДНК.
Тогда более длинная цепь служит матрицей, по которой
ДНК полимеразная система достраивает более короткую цепь.
В одной из двух гибридных теломер растущая цепь является ли-
дирующей (растет путем простого удлинения), а во второй тело-
мере — запаздывающей (растет с противоположного конца в ви-
де фрагмента Оказаки).
32
Глава 1
DMi 1 .18, Удлик“ни* Te/kzM [гной ДНК путем рекомбинации
По окончании процесса либо восстанавливается негибридная
структура теломер (как показано на рис. 1.18), либо молекулы
ДНК обмениваются теломерными фрагментами соответствующих
цепей. Таким образом, в немейотической клетке происходят (хотя
и в ограниченной степени) явления, характерные для мейоза.
Однако в целом роль подобных альтернативных механиз-
мов все же невелика.
1.3.2. Теломеры и теломераза
Итак, теломерная ДНК имеет определенный состав, а для
поддержания ее длины, как правило, используется специаль-
ный фермент теломераза.
Рассмотрим ряд важных вопросов, касающихся теломер
и теломеразы.
1.3.2.1. Структура теломер
Нуклеотидная структура теломерных последовательностей
ДНК нам уже известна. Более высокие уровни организации об-
разуются за счет специфических белков.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза 33
Видимо, эти белки, в отличие от обычных гистонов, не обра-
зуют нуклеосомные глобулы. Нуклеосомная структура в доста-
точно коротких теломерах не обнаружена. Хотя длинные тело-
меры мышей имеют нуклеосомную организацию.
Самые известные среди теломерных белков — белок Rapl
(у дрожжей) и его аналог белок TRF1 (у млекопитающих).
Очевидно, благодаря этим белкам, теломеры имеют плот-
ную упаковку, т. е. относятся к фракции гетерохроматина.
В свою очередь, такая структура делает теломеры весьма
стабильными. В частности, теломерные повторы недоступны
для теломеразы на протяжении большей части клеточного ци-
кла. Очевидно, в S-фазе в ответ на некий сигнал белок TRF1 дис-
социирует от теломеры — начинается ее удлинение. Затем же он
вновь связывается и тем самым предупреждает избыточный
рост теломеры.
По той же причине теломерные участки ДНК малодосту-
пны для других ферментов — ДНК-метилаз (п. 1.6) и эндонукле-
аз. В связи с последним обстоятельством, при мейозе в области
теломер очень низка частота двухцепочечных разрывов.
Наконец, с помощью теломерных белков теломеры крепят-
ся к компонентам ядерно го матрикса, в т. ч., возможно, к яд ер-
ной ламине (пластинке, связанной с внутренней ядерной мем-
браной, п. 1.1.1). Действительно ли во всех клетках теломеры
прикреплены к ядерной мембране, пока не вполне ясно. Но,
по крайней мере, на ранних и средних стадиях профазы мейоза
такая связь, бесспорно, существует.
Полагают также, что теломерная ДНК образует несколько
петель (в виде «лепестков ромашки»), фиксированных на ма-
триксе; и по мере укорочения теломер число «лепестков» посте-
пенно уменьшается.
1.3.2.2. Функции теломер
Теперь обсудим известные функции теломер.
1. Некоторые функции можно условно обозначить как ме-
ханические.
а) Так, только что было сказано, что теломеры участвуют
в фиксации хромосом к ядерному матриксу. Это важно для пра-
вильной ориентации хромосом в ядре, и данное обстоятельство
особенно проявляется в мейозе.
На зиготенной стадии профазы мейоза происходят напра
вленные перемещения концов хромосом на поверхности ядер-
нои мембраны — так, что концы гомологичных хромосом смы-
каются и с них начинается спаривание (конъюгация) этих хро-
мосом строго однородными участками.
2-36
34
Глава 1
б) Кроме того, теломеры сцепляют друг с другом концы се-
стринских хроматид (образующихся в хромосоме после S-фазы).
Возможно, это сцепление происходит за счет гибридизации те-
ломер сестринских ДНК — как было показано на рис. 1.18.
В то же время структура теломер такова, что допускает рас-
хождение хроматид в анафазе. Однако возможна мутация (на
уровне гена теломеразной РНК; см ниже), которая меняет ну-
клеотидную последовательность теломер; тогда расхождение
хроматид блокируется.
2. Функции второй группы — стабилизационные.
а) Важнейшая из них нам уже знакома: если в клетке нет
теломеразы (или ALT), то наличие теломер предохраняет от не!
дорепликации генетически значимые отделы ДНК.
б) Если же в клетке есть теломеразная активность, то по-
является еще одна возможность — стабилизация концов разор-
ванных хромосом.
Так, при случайном разрыве хромосомы образуются фраг-
менты, на одном или на обоих концах которых нет теломерных
повторов. В отсутствие теломеразы эти фрагменты претерпева-
ют слияния и деградацию, что блокирует клеточный цикл и ве-
дет клетку к гибели.
В присутствии же теломеразы к местам разрыва присоеди-
няется теломерная ДНК. Это стабилизирует хромосомные фраг-
менты и позволяет им функционировать.
В частности, данный феномен обнаружен у больных а-та-
лассемией: в генах а-глобина происходят разрывы хромосо-
мы 16q, и к поврежденному концу добавляются теломерные
повторы.
3. Влияние на экспрессию генов.
Еще одно интереснейшее свойство теломер обозначается как
эффект положения: активность генов, расположенных рядом
с теломерами, снижена (репрессирована). Такой эффект часто
обозначается как транскрипционное молчание, или сайленсинг.
При значительном же укорочении теломер эффект положе-
ния пропадает и прителомерные гены активируются.
а) Сайленсинг может быть результатом действия белков
(таких, как Rapl или TFR1), взаимодействующих с теломера-
ми. Тем более, как уже отмечалось, эти белки снижают доступ-
ность теломерной ДНК для целого ряда ферментов.
б) С другой стороны, эффект положения может быть обу-
словлен близостью к ядерной оболочке. Так, по гипотезе
А. М. Оловникова, в этой оболочке могут располагаться Са2’-ка-
налы, и поток ионов Са2' влияет на взаимодействие белков
с близлежащими генами.
НПРО: синтез ДНК и теломераза 35
Эффект положения может коснуться и внутренних генов,
если какой-нибудь из таких генов становится транспозоном (ге-
ном, способным к перемещению в другой участок ДНК)
и встраивается в теломерную область. Или если происходит раз-
рыв хромосомы и образование на концах разрыва теломерных
повторов: с помощью последних становится возможно связыва-
ние теломерных белков и прикрепление к ядерной мембране.
4. «Счетная» функция.
Наконец, теломерные отделы ДНК выступают в качестве
часового устройства (т. н. репликометра) которое отсчитывает
количество делений клетки после исчезновения теломеразной
активности. Действительно, как уже отмечалось, каждое деле-
ние приводит к укорочению теломеры на 50 -65 н. п.
Причем гораздо важней для клетки не то, сколько делений
уже прошло, а сколько еще осталось до критического укороче-
ния теломеры. Поэтому можно сказать и так, что теломеры
устройство, определяющее количество делений, которые спо-
собна совершить нормальная клетка в отсутствие теломеразы.
Достигая же критически короткой длины, теломеры теря-
ют возможность выполнять все или многие из вышеперечислен-
ных функций. Нарушается клеточный цикл, и в конечном счете
клетка погибает.
1.3.2.3. Механизм действия теломеразы-
Из сказанного вытекает очень важная биологическая роль
теломеразы. Но как функционирует этот фермент?
Мы уже знаем, что теломераза удлиняет G-цепь каждой те-
ломеры. Разберемся в механизме этого процесса.
Ключевую роль играет тот факт, что с теломеразой связана
т. н. теломеразная РНК длиной около 450 нуклеотидов. Ее сред-
ний короткий участок комплементарен полутора теломерным
повторам:
(3 )...-......АУЦ ЦЦА АУЦ..............- (5 ).
Левый триплет этой РНК (АУЦ) используется для связыва-
ния (путем гибридизации) с крайним теломерным полуповто
Ром G-цепи ДНК (рис. 1.19).
Остальной же гексануклеотид (ЦЦААУЦ) служит в каче-
стве матрицы для удлинения З'-конца G-цепи на один теломер-
ный повтор. А само последовательное включение нуклеотидов
(в соответствии со структурой матрицы) катализируется белко-
выми субъединицами теломеразы.
36
I лава 1
Следовательно, теломераза выступает как обратная тран-
скриптаза фермент, осуществляющий синтез ДНК на РНК-
матрице. В то же время направление удлинения цепи ДНК оста
ется обычным: 5' —> 3'.
Процесс образования нового теломерного повтора обознача-
ют как элонгацию
Затем происходит транслокация перемещение фермента
вместе со своей РНК по удлиняемой цепи ДНК на один повтор «ле-
вее» , т. е. к З'-концу. Очевидно, в процессе транслокации РНК те-
ряет связь с ДНК, а затем ее устанавливает, взаимодействуя
с крайней «половинкой» только что синтезированного повтора.
Потом цепь ДНК удлиняется еще на один повтор. И так далее.
Таким образом, цикл работы теломеразы включает две ста-
дии — элонгацию и транслокацию. Чередуя их, фермент при-
страивает к старой цепи несколько десятков или сотен теломер
ных повторов
При этом оказывается, что теломерная РНК не только
матрица, но и важная часть каталитической машины: при заме-
не в ней нескольких нуклеотидов происходит не синтез «непра-
вильных» повторов, а потеря теломеразой своей активности.
1.3.2.4. О методах определения активности
теломеразы
Как же определяют наличие теломеразы в том или ином
биологическом объекте? Имеются два основных метода.
дЛРО: синтез ДНК и теломераза
37
В т. н. прямом методе в инкубационную смесь, кроме иссле-
дуемого образца, вносят праймер G цепи (олигонуклеотид, со-
держащий несколько теломерных повторов) и меченые дНТФ.
Праймер выступает в роли G-цепи, с которой связывается и ко-
торую затем удлиняет теломераза. О наличии активности судят
по включению радиоактивности в состав олигонуклеотида.
Второй, непрямой, метод — т. н. TRAP анализ (Telomer Re-
peat Amplification Protocol); он использует ПЦР — полимераз-
ную цепную реакцию. Здесь в смесь, помимо образца, тоже до-
бавляют G-праймер и меченые нуклеотиды. Но, кроме того,
в смесь вносят С праймер и термостойкую бактериальную ДНК
полимеразу. Благодаря этому, в ходе ПЦР происходит много-
кратное «клонирование» (или амплификация) удлиненного те-
ломеразой олигонуклеотида.
Удлинённая О-цспь
5' --------------------------3*
Взаимодействие с прайме-
ром С-цспн
— S
I ДНК-полимераза
i Разделение цепей путем
назревания
3'----------------------- 5'
(показана лишь одна С-цепь)
Взаимодействие с прай-
мером G-цепн
ДНК-полимераза
5----.-_____________^.У
У----------------- - 5'
Разделение цепей
(и так далее — очень много раз)
Принцип ПЦР показан
на рис. 1.20.
С удлиненной G-цепью
взаимодействует С-праймер,
после чего он наращивается
ДНК-полимеразой (исполь-
зующей G-цепь в качестве ма-
трицы). Образуется двухце-
почечная ДНК. Ее цепи раз-
деляют нагреванием.
С удлиненной С-цепью
взаимодействует G-праймер,
который затем наращивается
ДНК-полимеразой. Образую-
щуюся двухцепочечную цепь
вновь разделяют нагревани-
ем — в среде появляется до-
полнительная удлиненная G-
цепь. Но теперь она синтези-
рована уже не теломеразой,
а ДНК-полимеразой — путем
двустадииного копирования
первой G-цепи.
И так далее. Многократ-
Рис. •*. .20. 6ж-мя ЛЦЯНсодъ'м*-
рззной цопнрй реакции)
ДНК-полимеразное копирование
Цепей путем нагревания.
но чередуются циклы, вклю-
чающие взаимодействие С-
или G-праймера с соответ
ствующей одиночной цепью,
этой цепи и разделение двух
38
Глава 1
Все это происходит в одной пробирке, поскольку термоста-
бильная ДНК-полимераза выдерживает нагревание в конце
каждого из многочисленных циклов.
В итоге количество G цепей амплифицируется (умножает-
ся) примерно в 10' раз, и, соответственно, во столько же раз по-
вышается чувствительность метода.
Продукты реакции подвергают гель-электрофорезу и полу-
чают спектр радиоактивных полос, соответствующих удлинен-
ным олигонуклеотидам.
С появлением TRAP-анализа резко облегчилось выявление
теломеразы в различных объектах. Однако и до сих пор речь,
в основном, идет лишь о качественном выявлении активности.
Стандартного же способа измерения уровня активности до по-
следнего времени не существовало.
Кроме того, оценивая те или иные результаты, надо иметь
в виду возможность артефактов. Одни обстоятельства методиче-
ского характера могут маскировать теломеразную активность;
другие, напротив, — давать ложноположительные результаты.
1.3.2.5. Распространение теломеразы
Адекватное применение вышеизложенных методов позволя-
ет решить, в каких клетках имеется и функционирует теломера
за, а в каких клетках ее нет. Это, пожалуй, ключевой вопрос всей
«теломеразной биологии». Действительно, именно в нем кроется
связь данной проблемы со старением и канцерогенезом.
По исходным представлениям А. М. Оловникова, у взро-
слого человека теломеразная активность должна быть лишь
в клетках зародышевого пути (в линии половых клеток). Во всех
же соматических клетках она отсутствует и появляется только
в случае их опухолевого перерождения.
Экспериментальные исследования, казалось, полностью
подтвердили эти представления.
Так, впервые теломераза была открыта в 1985 г. у однокле-
точных эукариот. Затем ее обнаружили в опухолевых клетках че-
ловека, а еще позднее — в яичниках. В нормальных соматических
тканях теломеразную активность детектировать не удавалось.
Все это превратило прежние гипотетические взгляды прак-
тически в аксиому; причем многие и до сих пор считают эту ак-
сиому совершенно незыблемой.
Однако на самом деле положение значительно изменилось
после появления высокочувствительного TRAP анализа. С его
помощью теломеразную активность стали обнаруживать в са-
мых разных тканях и органах животных и человека.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
39
При этом в характере распространения теломераазы имеется
вполне определенная закономерность, если учитывеать способ-
ность соответствующих клеток к делению (п. 1.2.1.3)4. Это видно
из табл. 1.1.
Таблица 1.1. Распространение теломеразы в нормалыяных клетках
и тканях организма
Клетки, ткань или орган Вероятьность обна- ружен или теломераз ной актривности, %
Митотичес кие клетки (или ткаии, содержащие такие клетки) а) Лимфоциты (в лимфоузлах, мин- далинах, периферической крови) 1100
б) Эндометрий 60
в) Эпидермис 50 (при 1 инсоляции возрастает)
г) Слизистая оболочка толстой кишки (нижние отделы крипт) 35
д) Яичники (фолликулярные клетки; вклад вносят также мейотические клетки — ооциты) 25
е) Слизистая оболочка желудка 15
ж) Слизистая оболочка мочевого пузыря 5
Условно пост митотические клетки а) Лёгкие (эпителиальный компонент) 16
б) Поджелудочная железа 14
в) Печень 8
г) Щитовидная железа 0
д) Предстательная железа 0 (но В СТВОЛОВЫХ клеткхах есть)
Постмитоти- ческие клетки (ткани) а) Мозг 0
б) Мышечные ткани (по косвенным данным) 0
а) С наибольшим постоянством (среди нормальных сомати-
ческих клеток) теломераза обнаруживается в органа» кроветво-
рения — костном мозгу, лимфоузлах и т. д.
Причем в костном мозгу ее активность практически отсут-
ствует в исходных стволовых клетках (делящихся очень редко),
ио достигает высокого уровня в последующих, коммтитирован-
иых и активно делящихся, клетках, а затем опять исчезает.
В клетках периферической крови (гранулоцита» и лимфо-
цитах) теломераза выявляется вновь. Правда здесь активность
невелика, но она значительно увеличивается (до уровня таковой
40
Глава 1
в опухолях) при стимуляции делений лимфоцитов различными
митогенами.
Несколько реже, но все-таки весьма часто теломеразу нахо-
дят в эпителии кожи и слизистых оболочек самых различных
органов. И здесь, как выяснено, она локализуется в пролифери
рующих клетках.
В частности, в эндометрии пик теломеразной активности
приходится на конец фазы пролиферации (проходящей под кон-
тролем эстрогенов), а в последующую фазу секреции активность
быстро падает.
Аналогично обстоит дело в других эпителиальных тканях:
клетки, вступающие в терминальную дифференцировку, актив-
ность теломеразы утрачивают.
б) С существенно меньшей частотой обнаруживают фер-
мент в органах с условно постмитотическими клетками — пече-
ни, поджелудочной железе. Возможно, сюда можно отнести
и респираторные отделы легких, где альвеолоциты II, как счи-
тают, способны к делениям и трансформации в альвеолоциты I
(основные клетки, выстилающие стенки альвеол).
Имеется активность и в стволовых клетках предстательной
железы (хотя в целом ткань железы практически неактивна).
в) И, наконец, в мозгу и в мышечных тканях, где пода-
вляющее большинство составляют постмитотические клетки
или волокна (окончательно утратившие способность делиться),
теломераза стабильно не обнаруживается.
Все это и дает основание говорить о наличии достаточно
простой связи: теломераза имеется во многих из тех соматиче-
ских клеток, которые способны к делениям
Такой вывод в корне противоречит ранее сложившейся па-
радигме (постулировавшей, что во всех соматических клетках
взрослого организма теломеразы нет).
Правда, надо отметить, что наличие указанной активности
в делящихся клетках далеко не всегда спасает теломеры от по-
степенного укорочения. Так, отмечено укорочение теломер
и в кроветворных клетках, и в лимфоцитах по мере увеличе-
ния числа делений (в культуре) или календарного возраста жи-
вотного (in vivo).
Очевидно, дело объясняется низкой активностью теломера-
зы либо ее торможением какими либо ингибиторами (вроде бел-
ка TRF1, блокирующего теломеры; п. 1.3.2.1).
Но как бы то ни было, в принципиальном вопросе о распро-
странении теломеразы все далеко не так однозначно, как это
представлялось вначале.
ддрО; синтез ДНК и теломераза 4?
1 4 ТЕЛОМЕРАЗА И СТАРЕНИЕ
Теломерная теория старения была сформулирована
А. М. Оловниковым, исходя из двух обстоятельств — проблемы
концевой недорепликации ДНК (п. 1.3.1.1) и т. н. эффекта Хей-
флика, обнаруженного для клеточных (или тканевых) культур.
Открытие данного эффекта в 1961 г. принципиально изме-
нило общие представления о природе старения. Еще через 10
лет, как уже сказано, эффект послужил основой для формули-
ровки теломерной теории старения. И, наконец, сам метод изу-
чения клеток в культуре до сих пор активно используется в са-
мых разных исследованиях — в т. ч. по теломеразной пробле-
матике
Поэтому остановимся кратко на сути работ Хейфлика и его
не менее знаменитого предшественника — Алексиса Карреля.
1.4.1. Эксперименты Карреля и Хейфлика
1411. Исходные идеи Вейсмана
История описываемых ниже работ разворачивалась по
принципу «отрицание отрицания».
Вначале — еще в 1881 г. — классик цитологии Август Вейс-
ман постулировал: старение организма происходит потому, что
у соматических клеток «способность к росту путем деления не
вечна, а ограничена». Иными словами, в конце концов клетки
изнашиваются и более «не могут самообновляться» путем деле-
ния, что и приводит к смерти.
Исключение Вейсман делал для половых клеток, или т. н.
зародышевой плазмы: последняя по его представлениям, не ста-
реет В современных терминах это интерпретируют так, что в ли-
нии половых клеток (начиная от гоноцитов зародыша и кончая
зрелыми половыми клетками) какие либо возрастные измене-
ния отсутствуют. Если таковые все-таки случаются, то это явля-
йся исключительно аномалией, чему соответствуют аномалии
Развития (более частые у детей от пожилых родителей).
Эти утверждения не основывались на каких-либо экспери-
ментах (вряд ли возможных в то время), а представляли собой
лишь догадки выдающегося ученого.
Парадокс последующих событий состоял в том, что пер-
вая догма Вейсмана (относительно соматических клеток) на
протяжении многих десятилетий тщательнейшим образом
Проверялась и перепроверялась множеством исследователей;
42
Глава 1
вторая же догма (относительно половых клеток) всегда при-
нималась совершенно бездоказательно как само собой разу-
меющееся.
Получалось, как с законом сохранения энергии: теорети-
ки долго думали, что это экспериментальный факт, а экспе-
риментаторы, — что это математическая теорема.
Как бы то ни было, два постулата Вейсмана дали мощный
импульс многим последующим работам.
1 4.1.2. Опровержение первого постулата Вейсмана
Каррелем
В начале XX века появилась новая эффективная методи-
ка — выращивание кусочков ткани в культуре.
Эксперименты А. Карреля (удостоенного за них Нобелев-
ской премии) состояли в следующем.
Он брал небольшой (около 1,5 мм) кусочек ткани куриного
сердца, помещал его на стеклянной чашке в клейкообразную
питательную смесь из эмбрионального экстракта и плазмы и ин-
кубировал в термостате.
На периферии тканевого кусочка клетки (фибробласты)
делились, так что через несколько дней кусочек расширял-
ся с каждой стороны примерно на 0,3 мм, увеличиваясь по
площади в 2 раза. Его разрезали пополам, и один из фраг-
ментов помещали в очередную стеклянную чашку в тех же
условиях.
По данным Карреля, оказалось, что такие пересевы можно
производить сколько угодно раз — и фибробласты не потеряют
способность к делениям через много лет после того, как истечет
срок жизни целостного организма.
В частности, эти эксперименты продолжались 34 года
(с 1912 по 1946 г.) и были прекращены ввиду очевидности ре
зультата коллегами Карреля (к тому времени скончавшегося).
Иначе говоря, вопреки первому постулату Вейсмана, сами
по себе соматические клетки не стареют: в подходящих усло-
виях могут жить и делиться бесконечно долго. Старение же есть
свойство только сложного организма; как говорили, это «плата
за многоклеточность».
Данные представления вскоре получили самое широкое
распространение и на протяжении нескольких десятков лет счи-
тались окончательно установленной истиной.
Если в других лабораториях пересеваемые клетки рано или
поздно погибали, это объясняли недостаточно хорошими усло-
виями культивирования.
ЯДРО синтез ДНК и теломераза
43
Поэтому все это время причины старения искали не в клет-
ках, а только вне их. Например, советский ученый Безредка по-
лагал, что ведущим нарушением является старение межклеточ-
ного вещества соединительной ткани, и предлагал замедлять
этот процесс с помощью специальной сыворотки. И так далее —
подобных идей было достаточно много.
1.4 1.3. Опровержение Карреля Хейфликом
Ткань
Обработка трипсином
Суспензия клеток
Культивирование в
стеклянном «матраце»
V
Вдвое разросшийся минислой
Обработка трипсином
V
Суспензия клеток
Подразделение на 2 рае
ные части и культивиро-
вание одной из них
И
Вдвое разросшийся монослой
(и так далее много раз)
р“'- 1.21. Схема кульуманииваилг.
клеток по Х*>чфлиху
В 1961 г. Леонард Хей-
флик вместе с П. Мурхедом
работал с культурами фи-
бробластов из человеческих
эмбрионов. К этому времени
техника подобных экспери-
ментов заметно изменилась
(рис. 1.21).
Теперь исходный кусо-
чек ткани стали предвари
тельно обрабатывать три-
псином для диссоциации
ткани на отдельные клетки.
И именно такие клетки по-
мещали в плоский стеклян
ный сосуд («матрац»).
Второе и, как оказа-
лось, ключевое обстоятель-
ство состояло в ином составе
питательной среды. Послед-
няя уже не содержала эк-
стракт из эмбриона и плаз
му, а представляла собой
смесь низкомолекулярных питательных веществ (аминокислот,
солей и т. д.) и бычьей сыворотки.
Нормальные соматические клетки, внесенные в такую сре-
ДУ и инкубируемые в термостате, через несколько часов прикре-
пляются ко дну сосуда, образуя монослой, а через день начина
Ют делиться
Деления прекращаются, когда на дне сосуда исчерпывается
свободное пространство и клетки начинают контактировать
дРУг с другом. Контактное торможение важнейшее свойство
неопухолевых клеток.
ств О6Ь1чно очеРедной пересев производят тогда, когда количе-
клеток в культуре увеличивается примерно вдвое.
44
Глава 1
Для этого монослой вновь обрабатывают трипсином — для
отделения клеток друг от друга и от поверхности сосуда. Из об-
разующейся клеточной суспензии забирают половину и вносят
в очередной «матрац» с питательной средой.
В этих экспериментах совершенно неожиданно обнаружи-
лось: нормальные фибробласты, взятые от человеческого эм-
бриона не могут делиться сколь угодно долго.
Многочисленные проверки показали, что гибель культу-
ры — не случайность, обусловленная неблагоприятными усло-
виями роста, а всегда повторяющаяся закономерность: деле-
ния прекращаются примерно после 50 пересевов (клеточных
удвоений).
В итоге жизненный цикл клеточной популяции разбивался
на 3 фазы. Из них последняя (фаза III) знаменовалась тем, что
у клеток замедлялась скорость деления, и они в конце концов
погибали.
Отсюда следовал вывод, совершенно противоположный
утверждению Карреля, но полностью созвучный с первым по-
стулатом Вейсмана. Линия делящихся соматических клеток
вовсе не бессмертна; старение — это свойство самих клеток (его
проявлением служит фаза III), причем оно даже запрограмми-
ровано в геноме клеток, поскольку наступает после определен-
ного числа делений.
Это критическое число делений получило название лимита
Хейфлика.
Данные результаты завоевали признание не сразу: было со-
вершенно непонятно, как объяснить в таком случае классиче-
ские эксперименты Карреля.
Хейфлик полагает, что, если исключить намеренную фаль
сификацию со стороны Карреля или его сотрудников, речь мо-
жет идти о методической погрешности.
Дело в том, что в опытах Карреля культуру ежедневно
«подкармливали» экстрактом из куриного эмбриона. И хотя
этот экстракт предварительно центрифугировали для отделения
клеток, единичные клетки могли оставаться и попадать в куль-
туру. Т. е. последняя, видимо, регулярно пополнялась свежими
клетками, деления которых и создавали иллюзию вечности
культуры.
Эта история очень поучительна, по крайней мере, в двух от-
ношениях.
Во-первых, для самих исследователей: каждая используе-
мая методика требует тщательнейшего анализа на предмет воз-
можных «подводных камней». Тем более нельзя оказываться
в плену у собственной идеи и собственного результата, какими
ЯДРО синтез ДНК и теломераза
45
бы блестящими и красивыми они ни казались и какой бы обще-
ственный резонанс они уже ни получили.
Во-вторых, урок для научного мира. Здоровый скепсис в от-
ношении всего нового у ученых есть. Но какие-либо сомнения
в старых истинах, привитых с молодости, часто отсутствуют.
Так вот, оказывается, что и старые — очевидные и общеприня-
тые — истины тоже бывают неверными.
Между прочим, с этих позиций можно подойти и к феноме-
ну Хейфлика.
В его экспериментах клетки отделяли друг от друга с помо-
щью трипсина, а потом инкубировали в присутствии сыворотки.
Но оба эти агента не так уж безобидны. По крайней мере, в случае
сперматогенных клеток трипсин и сывороточные белки суще-
ственно влияют на стабильность плазмолеммы и ядерной оболоч-
ки (наблюдения Н Н Мушкамбарова). По другим данным, влия-
ет трипсин и на фибробласты: вызывает деградацию мембранных
белков, полисом (в цитоплазме) и негистоновых белков (в ядре).
Можно представить, что не внутренние часы, а именно
50-кратная обработка клеток трипсином приводит культуру
к гибели.
Есть также иные основания усомниться в том, что и in vivo
соматическим клеткам человека отпущен лимит в 50 делений.
(О них мы скажем в п. 1 4.3.2.)
Тем не менее, Хейфлик получил немало доказательств
в пользу своих представлений, и эти доказательства достаточно
убедительны. О том же свидетельствуют опыт работы с клеточ-
ными культурами во множестве лабораторий мира и исследова-
ния по теломеразной проблематике.
I 4 1.4 Дополнительные аргументы Хейфлика
Вот некоторые из дополнительных аргументов Хейфлика.
а) В первоначальных его опытах исходные клетки (фибро-
бласты) получали из человеческого эмбриона — и они делились
около 50 раз.
Но если получать фибробласты от взрослого человека,
то число делений клеток до гибели популяции оказывается ме-
ньше 50. Причем имеется явная зависимость от возраста донора:
Чем старше донор, тем меньше число делений.
Подобная закономерность установлена многими авторами
Для самых разных клеток, в т. ч. эпителиоцитов, гладких мио-
Нитов и лимфоцитов.
„ Следовательно, in vivo в клетках тоже функционирует не-
и счетчик, фиксирующий количество делений. И при перено-
46
Глава 1
се клеток in vitro он продолжает счет, а не начинает его сначала.
Так что дело, похоже, не в повреждающих воздействиях на
клетки при работе с ними.
Выяснена и конкретная количественная связь: с увеличе-
нием возраста человека (донора) на один год количество возмож-
ных делений фибробластов в культуре уменьшается в среднем
на 0,2.
Отсюда следует интереснейший вывод. За 100 лет жизни че-
ловека репликативный потенциал фибробластов снижается все-
го на 20 делений. А весь этот потенциал израсходуется (при сох-
ранении тех же темпов) только за 250 лет.
Это могло бы указывать на максимально возможную про-
должительность человеческой жизни. Но вызывает сомнение,
что за 50-75 лет обычной жизни соответствующие клетки де-
лятся лишь 10-15 раз: это значительно меньше, чем теоретиче-
ски ожидаемое число делений in vivo (п. 1.4.3.2).
б) Как бы то ни было, вышеприведенные факты свидетель-
ствуют, что клетки «запоминают» количество прошедших (или
оставшихся) делений
Оказалось, что «память» об этом сохраняется и в том слу-
чае, если клетки на длительный срок (вплоть до нескольких де-
сятков лет) подвергнуть глубокому замораживанию. Правда,
предварительно, во избежание разрушения, их надо обработать
антифризом.
После размораживания клетки возобновляют деления и де-
лятся именно столько раз, сколько им оставалось делиться до
замораживания.
в) Еще одна показательная корреляция — между видовой
продолжительностью жизни животного и количеством делений
его клеток в культуре.
Таблица 1.2 Лимит Хейфлика для разных животных
Источник клеток Максимальная продолжительность жизни животного Количество делений клеток в культуре
Новорождённые мыши 3 года 15-20 раз
Новорождённые цыплята 12 лет 25 раз
Эмбрион человека - 100 лет - 50 раз
Галапагосская черепаха 175 ле ПО раз
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
47
Как видно из табл, 1.2, чем больше живут животные данно-
го вида, тем больше делений совершают выделенные из них
клетки in vitro — до наступления фазы III.
Т. е. 50 делений — это видовая характеристика лимита
Хейфлика только для человека; у других организмов он может
быть и значительно меньше (15 20 у мышей), и значительно
больше (175 у черепахи).
г) Наконец, важным аргументом служит изучение клеток,
вошедших в фазу III.
Еще за несколько делений до остановки размножения рост
популяции плавно замедляется и меняется морфология клеток:
они становятся более крупными (из-за увеличения промежутков
времени между делениями) и распластываются по стеклу (из-за
снижения тургора).
Помимо того, меняются многие биохимические показате-
ли — активность ферментов, интенсивность макромолекуляр-
ных синтезов и т. д. Часто аналогичные изменения обнаружива-
ют и in vivo - при старении целостного организма.
Все это трактуется как свидетельство того, что фаза III —
старение клеток in vitro
Совокупность же всех вышеприведенных фактов позволяет
думать, что делящимся клеткам человека и животных, действи-
тельно, соответствует некий генетически детерминированный
лимит делений, при приближении к которому в клетках насту-
пают глубокие изменения, вызывающие в конечном счете пре-
кращение делений и гибель клеток.
1.4.2 Теломерная теория старения
1 4.2.1. Основные положения теории
Итак, к 1971 году открытие Хеифлика стало общеприня-
тым, и в это же время А. М. Словников обратил внимание на то,
что для репликации теломерных отделов ДНК должен суще
ствовать специальный механизм.
Это и натолкнуло его на т.н. теорию маргинотомии
(которая теперь обычно именуется теломерной теорией ста-
рения).
По ней, во всех соматических клетках организма механизм
репликации теломер отсутствует; поэтому при делениях клеток
теломеры постепенно укорачиваются. При приближении длины
теломер к критическому уровню клетки начинают стареть, а по
Достижении этого уровня погибают.
48
Глава 1
Таким образом, эффект Хейфлика объяснялся укорочени-
ем хромосом; и одновременно допускалось, что к этому эффекту
сводится основная суть старения.
Заметим: примерно в то же время была выдвинута т. н. ги-
потеза «билетиков» для объяснения функционирования моле-
кул мРНК. Последние тоже имеют с одного из концов участок
(полиА-фрагмент), не содержащий генетическую информацию.
И считалось, что при каждом «прочтении» мРНК на рибосоме
полиА-фрагмент укорачивается на 10 15 нуклеотидов (как бы
отрывается один «билетик»). Когда же длина полиА-фрагмента
достигает критически короткой величины (50 нуклеотидов),
мРНК становится доступной для РНКазы и разрушается.
Как видим, теория маргинотомии, призванная объяснить
старение, являлась полным аналогом гипотезы «билетиков»,
только отнесенной не к мРНК, а к ДНК.
Впрочем, в природе часто используются сходные решения,
и не было бы ничего удивительного, если бы реализовались оба
варианта «билетного» механизма.
Итак, теория маргинотомии объясняла феномен Хейфли-
ка — экспериментальное доказательство первого постулата
Вейсмана (о том, что соматические клетки имеют не бесконеч-
ную, а ограниченную способность к делениям; п. 1.4.1.1).
Одновременно теория касалась и второго постулата Вейс-
мана (по которому в линии половых клеток старение отсут-
ствует)
Полностью принимая данный постулат, теория маргиното-
мии предполагала, что во всех клетках половой линии функци-
онирует механизм поддержания длины теломер. И именно это
обеспечивает «вечную молодость» названных клеток.
1 4.2.2 Факты, подтверждающие теорию
Предположение об укорочении теломер в соматических
клетках блестящим образом подтвердилось.
Так, было обнаружено, что при каждом делении нормаль-
ных клеток в культуре длина теломерных последовательностей
сокращается на 50 100 н. п. За все же 50 делений человеческих
фибробластов укорочение составляет 2—3 тысячи н п
Правда, по сравнению с общей длиной теломерной ДНК
10-15 тысяч н. п. (п. 1.3.1.2) это не так уж и много: пример-
но одна пятая часть.
Но, по мнению ряда исследователей, in vivo допустимое число
клеточных делений больше (где-то около 80), что увеличивает теря-
емую часть теломерных повторов. Кроме того, в каких то хромосо-
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
49
мах начальная длина теломер может быть заметно меньше сред-
ней, а потери при делениях — выше средних. Так что здесь длина
теломер, действительно, может становиться критически короткой.
Более сложно объяснить ситуацию у мышей. Их хромосо
мы имеют очень длинные теломеры (по 100 тысяч, н. п.), а клет-
ки в культуре делятся всего 15- 20 раз. Поэтому итоговое укоро-
чение теломер составляет лишь несколько процентов.
Чтобы «подвести» этот факт под концепцию маргинотомии,
полагают, что каждая теломера хромосомы образует несколько
петель (по типу лепестков ромашки), и критическим для жиз-
неспобности клетки является потеря хотя бы одной петли.
До сих пор мы говорили об укорочении теломер в культу-
ральных клетках. Есть данные аналогичного характера и для
клеток in vivo.
Так, в лимфоцитах, несмотря на наличие в них теломераз-
ной активности, по мере увеличения возраста человека теломе-
ры оказываются все короче и короче — в среднем на 40 н. п.
за один год.
У больных же синдромом Дауна, отличающихся прежде-
временным иммунным старением лимфоцитов, соответственно
оказывается выше и скорость укорочения теломер в лимфоци
тах — по 133 н. п. в год.
Имеются и другие сведения подобного рода.
Исследованы также половые клетки. В них теломеры ока-
зались длиннее, чем в соматических клетках того же индивиду-
ума. Причем с возрастом человека теломеры в зрелых половых
клетках, как и ожидалось, остаются стабильными.
Итак, во многих соматических делящихся клетках теломе-
ры укорачиваются. Но действительно ли именно данное обстоя-
тельство в конечном итоге приводит к ограничению делений
и гибели популяции?
Оказалось, да. Это было показано в недавних (1998 г.) экс-
периментах, которые привлекли к себе очень широкое внима-
ние. В этой работе в культивируемые клетки был введен (мето-
дами генной инженерии) ген TERT, кодирующий каталитиче
скую субъединицу теломеразы. После чего в своих делениях
клетки намного (по крайней мере, на 20 делений) превысили ли-
мит Хейфлика. Т. е. поддержание длины теломер предупредило
остановку делений и гибель культуры.
По сути дела, был достигнут такой же результат, как и тот,
о котором сообщал в свое время Каррель. В обоих случаях речь шла
о возможности бесконечной жизни клеток в культуре. И в обоих
случаях была практически одинаковой восторженная реакция пу-
блики: сразу представилось, что открыт путь к бессмертию.
50
Глава 1
1 4.2.3. Дополнительные предположения
Каким же образом укорочение теломер может оказывать
негативное влияние на клетку ?
Обычно рассматривают два взаимно противоположных ва-
рианта:
в одном случае «негатив» состоит в активации «плохих» ге-
нов — т. н. генов AGE, отвечающих за старение;
в других случаях происходит инактивация «хороших»
генов, необходимых для полноценного функционирования
клетки.
а) Первый вариант обычно исходит из эффекта положения
(п. 1.3.2.1), который экспериментально выявлен у некоторых
организмов: достаточно длинные теломеры вызывают сайлен-
синг (репрессию активности) прилежащих генов. При укороче-
нии теломер эти гены активируются.
Предложены и другие модификации данного варианта.
По одной из них, существует некий ген-репрессор, подавляю-
щий в «молодых» клетках гены старения AGE. Если же тело-
мерные последовательности значительно укорочены, остающие-
ся свободными теломерные белки связываются с геном-репрес-
сором и «выключают» его. Происходит активация генов AGE.
Что касается конкретной природы генов AGE, то, по неко-
торым данным, к ним можно отнести ген белка р53. Обнаруже-
но, что при утрате функции этого гена культивируемые фибро-
бласты дополнительно совершают (сверх обычного лимита Хей-
флика) несколько десятков делений.
б) Теперь обратимся ко второму возможному варианту
влияния длины теломер на состояние клетки (предполагающе-
му инактивацию «хороших» генов).
Он возник из исходного представления, что процесс укоро-
чения хромосом при клеточных делениях в конечном счете до-
стигает структурных генов.
Когда выяснилось, что это не так, стали создаваться раз
личные умозрительные конструкции. В частности, в п. 1.3.2.1
мы уже упоминали о новой гипотезе А. М. Оловникова.
Согласно этой гипотезе, в местах прикрепления теломер
к внутренней ядерной мембране имеются Са! каналы, и поток
ионов через них создает своего рода «душ», необходимый для
функционирования генов. При значительном же укорочении те-
ломер теряется связь хромосом с мембраной, отчего гены оказы-
ваются дальше от ионного «душа» — с соответствующими нега-
тивными последствиями.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
51
1 4.2.4 Некоторые итоги
Таким образом, пока можно только строить предположения
о том, как и почему укорочение теломер до некоего критическо-
го размера ухудшает состояние клетки.
Но само наличие такого влияния представляется, в свете
имеющихся данных, практически бесспорным.
В связи с этим хотелось бы еще раз перечислить те чисто
теоретические предсказания А. М. Оловникова, которые нашли
экспериментальное подтверждение.
а) Предсказание о том, что должен существовать специаль-
ный механизм поддержания длины теломер. Подтверждено от-
крытием теломеразы и альтернативного механизма (ALT).
б) Предсказание об укорочении теломер в соматических
клетках. Подтверждено для многих делящихся клеток —
в культуре и in vivo.
в) Предсказание о том, что в зрелых половых клетках дли-
на теломер не должна зависеть от возраста. Подтверждено.
г) Предсказание о том, что именно укорочение теломер
приводит к прекращению делений клеток в культуре. Подтвер-
ждено экспериментом, в котором лимит Хейфлика преодолен
путем введения в клетки гена теломеразы.
д) Сделаны и подтвердились также еще несколько смеж-
ных предсказаний например, о наличии теломеразы в опухо-
левых клетках (чем и объясняется их способность к неограни-
ченным делениям).
Нетрудно видеть, что все эти идеи имеют единый корень —
неожиданно замеченную проблему концевой недорепликации и,
казалось бы, простейшую мысль о «билетиках».
Но, чтобы обнаружить этот плодотворный корень, надо бы
ло сделать то, что в биологии делать не принято, стать теоре-
тиком и всецело посвятить себя размышлениям, т. е скрупулез
ному анализу имеющихся данных.
А. М. Словников один из первых и очень немногих, кто
ступил на этот путь. И та чрезвычайно редкая для ученого уда
ча, которая выпала ему, является вполне справедливой хотя
бы потому, что он шел своим путем.
1.4.3. Критика теломерной теории старения
Но вышесказанное не означает, что теломерная теория на
самом деле полноценно описывает старение Напротив: старе-
ние - неизмеримо более сложный и многогранный процесс, чем
представляется из идеи с «билетиками».
Итак, проанализируем главные положения данной теории.
52
Глава 1
14 3 1 Тезис о том, что лимит Хейфлика обусловлен
укорочением теломер
Это наиболее обоснованное положение. Мы уже приводили
факты, подтверждающие его.
Но имеются факты и противоположного свойства.
а) В большинстве клеток мышей — довольно высокая актив-
ность теломеразы, отчего теломерные последовательности очень
длинные и весьма мало укорачиваются при делениях клеток. Тем
не менее, лимит Хейфлика составляет здесь всего 20 делений.
б) Кроме того, клетки человека, зараженные вирусом
SV40, совершают 20-60 делений сверх лимита Хейфлика
(п. 1.5.1.2). И все это время у них отсутствует теломераза и про-
должается укорочение теломер. Значит, к моменту совершения
определенных лимитом 50 делений теломеры еще не достигли
критически короткой длины, и прекращение делений вызвано
каким то иным обстоятельством.
в) Наконец, в ряде случаев (кератиноциты, клетки молоч-
ной железы) введение в клетки гена теломеразы (TERT) вызыва
ет удлинение теломер, но не увеличивает лимит Хейфлика.
Тем не менее, если не во всех, то, по крайней мере, в каких-
то клеточных культурах теломеры, видимо, все же выполняют
роль счетчиков (репликометров), «отсчитывающих» количе-
ство прошедших и количество еще возможных делений
(п. 1.3 2.2).
1 4 3.2. Тезис о том, что старение in vivo обусловлено
эффектом Хейфлика
Данный тезис принять уже гораздо трудней. Действитель-
но, фундаментальное значение феномена Хейфлика, как мы от-
мечали, состоит в том, что из него следует: способность к деле-
ниям нормальных соматических клеток даже в оптимальных
условиях не бесконечна, а ограничена некоторым пределом.
Но можно ли утверждать, что старение и смерть целостного
организма определяются именно этим обстоятельством? На этот
счет имеются большие сомнения.
а) Во-первых, в организме, кроме делящихся, имеется не-
мало неделящихся клеток. Причем последние тоже стареют и,
по многим данным, не медленней, а даже быстрей делящихся
клеток.
Клетки мозга, печени, мышечные волокна и т. д.: с одной
стороны, они существуют, не делясь, десятки лет — и эффектив-
но функционируют; с другой стороны, во всех них обнаружены
и описаны те или иные возрастные изменения.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
53
Очевидно, в этом случае нельзя сказать: старение и гибель
обусловлены тем, что достигнут лимит делений.
б) Во-вторых, возьмем обновляющиеся ткани — например,
эпидермис.
В культуре эффект Хейфлика проявляется как бы скачко-
образно: на протяжении нескольких десятков делений нет ника-
ких изменений, и лишь в самом конце состояние клеток резко
ухудшается.
In vivo старение эпидермиса (и подлежащей дермы) проис-
ходит совершенно иначе — не скачкообразно, а постепенно.
Не случайно по состоянию кожи можно достаточно определенно
судить о возрасте человека.
Значит, и здесь старение обусловлено вовсе не приближени-
ем к критическому пределу, а иными постоянно действующи-
ми — причинами.
в) О том же свидетельствуют экспериментальные данные,
согласно которым даже у пожилых людей репликативный по-
тенциал делящихся клеток далеко не исчерпан (п. 1.4.1.4).
Фибробласты, выделенные у 90-летних доноров, делились
в культуре всего на 20 раз меньше, чем фибробласты плодов че-
ловека. Тогда как лимит, по Хейфлику, равен 50 делениям.
Следовательно, «старыми» делящиеся клетки становятся
у стариков не потому, что слишком много делились.
г) Не все ясно и с самим лимитом Хейфлика.
Положение о том, что m vivo тоже (как и in vitro) деления
соматических клеток ограничены неким пределом, кажется до-
статочно естественным и обоснованным. Но действительно ли
этот предел примерно равен 50?
В только что упоминавшихся экспериментах исследова-
лись фибробласты. Произведем приблизительные расчеты для
клеток эритропоэтического ряда.
Начнем с того, что в организме новорожденного ребенка —
порядка 1012 всевозможных клеток. Из соотношения 2' = 10,z на-
ходим, что для их образования из зиготы должно было произой-
ти около 40 циклов митотических делений.
Но это лишь при условии, что все вновь образующиеся
клетки тоже непременно делятся. На самом деле какие-то
клетки в эмбриогенезе погибают, а еще часть клеток вступа-
ет в дифференцировку и не делится. Так что фактически
в «предыстории» многих клеток новорожденного (в т. ч
эритропоэтических) не 40, а больше делений. Однако прене-
брежем этим.
Теперь обратимся к гемопоэтическим клеткам. Среди них
содержится некое количество стволовых клеток. Всю жизнь че-
54
Глава 1
ловека их популяция должна самоподдерживаться, для чего
необходимы редкие деления по типу:
1 клетка, идентичная исходной + 1 дифференцирующаяся
клетка.
По некоторым данным, можно полагать, что у взрослого че-
ловека:
а) в красном костном мозга — примерно 1013 гемопоэтиче-
ских клеток,
б) доля стволовых клеток среди них близка к 10 3,
в) для обеспечения нормальной скорости эритропоэза в де-
ления вышеуказанного типа ежесуточно должно вступать около
2x10"стволовых клеток.
(Заметим: обычно считается, что при т. н. гомопластиче-
ском эритропоэзе основным источником эритроцитов являются
деления эритробластов. Однако для поддержания системы в ста-
ционарном состоянии необходимо, чтобы пул несамоподдержи-
вающихся эритробластов все время пополнялся со стороны ство-
ловых клеток.)
Из приведенных значений нетрудно найти, что каждая из
стволовых клеток делится в среднем один раз в 50 суток. Это весь-
ма редко и вполне соответствует имеющимся представлениям.
Но это же означает, что, например, за 60 лет жизни челове-
ка стволовые клетки делятся более чем по 7x60 - 400 раз!
Наконец, еще следует добавить примерно 10 делений в ходе
собственно эритропоэза (большая часть этих делений приходит-
ся на эритробласты).
Итого, общая сумма делений, предшествующих образова
нию эритроцитов у 60-летнего человека, составляет примерно:
450, если начинать считать от зиготы, и
400, если считать от рождения.
Разумеется, это весьма приблизительные оценки, но они нам-
ного больше лимита Хейфлика, установленного для эмбриональ-
ных фибробластов человека (при том, что у прочих клеток способ-
ность к размножению in vitro еще меньше, чем у фибробластов).
Обычно в качестве доказательства, что 50 60 делений впол-
не достаточно, приводят простейший расчет типа: 2м - 10'“, ре-
зультат которого на несколько порядков превосходит количе-
ство всех клеток взрослого человека (10").
Но на примере эритропоэза мы видим, что механически во-
зводить 2 в ту или иную степень нельзя: надо еще хотя бы прибли-
женно учитывать реальные особенности целостного организма.
В итоге, остается совершенно неясным, каково же на самом
деле предельно допустимое количество делений in vivo для кле-
ток человека.
ЯДРО синтез ДНК и теломераза
55
Нам кажется, что этот предел (если он, действительно,
существует) для разных клеток может быть совершенно раз-
личным
Действительно, многие делящиеся клетки обладают тело-
меразной активностью (п. 1.3.2.5), и, в зависимости от ее уров-
ня, в одних случаях критическое укорочение теломер наступит
после меньшего, а в других случаях — после гораздо большего
числа делений.
Резюмируя обсуждение второго тезиса теломерной теории
старения, можно сказать:
а) лимит делений in vivo для различных клеток неизве-
стен;
б) старение in vivo, скорее всего, не связано с приближени-
ем делящихся клеток к этому лимиту.
Показательно, что второй из сделанных выводов полностью
поддерживается и самим Хейфликом. Вот его собственные слова:
«...я не верю в то, что старение и смерть людей наступают
вследствие прекращения деления их клеток».
Но в поисках простых решений апологеты и толкователи
эффекта Хейфлика стали придавать ему такое значение, кото-
рое вовсе не имел в виду сам первооткрыватель.
1.4.3.3. Тезис о том, что ведущая причина старения in
vivo — укорочение теломер
Наконец, данный тезис принять уже совершенно нельзя.
Вначале, правда, отметим, что, по мнению А. М. Оловнико-
ва, укорочение теломер может происходить не только в деля-
щихся клетках - из-за концевой недорепликации, — но и в не-
делящихся клетках из-за концевой недорепарации
Имеется в виду деятельность системы репарации ДНК
совокупности ферментов, занимающихся поиском повреждений
в структуре молекул ДНК и их исправлением. Исправление за-
ключается в вырезании участка поврежденной цепи и его пов-
торном синтезе с использованием второй цепи в качестве ма-
тричной (подробней об этом — в разделе 1.7).
И если данный участок находится на 5 конце поврежден-
ной цепи, то возникает та же проблема, что и при репликации
(см. рис. 1.16). Т. е. вновь необходима теломераза.
Надо сказать, что, несмотря на интенсивное исследование
теломер и теломеразы, нам пока неизвестны данные об укороче-
нии с возрастом теломерных повторов в неделящихся клетках.
Но не это главное; в принципе, предположение о концевой недо-
репарации логично и вполне может подтвердиться.
56
Глава 1
Главное, с чем трудно согласиться, — то, что все старение
соматических клеток сводится к выключению в них всего одно-
го гена (гена теломеразы) и, соответственно, отсутствию всего
одного фермента (самой теломеразы).
Простейший контраргумент: регуляция деятельности любо-
го гена пусть крайне редко, но может давать сбой. Если причиной
старения был бы исключительно недостаток теломеразы, то мута-
ция регуляторного отдела ДНК, отвечающего за выключение те-
ломеразы, приводила бы к появлению бессмертных индивидуу-
мов. Чего, к сожалению или к счастью, никогда не случалось.
На самом деле все гораздо сложней. Если говорить о ДНК
и хромосомах, то с возрастом происходит не только укорочение
теломер (что само по себе показано далеко не для всех клеток).
Вот неполный список других изменений:
- увеличение числа разрывов в цепях ДНК, а также нако-
пление прочих дефектов структуры;
— уменьшение содержания 5-метилцитозина (п. 1.6.1)
в ДНК;
- усиление прочности связывания белков с ДНК;
- снижение активности ферментов, функционирующих на
хромосомах (в т. ч. ферментов репарации ДНК).
Трудно представить, что все это является следствием конце-
вой недорепликации или недорепарации. Скорее всего, это неза-
висимые процессы, действующие, однако, в одном направле
нии — ухудшении состояния и функционирования наследствен
ного аппарата.
Причем происходят эти процессы под влиянием сложней-
шей гаммы внешних и внутренних факторов.
Вообще говоря, в XX веке было выдвинуто несколько десят
ков, если не сотен, теорий старения. Несмотря на их многообра-
зие, все они делились на 2 группы.
По одним теориям, старение — это результат изнашивания
или повреждения каких-то структур под влиянием различных
стохастических (случайных) факторов - внешнего облучения,
свободных радикалов, локальных всплесков температуры и т. д.
По другим теориям, старение — запрограммировано: все
дело в некоей генетической программе, определяющей продол-
жительность жизни. Теломерная теория — типичный пример
такого типа: здесь программа состоит в выключени теломеразы
в соматических клетках. Но это, как мы видели, не может
объяснить других возрастных изменений хромосом, не говоря
о бесконечном числе прочих возрастных явлений.
Зато противоречия исчезают, если объединить обе группы
теорий в единую концепцию.
ЯДРО синтез ДНК и теломераза
57
Заметим предварительно: в организме имеется целая сово-
купность различных защитных систем. На внутриклеточном
уровне это:
- система репарации ДНК,
система теломер и теломераза,
антиоксидантная система (обезвреживающая свободные
радикалы),
- система шаперонов (белков теплового шока), восстана-
вливающая третичную структуру белков при ее наруше-
нии вследствие, например, локального всплеска темпера
туры (см. главу 3).
Возможно, в этот список следует включить и систему мети-
лирования ДНК (раздел 1.6).
Так вот, если старение действительно запрограммировано,
то программа, скорее всего, состоит в постепенном ослаблении
деятельности вышеперечисленных защитных систем.
Тогда становится понятно, почему, несмотря на эффектив-
ную систему репарации, в структуре ДНК с возрастом накапли-
ваются разрывы и другие дефекты. Или почему в культуре фи-
бробластов по мере делений белки теплового шока индуцируют-
ся все хуже и хуже. Или почему уменьшается количество 5 ме-
тилцитозина в ДНК. И так далее.
И в этом же ряду — снижение активности теломеразы в де-
лящихся клетках. Т. е. это всего один из элементов единого
и гораздо более сложного процесса.
Практически аналогичной точки зрения придерживается из-
вестный биохимик В. П. Скулачев. А недавно (на 2-м Европей-
ском конгрессе геронтологов) к ней присоединился и А М. Олов
ников, отойдя от своей прежней ортодоксальной позиции.
1 4.3.4. Тезис о том, что в линии половых клеток старе
ние отсутствует
Наконец, обратимся к половым клеткам. Вообще говоря,
приведенный в заголовке тезис —- это постулат Вейсмана
(п. 1.4.1.1). Теломерная же теория его полностью воспроизво-
дит, утверждая, что в линии половых клеток всегда эффективно
Функционирует теломераза и потому теломеры имеют постоян-
ную длину (п. 1.4.2.1).
Чтобы ясно представить, о чем идет речь, уточним, что
собственно, следует понимать под линией половых клеток.
Если это, например, линия мужских половых клеток, то ее
полный жизненный цикл («от зиготы до зиготы») включает
следующие этапы:
58
Глава 1
— первые недели эмбрионального развития, в течение кото-
рых в зародыше обособляются первичные половые клет-
ки (гоноциты);
- половую дифференциацию этих клеток и несколько перио-
дов деления, сменяемых фазами покоя; в итоге образуется
пул изолированных сперматогоний — стволовых клеток;
длительное (в течение нескольких десятилетий) суще-
ствование изолированных сперматогоний в семенных ка-
нальцах яичек; в это время, видимо, регулярно происхо-
дят деления самоподдержания и так же регулярно (после
полового созревания организма) какая-то часть спермато-
гоний вступает в дифференцировку;
- собственно сперматогенез, продолжающийся у человека 75
суток и последовательно включающий митотическое раз-
множение сперматогоний, мейотическое деление спермато-
цитов и преобразование сперматид в сперматозоиды.
Так вот, нам неизвестны работы, в которых бы теломераза
и длина теломер последовательно исследовались хотя бы на не-
которых ключевых стадиях изложенного цикла.
Но, в принципе, даже если все обстоит так, как утверждает
теломерная теория, из этого вовсе не следует справедливость ис-
ходного тезиса Вейсмана. Ведь, как мы говорили, старение или
отсутствие такового не может определяться только по состоя-
нию теломер.
Однако нет и работ, в которых бы вообще тем или иным спо-
собом изучалось отношение линии половых клеток к старению.
Исключение составляют давние (выполненные в 1978
1980 гг.) эксперименты Н. Н. Мушкамбарова и Н П. Волковой.
В них были обнаружены достоверные биохимические различия
между одноименными сперматогенными клетками, получен-
ными из мышей разного возраста. Что в корне противоречит
утверждению Вейсмана.
Поэтому тезис Вейсмана относительно половых клеток до
сих пор остается всего лишь непроверенной, недоказанной и,
с нашей точки зрения, маловероятной гипотезой.
Ей можно противопоставить альтернативную гипотезу
(М.М. Виленчик, 1976, Н. Н. Мушкамбаров, 1980).
Она предполагает, что в линии половых клеток, несмотря
на митотические деления и действие защитных систем, посте-
пенно накапливаются возрастные изменения Особенно важны
изменения структуры хромосом.
Но на одной из стадий цикла происходит «капитальный ре-
монт», или «омоложение», клеток. В первую очередь, «ремонт-
ные работы» должны касаться, разумеется, хромосом.
ЯДРО синтез ДНК и теломераза
59
Наиболее вероятной стадией, используемой для этого, яв-
ляется весьма продолжительная профаза мейоза. В это время
происходят сложные преобразования хромосом (конъюгация,
кроссинговер), в процессе которых или одновременно с которы-
ми и может совершаться полное восстановление нормальной
структуры генома.
О подобной роли мейоза свидетельствуют, например, такие
факты.
Некоторые простейшие (например, инфузории) размножа
ются и половым, и бесполым путем. При этом половое деление
ядер (т. е. мейоз) и последующий половой процесс (слияние га-
плоидных ядер) резко активизируют культуру: клетки начина-
ют чаще делиться, в них интенсифицируется обмен веществ.
Другой широко известный факт — с клонированием. Зна
менитая овечка Долли получила хромосомы соматической клет
ки, т. е. не прошедшие мейоз. В результате у нее (и других по-
добных животных) развилось преждевременное старение. Пра-
вда, справедливости ради, следует заметить, что то же самое сле-
довало бы и из постулата Вейсмана, а не только из гипотезы
«омоложения».
Резюмировать вышесказанное можно одним: отношение
линии половых клеток к процессу старения ни в коем случае
нельзя считать решенным вопросом; для его выяснения требу-
ются специальные и самые разнообразные исследования.
Все же принципиально возможные варианты представлены
на рис 1.22. На нем G — это биологический возраст клетки,
т. е. некая интегральная характеристика, учитывающая во-
зрастные изменения всевозможных клеточных параметров.
И показаны графики возможного изменения G в полном цикле
линии половых клеток (от зиготы одного поколения до зиготы
следующего поколения).
Постулат Вейсмана отражается графиком А, а в модифици
рованном (и более вероятном) виде — графиком D
В последнем случае предполагается, что в общей массе ста-
реющих клеток сохраняется какое то (все уменьшающееся) ко
личество клеток с интактным геномом, которые и используются
для оплодотворения.
Графики С, F и Е — разные модификации гипотезы «омоло-
жения»: С нестатистический, а два последних — статистиче-
ские варианты.
Так, в варианте F биологический возраст уменьшается у всех
Клеток, но у одних — более эффективно, у других — менее.
Вариант же Е допускает, что «омоложение» одних клеток
Может происходить за счет других (у которых G возрастает еще
60
Глава 1
Fat,it »зм жные йаг ис;нты изменами» РОЗ-
растя в лямии п^л^»р-»*х кл* ток
больше). О такой возможности заставляет думать мейоз в ооге-
незе, где на одну яйцеклетку образуется три редукционных
тельца. Не исключено, что в последних собраны отбракованные
(«старые») хромосомы.
Вот среди этих вариантов и надлежит сделать эксперимен-
тально аргументированный выбор.
Что же касается графика В, то он отражает маловероят-
ную ситуацию: зиготы каждого последующего поколения
старше (имеют большее значение биологического возраста G),
чем зиготы предыдущего поколения. В таком случае биологи-
ческий вид был бы обречен на постепенную деградацию и вы-
мирание.
1.5. ТЕЛОМЕРАЗА И ОНКОГЕНЕЗ
Кроме старения, теломеры и теломераза связаны с другой
важнейшей биологической проблемой — проблемой опухолево-
го роста (онкогенезом).
Эта связь с наибольшей очевидностью продемонстрирована
опять таки на культурах клеток. Поэтому остановимся на сути
соответствующих экспериментов.
61
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза___________________
1.5.1. Получение линий опухолевых клеток
1.5.1.1. Общие сведения
Нормальные соматические клетки, как мы знаем, делятся
в культуре ограниченное количество раз.
В отличие от этого, опухолевые клетки в своих делениях не
имеют какого-либо предела: их популяция может удваиваться бес-
конечно. Чтобы подчеркнуть данную особенность таких клеток,
их часто называют иммортализованными («бессмертными»).
Получить «бессмертные» линии можно двумя способами:
- либо трансформировать нормальные клетки in vitro,
— либо выделить клетки из опухоли, растущей in vivo.
В обоих случаях культивировать иммортализованную ли-
нию можно опять-таки двумя способами:
- in vitro, т. е. путем пересева клеток в новые флаконы по-
сле каждого удвоения популяции,
— in vivo - путем регулярного пересева клеток здоровым
животным.
Так, например, трансформированные in vitro клетки неред-
ко вводят в организм животного, где они вызывают опухоль.
И наоборот: выделенные из первичной опухоли клетки де-
сятилетиями культивируют in vitro.
Наиболее известной из таких длительно поддерживаемых
культур’является линия HeLa. Ее клетки получены в 1952 г. из
опухоли шейки матки женщины и названы по инициалам паци-
ентки.
1.5.1.2. Иммортализация in vitro
Как осуществляется иммортализация in vitro? — Она быва-
ет спонтанной и индуцированной.
В случае мышиных фибробластов спонтанная трансформа-
ция происходит следующим образом.
Как уже отмечалось (п. 1.4.1.4), эмбриональные фибробла-
сты мышей делятся в культуре примерно 20 раз. При этом по-
следние деления совершаются все реже, а размер клеток увели
чивается. Но и после завершающего удвоения клетки еще дли-
тельно (в течение нескольких месяцев) остаются живыми.
В такой неделящейся культуре через 2-3 месяца могут воз-
никать отдельные фокусы роста. Количество клеток в фокусе
начинает увеличиваться в геометрической прогрессии. Это и оз-
начает, что произошла спонтанная трансформация какой то пе
Реживающей «старой» клетки, дающая начало новому клону.
62
Глава 1
При этом клоны трансформантов бывают двух видов. Одни
клоны имеют ограниченный пролиферативный потенциал: со-
вершают еще 20-30 удвоений популяции и подвергаются
повторному старению. И только другая часть трансформирован-
ных клонов оказывается иммортализованной: удваивается нео-
граниченное число раз.
В отличие от клеток мышей, нормальные клетки человека
крайне редко претерпевают спонтанную трансформацию in vitro.
Однако трансформацию можно надежно, хотя и с очень
низкой частотой, вызвать онкогенными ДНК-содержащими ви-
русами — например, вирусом SV40. В этом процессе обычно
различают две стадии.
Первая стадия — временное удлинение жизни культуры:
после заражения вирусом клетки меняют свою морфологию
и совершают на 20 60 делений больше, чем нормальные клетки.
Эта стадия кончается кризисом — прекращением роста популя-
ции. рольшая часть клеток после этого погибает.
Но единичные клетки (их доля варьирует от 10 до 10 ’),
преодолевая кризис, проходят вторую стадию, в ходе которой
становятся иммортализованными.
Таким образом, у клеток мышей временное удлинение жиз-
ни культуры и иммортализация — два независимых варианта
трансформации.
А у клеток человека временное удлинение жизни и иммор-
тализация — две последовательные стадии трансформации, ко-
торая в подавляющем большинстве случаев ограничивается
только первой стадией.
1.5-2- Теломеры и теломераза
в трансформированных клетках
1.5.2.1- Исходные предположения
Создавая свою теорию маргинотомии, А. М. Словников по-
пытался объяснить не только эффект Хейфлика, но и беспре-
дельное существование иммортализованных клеточных линий.
Согласно этой теории, как МЬ1 знаем, нормальные клетки
прекращают деления из-за отсутствия теломеразы и укорочения
теломер.
Отсюда естественно было считать, что иммортализация
обусловлена индукцией теломеразы событием, которое при-
водит к восстановлению теломер и постоянному поддержанию
их длины после очередных делений. Правда, механизм индук-
ции фермента четко не прописывался.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
63
Таким образом, просто постулировалось, что опухолевые
клетки, как и клетки половой линии, должны содержать высо-
кую активность теломеразы.
1 5.2.2. Клеточные линии: экспериментальные факты
Экспериментальные факты в целом подтвердили исходные
представления.
а) При вирусной трансформации клеток человека на пер-
вой стадии (до кризиса) продолжается укорочение теломер по
мере деления клеток.
Как мы уже отмечали (п. 1.4.3.1), это обстоятельство свиде-
тельствует против того, что остановка делений на лимите Хей-
флика вызвана недостаточной длиной теломер. Ведь при тран-
сформации деления продолжаются и при большем укорочении
теломер.
Но последующий кризис практически несомненно обусло-
влен предельным укорочением теломер. Об этом говорят как
прямые определения их длины, так и наблюдаемое в это время
слияние концов хромосом во многих клетках. Вспомним
(п. 1 3.2.2): одной из функций теломер является стабилизация
концов хромосом; недостаточность этой функции и приводит
к объединению хромосом.
В клетках же, преодолевших кризис, наблюдается увеличе-
ние длины теломер. Исключений из этого правила (для иммор-
тализации in vitro) не известно.
б) Чаще всего длина теломер стабилизируется за счет по-
явления теломеразной активности. Последняя обнаружена
в подавляющем большинстве иммортализованных линий, в то
время как в докризисных клетках теломеразы нет.
А что будет при воздействии на иммортализованные клетки
ингибиторами теломеразы?
В качестве такого ингибитора успешно выступает 3' азидо-
3 дезокситимидин — ингибитор всех обратных транскриптаз
(на основании чего он используется, в частности, для лечения
СПИДа). Поскольку теломераза тоже относится к этой группе
Ф рментов (п. 1.3.2.4), указанное вещество подавляет и ее ак-
тивность.
Так вот, если воздействовать на иммортализованную ли-
нию клеток ингибитором теломеразы, то свойство иммортали-
зации пропадает: клетки, в конце концов, перестают делиться
и демонстрируют все признаки старения в культуре.
Это еще раз показывает: обязательным условием имморта-
лизации является поддержание длины теломер.
64
Глава 1
Кроме того, вырисовывается новое направление в лекар-
ственной терапии опухолей. Следует использовать не тотальные
ингибиторы синтеза ДНК (как это давно практикуется), а более
специализированные ингибиторы теломеразы: в этом случае бу-
дет меньше побочного влияния на нормальные клетки.
в) Еще один интересный экспериментальный подход — по-
лучение гибрида нормальной и иммортализованной клеток. Ка-
кова в этом гибриде теломеразная активность — высокая (как
в иммортализованных клетках), нулевая (как в нормальных
клетках) или какая-то средняя?
Оказалось, активность в гибриде отсутствует
Следовательно, в нормальной клетке имеются некие репрес-
соры генов теломеразы, а при иммортализации эти репрессоры
утрачиваются. В гибридной же клетке репрессоры подавляют ак-
тивность теломеразных генов из обеих исходных клеток.
г) Однако не всегда в иммортализованных клетках обнару-
живается теломеразная активность.
Примерно в 25 % случаев длина теломер в таких клетках
стабилизируется (иногда даже на уровне, превышающем нор-
мальный), а активность теломеразы — отсутствует.
Очевидно, здесь действует один из альтернативных меха-
низмов удлинения теломер (ALT; п. 1.3.1 4).
д) В то же время иммортализацию ни в коем случае нельзя
сводить только к восстановлению теломер. Так, введение гена
теломеразы в клетки, даже если и увеличивает лимит Хейфли-
ка, не делает клетки иммортализованными.
Для иммортализации же должны произойти и другие собы
тия — снижение или полное исчезновение активности опреде-
ленных белков: например, р53 и pRb (участвующих в регуляции
клеточного цикла в нормальных клетках), прохибитина (еще
одного супрессора роста), ферментов репарации ДНК и т. д.
Причем в совокупности эти события не возвращают клетку
к исходному ( «молодому») состоянию, а делают ее во многом иной.
Поэтому нельзя считать их следствием удлинения теломер
Действительно, еще можно было бы допустить, что укорочение
теломер меняет функционирование прилежащих генов и вызы-
вает старение. Но трудно представить, как обратный процесс
(простое восстановление теломер) может превращать старую
клетку не в молодую, а в опухолевую.
Следовательно, удлинение теломер лишь одно из ключе-
вых событий иммортализации, причем, по-видимости, необхо-
димое: без него иммортализация невозможна.
Но это, как представляется, вовсе не инициирующее собы-
тие и тем более не достаточное Инициирующие события — сов
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза 65
сем иные: они придают клетке качества, еще не присущие ей
р прежней истории.
1.5.2.3. Первичные опухоли: экспериментальные факты
По сравнению с линиями иммортализованных клеток, пер-
вичные опухоли исследованы в отношении теломер и теломера-
зы менее подробно. Но имеющиеся данные вполне согласуются
с предыдущими данными.
Так, были протестированы на теломеразную активность
несколько тысяч образцов опухолей человека.
В подавляющем большинстве (85%) злокачественных но-
вообразований обнаружена теломеразная активность. Некото-
рым исключением оказался ряд злокачественных опухолей го-
ловы, где фермент был выявлен лишь в 40-60 % случаев.
Напротив: в доброкачественных опухолях частота обнару-
жения фермента в целом такая же, как в нормальных тканях
(27%).
На этом основании теломеразу считают биохимическим
маркером злокачественных опухолей человека.
1 6. МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК
Продолжая рассмотрение процессов, связанных с синтезом
ДНК, обратимся теперь к метилированию ДНК. Этот процесс
модификации в одних случаях следует непосредственно за ре-
пликацией ДНК, а в других случаях происходит много позднее.
1.6.1. Метилирование цитозина в ДНК эукариот
1611. Общие сведения
В ядрах (и митохондриях) эукариот существуют ферменты
ДНК-метилазы. Они катализируют перенос метильной группы
от активной формы метионина (S-аденозилметионина,
или SAM) на определенные азотистые основания ДНК.
Долгое время у эукариот была известна лишь одна ДНК-ме-
тилаза; она метилирует в ДНК остатки цитозина, превращая их
в 5-метилцитозин (5-МЦ) (рис. 1.23) В этом разделе речь будет
идти только о данном ферменте.
Метилированию под его действием подвергаются не все, а,
в среднем, около 5 % остатков цитозина, т. е. один из 20.
При этом 5-МЦ в ДНК расположены не равномерно, а сгруппи-
3. 36
66
Глава 1
рованы в определенных локусах
В частности, к таковым относятся центромерные отделы
ДНК и, как считают, премоторные последовательности некото-
рых генов (места связывания РНК-полимеразы). Другая вер-
сия — 5-МЦ локализованы в спейсерных (межнуклеосомных)
участках ДНК
Что может давать преобразование цитозина в 5-МЦ? Об
этом нетрудно судить на примере другой аналогичной пары —
урацил, тимин (последний — это 5-метилурацил).
Как известно, тимин комплементарно взаимодействует
с аденином сильней, чем урацил. Причина в том, что метильная
группа увеличивает гидрофобные свойства основания. И этим
(наряду с заменой рибозы на дезоксирибозу) объясняется тот
фундаментальный факт, что ДНК имеет не одноцепочечную
структуру (как РНК), а двухцепочечную.
Так же обстоит дело и в случае метилирования цитозина по
5-му положению. Оно усиливает взаимодействие с комплемен-
тарным основанием гуанином Причем пара Г Ц и так являет-
ся более прочной, чем пара А-Т (включает не две, а три водород-
ных связи). В результате же метилирования цитозина двухцепо-
чечная структура соответствующего локуса ДНК как бы закре-
пляется дополнительным «замком».
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
67
1 6 1.2. Динамика содержания 5 МЦ: параллель
с теломерами
Активность ДНК-метилазы и содержание 5-МЦ в ДНК за-
висят от многих обстоятельств. И здесь обнаруживаются удиви-
тельные параллели с изменением длины теломер и активности
теломеразы.
а) Так, в культуре фибробластов по мере делений клеток
уровень 5-МЦ в ДНК и активность ДНК метилазы снижаются.
Одновременно, как мы знаем, уменьшается длина теломер
(п. 1.4 .2.2).
Причем, чем больше видовая продолжительность жизни
животного, а следовательно, выше лимит Хейфлика (п. 1.4 1.4),
тем медленней идет падение содержания 5-МЦ в ДНК культиви
руемых клеток. Наиболее же быстро снижается уровень 5-МЦ
в клетках мышей, делящихся всего 20 раз.
Если искусственным образом ускорить падение этого уров-
ня — путем обработки «молодых» клеток деметилирующими
веществами, то количество делений в культуре уменьшается.
Заметим: в отношении теломер доказан только факт их уко-
рочения по мере делений клеток, но не обнаружена корреляция
с видовой продолжительностью жизни. Таким образом, степень
метилированности ДНК демонстрирует более тесную связь с лими-
том Хейфлика и старением клеток in vitro, нежели длина теломер.
б) Прослеживается сходная связь и со старением in vivo.
С возрастом у животных и человека содержание 5-МЦ в ДНК
разных органов снижается. Особенно это выражено в мозгу
и сердце — органах, где старение проявляется наиболее сильно.
Также чрезвычайно наглядны события у горбуш после не-
реста. В это время в их тканях быстро развиваются инволюцион-
ные процессы (приводящие к смерти), и параллельно в ДНК тка
Ней катастрофически резко падает уровень 5-МЦ
Пока нельзя однозначно сказать, что здесь первично: то ли
деметилирование ДНК приводит к гибели клеток у горбуш,
то ли какие-то иные процессы вызывают, помимо прочего, деме-
тилирование ДНК. Например, можно было бы представить что
5-МЦ содержащие локусы просто выщепляются из состава ДНК
Ca2‘,Mg‘ -зависимой эндонуклеазой, которая активируется при
апоптозе (раздел 6.2.2.2). Т. е. в этом случае падение 5-МЦ —
один из ранних показателей апоптоза (запрограммированной
гибели клеток).
В то же время, как видно из данных по другим животным,
снижение содержания 5 МЦ — одно из очень немногих про
явлении старения иа уровне ДНК
68
Глава 1
Другое из таких проявлений, как мы знаем, — укорочение
теломер (п. 1.4.2.2). Но последнее обнаружено лишь в делящих-
ся клетках, тогда как для неделящихся клеток пока лишь пред-
полагается в виде гипотезы. На этом фоне падение уровня 5-МЦ
представляется более универсальным возрастным событием.
в) Третья параллель касается опухолевой трансформации
клеток. Эта трансформация сопровождается не только появле-
нием теломеразной активности, но и активацией ДНК-метила-
зы с возрастанием содержания 5-МЦ. Данный феномен наблю-
дается при иммортализации как in vitro, так и in vivo.
Но в случае трансформации in vitro вирусом SV40 между
изменениями длины теломер и уровня 5-МЦ имеется достаточно
красноречивое различие.
На первой стадии процесса (когда клетки преодолели ли-
мит Хейфлика, но еще не прошли кризис; п. 1.5.1.2) теломеры
продолжают укорачиваться. Однако содержание 5-МЦ в ДНК
перестает снижаться и стабилизируется уже сейчас (а не только
после кризиса, как теломеры).
Это говорит о том, что метилирование ДНК вовлечено в од-
но из начальных событий трансформации, которые хотя еще не
приводят к иммортализации клетки, но уже обеспечивают пре-
одоление старения и лимита Хейфлика.
С другой стороны, метилирование ДНК, очевидно, не пре-
дупреждает развитие кризиса в культуре трансформированных
клеток. Следовательно, восстановление уровня 5-МЦ — необхо-
димое, но недостаточное условие опухолевого перерождения.
Точно такое же заключение мы сделали выше относительно вос-
становления длины теломер.
Но эти необходимые события совершаются на разных эта-
пах трансформации; одно — на первом (при преодолении лими-
та Хейфлика), другое — на втором (при преодолении кризиса).
1.6.1.3. Возможные функции, метилирования ДНК
Метилирование ДНК по цитозину открыто у эукариот уже
несколько десятилетий назад и с тех пор изучалось многими ис-
следователями. В том числе кандидатская работа одного из авто-
ров этой книги (Н. Н Мушкамбарова) тоже была посвящена
данной проблематике (1974 1977 гг.).
Но, несмотря на давность вопроса и множество накоплен-
ных сведений, функциональная роль метилирования ДНК до
сих пор остается загадкой. Не исключено, правда, что эта зага-
дочность обусловлена полифункциональностью метилирования
ДНК, т. е. тем, что оно вовлечено в самые разные процессы.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
69
Не перечисляя все возможные версии, остановимся лишь
на двух из них. Предварительно заметим: в основе их обеих ле-
жит представление, что метилирование цитозина в ДНК закре-
пляет двухцепочечную структуру соответствующего локуса.
а) Участие в регуляции активности генов. Мы уже знаем,
что старение (in vitro и in vivo) сопровождается падением уров-
ня 5-МЦ в ДНК. Т. е. имеется положительная корреляция
между функциональной активностью клеток и содержанием
5 МЦ О наличии такой корреляции говорит и целый ряд дру-
гих фактов.
Наиболее метилированной является ДНК мозга и печени,
в мозгу ДНК больших полушарий и коры мозжечка. В про-
цессе выработки условного рефлекса у крыс в ДНК коры и гип-
покампа содержание 5-МЦ возрастает на 35-40 % . Гормональ-
ная стимуляция мозга дексаметазоном приводит к усилению
синтеза РНК (особенно рРНК) и увеличению степени метилиро-
ванности ДНК. И так далее — этот перечень можно продолжить.
Как же совместить подобные сведения с непосредственным
результатом метилирования — закреплением двухцепочечной
структуры локусов ДНК? Тем более что, по некоторым данным,
среди этих локусов — промоторные последовательности, т. е.
участки ДНК, которые предшествуют структурным генам
и с которыми связываются молекулы РНК-полимеразы (осу-
ществляющие синтез РНК). Парадокс в том, что при связыва-
нии РНК-полимеразы должно происходить локальное расплете-
ние ДНК, а метилирование, напротив, затрудняет расхождение
цепей, в соответствии с чем блокирует, по литературным сведе-
ниям, некоторые промоторные последовательности.
Чтобы снять это противоречие, приходится предположить,
что метилируются промоторы генов таких регуляторных бел-
ков (типа белка р53), которые репрессируют функциональную
активность клетки. Тогда торможение торможения, достигае-
мое метилированием, действительно приведет к повышению
клеточной активности.
В числе метилируемых генов могут быть и гены группы
AGE, отвечающие за старение (рис. 1.24). Уменьшение с возра-
стом содержания 5-МЦ в их промоторах будет постепенно акти-
вировать эти гены.
Но, чтобы в неделящихся клетках происходило снижение
содержания 5-МЦ, необходимы два условия — потеря молеку-
лами ДНК уже включенных метильных групп и уменьшение ак-
тивности ДНК-метилазы.
Что касается исчезновения 5 МЦ, то оно, в принципе, мо-
жет осуществляться тремя способами.
70
Глава 1
1.21. •жн.’ия Матилмгчмйния ДНК с актигн'“*т*>с
г- нм- и «ф^доисэмм crai'f’HH?'
Первый способ — истинное деметилирование, т. е. обратное
превращение 5-МЦ в цитозин. Однако акцептор метильных
групп для такого превращения не известен, как не известно и то,
возможно ли оно вообще.
Второй гипотетически возможный способ — эксцизионное
удаление 5-МЦ, т. е. вырезание из цепи ДНК небольшого фраг-
мента с 5-МЦ и замена его неметилированным участком — так,
как это делает система репарации с повреждениями ДНК. Вари-
ант этого способа — вырезание сразу двухцепочечного фрагмен-
та — ферментом типа Са, Mg-зависимой эндонуклеазы.
Наконец, третий способ — гидролитическое дезаминирова-
ние 5-МЦ, которое может происходить неферментативным пу-
тем (т. е. спонтанно) и приводит к превращению 5-МЦ в обычное
основание тимин. Тем самым комплементарная пара 5-МЦ-Г
превращается в некомплементарную пару Т-Г.
Каким-то из этих способов и осуществляется постепенное
деметилирование ДНК, наблюдаемое с возрастом, а также при
обратимом снижении функциональной активности клетки.
Причем для падения уровня 5-МЦ деметилирование должно
происходить с большей скоростью, чем включение ДНК-метила-
зой новых метильных групп.
А почему уменьшается активность ДНК метилазы? — Если
деметилирование действительно приводит к активации генов
супрессорных белков, то можно предположить, что среди объек-
ЯДРО- синтез ДНК и теломераза
71
Содержание 5-МЦ
Время жизни клетки или
количество удвоении культуры
|*ио. 1.‘25-. G»-тдялмнй
ИЗМл-HfcHkMi СО в: ХМ* Н* М « < А'З -
женит. К-МЦ • ДНК
тов действия этих супрессоров
находится и ген ДНК-метила-
зы (см. рис. 1.24). В таком
случае причиной снижения
активности ДНК метилазы
является первичная потеря
молекулами ДНК метильных
групп.
Иначе говоря, образуется
порочный круг: недометили
рованность ДНК снижает ак-
тивность ДНК-метилазы,
а это снижение, в свою оче-
редь, усугубляет недометили-
рованность ДНК. Тогда паде-
ние со временем содержания
5-МЦ (а следовательно, и снижение жизнеспособности клетки)
будет происходить не линейно, а по гиперболическому закону
(рис. 1.25): вначале — медленно, а затем с быстро увеличива-
ющейся скоростью.
До сих пор речь шла о неделящихся клетках. В митотиче-
ских же клетках на баланс метильных групп влияет еще одно
обстоятельство — образование новых цепей ДНК, первоначаль-
но совсем лишенных 5-МЦ. Поэтому ДНК метилаза должна в эт-
их клетках функционировать с большей нагрузкой.
Если при каждом делении потребности новых цепей в ме-
тильных группах и потери таких групп старыми цепями не ком-
пенсируются полностью ДНК-метилазой, то все больше усугуб-
ляется недометилирование ДНК. Уровень 5 МЦ в ДНК вновь па-
дает по гиперболическому закону (см. рис. 1.25); только теперь
в качестве аргумента удобней рассматривать не время, а количе-
ство удвоений культуры.
Именно так ведет себя, как известно, жизнеспособность
клеток в культуре. Так что если эта жизнеспособность действи-
тельно определяется уровнем 5-МЦ в ДНК, то мы получаем еще
одну модель (помимо теломерной теории), объясняющую эф-
фект Хейфлика
А что происходит, согласно этой модели, при трансформа-
ции клеток? — Ген ДНК метилазы тем или иным способом
необратимо высвобождается из-под супрессорного действия ге-
нов AGE. Поэтому уровень 5-МЦ в ДНК возрастает и стабилизи-
руется гены AGE блокируются, а функциональная актив-
ность клеток возрастает. Клетки вновь оказываются способны-
ми к делению.
72
Глава 1
Но длина теломер продолжает укорачиваться. Требуется
второе ключевое событие — активация теломеразы, которая
происходит в незначительном числе клеток во время кризиса.
б) Вторую гипотезу мы изложим весьма коротко. Как отме-
чалось, особенно богаты 5-метилцитозином центромерные отде-
лы ДНК (п. 1.6.1.1). Известно также, что данные отделы репли
цируются не в S фазе, а непосредственно перед расхождением
хроматид — в начале анафазы митоза (п. 1.2.1 2).
Исходя из этого, можно предположить: метилирование
центромерных областей предупреждает их преждевременную
репликацию. Объяснение все то же: для репликации необходи-
мо расплетение цепей ДНК, а высокая степень метилированно-
сти препятствует этому.
В начале же анафазы блок каким-то образом преодолевает-
ся — либо за счет включения более мощного расплетающего ме
ханизма, либо путем деметилирования.
Очевидно, что обе вышеизложенные гипотезы не исключа-
ют одна другую, а могут быть справедливы одновременно.
1.6.2. Система рестрикции и модификации
у бактерий
1 6.2.1 Введение
В отличие от эукариот, функциональная роль метилирования
ДНК у бактерий была выяснена еще в 60-х годах XX века и явля-
ется столь интересной, что о ней обязательно следует упомянуть.
Другое важное обстоятельство: бактериальная ДНК мети
лаза входит в т. н. систему рестрикции и модификации. Второй
компонент этой системы — особый вид эндонуклеаз, рестрикта-
зы. Последние же оказались незаменимым инструментом в ген
но инженерных исследованиях. По существу, генная инжене-
рия началась именно с открытия рестриктаз и всей бактериаль
ной системы рестрикции и модификации.
Примечательный исторический урок. Весной 1974 года,
когда о генной инженерии еще мало кто думал, группа извест-
ных западных ученых опубликовала письмо-обращение. В нем
указывалось на потенциальные опасности зарождающегося на
учного направления и содержался призыв наложить мораторий
на соответствующие исследования. Письмо сыграло прямо про
тивоположную роль: интерес к данной тематике резко увели-
чился, и количество работ по рестриктазам, другим эндонукле-
азам, а также ДНК-метилазам стало расти лавинообразно.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
73
Урок — старый, как мир: не следует привлекать внимание
к запретному плоду.
Впрочем, и без особых предостережений всегда найдется
тот, кто заметит затерявшийся в густой листве плод и заинтере-
суется им. Познание неостановимо. Хотя, бесспорно, не лишено
риска — и для любопытствущего, и для окружающих.
1 6 2.2. Принцип функционирования системы
Ключевая особенность бактериальных ДНК-метилаз и эн-
донуклеаз (рестриктаз) состоит в том, что данные ферменты яв-
ляются сайт-специфичными.
Это означает, что они узнают в молекулах ДНК строго опре-
деленные сайты — последовательности из 4-6 нуклеотидных пар.
И только при наличии таких сайтов осуществляют свое действие.
Заметим: хотя в двойной спирали ДНК азотистые основа-
ния обращены друг к другу, тем не менее они могут узнаваться
белками «сбоку» со стороны т. н. большой бороздки двойной
спирали.
При этом метилаза ДНК, узнав «свой» сайт, метилирует
в нем опять-таки строго определенный нуклеотид. Чаще всего
метилированию подвергается аденин по аминогруппе, в резуль-
тате чего образуется 6-1М-метиладенин, или 6-Ь1-метиламинопу-
рин (6-МАП). Реже происходит превращение цитозина в 5-ме-
тил-цитозин (5-МЦ). Донором метильной группы всегда являет-
ся S-AM.
Самое главное заключается в том, что метилирование сай-
та предупреждает воздействие на ДНК рестриктазы с той же
сайт-специфичностью. Поэтому собственная ДНК бактерии
(прометилированная по соответствующим сайтам) не подверга-
ется разрушению рестриктазой.
Зато проникшая в клетку чужеродная (вирусная) ДНК не
защищена в этих локусах. (А в длинной молекуле ДНК и виру
са, и любого иного организма всегда найдется хотя бы одна по-
следовательность, совпадающая с сайтом данной рестриктазы.)
Соответственно, эта ДНК будет расщеплена на несколько фраг-
ментов, что лишит ее биологической активности.
Таким образом, система рестрикции и модификации слу-
жит для защиты бактерий от вирусов (бактериофагов). А роль
метилирования — мечение своей ДНК в строго определенных
местах.
Сайт-специфичность ДНК-метилазы и рестриктазы у каж
Дого вида и даже штамма бактерий своя. Т. е. разные пары фер-
ментов (ДНК метилаза и рестриктаза) настроены на узнавание
74
Глава 1
разных сайтов. Благодаря этому вирус, приспособившийся к од-
ному штамму бактерий, будет по-прежнему «чужим» для бакте-
рий другого штамма.
Некоторые бактерии имеют сразу несколько систем с раз-
ной сайт-специфичностью.
1.6.2.3. Действие ДНК метилоз и рестриктаз
Уточним некоторые моменты, касающиеся действия ДНК-
метилаз и рестриктаз.
Сразу после репликации дочерние молекулы ДНК содержат
метильные группы лишь в «старых» (родительских) цепях
(рис. 1.26). Этого достаточно, чтобы защитить соответствующие
сайты от рестриктаз.
Тем не менее вскоре метилируются сайты и новых цепей
ДНК. Это обеспечивает целостность будущего «поколения» ДНК,
которое образуется после репликации в дочерних клетках.
Следовательно, у бактерий метилирование собственной
ДНК происходит вскоре после ее репликации и затрагивает,
в основном, лишь новообразованные цепи.
Рис. 1.26. Схем» пострел лика-
тивного мегипир 'вч«и« с<>6-
«Ткени -и бякт»р0.»г><М' й ДНК
А как действует рестри-
ктаза на чужеродную ДНК
(т. е. на ДНК, не метилиро-
ванную по специфическим
для рестриктазы сайтам)?
Рестриктаза наносит
два одноцепочечных разры-
ва — в самом сайте или на
определенном расстоянии от
него. В результате линейная
ДНК расщепляется на п+1
фрагментов, где п количе-
ство в молекуле сайтов дан-
ного вида.
Различают два типа си-
стем рестрикции и модифи
кации.
Системы типа I Здесь
функционирует единый фер-
ментный комплекс, включа-
ющий три субъединицы —
сайт-узнающую, метили
рующую и рестриктирую-
щую.
ЯДРО- синтез ДНК и теломераза
75
1 - место метилирования; 2- место гидролиза
1 2
I I Сайт в ДНК
5' Д-РА—Г—Ц—Г— Т_____________________________ 3'
♦
3- Т—Т—Ц—Г—At—А---------------------------5'
i t
РЕСТРИКТАЗА
-------А А—Г—Ц—Т—Т-----------
-------Т—Г— Ц—Г—А А--------
Фрагменты с "липкими" концами
Разрыв же чужеродной ДНК осуществляется на сравни-
тельно большом расстоянии (порядка 1000 н. п.) от сайта узна-
вания (и метилирования) и, видимо, в достаточно произвольном
месте.
Системы типа II гораздо более интересны в практическом
отношении. Их особенности:
- сайты являются палиндромами, т. е. читаются одинаково
с обеих сторон (с учетом полярности цепей);
метилаза и рестриктаза отдельные ферменты;
гидролиз производится в области сайта узнавания (и ме-
тилирования), в строго определенном месте;
- при этом места гидролиза на обеих цепях ДНК не вполне
совпадают, отчего образующиеся фрагменты ДНК имеют
т. н. «липкие» концы (небольшие одноцепочечные участ
ки, способные к спариванию).
Пример палиндромного сайта, а также места его метилиро-
вания и гидролиза показаны на рис. 1.27.
Именно рестриктазы типа II стали незаменимым инстру-
ментом в генноинженерных работах. Действительно, поскольку
места их действия на ДНК строго определенны, с их помощью
можно производить фрагментирование исследуемой ДНК с «хи
рургической» точностью. Наличие же у образующихся фраг-
ментов «липких» концов облегчает их «сшивание» с другими
молекулами ДНК.
76
Глава 1
Наконец, остается вопрос: как же при наличии у бактерий
такой защитной системы бактериофаги все-таки сохраняются
в природе?
Дело в том, что, как и прочие системы защиты (репарацион-
ная, антиоксидантная и пр.), данная система тоже не является
абсолютной.
При попадании в бактерии фаговой ДНК в подавляющем
большинстве случаев эта ДНК, действительно, разрушается.
Но примерно в 1 случае из 10"’ фаговая ДНК успевает проме-
тилироваться бактериальной ДНК-метилазой. В результате она
становится «своей» для рестриктазы и может беспрепятственно
многократно реплицироваться в клетке. После каждого цикла
репликации фаговые ДНК несут на своих «старых» цепях ме-
тильные группы, т. е. защищены от рестрикции и поэтому вновь
подвергаются метилированию.
Иными словами, все потомки сохранившегося бактериофа-
га становятся резистентными к рестриктазам данного штамма
бактерий. Это позволяет им беспрепятственно размножаться
в других клетках этого штамма.
1 6.3. Метилирование ДНК, связанное с репара-
цией ошибок репликации
Итак, длительное время считалось, что у эукариот в ДНК
метилируется только цитозин, а у бактерий метилирование
ДНК необходимо лишь для защиты от вирусов.
Теперь же выясняется, что и у тех, и у других имеется еще
один вид метилирования ДНК, связанный сразу и с репликаци-
ей, и с репарацией ДНК.
Акцептором метильной группы в ДНК при этом является
пуриновое основание: у бактерий — аденин, находящийся в по-
следовательности Г АТЦ; у эукариот — гуанин. Образуются, со-
ответственно, 6-Ы-метиладенин и 6-О-метилгуанин.
Эти основания служат «метками» родительской цепи при
репарации ошибок репликации.
Как мы уже отмечали (п. 1.2.3.2), в ДНК полимеразной си-
стеме имеется механизм контроля за правильностью включения
нуклеотидов в синтезируемую цепь ДНК. Однако существует
и второй уровень контроля специальная система репарации.
Если в дочерней цепи все-таки оказывается «неправиль-
ный» (с точки зрения комплементарности) нуклеотид, то это вы-
зывает нарушение структуры двойной спирали, что распознает
ся указанной системой.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
77
hr. 1.2?*. ₽<гт мгтилиг1 иаиит-ДНКгръпасяции
ошибок i «*1пикаиии
Но прежде чем осуществлять репаративные мероприятия,
система должна распознать еще одно обстоятельство — какая из
цепей является родительской (и, следовательно, правильной),
а какая — дочерней.
Для этого репарационный комплекс начинает переме
щаться по дуплексу ДНК (рис. 1.28), пока не находит на одной
из цепей неметилированную последовательность (5 )ГАТЦ(3 )
(у бактерий). Отсюда следует, что данная цепь — новосинтези-
рованная.
«Выяснив» это, репарационный комплекс разрывает здесь
указанную цепь и начинает обратное движение к месту дефекта
спиральной структуры, последовательно отщепляя от новой це-
пи нуклеотиды — за счет 3 —>5 экзонуклеазной активности.
После того как будет пройдено место ошибки, ферментный
комплекс останавливается, а в дочерней цепи оказывается боль-
шая брешь (порой в несколько тысяч нуклеотидов) — от места
Разрыва цепи до места ошибки.
Эта брешь застраивается за счет включения ДНК-полиме-
разной активности. Т. е. ферментный комплекс (или только его
ДНК полимеразный компонент) перемещается теперь в проти-
воположном направлении — от места исправленной ошибки
к месту первоначального разрыва дочерней цепи.
78
Глава 1
Завершает репарацию ДНК-лигаза (п.1.2.3.3), образующая
межнуклеотидную связь в месте разрыва.
Таким образом, репарационный комплекс, исправляющий
ошибки репликации, при обнаружении одной такой ошибки со-
вершает по ДНК трехкратное перемещение:
— от места дефекта к месту, позволяющему идентифициро-
вать цепи,
— отсюда назад к месту ошибки,
— и, наконец, вновь к идентификационному локусу.
Ключевую же роль в идентификации цепей играет наличие
или отсутствие в соответствующем месте метильной группы.
Но после того, как репликация всей ДНК и ее проверка ре-
парационной системой будут завершены, очевидно, новые цепи
ДНК также должны подвергаться данному виду метилирования
(по крайней мере, в клетках, которые еще будут делиться). Тог-
да в очередной S-фазе они смогут распознаваться как «старые»,
а значит «правильные», цепи.
Вышеизложенная схема, видимо, в полной мере применима
к бактериям, при изучении которых она и была установлена.
В случае же эукариот могут быть какие-то отличия в деталях, хо-
тя само наличие у них метилирования ДНК, связанного с репара-
цией ошибок репликации, выяснено достаточно определенно.
1 7. РЕПАРАЦИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК
Кроме репарации ошибок репликации, в клетках происхо-
дит репарация разнообразных повреждений ДНК, постоянно
появляющихся под действием всевозможных факторов (о чем
выше уже упоминалось).
Рассмотрим, какими конкретно могут быть эти поврежде-
ния и каковы механизмы их исправления.
1.7.1. Возможные повреждения ДНК
Агенты, вызывающие повреждения ДНК, достаточно раз-
нообразны: внешние облучения (ультрафиолетовое, инфракрас-
ное, радиоактивное и пр.), самопроизвольные локальные изме-
нения температуры, свободные радикалы, химические мутаге-
ны и т. д.
Нередко есть связь между природой повреждающего воз-
действия и характером повреждений ДНК.
При этом последние можно подразделить на два основных
типа: повреждения оснований и повреждения цепей.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
79
1.7.1.1. Повреждения оснований
а) Гидролитическое выщепление оснований: происходит
спонтанно, а также под действием вышеперечисленных факто-
ров. Пентозофосфатный остов цепи при этом сохраняется.
Особенно велика скорость выщепления пуриновых основа-
ний. В среднем за сутки в диплоидной клетке молекулы ДНК те-
ряют 5Х10" таких оснований.
Если бы эти потери не репарировались, то за 70 лет в каж-
дой неделящейся клетке организма молекулы ДНК лишились
бы примерно 25 % своих пуриновых оснований. Очевидно, клет-
ки потеряли бы свою жизнеспособность задолго до этого срока.
Не менее драматичными были бы последствия и в делящих-
ся клетках. Если бы сохранялся хотя бы один депуринизирован-
ный нуклеотид, то после репликации ДНК одна из дочерних це-
пей была бы лишена в данном месте уже целого нуклеотида
А после второй репликации появлялись бы молекулы ДНК, ли-
шенные нуклеотидной пары Что меняло бы весь смысл генети-
ческой информации за поврежденным местом.
б) Гидролитическое дезаминирование оснований. В дан-
ном случае теряется не целое основание, а только его амино-
группа. В ходе такого процесса происходит следующее:
цитозин превращается в урацил — основание, которое
в нормальных условиях содержится только в РНК;
- 5-метилцитозин превращается в тимин — обычное осно-
вание ДНК;
— аденин превращается в гипоксантин — основание,
не встречающееся в норме ни в ДНК, ни в РНК
Такие переходы меняют генетический смысл локуса.
В частности, урацил и тимин комплементарны уже не гуанину
(как цитозин и 5-МЦ), а аденину. Это будет проявляться при
синтезе РНК или ДНК.
в) Образование димеров тимина Инициируется ультрафи-
олетовым облучением и происходит там, где два тимидиловых
нуклеотида соседствуют в цепи ДНК
При этом между их основаниями замыкаются две ковалент-
ные связи. В результате в данном локусе ДНК нарушаются
структура двойной спирали и способность последней участво-
вать в синтезе ДНК и РНК.
1.7.1.2. Повреждения цепей ДНК
а) Одноцепочечные разрывы: между соседними нуклеоти-
дами цепи ДНК разрывается фосфодиэфирная связь (т. е. связь
между фосфатной группой и дезоксирибозой; п. 1.1.2.1).
80
Глава 1
Особенно часто это происходит под влиянием рентгеновско-
го и радиоактивного облучения. К такому же последствию мо-
жет привести происшедшее до того выщепление азотистого ос-
нования из цепи ДНК.
При накоплении в ДНК большого количества разрывов на-
рушается структура хромосом — появляются т. н. хромосомные
аберрации (видимые повреждения хромосом).
б) Поперечные сшивкн. Это ковалентные связи двух видов:
- ДНК ДНК, т. е. между основаниями двух цепей ДНК, и
ДНК-белок, т. е. между цепью ДНК и каким-либо белком
хромосомы.
Такие сшивки блокируют в данном локусе синтез ДНК
и РНК, поскольку в обоих этих процессах требуется расхожде-
ние цепей ДНК.
В итоге, как видим, даже локальные повреждения структу-
ры ДНК могут приводить к очень серьезным последствиям.
Этим и объясняется наличие в клетках разнообразных систем
репарации ДНК, специализирующихся на устранении опреде-
ленных повреждений.
1.7.2. Некоторые примеры репарации ДНК
Общий принцип репарации ДНК основан на том, что веро-
ятность одновременного повреждения в одном локусе сразу обе-
их цепей весьма мала. Поэтому одна из цепей (неповрежденная)
может служить в качестве матрицы при восстановлении нор-
мальной структуры поврежденной цепи.
1.7.2.1. Удаление тиминовых димеров: репарация
с эксцизией участка цепи
У растений и бактерий тиминовые димеры могут удаляться
с помощью прямой фоторепарации. Ее осуществляет фермент,
который, используя энергию света, просто разрывает ковалент-
ные связи между остатками тимина.
У бактерий существует и другой механизм; видимо, анало-
гичный способ используется у животных и человека. Его суть:
- вырезание (эксцизия) из поврежденной цепи фрагмента,
содержащего тиминовый димер, и
- ресинтез аналогичного фрагмента de novo.
При этом у бактерий существует фермент (эксцинуклеаэа),
который находит место повреждения и разрывает по обе стороны
от него соответствующую цепь ДНК. Тем самым вырезается фраг-
мент из 12-13 нуклеотидов, включающий тиминовый димер.
ЯДРО: синтез ДНК и теломераза
81
Гии 1.20. Скьмзг спаг.’.ции ти-
мит г ага ;;им«ра
Есть ли такой фермент
у животных, не известно. Ско-
рее всего, в процессе участвует
репарационная эндонуклеаза
II, которая разрывает межну-
клеотидную связь с одной сто-
роны (5‘) от димера (рис. 1.29).
Затем специальная экзонуклеа-
за поочередно отщепляет до
100 нуклеотидов.
Ресинтез фрагмента осу-
ществляется ДНК-полимера-
зой р последняя же межну-
клеотидная связь образуется,
как всегда, ДНК-лигазой.
Иногда встречаются гене-
тические дефекты данной репа-
рационной системы. Одна из та-
ких наследственных болезней — пигментная ксеродермия
При этом кожа чрезвычайно чувствительна к свету, поскольку
УФ облучение провоцирует образование димеров тимина.
Рис. 1.30. Синдром прежде ремчнюжо стадия
Слым - молодой человек 21 года f. тр^а, пд же-юповекв2< /нж
Другой вариант синдром преждевременного старения
(рис. 1.30); это подверждает предположение о том, что и нор-
мальное старение связано с ослаблением деятельности систем
репарации ДНК (равно как и других защитных систем;
п. 1.4.3.3).
82
Глава 1
1.7.2.2. Удаление остатков урацила и репарация
участков, лишенных основания
Как мы знаем, остатки урацила появляются в ДНК в ре-
зультате гидролитического дезаминирования цитозина.
В репарации принимают участие 5 ферментов (рис. 1.31),
из которых первый специфичен в отношении только данных на-
рушений.
Урацил-ДНК-
гликозидаза
Эндонуклеаза и
экзонуклеаза
------гт-|-----
А ГЦ
______1 I______
ДНК-поли мераза р
у и ДНК-ли газа
------ш--------
______ш________
1 Рис. >.31. Удаление остатком
урацила из ДНК
' _______________:
Это урацил-ДНК-глико-
зидаза: обнаруживая урацил
в ДНК, она выщепляет его пу-
тем разрыва связи с пентозо-
фосфатным остовом цепи. Об
разуется апиримидиновый
сайт.
Дальнейшая схема репа-
рации используется не только
в рассматриваемом случае,
но и при гидролитической по-
тере пуринового или пирими
динового основания.
Репарационная эндону-
клеаза I расщепляет остов по
месту отсутствия основания.
По некоторым сведениям, апи-
римидиновые и апуриновые
локусы узнаются разными эн-
донуклеазами.
Затем экзонуклеаза от-
щепляет оставшийся дезок-
сирибозофосфат и, возможно,
еще 1 2 нуклеотида. Таким
образом, в отличие от репара
ции тиминовых димеров,
здесь размер выщепляемого
участка поврежденной цепи
очень мал.
Далее ДНК-полимераза р
достраивает репарируемую
цепь (т. е. включает 1-3 ну-
клеотида), а ДНК-лигаза сшивает ее.
По сравнению с предыдущим типом репарации (продол-
жающимся от 2 до 24 ч), данный процесс занимает гораздо мень-
ше времени — от 5 мин до 2 ч.
ЯДРО' синтез ДНК и теломераза
83
Однако тот же механизм, очевидно, не может исправлять
сходное повреждение — дезаминирование 5-метилцитозина
с образованием тимина. Действительно, тимин — нормальное
основание ДНК, и, следовательно, не существует фермента, на-
строенного на его выщепление.
Репарация могла бы быть основана лишь на узнавании де-
фекта спаривания в паре Т-Г (заменившей пару 5-МЦ-Г) — при-
мерно так же, как это происходит при репарации ошибок репли-
кации (п 1.6.3). Но функционирует ли этот механизм вне S-фа-
зы, неясно. Поэтому некоторые авторы считают, что дезамини-
рование 5-МЦ не репарируется.
Если это так, то спонтанное дезаминирование 5-МЦ в поло-
вых клетках, как бы редко оно ни происходило, меняет генети-
ческий смысл соответствующих локусов ДНК, и это передается
в генотип потомства.
Литература к главе 1
Билич Г. Л., Катииас Г. С., Назарова Л. В. Цитология. СПб.: Деан,
1999, 112 с.
Блэкбэри Е. X. Теломера и теломераза: нуклеопротеидные ком-
плексы, участвующие в гомеостатической системе поддержания по-
стоянной длины теломер//Биохимия, 1997, 62. С. 1400-1406.
Вазири X. Критическое укорочение теломер...//Биохимия, 1997,
62. С. 1528- 1527.
Вилеичик М М. Биологоческие основы старения и долголетия. М:
Знание, 1976, 160 с.
Гистология, цитология и эмбриология. Под редакцией Афанасье-
ва Ю. И., Юринои Н. А. М.: Медицина, 1999, 744 с.
Докудовская С. С. и др. Теломераза — необычный РНК-содержа-
щий фермент//Биохимия, 1997, 62. С. 1411-1422.
Доицов В. И., Крутько В. Н Подколзин А. А Старение: механиз-
мы и пути преодоления. М.: Национальный геронтологический центр,
1997, 240 с.
Дуикаи Э. Л. Реддел Р. Р. Генетические изменения, связанные
с иммортализацией//Биохимия, 1997, 62. С. 1467- 1490.
Егоров Е. Е. и др. Подавление функции теломеразы аналогами ну-
клеозидов//Биохимия, 1997, 62. С. 1516 1527.
Ишикава Ф. Механизмы регуляции теломеразы млекопитаю-
щих//Биохимия, 1997, 62. С. 1558 1567.
Куренова Е В Мейсон Д М. О функциях теломер Биохимия,
1997, 62. С. 1453 1466.
Микер А. К. Коффи Д. С. Теломераза: многообещающий маркер
биологического бессмертия половых, стволовых и раковых кле-
ток/ Биохимия, 1997, 62. С. 1547-1557.
Мушкамбаров Н. Н. Изучение метилирования ДИК в животвых
тканях. Дисс. канд., М.: 1-й ММИ им. И. М. Сеченова, 1978, 132 с.
84
Глава 1
Мушкамбаров Н. Н. Динамика возрастных изменений в процессе спер-
матогенеза. Научный отчет. М.: 1-й ММИ им. И. М. Сеченова, 1980, 89 с.
Мушкамбаров Н. Н. Аналитическая биохимия. М.: Экспедитор,
1996. Т. 2. С. 395-798.
О( ивац X. Д., Хаманн А. Реорганизация ДНК и биологическое ста-
рение//Биохимия, 1997, 62. С. 1491-1502.
Прайд Ф. Е., Льюис Э. Д. Теломеры Saccharomyces cerevi-
31ае//Биохимия, 1997, 62. С. 1442-1452.
Прайс К. М. Синтез теломерной С-цепи//Биохимия, 1997, 62.
С. 1423-1431.
Реддел Р. Р., Брайан Т. М., Мернейи Д. П. Иммортализованные
клетки без измеримой активности теломеразы//Биохимия, 1997, 62.
С. 1467-1466.
Роузе В и др. Кинетика старения пигментных клеток эпителия
сетчатки: проверка теломерной гипотезы старения?//Биохимия, 1997,
62. С. 15101515.
Руководство по геронтологии. Под редакцией Чеботарева Д. Ф.,
Маиьковского II. В., Фролькиса В. В. М.: Медицина, 1978, 504 с.
Скулачев В. П. Старение организма особая биологическая функ-
ция, а не результат поломки сложной живой системы: биохимическое
обоснование гипотезы Вейсмана//Биохимия, 1997, 62. С. 1394-1399.
Спитковский Д. М. Теломерные последовательности ДНК и кон-
цепция о клетках онтогенетического резерва//Биохимия, 1997, 62.
С. 1503 1509.
Страйер Л. Биохимия. М.: Мир, 1985. Т. 3. С. 1 396.
Хейфлик Л. Как и почему мы стареем? М.: Вече, 1999, 432 с.
Хеифлик Л. Смертность и бессмертие на клеточном уровне//Био-
химия, 1997, 62. С. 1380 1393.
Чех Т. Р., Накамура Т М., Лингнер И. Теломераза как истинная
обратная транскриптаза//Биохимия, 1997, 62. С. 1407-1410.
Эллиот В„ Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология. М.: НИ-
ИБМХ, 1999, 372 с.
Глава 2. ЯДРО: ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ
И ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ
2.1. ВВЕДЕНИЕ
Как известно, в ДНК содержится определенная генетиче-
ская информация:
- о структуре всех белков и РНК организма,
- а также о порядке реализации этой информации в раз-
ных клетках в процессе онтогенеза и при различных
функциональных состояниях
Поскольку во всех соматических клетках организма —
один и тот же набор из 46 хромосом, то, несмотря на подчас
сильные отличия между клетками, все они содержат в своих
ДНК одну и ту же генетическую информацию. (Некоторое ис-
ключение составляют лимфоциты, в процессе формирования
которых происходит перестройка генов иммуноглобулинов.)
Данное обстоятельство — генетическая эквивалентность
ядер всех соматических клеток организма — и послужило ос-
нованием для клонирования животных. Правда, как отмеча-
лось выше (п. 1.4.3.4), одного этого основания оказывается не-
достаточно.
В процессе уже знакомой нам репликации ДНК генетиче-
ская информация воспроизводится целиком, чтобы затем пере-
даваться дочерним клеткам.
Но, кроме того, эта информация экспрессируется (реализу
ется) в клетке, обуславливая все проявления ее жизнедеятель-
ности. Однако экспрессии подвергается отнюдь не вся имеющая-
ся в ядре генетическая информация, а лишь какая то (обычно
весьма небольшая) ее часть.
Этим-то и обусловлены особенности тех или иных клеток —
тем, каков спектр (набор) функционирующих генов и каковы
при этом уровни их активности.
Экспрессия информации о структуре определенного белка
включает 2 основных этапа (рис. 2 1)
а) Первый из них - транскрипция: образование в клеточ-
ном ядре на соответствующем гене (локализующемся в одной из
хромосом) специального посредника — матричной РНК
(мРНК)
Смысл этого процесса — переписывание информации
о структуре белка с огромного неподвижного носителя (ДНК
в составе хромосомы) на небольшой подвижный носитель —
86
Глава 2
мРНК. Примерно так же
обстоит дело, когда с же-
сткого диска компьютера,
содержащего тысячи фай-
лов, переписывают один из
них на дискету. С той лишь
разницей, что мРНК в про-
цессе записи информации
образуется de novo из ну-
клеотидов. Следовательно,
мРНК, считанные с разных
генов, должны отличаться
друг от друга — как отли-
чаются друг от друга сами
гены.
Другое важное обстоя-
тельство: непосредствен-
ный продукт транскрип-
ции гена правильней назы-
вать предшественником
мРНК (пре-мРНК). Дело
в том, что новообразован-
ная мРНК подвергается
тут же (в ядре) созреванию, или процессингу При этом она пре-
терпевает существенную модификацию.
И лишь после того зрелая мРНК (видимо, в комплексе со
специальными белками) поступает из ядра в цитоплазму.
б) Второй из основных этапов экспрессии гена — трансля
ция: синтез белка на рибосомах по программе, диктуемой
мРНК. Суть этой программы — определение очередности, в ко-
торой аминокислоты должны включаться в строящуюся пеп-
тидную цепь.
Причем в процессе участвуют не свободные, а активирован-
ные аминокислоты: каждая из них связана с т. н. транспортной
РНК (тРНК), т. е. находится в виде аминоацил тРНК (аа-
тРНК). Для каждой из 20 аминокислот имеется своя специфиче-
ская форма тРНК, а чаще — даже не одна, а несколько форм.
Рибосомы же играют в трансляции роль молекулярных ма-
шин, обеспечивающих правильное взаимодействие участников.
В состав рибосомы входят четыре молекулы т н. рибосомной
РНК (рРНК) — по одной молекуле каждого из 4 х видов рРНК.
Объединяясь с рибосомными белками, они образуют две субъе-
диницы рибосомы и выполняют в них структурную, а также,
возможно, каталитическую функции.
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
87
Таким образом, в трансляции участвуют РНК трех клас-
сов - мРНК, тРНК и рРНК.
Далее в этой главе мы рассмотрим:
- как организована в ДНК генетическая информация,
— как она считывается (транскрибируется) и
- как регулируется это считывание.
Процесс же трансляции и связанные с ним вопросы обсуж-
даются в главе 3.
2.2. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО
МАТЕРИАЛА: ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ
2.2.1. Функциональные отделы генома
2.2.1.1. Гены и их структура
Собственно информация о структуре белков и РНК записа-
на в участках ДНК, называемых генами и цистронами.
Ген — это участок ДНК, кодирующий один белок.
Цистрон же — участок ДНК, кодирующий одну полипеп-
тидную цепь.
Таким образом, если белок состоит из нескольких разных
полипептидных цепей (субъединиц), то его ген включает не
сколько цистронов (рис. 2.2).
Однако такое подразде-
ление относится, в основном,
к бактериям, где цистроны
одного гена обычно следуют
на ДНК друг за другом.
У животных же и чело-
века цистроны нередко рас-
полагаются в разных хромо-
сомах и обычно тоже называ-
ются генами: например, ген
а цепи и ген р цепи гемогло-
бина.
Кроме генов всех белков
организма, в хромосомах
имеются также гены РНК —
четырех видов рибосомных
РНК и нескольких десятков транспортных РНК.
88
Глава 2
Общая совокупность генов, определяющих наследственную
информацию организма, называется геномом.
Всего в геноме бактерий (конкретно — кишечной палоч-
ки) — около 2500 цистронов. В хромосомах человека число ге-
нов, по последним данным, составляет около 30 000.
Почти все гены эукариот (в отличие от генов прокариот)
имеют характерную особенность: содержат не только кодирую-
щие участки — экзоны, но и некодирующие — интроны
(рис. 2.3). Экзоны и интроны перемежаются друг с другом, что
придает гену как бы «разорванную» структуру.
ГЕН
Экзон Интрон
;. 2 3. Экзоны и интроны н гене
интронов в гене
варьирует от 2 до несколь-
ких десятков; в гене миози-
на их около 50. Порой на ин-
троны приходится до 90 %
общей длины гена.
Возможно, такая орга-
низация генов объясняется
тем, что в эволюции они образовались из разных фрагментов ДНК
(соответствующих теперешним экзонам), которые соединились,
хотя и не полностью, в единые функциональные элементы.
2.2.1.2. Прочие отделы ДНК
Между генами также находятся некодирующие последова-
тельности — спенсеры. Несмотря на общее название, функцио-
нальная роль их может быть абсолютно различной.
а) Многие спейсерные участки, видимо, выполняют струк-
турную роль:
— участвуют в правильной укладке нуклеосомной цепи
в высшие структуры хроматина,
— в прикреплении хромосом к аппарату центриолей и т. д.
б) Другие некодирующие участки ДНК служат специфиче-
скими локусами связывания определенных белков:
— функционирующих на ДНК ферментов (ДНК-полиме-
разного комплекса и др.),
— белков, выполняющих регуляторную функцию.
При этом участки связывания РНК-полимеразы (фермен-
та, синтезирующего РНК на ДНК) называются промоторами.
Они либо вплотную примыкают к началу гена (или группы ге-
нов), либо отделены от гена какими-либо другими функцио-
нальными локусами.
Характерный компонент промоторов у кишечной палоч-
ки — т. н. бокс (последовательность) Прибнова:
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
89
(5')-ТАТААТ-(3)
(3’)—АТАТТА—(5').
Он находится за 15 н. п. от стартовой точки транскрипции.
Общая же протяженность промотора - - несколько десятков н. п.
В случае эукариот промотор — более сложное понятие, по-
скольку РНК-полимераза связывается с ДНК не непосредствен-
но, а лишь вместе с комплексом других белков — т. н. общих
факторов транскрипции.
В промоторе эукариот различают небольшую область ини-
циации, ТАТА-бокс (сходный с боксом Прибнова у бактерий)
и ряд других типичных участков.
в) Что касается участков связывания регуляторных бел-
ков, то у бактерий их называют операторами. Они располагают-
ся после промотора (рис. 2.4). При определенных условиях
с оператором связывается специфический белок-репрессор,
и это блокирует «прочтение» РНК-полимеразой соответствую-
щей группы генов.
Промотор Оператор Аттенюатор Гены Терминатор
ДНК I I I / I X \
PllK-полимераза Белок-ренрессор
«!.♦. Фунг до «?Л1 ныв отделы v ДНК бвщгьрий
У эукариот (включая человека) регуляцию «прочтения» ге-
нов осуществляют не только белки-репрессоры, но и белки-ак-
тиваторы — т. н. транскрипционные факторы (рис. 2.5).
К последним относятся уже упоминавшиеся общие факторы
транскрипции, необходимые для связывания РНК-полимеразы
с промотором. Эти факторы имеются во всех клетках и необходи-
мы для «прочтения» любого функционирующего гена.
Другие транскрипционные факторы повышают активность
только определенных генов, и локусы ДНК, связывающие такие
факторы, называются энхансерами.
Энхансеры могут располагаться достаточно далеко от регу-
лируемого гена: на расстоянии нескольких тысяч нуклеоти-
дных пар. Как же связывание с ними транскрипционных факто-
ров может стимулировать активность гена?
90
Глава 2
Иис. 2.5. Фуикдм Н (Л’ ИЫГ отл гы к ДЧК эуг.риот
Видимо, дело в сложной пространственной организации
ДНК. Последняя образует петли, благодаря чему энхансеры
сближаются с промоторной зоной и связанные с ними факторы
влияют на активность транскрипционного комплекса.
Причем, для некоторых ключевых генов в клетке имеется
сразу несколько энхансеров, достаточно удаленных друг от дру-
га. Следовательно, все они в результате изгибов ДНК должны со-
бираться примерно в одном месте пространства.
Нетрудно видеть, что ситуация очень напоминает формиро-
вание активного центра в молекуле фермента. Там тоже амино-
кислотные остатки, образующие этот центр, расположены в раз-
ных участках полипептидной цепи и собираются вместе лишь
при формировании третичной структуры.
Что же касается белков-репрессоров, то они при вхожде
нии в состав транскрипционных комплексов не повышают, а по-
нижают их активность.
Заметим: часто используется также термин «супрессоры» —
так называются факторы (обычно это белки), которые угнетают
тот или иной клеточный процесс. Например, опухолевые супрес-
соры регуляторные белки, препятствующие опухолевому рос
ту. Очевидно, по механизму своего действия они могут быть как
репрессорами, так и транскрипционными факторами.
г) Наконец, в ДНК могут содержаться короткие локусы,
служащие сигналами об окончании (терминации) транскрип
ции ДНК.
ЯДРО' экспрессия генов и транскрипционные факторы
91
У бактерий в ряде случаев участки с такой функцией нахо-
дятся перед группой совместно регулируемых генов. Это т. н. ат-
тенюаторы (см. рис. 2.4). Терминирующие же участки, распола-
гающиеся после генов, называются терминаторами
В одних условиях транскрипция прекращается на аттенюа-
торе (гены не считываются), в других условиях - на терминато-
ре (гены прочитываются).
У эукариот сигналы терминации более сложные: в отличие
от бактериальных, они тоже транскрибируются РНК-полимера-
зой, и только затем последняя завершает свою работу.
2.2.2. Способ записи генетической информации
2.2.2.1 Функциональная роль цепей ДНК
Две цепи ДНК в области гена принципиально различаются
по своей функциональной роли: одна из них является кодирую-
щей, или смысловой, вторая — матричной (рис. 2.6).
Смысловая цепь ДНК (5') — ТТЦ-АГТ-ЦА1 -I АЦ ГАТ-АЦГ — (3')
Матричная цепь ДНК (3 ) — ААГ-ТЦА-ГТЦ-ЦТГ-ЦТА-ТГЦ — (5')
ТРАНСКРИПЦНЯ
▼
Матричная РНК (5') —У УЦ-АГУ-ЦАГ-1 АЦ-ГАУ-АЦГ— (3')
(мРНК)
ТРАНС ПЯНИЯ
▼
Пептидная цепь белка (NHj) —Феи-Сер—Г.тн—Асп—Acn—Тре—(СООН)
. I Принцип записи и ; сагиг-ацип
геиетичоскои ин^ормпции
Это значит, что в процессе «считывания» гена (транскрип-
ции, или синтеза пре-мРНК) в качестве матрицы выступает
только одна — матричная — цепь ДНК. Продукт же этого про-
цесса — пре-мРНК — по последовательности нуклеотидов сов-
падает с кодирующей цепью ДНК (с заменой тиминовых основа-
ний на урациловые).
Таким образом, получается, что с помощью матричной це-
пи ДНК при транскрипции воспроизводится в структуре РНК
генетическая информация кодирующей цепи ДНК
92
Глава 2
На рисунках ген принято изображать так, чтобы кодирую-
щая цепь была сверху; тогда, в соответствии с общим правилом
изображения ДНК (п. 1.1.2.1), б'-конец кодирующей цепи дол-
жен располагаться слева.
Информация на кодирующей цепи записана в направлении
5 —>3 ; следовательно, промотор находится со стороны 5 -конца
кодирующей цепи гена. И этот же конец принято считать 5‘-кон-
цом всего гена (хотя у его матричной цепи здесь находится 3‘-
конец).
Всего на длинной молекуле ДНК находится несколько ты
сяч генов. И, как правило, для всех этих генов кодирующей яв-
ляется одна и та же цепь ДНК. Но иногда бывает иначе: для од-
них генов в качестве смысловой выступает одна цепь ДНК, а для
других генов — противоположная цепь. Такие гены, очевидно,
читаются в разных направлениях. Подобная ситуация обнару-
жена, в частности, для пяти генов гистонов у дрозофилы: напра-
вление прочтения двух генов отличается от такового для трех
других.
2.2.2.2. Основные свойства генетического кода
Единицей информации в кодирующей цепи ДНК является
триплет — последовательность из трех нуклеотидов.
4 вида нуклеотидов (встречающиеся в ДНК) могут образо-
вывать 43 = 64 вида триплетов. Из них 61 триплет является смы-
словым, т. е. кодирует ту или иную из 20 аминокислот, а 3 три-
плета являются «бессмысленными».
Как видим, на одну аминокислоту приходится в среднем
несколько смысловых триплетов (в реальности от 1 до 6).
По этой причине генетический код называют вырожденным.
Не будь он таким, случайные точечные мутации (замены в ДНК
одних нуклеотидов на другие) с очень высокой частотой приво-
дили бы к появлению «бессмысленных» триплетов.
В то же время код специфичен: каждому из смысловых три-
плетов соответствует только одна аминокислота.
Сама же информация о белке состоит в том, что в полном ге-
не (исключая интроны) линейная последовательность триплетов
кодирует аналогичную линейную последовательность аминоки
слот в первичной структуре данного белка (в направлении от
аминного к карбоксильному концу пептидной цепи) (рис. 2.6).
Этого оказывается вполне достаточно, поскольку первич-
ная структура белка определяет пространственную конфигура-
цию белковой молекулы, а также ее физико-химические и био-
логические свойства.
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
93
Линейное соответствие между последовательностью три-
плетов в экзонах гена и аминокислот в пептидной цепи обозна
чается как коллинеарность генетического кода.
Заметим, что хотя на рис. 2.6 для удобства восприятия три-
плеты разделены черточками, на самом деле между ними в ДНК
нет никаких «знаков препинания» — в виде, например, проме-
жуточных нуклеотидов (не считая интронов).
Итак, генетический код является триплетным, специфиче-
ским, вырожденным, коллинеарным и непрерывным.
К этому списку обычно добавляют универсальность: у всех
видов организмов смысл любого триплета один и тот же.
2.2.2.3. Генетический код
Говоря о коде, до сих пор мы имели в виду смысловую цепь
ДНК. Но такова же, с учетом замены тимина (Т) на урацил (У),
последовательность нуклеотидов в пре-мРНК (или, с некоторы
ми оговорками, мРНК).
Триплеты мРНК, соответствующие триплетам ДНК, назы-
ваются кодонами. Действительно, именно они непосредственно
определяют порядок включения аминокислот в пептидную
цепь, синтезируемую на рибосоме (см. рис. 2.6).
По той же причине в таблице генетического кода (расши-
фрованного в ходе модельных экспериментов) всегда указывают
не триплеты смысловой цепи ДНК, а кодоны мРНК (табл. 2.1).
Из этой таблицы видно, что код, действительно, является
вырожденным' для всех аминокислот, кроме метионина и трип-
тофана, имеется по 2 кодона и более. В том числе по 6 кодонов
для трех аминокислот — аргинина, лейцина и серина.
Кроме того, можно сделать еще два заключения.
а) В большинстве случаев кодоны одной аминокислоты
различаются лишь последним (третьим) нуклеотидом
Различия же по второму или первому нуклеотиду наблюда
ются лишь тогда, когда аминокислоте соответствует более 4 ко
донов, т. е. когда вариации по третьему нуклеотиду исчерпаны
б) Второе заключение состоит в том, что у сходных по стро-
ению аминокислот кодоны также сходны между собой: совпада-
ют по двум нуклеотидам или (реже) по одному, но центрально-
му, нуклеотиду.
Например, кодоны гомологов — Асп и Глу — совпадают по
первым двум нуклеотидам; кодоны Глу и его амида — Глн — по
Двум последним; кодоны 5 аминокислот с неполярным радика
лом (Фен, Лей, Иле, Мет, Вал) — по центральному нуклеотиду.
И так далее.
94
Глава 2
Таблица 2.1. Кодоиы мРНК
Первое по- ложение кодона (с 5' конца) Второе положение кодона Третье по- ложение кодона (с 3‘-конца)
У ц А Г
У УУУ - Фен УУЦ - Фен УУА Лей /УГ - Лей УЦУ - Сер УЦЦ - Сер УЦА - Сер УЦГ-Сер УАУ - Тир УАЦ - Тир УАА - Стоп УАГ - Стоп УГУ - Цис УГЦ-Цис УГА - Стоп УГГ -Три У Ц А Г
Ц ЦУУ ЦУЦ Лей ЦУА - Лей ЦУГ ЦЦУ - Про ЦЦЦ-Про ЦЦА Про ЦЦГ-Про ЦАУ - Гис ЦАЦ Гис ЦАА - Глн ЦАГ- ЦГУ - Apr ЦГЦ Apr ЦГА - Apr ЦГГ Apr ц А Г
А АУУ - Иле АУЦ - Иле АУА - Иле АУГ - Мет АЦУ Тре АЦЦ - Тре АЦА-Тре АЦГ Тре ААУ - Асн ААЦ - Асн ААА Лиз ААГ - Лиз АГУ Сер АГЦ - Сер АГА Apr АГГ - Apr ц А Г
Г ГУУ - Вал ГУЦ - Вал ГУА - Вал ГУГ- Вал ГЦУ - Ала ГЦЦ - Ала ГЦ А Ала ГЦГ ГАУ - Асп ГАЦ - Асп ГАА - Глу ГАГ Глу ГГУ - Гли ГГЦ - Гли ГГА Гли ГГГ - Гли Ц А Г
Сокращенные обозначения аминокислот: Ала — аланин, Арг —
аргинин, Асн аспарагин, Асп — аспарагиновая кислота. Вал — ва
лин Гис — гистидин, Гли — глицин, Глн — глутамин, Глу — глутами-
новая кислота, Иле — изолейцин, Лей — лейцин, Лиз — лизин, Мет —
метионин. Про — пролин, Сер — серин. Тир — тирозин, Тре — трео-
нин. Три — триптофан. Фен фенилаланин. Цис — цистеин.
Стоп «бессмысленный» кодон. прерывающий трансляцию мРНК.
Возможно, это объясняется тем, что вначале (на ранних стадиях
эволюции) имелись кодоны лишь для небольшой группы пер-
вых аминокислот. Затем же расширение множества аминоки-
слот путем их модификации сопровождалось модификацией
и исходных кодонов, т. е. заменой одного, реже двух, нуклеоти-
дов. Но остальные два нуклеотида (или один центральный) оста-
вались прежними. * j- *
Познакомившись с функциональными элементами ДНК
и способом записи генетической информации, продолжим рас-
смотрение этих элементов.
Наиболее интересный вопрос — как они взаимодействуют
друг с другом, т. е. какие более сложные объединения образуют
и как последние функционируют при тех или иных условиях.
По сути дела, вопрос об организации генетического матери-
ала теснейшим образом связан с ключевым вопросом о регуля-
ции активности генов.
95
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
Наиболее хорошо эти аспекты изучены у бактерий, к кото-
рым мы поэтому обратимся вначале.
Затем перейдем к генетическому материалу эукариот.
2.3. ОПЕРОННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У БАКТЕРИЙ
2.3.1. Регулируемые и конститутивные гены
2.3.1.1. Общая схема оперона
У бактерий гены ферментов, катализирующих ряд после-
довательных реакций, нередко объединяются в одну структур-
но-функциональную единицу — оперон (рис. 2.7).
96
Глава 2
Помимо указанных генов, в оперон входят промотор (место
связывания РНК-полимеразы; п. 2.2.1.2) и оператор (место свя-
зывания белка-репрессора).
Сам же белок-репрессор кодируется специальным геном-
регулятором, который в состав оперона обычно не входит.
Для разных оперонов существуют разные белки-репрессоры и,
соответственно, разные гены-регуляторы. Хотя не исключено,
что какие то белки-репрессоры контролируют активность сразу
нескольких оперонов.
Принцип регуляции активности оперона состоит в том, что
на сродство белка-репрессора к оператору могут влиять метабо-
литы той цепи реакций, ферменты которой кодируются данным
опероном. В связи с этим различают опероны двух типов.
а) Индуцибельные опероны:
регулятором является исходный субстрат (So) цепи кон-
тролируемых реакций;
- в отсутствие этого субстрата белок-репрессор имеет высо-
кое сродство к оператору, отчего РНК-полимераза не мо-
жет транскрибировать гены оперона (оперон «выклю-
чен»);
при накоплении метаболита So в клетке некоторое коли-
чество его связывается с белком-репрессором, понижая
сродство последнего к оператору; оперон «включается» —
и синтезируются ферменты, обеспечивающие превраще-
ния вещества So.
Как видно, регуляция оперона веществом So это пример
прямой положительной связи: начальный субстрат стимулиру-
ет в конечном счете реакции своего метаболизма.
б) Репрессибельные опероны:
регулятором служит конечный продукт (Рп) цепи контро-
лируемых реакций;
в отсутствие этого продукта белок-репрессор имеет низкое
сродство к оператору; поэтому РНК-полимераза транскри-
бирует гены оперона оперон «включен», и синтезируют-
ся ферменты, способствующие образованию вещества Рп;
при накоплении же данного вещества некоторое его коли
чество связывается с белком-репрессором и повышает
сродство последнего к оператору - оперон «выключает-
ся», синтез соответствующих ферментов и образование
метаболита Рп прекращаются.
Здесь, в отличие от предыдущ го случая, мы видим регуля-
цию по типу отрицательной обратной связи метаболит тормо
зит в итоге реакции, ведущие к его образованию.
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
97
Таковы общие схемы функционирования индуцибельных
и репрессибельных оперонов. Но организация конкретных опе-
ронов нередко включает те или иные дополнительные детали,
которые порой существенно усложняют картину. Два таких
конкретных оперона мы рассмотрим чуть ниже.
2.3.1.2. Конститутивные гены и белки
Однако прежде чем обратиться к оперонам, заметим: подоб-
ным образом регулируется активность далеко не всех генов.
Многие гены являются конститутивными, т. е. все время
находятся в активном состоянии, и скорость их транскрипции
не подвергается избирательной регуляции (хотя и может ме-
няться в связи с изменением общего состояния клетки). Такие
гены кодируют белки (в т. ч. ферменты), постоянно необходи-
мые клетке.
Эти белки (как и гены) тоже называются конститутивны
ми. Для кишечной палочки к подобным белкам относятся, на-
пример, ферменты метаболизма глюкозы.
Но скорость транскрипции различных конститутивных ге
нов может не совпадать! Этому может быть несколько причин.
а) Одна из них — различное сродство промоторов
к РНК-полимеразе или, как говорят, различная «сила» про
моторов.
У некоторых конститутивных генов промотор имеет высо-
кое сродство к РНК-полимеразе (т. е. является «сильным»). По-
этому здесь молекулы РНК полимеразы связываются с промото-
ром часто, отчего за единицу времени образуется большое коли-
чество копий мРНК.
У промоторов других генов невысокое сродство к РНК по-
лимеразе. Соответственно, молекулы этого фермента связыва-
ются редко, и образуется гораздо меньше копии мРНК
б) Вторая возможная причина заключается в самой РНК-
полимеразе. Как будет сказано позднее, одна из ее субъединиц
(т н. сигма-фактор) служит для узнавания промоторов, высту-
пая в качестве упрощенного аналога общих факторов тран-
скрипции эукариот (п. 2.2 1 2).
В разных условиях существования бактериальной клетки
образуются сигма факторы, узнающие разные промоторы. Так,
особые сигма-факторы соответствуют обычным условиям, азот-
ному голоданию, тепловому шоку и состоянию споруляции.
В каждом из этих случаев РНК-полимераза связывается с про-
моторами одних генов и не связывается с промоторами других
генов.
4 36
98
Глава 2
Таким образом, у бактерий используются два принципи-
альных способа регуляции экспрессии генов:
регуляция связывания РНК-полимеразы с промоторами
(за счет природы промотора, природы сигма фактора
РНК-полимеразы, а также, как мы увидим на примере
лактозного оперона, специального белка САР);
регуляция перемещения связавшейся РНК-полимеразы
от промотора к собственно генам (при «чисто» оперонном
механизме регуляции).
2.3.2. Примеры оперонов
2.3.2.1. Лактозный оперон — пример индуцибелъных
оперонов
Лактозный оперон интересен тем, что здесь в одной регуля
торной системе используются сразу оба только что названных
принципиальных подхода — регуляция и связывания РНК-по-
лимеразы, и ее перемещения через оператор.
Причем, существуют и другие опероны со сходпым прин-
ципом организации. Примечательно, что все они являются ин-
дуцибельными и все контролируют распад (катаболизм) посту-
пающих извне питательных веществ В то же время не для всех
таких веществ имеется оперонный принцип регуляции, приме-
ром чему, как отмечалось выше, служит глюкоза.
Итак, обратимся к лактозному оперону (рис. 2.8). Он вклю-
чает три гена. Из них первые два кодируют ферменты утилиза-
ции лактозы: пермеазу и Р-галактозидазу.
Пермеаза необходима для проникновения лактозы из вне-
шней среды в клетку. Заметим, что даже при «выключенном»
опероне имеется небольшое количество пермеазы. Поэтому при
появлении во внешней среде лактозы какое-то количество ее мо-
жет проникать внутрь и оказывать сигнальное воздействие на
лактозный оперон.
Второй фермент — р-галактозидаза катализирует распад
лактозы на глюкозу и галактозу. Последние далее вступают в ката-
болические превращения, обеспечиваемые конститутивными фер-
ментами. При «выключенном» опероне имеется небольшая актив
ность и этого фермента Это важно потому, что параллельно с основ-
ной реакцией (гидролизом лактозы) происходит и побочная — изо-
меризация лактозы в аллолактозу (где галактоза и глюкоза соеди-
нены не 1,4 а 1,6-гликозидной связью). И именно аллолактоза,
а не лактоза, служит регулятором активности оперона.
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
99
Конкретно, аллолактоза, появляясь в клетке при наличии
во внешней среде лактозы, связывается с лактозным репрессо-
ром. Этот белок кодируется специальным геном, имеет 4 субъе-
диницы и в отсутствие аллолактозы связывается с оператором
лактозного оперона, блокируя транскрипцию генов оперона.
Аллолактоза же, связываясь с репрессором, снижает его срод-
ство к оператору, что деблокирует гены. Таким образом, при по-
явлении вне клетки лактозы происходит активация лактозного
оперона и интенсивное образование в клетке ферментов утили-
зации лактозы.
100
Глава 2
Но это имеет место только тогда, когда во внешней^ среде нет
глюкозы. Если же там достаточно глюкозы, то биологического
смысла в использовании лактозы уже нет. В соответствии
с этим, глюкоза препятствует активации лактозного» оперона
даже в присутствии больших количеств лактозы.
Достигается это путем влияния на связывание Р ИК-поли-
меразы с промотором. Дело в том, что промоторнав область
в лактозном опероне (и в сходных с ним оперонах) цтире, чем
обычно, и способна связывать не только РНК-поЛимеразу,
но и особый белок - CAP (catabolite gene activator protein), бел-
ковый активатор катаболизма.
В отсутствие САР РНК-полимераза очень плохо связывает-
ся с промотором лактозного оперона, а САР изменяет структуру
промотора, резко повышая его сродство к РНК-поЛимеразе.
По существу, САР играет у бактерий примерно ту же роль, что
общие факторы транскрипции у эукариот (п. 2.2.1.2 ). Только
САР необходим для деятельности лишь некоторых Оперонов,
тогда как общие факторы транскрипции — для функционирова-
ния любого гена эукариот.
Связывание САР с промотором происходит, только если
САР находится в комплексе с циклическим АМФ (цА^МФ). По-
следний же образуется из АТФ под влиянием фермен та адени-
латциклазы.
В отсутствие глюкозы активность аденилатциклб»зы высо-
кая, в клетке — достаточная концентрация цАМФ, поэтому
САР связан с лактозным промотором, к которому легк^о присое-
диняется РНК-полимераза. В этих условиях активности» оперона
зависит только от того, свободен или нет оператор, т. е - от нали-
чия во внешней среде лактозы.
Если же имеется глюкоза, то активность аденилалциклазы
оказывается сниженной, отчего в итоге промотор остается без
САР и практически теряет сродство к РНК-полимеразе^- Лактоз-
ный оперон не функционирует, а в качестве питатель-ного суб-
страта используется глюкоза.
До сих пор мы упоминали два фермента лактозного опе-
рона — пермеазу и р-галактозидазу. Третий ген оперон Ja кодиру-
ет трансацетилазу — фермент, катализирующий in. vitro ацети-
лирование тиогалактозида. Имеет ли трансацетилаза вакое-ли-
бо отношение к обмену лактозы и почему ее ген находится в лак-
тозном опероне, неясно.
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
101
2.3.2.2. Триптофановый оперон - - пример
репрессибельных оперонов
В триптофановом опероне, как и в лактозном, тоже имеется
двойной механизм регуляции. Во-первых, как обычно, регули-
руется перемещение РНК-полимеразы по оператору. Вторым же
(и более чувствительным) объектом регуляции является не свя-
зывание РНК-полимеразы с промотором, а окончание тран-
скрипции на аттенюаторе.
Напомним (п. 2.2.1.2): аттенюатор — это присутствующий
в некоторых оперонах участок ДНК между оператором и гена-
ми, на котором при определенных условиях прекращается тран-
скрипция оперона.
Как правило, опероны, имеющие аттенюатор, являются ре-
прессибельными и контролируют синтез (анаболизм) того или
иного необходимого компонента — например, редкой аминоки-
слоты: триптофана, гистидина, фенилаланина.
Пр - "ром'^ср. о — он$ра »ор, л оед*эд »( а. ~ втте
юатор; Н - белок-репрессор, Е — ?ЙЙ1 -полимераза, ЙЙ — лидермьн
яети.д, Е; .... Eg • фермс>*»ь1 синтеза триптофана, .
— р4 литы пути синтеза триптофан '
102
Глава 2
Триптофановый оперон (рис. 2.9) включает 5 цистронов,
кодирующих четыре фермента заключительного этапа образо-
вания триптофана. При этом последний фермент содержит
субъединицы двух видов, отчего кодируется двумя цистронами.
Вместе с тем, ген предпоследнего фермента цепочки, по-видимо-
му, находится где-то вне данного оперона.
Вслед за промотором и оператором в оперонах этого типа
находится т. н. лидерный отдел; именно он оканчивается атте-
нюатором.
В процессе транскрипции этого отдела образуется лидер-
ный участок мРНК. Последний тут же связывает рибосому и на-
чинает трансляцию с образованием лидерного пептида (ЛП).
Ключевая особенность последнего — среди его 14 аминокислот-
ных остатков содержатся 2 остатка триптофана, т. е. той самой
аминокислоты, синтез которой контролируется опероном.
Аналогично, в ЛП фенилаланинового оперона среди 15 ос-
татков — 7 остатков фенилаланина, а в ЛП гистидинового опе-
рона — 7 подряд остатков гистидина. Так что механизм атте-
нюаторной регуляции во всех этих случаях одинаков.
Вернемся к триптофановому оперону. Когда в клетке доста-
точно триптофана, то синтез лидерного пептида идет без за-
держки: образующая его рибосома не отстает от РНК-полимера-
зы. В этих условиях при достижении РНК полимеразой атте-
нюатора с высокой долей вероятности срабатывает сигнал об
окончании транскрипции. РНК-полимераза диссоциирует от
ДНК и гены не считываются.
Таким образом, триптофан, быстро включаясь в лидерный
пептид, блокирует через аттенюаторный механизм синтез фер-
ментов, необходимых для его образования. Правда, блокирова-
ние это — не полное, т. к. сохраняется небольшая вероятность
того, что РНК полимераза все же преодолеет аттенюаторный
участок.
Если, наоборот, концентрация триптофана в клетке низ-
кая, то рибосома задерживается с синтезом лидерного пептида
и отстает от РНК-полимеразы. Это так меняет конфигурацию
ДНК или лидерного отдела мРНК, что сигнал об окончании
трансляции на аттенюаторе не срабатывает. Каждая молекула
РНК-полимеразы проходит этот «опасный» участок и транскри-
бирует гены. Т. е. активно синтезируются ферменты, необходи-
мые для пополнения запаса триптофана в клетке.
Заметим: содержание триптофана в самих этих ферментах
весьма невелико. Поэтому его дефицит в клетке не очень сильно
сказывается на скорости трансляции структурных цистронов
мРНК (в отличие от синтеза лидерного пептида).
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
103
Итак, через аттенюаторный механизм триптофан может по-
давлять активность «своего» оперона, но, как было сказано,
не до конца.
Более глубокое подавление активности оперона происходит
при очень высокой концентрации триптофана. Тогда реализует-
ся второй (и более общий) способ регуляции. Триптофан связы-
вается со специфическим белком-репрессором и повышает его
сродство к оператору триптофанового оперона. Это полностью
блокирует данный оперон.
2.4. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО
МАТЕРИАЛА У ЭУКАРИОТ
2.4.1. Гены ряда белков и РНК
Теперь обратимся к эукариотам.
Как мы знаем (п. 2.2.1.1), одна из отличительных черт мно-
гих генов эукариот — наличие в их составе некодирующих
участков — интронов.
Другая особенность состоит в том, что наряду с уникальны-
ми генами (представленными в гаплоидном геноме единичным
числом копий) встречаются многократно повторяющиеся гены.
Чтобы проиллюстрировать эти две особенности, рассмо-
трим некоторые конкретные гены.
2.4.1.1. Гены гистонов
Гистоны — основные (по кислотно-щелочным свой-
ствам) белки, участвующие в формировании нуклеосомной
структуры хроматина (п. 1.1.2.2). Каждый из пяти видов эт-
их белков (Hl, Н2А, Н2В, НЗ и Н4) кодируется соответству-
ющим геном.
Вот характерные черты организации этих генов (рис. 2.10).
а) Все пять гистоновых генов сгруппированы в единый
кластер длиной примерно в 6900 н. п.
б) Такие кластеры повторяются в геноме многократно:
у человека — примерно 35 раз (в гаплоидном наборе хромосом),
а у морского ежа 300 1000 раз. Это ускоряет скорость синте-
за гистонов в S фазе клеточного цикла.
В хромосоме кластеры следуют тандемно друг за другом.
в) В разных кластерах однотипные гистоновые гены, видимо,
не всегда полностью идентичны. Поэтому и сами гистоны (Hl, Н2А
и Н2В) — это группы очень сходных, но все же разных белков.
104
Глава 2
КЛАСТЕР ГИСТОНОВЫХ I ЕНОВ
Кодирующая
цепь ДНК
5' --------
3' -
Матричная
цепь ДНК
Ген Н1 ГенН4 ГенН2В Ген ИЗ Ген Н2А Ген Н1
•ш у»:*:
ТРАНСКРИПЦИЯ
Пре-мРНК 5' -----Н------Н------1--1---Н------- 3'
Рис. 5, HJ. Гены гис.' оновь * Га
г) Во всех кластерах гены располагаются в одной и той же
последовательности и разделены между собой спейсерами.
На спейсеры приходится около 70 % всей длины кластера.
д) Важная особенность гистоновых генов отсутствие
в них интронов (чем они отличаются от подавляющего большин-
ства генов эукариот).
Другая особенность — относительно высокое содержание
пар ГЦ: так, в гене НЗ оно равно 0,52, а в среднем по всей ДНК
человека — 0,39.
е) У человека и большинства других эукариот во всех пяти
гистоновых генах в качестве кодирующей выступает одна и та
же цепь ДНК.
У дрозофилы же, как уже отмечалось (п. 2.2.2.1), в класте-
ре гистоновых генов в трех случаях (гены Hl, Н2А и НЗ) коди-
рующей является одна цепь, а в двух остальных случаях (гены
Н2В и Н4) — другая цепь. При этом гены расположены в таком
порядке (Hl, Н2В, Н2А, Н4, НЗ), что гены с противоположной
ориентацией правильно чередуются друг с другом.
ж) Исключая дрозофилу, у эукариот кластер гистоновых
генов транскрибируется как единое целое — в виде одной длин-
ной пре-мРНК, которая содержит информацию о всех пяти ги-
стоновых белках.
Но при созревании этой пре мРНК она разрезается на пять
отдельных гистоновых мРНК.
В случае же дрозофилы гены гистонов должны транскриби-
роваться по отдельности, причем в разных направлениях.
2 4.1.2. Гены рибосомных РНК
Как уже упоминалось (п. 2.1), в состав рибосом входят
рРНК четырех видов. Данные РНК различаются по константе
седиментации; в соответствии с этим их и обозначают:
ЯДРО' экспрессия генов и транскрипционные факторы
105
КЛАСТЕР ГЕНОВ рРНК
Кодирующая Ген Ген
цепь ДНК 18S-pPHK 5,8S-pPHK
Матричная
цепь ДНК
Ген
28S-pPHK
Ген
18S-pPHK
ТРАНСКРИПЦИЯ
Пре-рРНК
РИС. 2.11. тер т< ИЙ* 1-FHK
5S-pPHK, 5.8S-pPHK, 18S-pPHK, 28S-pPHK.
а) Гены всех рРНК локализуются в ядрышковых организа-
торах (и. 1.1.3), т. е. тех участках хромосом, которые ассоци
ированы с ядрышками.
При этом ген самой маленькой рРНК (5S-pPHK) располага
ется отдельно от генов прочих рРНК. А гены остальных трех
рРНК объединены в кластер (рис. 2.11).
б) Подобно гистоновым генам, гены рРНК представлены
большим числом копий. У человека количество копий (в расче-
те на гаплоидный геном) примерно равно 100, у лягушки в сома-
тических клетках — около 900.
В созревающих же ооцитах лягушки происходит избира-
тельное и резкое увеличение числа генов рРНК (т. н амплифи-
кация) — до 2 млн копий на ядро.
в) Другое сходство с гистоновыми генами состоит в отсут-
ствии интронов, а также в более высоком (чем в среднем по
ДНК) относительном содержании пар ГЦ.
г) Длина кластера трех генов рРНК — примерно 8000 н. п.
В кластере гены разделены двумя спейсерами, но особенно ве-
лик спейсер между соседними кластерами — около 5000 н. п.
д) Каждый кластер вновь (подобно кластеру гистоновых
генов) транскрибируется как единое целое: образуется одна мо
лекула пре-рРНК, содержащая (помимо спейсеров) последова
тельности всех трех рРНК.
Таким образом, организация генов рРНК и гистонов явля-
ется весьма сходной.
2 4 13. Гены, гемоглобина
В норме, как известно, встречаются 4 вида гемоглобина
(НЬ), в состав которых входят субъединицы 5 видов:
106
Глава 2
Вид НЬ: НЬ А НЬ А2 НЬ эмбриона НЬ F
(Гемоглобин взрослых) (НЬ плода)
Субъеди- ничный
состав: ®2р2 а2^2 С^2^2 <Ыг
Причем в НЬ F у-цепи бывают двух видов: у° и ул (отличие —
по одному аминокислотному остатку).
Соответственно, белковая часть НЬ кодируется шестью ге-
нами а, Р, б, £, у- и у'. (Кроме того, несколько генов кодируют
ферменты синтеза гема — небелкового компонента НЬ.)
а) В отличие от предыдущих генов, гены НЬ считаются
уникальными: представлены очень небольшим числом копий.
б) При этом a-ген глобина находится в иной хромосоме, не-
жели прочие глобиновые гены, и повторяется в этой хромосоме
дважды.
А четыре глобиновых гена — у1, уА 8 и Р — объединены
в кластер (рис. 2.12), который тоже повторяется лишь несколь-
ко раз.
Такое расположение генов может иметь два не исключаю-
щих друг друга объяснения.
Во первых, гены, входящие в кластер, видимо, образова-
лись в эволюции из одного гена, который несколько раз удвоил-
ся. После этого его копии эволюционировали каждая по-своему.
Во-вторых, субъединицы, кодируемые этими генами, в от-
личие от a-цепей, входят в состав лишь какого-то одного вида
НЬ, который образуется на определенной стадии онтогенеза. Co-
Д. K'lU'lEP Г1ОЫ1НОВЫХ ГЕНОВ
Кодирующая
цепь ДНК
Сен 5
Ии грон
ШЗМ
Инг рои
Рис. 2.12, Четыре из шести глобиновых генов
ЯДРО' экспрессия генов и транскрипционные факторы
107
седство соответствующих генов может облегчать переключение
активности с одного гена на другой.
в) В глобиновом кластере весьма велики три спейсерных
участка: варьируя от 4000 до 14 000 н. п., они составляют боль-
шую часть длины кластера.
А внутри генов содержатся довольно протяженные интро-
ны: в гене р их два — с длиной 120 и 555 н. п.
г) Транскрибируются гены глобинового кластера, очевид-
но, по отдельности друг от друга (поскольку их экспрессия про-
исходит на разных стадиях онтогенеза).
Таковы краткие сведения об организации трех групп генов
эукариот.
2.4.2. Транскрипционные факторы и репрессоры
На функционирование генов оказывают влияние очень
многие белки. Причем это влияние не укладывается в те относи-
тельно простые схемы оперонной регуляции, которые реализу-
ются у бактерий.
Так, в последние годы выявлено и описано большое количе-
ство белков, обладающих свойствами транскрипционных фак
торов или репрессоров (либо тех и других сразу) При этом они
вступают в разнообразные взаимоотношения друг с другом,
а также с прочими веществами, от чего зависит конечное влия-
ние на активность генов.
Иными словами, подобно сложной сети из сотен метаболиче-
ских превращений, в клетках эукариот имеется не менее слож-
ная сеть регуляторных взаимоотношений. Полной картины этой
сети пока нет, но отдельные фрагменты ее уже известны.
В данную сеть, как только что было сказано, вовлечены не
только белки, непосредственно взаимодействующие с ДНК,
но и многие другие вещества — внеклеточные сигнальные веще-
ства (в т. ч. гормоны), клеточные и внутриклеточные рецепто
ры, внутриклеточные посредники (медиаторы). К тому же дале-
ко не каждое регуляторное воздействие имеет своим конечным
эффектом изменение активности генов.
По всем этим причинам регуляторные взаимоотношения
у эукариот требуют отдельного рассмотрения, которое будет
предпринято в главах 4 и 5.
Здесь же мы кратко осветим только те моменты, которые
касаются ДНК связывающих белков, выступающих в качестве
транскрипционных факторов или репрессоров. Таким образом,
читатель должен иметь в виду, что речь будет идти лишь о ко-
нечном звене сложных регуляторных цепей.
108
Глава 2
2.4 2 1 Подразделение ДНК-связывающих белков по их
структуре
В разных ДНК-связывающих белках подчас встречаются
сходные структурные элементы По этому признаку выделяют
несколько семейств таких белков. Однако надо заметить, что не
каждый ДНК-связывающий белок удается отнести к тому или
иному семейству.
а) Белки, содержащие мотив «спираль поворот спираль».
В этих белках (рис. 2.13) ДНК-узнающий участок (соста-
вляющий небольшую часть белка) включает две а-спирали, сое-
диненные петлей. Из них одна спираль непосредственно связы-
вается с ДНК, специфически взаимодействуя с определенной по-
следовательностью нуклеотидных пар.
В белке — две одинаковые субъединицы, которые одновре-
менно участвуют во взаимодействии с ДНК Это оказывается
возможным благодаря тому, что соответствующая нуклеоти-
дная последовательность ДНК является палиндромной, т. е.,
с учетом полярности цепей, читается одинаково с обеих сторон.
(С палиндромами мы уже сталкивались в п. 1.6.2.3.)
Особенно распространены подобные белки у прокариот,
имеются в виду белки-репрессоры.
Нижеследующие же семейства белков характерны, видимо,
лишь для эукариот.
б) Белки, содержащие гомеодомены.
Эти белки продукты т. н. гомейотических генов эука-
риот, т. е. генов, ответственных за эмбриональное развитие
Палиндромиый участок ДНК
5 Т АТЦ А-Ц-Ц Г ЦЦ А Г Т Г Г Т А . 3'
3' А-Т-А-Г-Т-Г Г-ЦЧ'-Г-Т Д-А-Ц Ц-А-Т 5'
Две субъединицы белка
Рив. ЕЛб. Жзчимодеист»и»ДНК и бея“а, содержащего мотив
спирале поворо, спирал* ♦
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
109
Р»Ю. 2Л4. ГемгодсмонныЙОлек
С помощью данных белков осуществляется управление развити-
ем путем включения одних и выключения других генов.
Отличительная черта этих белков — наличие в них одно-
типных доменов, называемых (по функции кодирующих генов)
гомеодоменами (рис. 2.14).
Как известно, домены — эта фрагменты белковой субъе-
диницы, имеющие относительно самостоятельную третичную
структуру. Иными словами, в этом случае единая полипепти-
дная цепь при сворачивании в третичную структуру образует
не одну большую, а несколько более мелких глобулоподоб-
ных частиц, связанных между собой «линкерными» участка-
ми цепи.
Доменная организация встречается только у достаточно
крупных субъединиц (белков) — содержащих не менее 200 ами-
нокислотных остатков. Фрагменты гена, кодирующие разные
домены белка, обязательно разделены интронами, т. е. предста-
вляют собой разные экзоны
В случае гомейотических генов такие экзоны называются го-
меобоксами. Следовательно, гомеобокс — это экзон гомейотиче-
ского гена, кодирующий гомеодомен соответствующего белка.
Гомеодомен образован примерно 60 аминокислотными ос
татками. По структуре же он напоминает белки-рйпрессоры про-
кариот, т. е. тоже имеет мотив « спира ль-поворот-спира ль».
И точно так же одна из а-спиралей этого мотива специфически
взаимодействует с определенными участками ДНК.
110
Глава 2
Гомеодомены разных белков данного семейства весьма
сходны друг с другом, что свидетельствует об общности их про-
исхождения. Возможно, они действительно произошли от бел-
ков-репрессоров прокариот. Но при этом каждый из гомеобел-
ков оказывает воздействие не на отдельный оперон, а на гораздо
большую совокупность генов.
Действительно, в процессе развития происходят масштаб-
ные изменения пространственной структуры больших фрагмен-
тов хромосом. Какие-то из этих фрагментов переходят в состоя-
ние гетерохроматина, другие — наоборот, в состояние эухрома-
тина.
Между прочим, отсюда следует, что и в гетерохроматине
должны иметься последовательности ДНК, доступные для узна-
вания гомеодоменными белками.
в) Белки, содержащие «цинковые пальцы».
Белки данного семейства имеют пальцеобразные структуры
(рис. 2.15). Каждая из последних стабилизирована атомом цин-
ка, который образует четыре координационные связи с двумя
остатками цистеина и двумя остатками гистидина пептидной
цепи.
На внешней поверхности «пальца» находится а-спираль,
специфически узнающая определенную последовательность ну-
клеотидных пар ДНК.
Количество «пальцев» у разных белков неодинаково и по-
рой достигает нескольких десятков.
К данному семейству относятся многие регуляторные белки
эукариот. В том числе внутриклеточные белки-рецепторы
стероидных гормонов. Связав соответствующий гормон, далее
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
111
такой рецептор взаимо-
действует «цинковыми
пальцами» со «своим»
энхансером в составе
ДНК, что меняет тран-
скрипционную актив-
ность определенных ге-
нов.
г) Белки, содержа-
щие лейциновую «за-
стежку».
Данные белки (рис.
2.16) состоят из двух су-
бъединиц, но последние
могут отличаться друг от
друга.
Главная особенность
заключается в способе соединения субъединиц друг с другом —
это, в основном, гидрофобные связи между остатками лейцина.
В участке же связывания с ДНК белок богат основными
аминокислотами — аргинином и лизином. Это свидетельствует
о том, что во взаимодействии с ДНК важно не столько специфи-
ческое узнавание белком определенных последовательностей
нуклеотидных пар (если таковое вообще имеет место), сколько
замыкание ионных связей с фосфатными группами ДНК.
За счет чего же белок специфично взаимодействует с нуж-
ным участком ДНК? Видимо, все определяется отчасти трехмер-
ной структурой этого участка, а главное его белковым окру
жением. Иначе говоря, связывающийся белок органично впи-
сывается в ту пространственную структуру (создаваемую макро-
молекулами), которая имеется в районе данного локуса ДНК.
Ионные же связи просто закрепляют результат этого «вписыва-
ния».
К данному семейству относятся многие из транскрипцион-
ных факторов эукариот. Т. е. те самые белки, которые, как мы
знаем (п. 2.2.1.2), взаимодействуя с ДНК, одновременно образу-
ют сложные комплексы друг с другом.
Как и гомеодоменные белки, рассматриваемые белки, ви-
димо, тоже имеют бактериальные «прототипы» — например,
Димерный белок САР (белковый активатор катаболизма;
п. 2.3.2.1).
Вышесказанное подводит к следующему предположению.
Чем тоньше регуляция (т. е. чем меньше ее масштаб или
чем меньше у регуляторного белка генов-мишеней), тем боль-
112
Глава 2
шее значение имеет пространственная структура регулируемого
участка хромосомы.
2.4.2.2. Общие факторы транскрипции
Теперь познакомимся с некоторыми конкретными предста-
вителями транскрипционных факторов и репрессоров. Начнем
с общих факторов транскрипции.
Как отмечалось в п. 2.2.1.2, это такие транскрипционные
факторы, которые необходимы для связывания РНК полимера-
зы с промотором (см. рис. 2.5 и 2.17), причем и сами тоже взаи-
модействуют с промотором.
Там же упоминалось, что в составе промоторов имеются не-
которые характерные последовательности нуклеотидных пар,
называемые боксами. Наиболее часто (у 80 % промоторов эука-
риот) встречается ТАТА-бокс; несколько реже — ГЦ-, ЦААТ-
и другие боксы. Очередность их расположения в разных промо-
торах неодинакова: в одних случаях ГЦ-бокс предшествует
ТАТА-боксу (как показано на рис. 2.17), в других — наоборот,
следует после него.
В области ТАТА-бокса с промотором вначале связывается
т. н. ТВР-белок (от TATA-Binding Protein). Это инициирует при-
соединение нескольких (восьми или более) TAF-белков (от ТВР-
Associated Factors).
Эти-то белки — ТВР и TAF — и называются общими факто-
рами транскрипции, поскольку присутствуют во всех клетках
и абсолютно необходимы для транскрипции большинства генов.
Fhc. 2; 17. S’Ksp-S'iBfcMM-* ^*щимитранскрипции
к •мпг*коз
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
113
Комплекс же данных белков кратко обозначают TFIID
(Transcriptional Factor D for polymerase II). Из обозначения сле-
дует, что эти белки необходимы для связывания с промотором
РНК-полимеразы II. Вместе с ней совокупность всех этих бел-
ков, связанная с промотором, называется основным инициатор-
ным комплексом.
Если же ген транскрибируется РНК-полимеразой I или III,
его промотор содержит вместо ТАТА-бокса какую-то иную после-
довательность и используются другие факторы транскрипции.
Кроме общих факторов, для эффективной работы гена
необходимы и другие белки. Так, с ГЦ-боксом промотора связы-
вается Spl-белок, с ЦААТ-боксом — еще один белок. Известны
и такие транскрипционные коактиваторы, как белки СВР
и рЗОО. Комплекс рЗОО/СВР ацетилирует гистоны. Возможно,
это способствует вытеснению с промоторной области ДНК ну-
клеосом и тем самым обеспечивает саму возможность формиро-
вания основного инициаторного комплекса.
Более же тонкая регуляция активности гена осуществляет-
ся прочими транскрипционными факторами — теми, которые
связываются вне промотора, т. е. с энхансерами.
2.4.2.3. Белок р53 как транскрипционный фактор
Среди большого числа уже открытых транскрипционных
факторов наиболее известен, пожалуй, белок р53. Это объясня-
ется тем, что он контролирует исключительно важные клеточ-
ные процессы и, благодаря этому, вовлечен в большое количе-
ство всевозможных регуляторных цепей.
а) Функциональная роль.
Белок р53 (или его ген) активируется в ответ на разнообраз-
ные повреждения клеточной структуры
нерепарированные разрывы и другие повреждения
ДНК,
- нарушение расхождения хромосом в митозе,
- разрушение микротрубочек и т. д.
Сам же белок р53 регулирует активность, по крайней мере,
трех групп генов:
1) активирует гены (Р21, GADD45 и др.), отвечающие за
остановку клеточного деления;
2) активирует гены (ВАХ, KILLER DR5, PIG и др.), запу-
скающие апоптоз — процесс, ведущий, путем активации спе-
циальных ферментов, к гибели клетки; а также репрессирует
гены (BCL2, RELA), сдерживающие апоптоз (подробней об
этом в главе 6);
114
Глава 2
Рис. 2.18. Схема доменной структуры мономера белка р53
3) активирует гены (TSP1, BAI1 и др.), тормозящие ангио-
генез (образование новых сосудов).
В итоге через посредничество белка р53 клетка в ответ на
повреждения своей структуры
либо задерживается на той или иной стадии митотиче-
ского цикла и исправляет эти повреждения;
— либо (при невозможности исправлений) вообще прекра-
щает деления и вступает в процесс клеточного старения
(фаза III по Хейфлику; пп. 1 4.1.3 и 1.4.2.3);
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
115
— либо (при потенциальной опасности поврежденной клет-
ки для ее окружения) осуществляет апоптоз, т. е., по-
просту говоря, самоубийство.
В частности, апоптозу, помимо прочих, подвергаются
и клетки, в которых произошла опухолевая трансформация.
В этой связи понятно, почему одновременно тормозится ангио-
генез: это еще один способ ограничения опухолевого роста.
Поэтому белок р53 — один из наиболее важных опухоле-
вых супрессоров. В большинстве же развивающихся опухолей
функции белка р53 оказываются в том или ином отношении на-
рушены.
Такова общая биологическая роль белка р53. А теперь рас-
смотрим некоторые связанные с ним вопросы более детально.
б) Структура белка р53
Белок р53 не входит ни в одно из тех семейств ДНК-связы-
вающих белков, которые были описаны в п. 2.4.2.1. В его моле-
куле — 392 аминокислотных остатка, образующих шесть раз-
личных по размеру и функции доменов (рис. 2.18).
Центральный и самый большой домен (включающий около
200 остатков) отвечает за узнавание энхансеров генов-мишеней
и связывание с ними.
А самый первый от N-конца (N-концевой) домен участвует
во взаимодействии с общими факторами транскрипции, т. е.
с комплексом TFIID (п. 2.4.2.2). Иными словами, именно два
названных домена обеспечивают правильное связывание белка
р53 с его основными партнерами.
Но это связывание находится под контролем многочислен-
ных факторов
Так, в том же N-домене имеется локус связывания с бел-
ком-ингибитором Mdm2, блокирующим взаимодействие с ком-
плексом TFIID. И здесь же присутствуют остатки серина и трео
нина, которые могут фосфорилироваться специальными проте-
ннкиназами (ДНК протеинкиназой, белком ATM и др.).
Эти киназы активируются при повреждениях ДНК и дру-
гих структур клетки. Их действие на N домен, а также, видимо,
на сам ингибитор Mdm2 высвобождает данный домен из-под
блокирующего влияния: он приобретает способность взаимодей-
ствовать с комплексом TFIID.
Взаимодействие центрального домена с энхансером тоже
находится под контролем, который вновь осуществляется путем
модификации. Но непосредственным объектом модификации
является не центральный, а С-концевой (он же щелочной) до-
мен. Причем сама модификация является более многообразной:
это не только фосфорилирование, но также ацетилирование
116
Глава 2
и гликозилирование (что также осуществляется специальными
ферментами).
Если С-концевой домен не модифицирован, центральный
домен не способен взаимодействовать с ДНК-мишенью. Моди-
фикация же С-домена не только придает белку р53 такую спо-
собность, но и влияет на его специфичность. Дело в том, что р53-
зависимые энхансеры (относящиеся к разным генам) несколько
различаются последовательностью нуклеотидных пар. И от ви-
да модификации С-домена зависит, с какими конкретно энхан-
серами будет связываться белок рбЗ, а с какими — нет.
Таким образом, с помощью модификации двух концевых
(N— и С-) доменов белок р53 получает (от очень многочисленных
«источников») информацию о состоянии клетки, перерабатывает
ее путем изменения своей конфигурации и надлежащим образом
реагирует как транскрипционный фактор определенных генов.
С-концевой домен выполняет еще одну функцию. Как отме-
чалось выше, некоторые гены (BCL2, KELA) белком р53 не акти-
вируются, а репрессируются. Это действие, как считают, осу-
ществляется С-доменом. При этом последний (вместо N-домена)
связывается с комплексом TFIID и подавляет его активность.
Достаточно важна функция и остальных частей белка р53.
Так, в клетке его молекулы образуют друг с другом тетрамер-
ные комплексы: это обычное состояние белка независимо от
уровня его активности. За образование же комплексов отвечает
а-спиральный домен предшествующий С-концевому домену.
В мономерном состоянии белок р53 не способен к активации.
Между центральным и а-спиральным доменами находится
функционально важный линкерный (связующий) участок. По-
лагают, что он необходим для проникновения новосинтезиро-
ванного белка р53 из цитоплазмы в ядро.
Наконец, между N-концевым и центральным доменами распо-
ложены еще два небольших домена, один из которых богат остатка-
ми пролина. Оба они участвуют в активации тех или иных мишеней.
Таким образом, структура белка р53 весьма сложна, что
вполне соответствует его крайне важной функциональной роли.
в) Обмен белка р53.
В клетках белок рбЗ постоянно синтезируется и так же по-
стоянно разрушается. Поэтому в клетках большинства тканей
средняя продолжительность жизни молекул белка и их стацио-
нарная концентрация оказываются весьма низкими.
Но при стрессах и повреждениях клетки скорость деграда-
ции белка рбЗ замедляется, что приводит к увеличению его кон-
центрации. Иными словами, используются два способа включе-
ния белка р53 в «работу»:
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
117
повышение его содержания (путем снижения скорости
распада)и
повышение активности (путем модификации).
Заметим: в случае подавляющего большинства других бел-
ков увеличение концентрации достигается иным способом —
путем активации гена и, следовательно, скорости синтеза белка.
Ген же р53, как мы видим, достаточно активно функционирует
практически всегда.
Известны лишь единичные ситуации существенной его ак-
тивации по сравнению с обычным уровнем. Это ранний эмбрио-
генез, а также развитие эмбриональной тератокарциномы.
2.5 СТРУКТУРА РНК
Все транскрипционные факторы, как и сама транскрипция,
призваны обеспечить только одно — образование с нужной ско-
ростью РНК на тех или иных участках хромосом.
Прежде чем говорить о механизме данного процесса, крат-
ко охарактеризуем строение разных видов РНК. Это необходи-
мо, чтобы понять особенности транскрипции и феномен созрева-
ния новосинтезированных молекул РНК.
2.5.1. Общий план строения РНК
Как и ДНК (п. 1.1.2.1), РНК (рис. 2.19) представляют собой
линейные (т. е. неразветвленные) полинуклеотиды с тем же
принципом организации:
— состоят из четырех видов нуклеотидов, каждое из которых
включает азотистое основание, пентозу и фосфатный остаток;
нуклеотиды связаны в цепь с помощью 5',3'-фосфоди-
эфирных связей;
- полинуклеотидные цепи полярны, т. е. имеют различи-
мые 5’- и 3’-концы.
Но имеются и отличия от ДНК. Главное из них — то, что мо-
лекулы РНК (кроме РНК некоторых вирусов) являются не двух-,
а одноцепочечными. Причиной служат следующие три особен-
ности первичной структуры.
а) Во-первых, пентоза в РНК — это не дезоксирибоза, а ри-
боза, которая содержит дополнительную гидроксигруппу. По-
следняя делает двухцепочечную структуру менее компактной.
б) Во вторых, среди четырех главных, или мажорных, азо-
тистых оснований вместо тимина содержится урацил, отличаю
щийся от тимина лишь отсутствием метильной группы в 5-м по-
ложении.
118
Глава 2
Рис 2. И О"шая схема
стрлени» ;-НК
родную связь; следовательно,
не может.
Но, как уже отмечалось
в п. 1.6.1.1, благодаря этому
уменьшается сила гидрофобно-
го взаимодействия в компле-
ментарной паре А-У. Что тоже
снижает вероятность образова-
ния устойчивых двухцепочеч-
ных молекул.
в) Наконец, в РНК (осо-
бенно в тРНК) высоко содер-
жание т. н. минорных основа
ний и нуклеозидов. Среди
них дигидроуридин (в ура-
циле нет одной двойной свя-
зи), псевдоуридин (урацил
иначе, чем обычно, связан
с рибозой), диметиладенин
и диметилгуанин (в азоти
стых основаниях — по две до-
полнительных метильных
группы) и многие другие.
Почти все эти основания
не могут участвовать в компле-
ментарных взаимодействиях.
Так, метильные группы в ди-
метиладенине (в отличие от ти-
мина и 5-метилцитозина) нахо-
дятся при таком атоме, кото-
рый в паре A-У образует водо-
теперь данная связь замкнуться
Это тоже препятствует образованию двухцепочечных мо-
лекул.
Таким образом, широко известные отличия состава РНК от
ДНК имеют огромное биологическое значение: ведь свою функ-
цию молекулы РНК способны выполнять только в одноцепочеч
ном состоянии. Наиболее очевидно это для мРНК: трудно пред-
ставить, как бы могла двухцепочечная молекула транслиро-
ваться на рибосомах.
Вместе с тем, оставаясь одиночной, в некоторых участках
цепь РНК может образовывать петли, или «шпильки », с двухце-
почечной структурой (рис. 2 20).
Эта структура стабилизирована взаимодействием основа-
ний в парах А:::У и Г:::Ц. Однако могут образовываться и «не-
ЯДРО' экспрессия генов и транскрипционные факторы
119
Гис. 2.2{'. «Шгшпькз > вце
nt* ГНК
правильные» пары (например,
Г-*-«У), а в некоторых местах
«шпильки» и вообще не происхо-
дит никакого взаимодействия.
В составе таких петель может
содержаться (особенно в тРНК
и рРНК) до 50 % всех нуклеотидов.
Общее же содержание нуклео-
тидов в РНК варьирует от 75 еди-
ниц до многих тысяч. Но даже са-
мые крупные РНК на несколько по
рядков короче хромосомных ДНК.
Теперь обратимся к особенно-
стям структуры трех классов
РНК — мРНК, тРНК и рРНК.
2.5.2. Особенности строения мРНК
Поскольку каждая мРНК содержит информацию о составе
той или иной полипептидной цепи, количество разных мРНК
в клетке очень велико
Несмотря на это, имеют место два обстоятельства. Во-пер-
вых, все эти мРНК составляют лишь небольшую часть общей
массы РНК в клетке — около 5 %. Во-вторых, при всем своем
многообразии, зрелые мРНК имеют сходный план строения. Он
состоит в том, что линейная цепь мРНК содержит несколько
областей с различной функциональной ролью (рис. 2.21).
а) На 5’-конце находится т. н. «колпачок», или кэп — уча-
сток из одного-четырех модифицированных нуклеотидов, на
пример:
(7-метил-Г)— ф-ф-ф-(2-О-метил-Х)-ф-(2-О -метил-У)-ф-
Первым всегда идет 7-метилгуанилат. Причем с очередным
нуклеотидом он связан пирофосфатной связью. Несколько еле
дующих нуклеотидов могут быть метилированы по 2" положе-
нию рибозы. Такая необычная структура призвана защищать
5’ конец мРНК от экзонуклеаз.
б) За «колпачком» иде 5'-нетранслируемыи участок по
следовательность из нескольких десятков нуклеотидов. Она
комплементарна одному из отделов той рРНК, которая входит
в малую субъединицу рибосомы. За счет этого она служит для
120
Глава 2
Рйс. 2.21, Сг'стйиыа «аст* зр»-
л-ймРНК
первичного связывания
мРНК с рибосомой, но сама,
как видно из названия,
не транслируется.
в) Трансляция же (счи-
тывание) мРНК начинается
всегда с т. н. инициирующего
кодона Во всех мРНК он
всегда один и тот же — АУГ,
т. е. в соответствии с табл. 2.1
(п. 2.2.2.3), кодирует метио-
нин. Поэтому после синтеза
пептидной цепи с е N-конца,
как правило, отщепляется
метионин (если последний не
нужен для функционирова-
ния белка).
г) За инициирующим
кодоном в мРНК следует ко-
дирующая часть, которая,
собственно, и содержит ин-
формацию о последовательно-
сти аминокислот в белке.
У эукариот зрелые мРНК
являются моноцистронными,
т. е. каждая из них несет ин-
формацию о структуре только
одной полипептидной цепи.
Другое дело, что иногда пептидная цепь вскоре после обра-
зования на рибосоме разрезается на несколько более мелких це-
пей. Так бывает, например, при синтезе инсулина и целого ряда
олигопептидных гормонов.
В отличие от эукариот, у бактерий мРНК — полицистрон-
ные (как было показано на рис. 2.7-2.9), и в таком виде они
транслируются рибосомами: на разных цистронах мРНК одно-
временно синтезируются разные полипептидные цепи.
И у прокариот, и у эукариот кодирующая часть зрелой
мРНК лишена интронов — каких-либо вставочных некодирую-
щих последовательностей. Иными словами, имеется непрерыв-
ная последовательность смысловых кодонов, которая должна
читаться в направлении 5’->3’.
д) По окончании этой последовательности находится кодон
терминации — один из трех «бессмысленных» кодонов: УАА,
УАГ или УГА (см. табл. 2.1).
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
121
е) За этим кодоном может следовать еще 3 -нетранслируе-
мын участок значительно превышающий по длине 5’-нетран
слируемую область.
ж) Наконец, почти все зрелые мРНК эукариот (кроме ги-
стоновых мРНК) на З’-конце содержат полн(А)-фрагмент из
150-200 адениловых нуклеотидов
И 3 нетранслируемый участок, и поли(А)-фрагмент имеют
отношение к регуляции продолжительности жизни мРНК, по-
скольку разрушение мРНК осуществляется З'-экзонуклеазами.
Механизмы этой регуляции мы будем рассматривать позднее
(в разделе 2.9).
Сейчас же коротко упомянем: поли(А)-фрагмент отчасти
подобен по функции теломере ДНК. В соответствии с гипотезой
«билетиков» (упоминавшейся в п. 1.4.2.1), после того, как оче-
редная рибосома заканчивает трансляцию мРНК, от поли(А)-
фрагмента отщепляются 10-15 нуклеотидов. Когда данный
фрагмент исчерпывается, начинает разрушаться значащая
часть мРНК (если отсутствует З'-нетранслируемый участок).
Общее количество нуклеотидов в мРНК обычно варьирует
в пределах нескольких тысяч. При этом на кодирующую часть
иногда может приходиться лишь 60-70 % нуклеотидов.
В клетках молекулы мРНК практически всегда связаны
с белками. Последние, вероятно, стабилизируют линейную
структуру мРНК, т. е. предупреждают образование в кодирую-
щей части «шпилек». Кроме того, белки могут защищать мРНК
от преждевременного разрушения. Такие комплексы мРНК
с белками иногда называют информосомами.
2.5.3 Особенности строения тРНК
2.5.3 1 Первичная, вторичная и третичная
структуры
Количество различных тРНК — несколько десятков: от од-
ного до шести видов для каждой из 20 аминокислот. Виды
тРНК, способные связывать одну и ту же аминокислоту, назы-
ваются изоакцепторными. Специфичность тРНК обозначается
верхним индексом, например: тРНК4-’”.
Общее число нуклеотидов в молекуле тРНК — невелико,
обычно не больше сотни. Среди них высоко содержание минор-
ных, или модифицированных, нуклеотидов. Например, в ала-
ниновой тРНК (рис. 2.22) таковыми являются 13 % нуклеоти-
дов. В их составе — следующие «нетипичные» нуклеозиды:
122
Глава 2
Акцгкторкля _____ Ц
«епо Ц
(3 Ж«кец)
•мосокислоты
Псесдсури&и-
лмм потя Г--Ц ДшпфоуриОа-
1 Ц • Г лмкл птпя
* У —У I
/А.У-УЧ Ц--Г ’
Г Ц-Ц-Г-Г-А/ мГ. уА-Г-дгУ.
I . Г-Ц-ГУ Й
ц Г-Г.Ц-ЦУ
4 пУ-мУ / /Ц-Г-ЦГ Т
Ц /А М2Й Ха-дгУ-Г^
ЛГУ /Г--Ц
Д обмоч-
ила потяя
У
Г-
г
ц
U
Ашшкобою-
*** пягяля
»о>НК
(5')—-
жтакоеох
1Выю*эдЛг>«{
с ходоком ж мГНК
—ГЦХ—— (3)
холок Ал»
Г Рис72.22. Структура tf-ftK :
(я»п>им*>ре эдной из адани-
ИиВЬЙ! тРНК)
— дигидроуридин (дгУ)
и псевдоуридин (пУ) (см.
п. 2.5.1.1);
— инозин (И): по сравне-
нию с аденозином, аминогруппа
замещена на кетогруппу;
метилинозин (мИ), ме-
тил- и диметилгуанозин (мГ
и м2Г);
— метилуридин (мУ): то
же самое, что риботимидин.
Другая особенность состоит
в том, что, благодаря образова-
нию нескольких «шпилек»,
цепь тРНК всегда приобретает
характерную структуру «кле-
верного листа». В этой структу-
ре — 4 двухцепочечных и 5 од-
ноцепочечных участков. По-
скольку минорные нуклеотиды,
как правило, не способны к ком-
плементарным взаимодействи-
ям, они содержатся, в основном,
в одноцепочечных локусах.
Для последних же (одноцепочечных участков) приняты
следующие названия:
Акцепторная ветвь — участок на З'-конце из 4 х нуклеоти-
дов; к самому крайнему из них (А) ковалентно присоединяется
структур» молекулы т<*ИК
аминокислота.
Антикодоновая петля
участок из 7 нуклеотидов в сере-
дине цепи. Три из этих нуклео-
тидов выполняют функцию ан-
тикодона который комплемен-
тарно взаимодействует с соот
ветствующим кодоном в цепи
мРНК.
Дигидроуриднловая, псев-
доурициловая и имеющаяся не
всегда добавочная петли- спо-
собствуют формированию спе-
цифичной для данной тРНК тре-
тичной структуры.
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
123
Само наличие стабильной третичной структуры — еще од-
на особенность тРНК: для длинных линейных полинуклеотидов
(мРНК, ДНК) это обычно не свойственно. В случае же тРНК 4
двухцепочечных участка, попарно сближаясь, образуют при-
мерно два витка двойной спирали, расположенные почти пер-
пендикулярно друг другу — так, что молекула приобретает Г-
образную форму (рис. 2.23).
ГйЙ. £.24. «РНИ с ММ**
КОИИСДОТОЙ
2.5.3.2. Взаимодействия тРНК с лигандами
Остановимся на связывании тРНК с аминокислотой и с ко-
доном мРНК.
Связывание «своей» аминокислоты происходит с помощью
фермента — специфической аминоацил-тРНК-сннтетазы. Су-
ществует 20 видов таких ферментов — по одному на аминоки-
слоту. И в каждом случае фермент имеет 2 центра узнавания
(см. рис. 2.24) — аминокислоты и любой из изоакцепторных
тРНК, специфичных для данной аминокислоты.
Следовательно, именно
данные ферменты сопряга-
ют генетический код со
структурой аминокислот.
Причем в составе фер-
ментов есть не только центр
образования ковалентной
связи между аминокисло-
той и тРНК, но и центр ги-
дролиза такой связи. По-
следний срабатывает, если
к тРНК присоединилась
«не та» аминокислота.
Что касается взаимо-
действия тРНК с кодоном
мРНК, то оно удовлетворяет общим принципам комплементар-
ности (что уже отмечалось) и антипараллельности (см.
рис. 2.22). Последнее означает: поскольку смысл кодона мРНК
читается в направлении 5'—>3', то антикодон в тРНК должен чи-
таться в направлении 3'—>5'.
При этом первые два основания кодона и антикодона спари-
ваются строго комплементарно, т. е. образуются только пары
А У и Г Ц. Спаривание же третьих оснований может отступать
от этого принципа. Допустимые пары определяются схемой:
124
Глава 2
Третий нуклеотид
антикодона тРНК: Ц
Взаимодействую-
щие с ним , f
нуклеотиды кодонов
мРНК Г
А
У
Из схемы вытекает следующее.
а) Молекула тРНК связывается только с 1-м типом кодона,
если третий нуклеотид в ее антикодоне — Ц или А
б) тРНК связывается с 2-мя типами кодонов, если антико-
дон заканчивается на У или Г.
в) И, наконец, тРНК связывается с 3-мя типами кодоиов,
если антикодон кончается на И (инозиновый нуклеотид); такая
ситуация, в частности, в аланиновой тРНК (см. рис. 2.22).
Отсюда, в свою очередь, следует, что для узнавания 61 смы-
слового кодона требуется, в принципе, не такое же, а меньшее
количество разных тРНК.
2.5.4 Рибосомальные рРНК и рибосомы
Рибосомальные РНК основа формирования субъединиц
рибосом. Заметим: эти субъединицы, а также входящие в них
рРНК принято обозначать по их константе седиментации
(и. 2.4.1.2).
80 S-рибосома
Малая субъединица. Большая субъединица,
иди 40 S-частипа иди 60 S-частица
18S-pPHK ( 2000 ц.), 28S-pPHK (-4000 и.),
5,8S-pPI>K (155 и.),
5S-pPHK (121 и.),
- 30 белков. - 45 быков.
. 2 .25. Состав Цйто6маз£*<» J
i тичвек-ай $у«ариот «
в скобках — ««пи ч"ство иу- i
' кмотмдов в UW№ рРНК
.л-:- • . ... ... ... ... - ;. ... ...с..
Рибосомы из разных источ-
ников несколько различаются
по данной константе и составу.
На рис. 2.25 приведен состав ци
топлазматических рибосом эу-
кариот.
Как видно, малая субъеди-
ница содержит 1 молекулу 18 S-
рРНК и около 30 молекул раз-
личных белков.
Большая же субъединица
включает 3 разные молекулы
рРНК (одну длинную и две ко-
роткие), а также 45 белковых
молекул.
В результате каждая субъе-
диница рибосомы это сверну-
тый рибонуклеопротеидный тяж.
ЯДРО’ экспрессия генов и транскрипционные факторы
125
Рис. 2.26. 5S-)VH*
Функциональные цен-
тры рибосомы мы рассмо-
трим в главе 3 (п. 3.2.1.2)
при обсуждении трансля-
ции. Сейчас же только крат-
ко охарактеризуем рРНК.
Среди азотистых основа
ний в рРНК выше, чем обыч-
но, содержание гуанина
и цитозина. Поэтому и гены
рРНК тоже являются ГЦ-бо-
гатыми (п. 2.4.1.2).
Встречаются также минорные нуклеозиды, но не столь ча-
сто, как в тРНК: примерно 1 %. Это, в основном, нуклеозиды,
метилированные по рибозе.
Во вторичной структуре рРНК много двухцепочечных
участков и петель (рис. 2.26).
Таково строение молекул РНК, образуемых в двух последо-
вательно проходящих процессах — транскрипции ДНК и созре-
вании (процессинге) РНК.
Обратимся теперь к первому из этих процессов.
2.6. СИНТЕЗ РНК (ТРАНСКРИПЦИЯ ДНК)
2.6.1. Общая характеристика транскрипции
В отличие от репликации ДНК, тесно связанной с клеточ-
ным делением (п 1.2.1), транскрипция ДНК происходит прак
тически во всех ядросодержащих клетках — как делящихся,
так и неделящихся.
Причем в делящихся клетках она совершается в любой мо-
мент митотического цикла, кроме периода репликации (у эука-
риот) и собственно деления. У прокариот, видимо, нет и этого
ограничения: клеточный цикл бывает столь коротким
(20-40 мин), что репликация и транскрипция происходят одно
временно, только на разных участках молекулы ДНК (которая
у бактерий является кольцевой).
Более того, транскрипция какого либо участка ДНК может
совершаться не только почти в любой момент цикла, но и много
кратно — сколь угодное число раз. С другой стороны, набор
транскрибируемых в клетке участков под действием тех или
иных факторов нередко меняется.
126
Глава 2
Ферментативное обеспечение процесса осуществляется
РНК-полимеразой. У эукариот — три вида этого фермента:
РНК-полимераза I — для синтеза пре-рРНК,
РНК-полимераза II — для синтеза премРНК и
РНК-полимераза III — для синтеза пре тРНК
Фермент ползет вдоль ДНК и катализирует поочередное
включение в растущую цепь рибонуклеотидов, комплементар-
ных нуклеотидам матричной цепи ДНК (п. 2.2.2.1).
Субстратами синтеза РНК являются рибонуклеозидтри-
фосфаты (рНТФ); как и при синтезе ДНК (п. 1.2.2.1), в ходе
включения в строящуюся цепь они теряют пирофосфатные ос-
татки:
свободные остатки рНМФ пиро
рНТФ в строящейся цепи РНК фосфат
Это обеспечивает процесс энергией, так что дополнитель-
ных ее источников не требуется.
Еще одно сходство с синтезом ДНК состоит в направлении
роста строящейся цепи — 5’—>3’. Это значит, что у этой цепи оче-
редные нуклеотиды присоединяются к З’-концу.
Как при всех матричных синтезах, строящаяся цепь антипа-
раллельна матричной цепи ДНК (см. рис. 2.6). Следовательно, по-
следняя транскрибируется ферментом в направлении 3'—>5'.
Но имеются и принципиальные отличия от синтеза ДНК.
а) Асимметричность процесса: в качестве матрицы, как мы
знаем, используется лишь одна цепь ДНК Не совсем ясно, как
ферментная система осуществляет правильный выбор нужной це-
пи. Видимо, ключевую роль тут играют какие-то последователь-
ности нуклеотидов на одной из цепей, узнаваемые системой.
б) Консервативность процесса: молекула ДНК по оконча-
нии синтеза РНК возвращается в исходное состояние При син-
тезе же ДНК молекулы наполовину обновляются, что делает ре-
пликацию полу консервативной.
в) Наконец, синтез РНК не требует для своего начала ника-
кой затравки, тогда как при репликации ДНК необходима РНК-
затравка.
2.6 2 Механизм транскрипции
2.6.2.1 Инициация транскрипции
Первый и, пожалуй, важнейший этап транскрипции — это
ее инициация: связывание РНК полимеразы с промотором и об-
ЯДРО- экспрессия генов и транскрипционные факторы 127
.шмг м! НК пояллеоаз!
разование первой межнуклеотидной связи.
О связывании РНК-полимеразы мы говорили уже не раз,
поэтому сейчас лишь напомним основные моменты (с добавле-
нием некоторых сведений).
У бактерий РНК-полимераза непосредственно узнает опре-
деленную последовательность нуклеотидных пар в составе про
мотора — например, бокс Прибнова (п. 2.2.1 2). В этом узнава
нии участвует специальный белок — т. н. о фактор (п. 2.3.1.2).
Затем к нему присоединяется РНК-полимераза, представляю-
щая собой тетрамер из субъединиц трех видов: а, р и
(рис. 2.27). В некоторых оперонах, например в лактозном
(п. 2.3 2.1), необходимо еще предварительное взаимодействие
с промотором дополнительного белка (САР).
У эукариот всегда требуется предварительное связывание
с промотором целой совокупности белков общих факторов
транскрипции, с образованием комплекса TFIID (п. 2.4.2.2).
Кроме того, инициация транскрипции гена зависит от прочих
транскрипционных факторов, взаимодействующих с энхансера
ми этого гена (п. 2.2.1.2).
Связавшись с промотором, РНК полимераза вызывает ло-
кальную денатурацию ДНК, т. е. разделение цепей ДНК на про-
тяжении примерно 1,5 витка ДНК (15 нуклеотидных пар:
п. 1.1.2.1). Как говорят, образуется транскрипционный «гла-
зок». Благодаря этому нуклеотиды матричной цепи ДНК в обла
сти «глазка» становятся доступными для спаривания с рНТФ.
Первым в строящуюся цепь РНК всегда включается пури-
новый нуклеотид — АТФ или ГТФ, причем все три его фосфат-
ных остатка сохраняются.
Затем образуется первая 5',3'-фосфатная связь со вторым
нуклеотидом.
128
Глава 2
После этого у бактерий о фактор теряет связь с ферментом,
и оставшиеся субъединицы (образующие т. н. кор-фермент) на-
чинают перемещаться по ДНК.
У эукариот, видимо, тоже РНК полимераза после ини-
циации транскрипции теряет связь с транскрипционными фак-
торами и перемещается по ДНК самостоятельно.
2.6.2.2. Элонгация транскрипции
Следующий за инициацией этап — элонгация: постепенное
удлинение растущей цепи пре-РНК до окончательного размера.
Это происходит по мере продвижения РНК-полимеразы
по ДНК. Соответственно, перемещается и транскрипционный
«глазок», т. е. участок локального расплетения ДНК.
На транскрибированной же части ДНК двухцепочечная спи-
ральная структура восстанавливается сразу после ухода РНК-
полимеразы.
Примерная скорость движения фермента и синтеза РНК —
30 нуклеотидов в секунду.
Транскрипция может сопровождаться ошибками спарива-
ния, в результате которых в синтезируемую РНК включаются
«неправильные» нуклеотиды. В среднем одна такая ошибка
приходится на 2 х 104 включенных нуклеотидов. Это существен-
но чаще, чем появление нерепарированных ошибок репликации
(одна ошибка примерно на 1010 нуклеотидных пар).
Очевидно, меньшая точность транскрипции связана с тем,
что ошибки здесь имеют не столь серьезные последствия. Они
легко компенсируются благодаря образованию на одном гене
множества копий пре-РНК.
Кроме того, вследствие вырожденности генетического кода
(п. 2.2.2.), не каждая замена нуклеотида меняет смысл кодона
мРНК. Можно найти, что в 67 % ошибок, касающихся третьих
положений кодонов, смысл последних остается прежним.
2.6 2.3. Терминация транскрипции
Последний этап терминация, или окончание транскрип-
ции.
Сигналом для этого служат специальные ГЦ -богатые участ-
ки в конце генов. Поскольку сила взаимодействия пар Г Ц до-
вольно велика (п. 1.6.1.1), локальная денатурация таких участ-
ков в ДНК происходит трудней. Это замедляет продвижение
РНК-полимеразы и может служить для нее сигналом к прекра-
щению транскрипции.
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
129
Но еще до окончания процесса в конце новосинтезирован-
яой РНК тоже успевает появиться ГЦ-богатый участок. Благо-
даря взаимодействию между своими нуклеотидами, он образует
«шпильку». Т. е. взаимодействия с нуклеотидами матричной
цепи ДНК заменяются на «внутришпилечные» взаимодействия.
Это облегчает отсоединение РНК от ДНК.
У бактерий тому же самому часто способствует и специаль-
ный белок — Rho-фактор. Он движется по ДНК вслед за РНК
полимеразой, догоняет ее на ГЦ-участке гена и, обладая распле-
тающей активностью, облегчает расхождение цепей РНК
и ДНК.
2.6.2 4 Конвейерный характер процесса
До сих пор мы имели в виду одну молекулу РНК-полимера
зы и образование одной цепи пре-РНК.
Но в действительности через какое-то время после того, как
предыдущая молекула РНК-полимеразы, покинув промотор,
продвинется по ДНК на некоторое расстояние, с промотором
связывается следующая молекула фермента и тоже начинает
транскрипцию.
Поэтому на каждом транскрибируемом гене обычно работа-
ют, двигаясь друг за другом, сразу несколько молекул РНК-по-
лимеразы (рис. 2.28). Среднее расстояние между ними зависит
от «силы» промотора (во многом обусловленной транскрипцион-
ными факторами) и концентрации РНК-полимеразы. Пример
ный порядок этого расстояния — 300 500 н. п.
Соответственно, с одним геном одновременно связано нес-
колько растущих цепей пре-РНК.
Таким образом, транскрипция гена происходит конвей-
ерным способом.
Рис. 2 Ж Транскрипция ДНК сднг мснно нисколькими
молекулами РНК-ш лимкразы (F;
5-36
2 6.2.5 Ингибиторы транскрипции
Имеется немало веществ, специфически ингибирующих
транскрипцию. Наиболее известны из них а-аманитин и акти-
номицин D.
а-Аманитин — это один из токсинов ядовитых грибов
(в частности, бледной поганки). Он представляет собой цикличе-
ский пептид, включающий ряд необычных аминокислот.
Данный пептид очень прочно связывает РНК-полимеразу II
(у эукариот) и блокирует тем самым синтез предшественников
матричных РНК (на стадии элонгации).
Актиномицин I) — антибиотик; точнее, это производное
естественного антибиотика из Streptomyces. Он содержит два
идентичных циклических пентапептида, соединенных с гетеро-
циклической системой.
Актиномицин прочно связывается с ГЦ-богатыми участка-
ми ДНК. Это блокирует продвижение РНК-полимеразы — из-за
невозможности локального расплетения цепей.
Особенно чувствителен к данному ингибитору синтез пред-
шественников рибосомальных РНК, поскольку их гены особен-
но обогащены ГЦ парами (п. 2.4.1.2).
2.6.3. Продукты транскрипции
Как мы уже не раз подчеркивали, в результате транскрип-
ции у эукариот (в отличие от прокариот) образуются лишь пред-
шественники тех или иных РНК — мРНК, рРНК и тРНК.
Зная структуру зрелых цепей РНК каждого вида (раздел
2.5), сравним с ней строение соответствующих пре-РНК.
а) Пре мРНК (рис. 2.29, А). Эти цепи обычно в несколько
раз длиннее, чем зрелые мРНК.
Действительно, они, во-первых, включают транскрипты
спейсеров (представляющих собой регуляторные участки, отде-
лы со структурной ролью и т. д.; п. 2.2.1.2). Во-вторых, коди-
рующая часть пре-мРНК, как и в исходном гене, прерывается
интронами При этом интронные последовательности нередко
образуют «шпильки».
Примечательно, что длина пре-мРНК не только гораздо
больше, чем у мРНК, но и значительно сильней варьирует у раз-
ных молекул от 2 тыс. до 20 тыс. нуклеотидов. Поэтому дан-
ный вид РНК часто называют гетерогенной ядерной РНК
(гяРНК).
Другая особенность пре-мРНК — отсутствие на б'-конце
♦колпачка» (кэпа), а на З'-конце — поли(А)-фрагмента.
ддрО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
131
►йс. 2.8S. Иг* пукты траисфипцм»
(«эобоажания дан» О» э С' блюдения
(Ивсштаба. Лишние «укаяптий’ьи
последовательности показаны гтунк
I ««ром. .«стальные — сплошной лйнивй
В большинстве случаев
пре-мРНК эукариот несут
информацию о синтезе лишь
одной пептидной цепи, т. е.
дают при созревании только
одну молекулу мРНК
Среди исключений из
этого правила гистоновая
пре-мРНК. Как указывалось
в п. 2.4.1.1, кластер гистоно-
вых генов транскрибируется
как единое целое, а при созре-
вании пре-мРНК из послед-
ней «нарезаются» 5 разных
гистоновых мРНК.
Наличие подобных ис-
ключений — еще одно отли-
чие пре-мРНК от мРНК: все
зрелые мРНК эукариот,
без каких-либо исключений.
являются моноцистронными (п. 2.5.2).
б) Пре-рРНК (рис. 2.29, Б). Кластер трех генов рРНК тоже
транскрибируется как единое целое (п. 2.4.2.2). Образующаяся
пре-рРНК, или 45S-PHK, содержит последовательности сразу
трех зрелых рРНК 18S-, 5,8S и 28S рРНК.
Эти последовательности разделены спенсерами, но не со-
держат интронов Кроме того, в них нет модифицированных ну-
клеотидов, содержащихся в зрелых рРНК.
132
Глава 2
в) Пре-тРНК (рис. 2.29, В). В отличие от пре-рРНК, все
пре-тРНК (за единичным исключением у бактерий) содержат
последовательности лишь одной тРНК.
При этом уже на уровне пре-тРНК образуется типичная
структура «кленового листа». Однако последняя еще отличает-
ся от окончательной: в ней
- имеется ряд дополнительных последовательностей (с об-
еих концов и в середине молекулы),
- отсутствуют минорные нуклеотиды,
не сформирована типичная последовательность акцеп-
торной петли (ЦЦА),
антикодон не занимает своего «правильного» положения.
Из всего вышесказанного ясно, что непосредственные про-
дукты транскрипции действительно (как и утверждалось
в п. 2.1) должны подвергаться определенным (и существенным)
изменениям для того, чтобы превратиться в функционально ак-
тивные цепи РНК.
2.7. СОЗРЕВАНИЕ (ПРОЦЕССИНГ) РНК
Практически все процессы созревания РНК могут быть по-
дразделены на три типа:
- удаление одних,
- присоединение других и
- модификация тех же или третьих нуклеотидов.
2.7.1. Удаление «лишних» последовательностей
2.7.1.1. Общее описание
Удаление «лишних» нуклеотидов осуществляется спе-
циальными нуклеазами. Экзонуклеазы последовательно отще-
пляют с определенного конца цепи (3' или 5') по одному нуклео-
тиду. А эндонуклеазы разрезают цепь где-то в средних участ-
ках, приводя к ее фрагментации.
Перечислим процессы созревания, идущие с участием ну-
клеаз.
а) В первую очередь, это отщепление отдельных «лишних»
нуклеотидов с концов цепи. Так, в пре-РНК с 5’ конца всегда на-
ходится АТФ или ГТФ, а с З'-конца нередко ГЦ-участки
(п. 2.5.2.2). Они играют важную роль в самом процессе тран-
скрипции, но не нужны и даже мешали бы при функционирова-
нии зрелой цепи, и поэтому удаляются.
ЯДРО' экспрессия генов и транскрипционные факторы 133
б) Кроме того, с концов цепей отщепляются спейсерные
последовательности нуклеотидов (если таковые имеются). По-
видимому, обычно для этого используются эндонуклеазы.
в) Такие пре-РНК, как 45S-npe-pPHK и гистоновая
пре-мРНК, разрезаются эндонуклеазами на индивидуальные
цепи РНК.
г) Наконец, из средних участков пре-тРНК и практически
всех (кроме гистоновых) пре мРНК вырезаются интронные после-
довательности. При этом экзонные последовательности сшивают-
ся друг с другом в непрерывную цепь. Данный процесс (вырезание
интронов и сшивание экзонов) обозначается как сплайсинг.
Очевидно, для его осуществления требуются не только эндо-
нуклеазы, но и лигазы (катализирующие соединение экзонов).
Правда, у некоторых простейших (Tetrahymena) удаление
интрона из одной пре-РНК происходит без участия каких-либо
белков-ферментов, т. е. катализируется самой же пре-РНК. Это
весьма интересно в эволюционном плане, но все-таки далеко от
обычно используемого у эукариот механизма.
Каков же этот механизм? Рассмотрим его подробней.
2.7.1.2. Механизм сплайсинга
Один из ключевых моментов рассматриваемого механизма
(рис. 2.30) обеспечение точности разрезания цепи пре-РНК:
ошибка даже на один нуклеотид приведет к «сдвигу рамки», что
изменит смысл всех кодонов мРНК или антикодона тРНК.
Точность достигается благодаря двум обстоятельствам.
Во-первых, в начале и в конце каждого интрона имеются опре
деленные последовательности нуклеотидов: так, интроны
всегда начинаются с Г-У, а кончаются дуплетом А-Г. Во-вто-
рых, для узнавания этих последовательностей используются
специальные РНК — т. н. малые ядерные РНК (мяРНК). По-
следние связаны с ферментами, катализирующими сплай
синг. Такие рибонуклеопротеидные комплексы называются
сплайосомами
Сплайсинг начинается со взаимодействия двух мяРНК с на-
чалом и концом интрона. Это дает «ориентацию» для эндону-
клеазы: последняя действует на границах двух- и одноцепочеч-
ных участков.
Первый разрыв пре РНК происходит в области 5’ конца ин-
трона — на рис. 2.30 это место нахождения левого края левой
мяРНК. При этом 5' конец интрона связывается с одним из ну-
клеотидов в средней части того же интрона, что приводит к обра-
зованию кольцевой (или, более точно, лассоподобной) структуры
134
Глава 2
Е —ф^рмецтныйкэмплукс (с нужлг .\знсйи лиг«еня« активностью)
Поэтому первая (на рисунке левая) мяРНК, видимо, дис-
социирует, а ферментный комплекс перемещается к другой (на
рисунке — правой) мяРНК, маркирующей З'-конец интрона. <
Здесь происходит второй разрыв пре РНК по месту нахожде- 1
ния «правого» конца «правой» мяРНК. Точнее, связь экзона 2
с интроном заменяется на связь с экзоном 1.
Следовательно, оба разрыва совершаются одним и тем же
способом путем замещения одной межнуклеотидной связи на
другую такую же связь.
С нарушением механизма сплайсинга связан один из видов Р-
талассемии — генетического заболевания, при котором нарушено
образование р цепей гемоглобина. У больных с т. н. р- талассеми-
ей в гене р-глобина замещена всего одна нуклеотидная пара, при-
чем даже не в кодирующей части, а в интроне. Но в результате
в интроне р-глобиновой пре мРНК с 5’-конца оказывается не Г,
а А. Поэтому не происходит узнавания этого конца со стороны
мяРНК, интрон не вырезается и зрелая мРНК не образуется.
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
135
2.7.2. Присоединение и модификация
нуклеотидов
Итак, в процессе созревания пре-РНК последняя теряет
значительную часть нуклеотидов. Но происходит также и не-
транскрипционное присоединение отдельных нуклеотидов.
В случае пре-мРНК со стороны 5'-конца присоединяется
(с помощью нетипичной для полинуклеотидов пирофосфатной
связи) 7-метилгуаниловый нуклеотид — компонент «колпач-
ка». А со стороны 3'-конца понуклеотидно наращивается по-
ли(А)-фрагмент примерно из 200 нуклеотидов. Для этого ис-
пользуются специальные ферменты; в частности, для образова-
ния поли(А)-фрагмента — полиаденилатполимераза.
В случае же пре тРНК с З'-конца по очереди присоединяют-
ся три нуклеотида — Ц, Ц и А, образующие акцепторную ветвь.
Наконец, важный момент созревания пре-РНК - образова-
ние в их составе модифицированных нуклеотидов. Как и в слу-
чае метилирования ДНК (раздел 1.6), минорные нуклеотиды по-
являются в полинуклеотидной цепи не на стадии полимериза-
ции, а по завершении ее — путем модификации содержащихся
в цепи обычных нуклеотидов.
Так, в пре-мРНК происходит метилирование рибозных ос-
татков нуклеотидов «колпачка», а в пре-рРНК — тоже метили-
рование рибозных остатков, но содержащие их нуклеотиды рас-
положены по всей длине цепи — с частотой примерно 1 %.
Гораздо более многообразны процессы модификации в слу-
чае пре-тРНК. Например, определенные остатки уридина под-
вергаются восстановлению (с образованием дигидроуридина),
другие — изомеризации (что дает псевдоуридин), третьи — ме-
тилированию (метилуридин). Некоторые остатки аденозина де-
заминируются (превращаясь в инозин), причем часть из продук
тов затем еще метилируется (образуя метилинозин) И так да-
лее. список происходящих модификаций в пре тРНК можно
продолжить.
Все вышеперечисленные события и приводят в конце кон
Цов к образованию в ядре зрелых молекул РНК:
а) 4 видов рРНК: 28S-, 18S-, 5.8S- и 5S-PHK;
б) нескольких десятков видов тРНК по 1-3 (или даже
больше) для каждой из 20 аминокислот;
в) тысяч различных мРНК копий генов, функционирую-
щих в данных клетках.
рРНК и мРНК тут же, в ядре, связываются с белками.
При этом рРНК формируют с рибосомными белками большие
136
Глава 2
и малые субъединицы рибосом, которые затем выходят в цито-
плазму. А мРНК связываются с другими белками (выполняю-
щими, видимо, защитную и транспортную функции) и в ком-
плексе с ними тоже перемещаются в цитоплазму.
В процессе всех этих преобразований существенно меняют-
ся седиментационные свойства. Для иллюстрации приведем ста-
дии созревания одной из мРНК (табл. 2.2).
Таблица 2.2. Созревание мРНК
Последовате- льные формы 40 S-npe- мРНК ' 15 S-npe- мРНК ’ 16,5 8-поли(А) мРНК 27 Б-поли(А)- ► мРНП
Кол-во нуклеотидов в РНК -9200 -1200 -1430 -1430
Кол-во связанных молекул белка — — — 3 (с массой по 50.000)
Как видно, в результате удаления «лишних» нуклеотидов
цепь пре-мРНК укорачивается примерно на 87 % (т. е. остается
лишь 13 % от исходной длины). Затем присоединяются пример-
но 230 адениловых нуклеотидов, отчего коэффициент седимен-
тации несколько увеличивается. И, наконец, на последней ста-
дии он возрастает гораздо сильней в результате связывания
с мРНК трех белковых молекул. В итоге образуется мРНП — м-
рибонуклеопротеид, т. е. комплекс мРНК с белками.
2.8. ПРОЧИЕ СИСТЕМЫ СИНТЕЗА РНК
Кроме рассмотренной в разделе 2.6 РНК-полимеразной си-
стемы синтеза РНК, существуют и другие ферментные системы,
тоже способные к образованию РНК. Вот краткое описание двух
из них.
2.8 1. Вирусы: РНК-синтетазная система
2.8.1 1 Способы репликации генома РНК-содержащих
вирусов
Как известно, у многих вирусов геномом служит не ДНК,
а РНК (это т. н. РНК-содержащие вирусы). Для репликации та-
ких геномов используются две ферментные системы.
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
137
Гис. 2.31. Сх« Мч РНК-синт* т-П
ной [•<>; кции
В одних случаях (у ретро-
вирусов, в т. ч. вируса СПИДа
и некоторых онкогенных ви-
русов) это обратная тран-
скриптаза, или РНК зависи-
мая ДНК-полимераза. Она по-
следовательно катализирует
три процесса:
— синтез (-)-цепи ДНК
на вирусной (+)-РНК как на
матрице;
— разрушение вирусной
РНК в составе образовавшего-
ся гибрида РНК-ДНК;
— синтез (+)-цепи ДНК
на (-)-цепи с образованием двухцепочечной ДНК.
Последняя обычно интегрируется в геном хозяйской клет-
ки и служит матрицей для синтеза вирусных мРНК РНК-поли-
меразной системой. Так что синтез РНК здесь происходит обыч-
ным способом; поэтому подробней на данной системе мы не оста-
навливаемся.
Более распространен иной способ репликации РНК-содер-
жащих вирусов. При нем используется другой фермент — РНК-
сиитетаза (или РНК-зависимая РНК-полимераза). Здесь на ви-
русной РНК как на матрице синтезируется не ДНК, а РНК
(рис. 2.31). Причем это происходит в цитоплазме зараженной
клетки: в одних случаях — вне вирусной частицы, в других —
внутри таковой.
Механизм процесса во многом сходен с механизмом РНК-
полимеразной реакции: субстратами служат рНТФ; синтезируе
мая цепь антипараллельна и комплементарна матричной, а ра
стет в направлении 5'->3' (следовательно, матричная цепь счи
тывается в направлении 3‘—>5’)-
При всем при этом в разных вирусах с РНК синтетазным
механизмом репликации используются несколько отличающие
ся схемы. Это, главным образом, зависит от того, какая именно
РНК служит в качестве генома.
2.8 1.2. (+) РНК-содержащие вирусы, использующие
РНК синтетазу
В пикорнавирусах содержится т. н. (+)-РНК (рис. 2.32). Это
значит, что она может непосредственно использоваться в тран
сляции как мРНК
138
Глава 2
Внутри вирусной частицы РНК не ассоциирована с белком.
Поэтому после того, как вирус попадает в клетку и теряет свою
оболочку, его РНК становится доступной для связывания с нею
рибосом клетки.
При этом образуется единая полипептидная цепь, которая
затем расщепляется на 7 вирусных белков. Шесть из них затем
войдут в состав новых вирусных частиц, а седьмой белок — фер-
мент РНК-синтетаза, отсутствующий в вирусных частицах.
Таким образом, репликация вирусной РНК может начина-
ться только после ее трансляции и накопления какого-то коли-
чества РНК-синтетазы.
Сама же репликация идет в 2 этапа — примерно так, как это
было показано на рис. 2.31. На первом этапе на (+)-РНК как на
матрице образуются (-)-цепи РНК, а на втором этапе эти ( )-це-
пи РНК служат матрицей для синтеза (+)-цепей РНК, идентич-
ных вирусным.
Эти вновь образованные (+)-цепи РНК могут использовать-
ся по трем направлениям:
в трансляции (как мРНК) для образования вирусных
белков;
в репликации — для образования новых цепей РНК;
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы 139
- в сборке (вместе с вирусными белками) новых вирусных
частиц.
2.8.1.3. (-)РНКсодержащие вирусы
Другие вирусы (например, рабдовирусы и парамиксовиру-
сы) содержат ( )-РНК (рис. 2.33), к трансляции не способную.
Вместо трансляции она участвует (как матрица) в транскрип-
ции — образовании пяти моноцистронных (+)-РНК, которые
и выступают впоследствии в качестве мРНК. Процесс катализи-
руется РНК-синтетазой, содержащейся в вирусной частице.
В связи с иной биологией вирус имеет и иную, более слож-
ную, организацию. В частности, (-)-РНК упакована с помощью
белков в т. н. иуклеокапсид, в составе которого остается и после
проникновения вируса в клетку.
Среди белков нуклеокапсида находятся два фермента —
разновидности РНК-синтетазы. Один фермент осуществляет
уже упоминавшуюся транскрипцию (-)-РНК. Образующиеся
при этом вирусные пре-мРНК подвергаются созреванию: у них
формируются «колпачки» и поли(А) фрагменты. Вероятно,
лишь после этого мРНК покидают матричный иуклеокапсид
и связываются с рибосомами зараженной клетки.
PfC. а.33. Рет {-) РНК-^дерхтихвмрусзе
140
Глава 2
В какой-то момент нуклеокапсид переключается на другой
процесс — репликацию. Возможно, это достигается путем моди-
фикации ферментов или всего нуклеокапсида. Как бы то ни бы-
ло, репликация осуществляется другой разновидностью РНК-
синтетазы.
Процесс вновь включает 2 этапа:
- образование на (-)-цепи как на матрице (+)-цепи РНК и
образование на (+)-цепи как на матрице (-)- цепей
РНК.
Новосинтезированные (-) РНК покидают нуклеокапсид
и объединяются с новосинтезированными же вирусными белка-
ми в новые нуклеокапсиды.
2.8.1.4. (±) РНК-содержащие вирусы
Наконец, реовирусы содержат в качестве генома около 10
различных двухцепочечных молекул РНК, которые можно
обозначить как (±)-РНК.
Принцип репродукции этих вирусов такой же, как если бы
геномом являлась двухцепочечная ДНК. Только ключевым фер-
ментом является РНК-синтетаза.
Неоднократно транскрибируя (-)-цепи (±) РНК, данный
фермент образует (+)-цепи, выступающие в качестве мРНК.
А для накопления новых двухцепочечных молекул (±)-РНК,
очевидно, необходимо использование в качестве матрицы обеих
цепей вирусной РНК.
2.8.2. Полинуклеотидфосфорилаза
В некоторых клетках (как бактериального, так и живот-
ного происхождения) имеется фермент полинуклеотидфосфо-
рилаза (ПНФаза). Он катализирует реакцию, которая может
идти как в прямом, так и в обратном направлениях.
Прямое направление реакции — расщепление РНК путем
фосфоролиза. Это значит, что в качестве литического агента ис-
пользуется не вода, а фосфорная кислота. Благодаря этому про-
дуктами реакции являются не нуклеозидмоно-, а нуклеозидди-
фосфаты (рНДФ).
Очевидно, существо обратной реакции — объединение
рНДФ в полинуклеотидную цепь (с высвобождением фосфатных
остатков):
свободные ____ остатки рНМФ + фосфат
рНДФ в полинуклеотидной цепи
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
141
При этом матрица не используется, и поэтому состав и дли-
на продукта определяются случайными обстоятельствами
концентрацией свободных рНДФ в среде и т. п.
Неизвестно, играет ли данная реакция какую-либо роль
в клетке.
В эксперименте же ПНФаза долгое время широко использо-
валась для синтеза полирибонуклеотидов требуемого состава,
которые затем служили в качестве мРНК для расшифровки ге-
нетического кода.
Например, синтезировав поли(У), обнаружили, что в белок-
синтезирующей системе этот полинуклеотид вызывает образо-
вание пептида из одних остатков фенилаланина. Отсюда — вы-
вод о том, что триплет УУУ — кодон фенилаланина.
Когда же был синтезирован полимер поли(УГ) с закономер-
ным чередованием У и Г, т. е. содержащий триплеты двух видов
(УГУ и ГУГ), оказалось, что под его влиянием в пептид с той же
очередностью включаются две аминокислоты — цистеин и валин.
Следовательно, кодон цистеина — УГУ, а кодон валина — ГУГ.
И так далее: подобным образом был расшифрован смысл
всех 64 кодонов (см. табл. 2.1).
2.9. РАСПАД мРНК
До сих пор мы говорили об образовании РНК. Теперь же
кратко обсудим, как распадаются РНК; наиболее интересен этот
вопрос в отношении матричных РНК.
Правда, в отличие от рассмотренных выше процессов, рас-
пад мРНК происходит (у эукариот) не в ядре клетки, а в цито-
плазме — там, где они функционируют. Тем не менее удобней
обратиться к данной проблеме сейчас — чтобы осветить сразу
и вторую сторону обмена мРНК.
2.9.1. Разрушение мРНК бактерий с 5'-конца:
эффект положения
У бактерий (по крайней мере, у некоторых их видов) распад
мРНК может начинаться с 5'-конца, т. е. происходить в том же
направлении (5'—>3'), в каком мРНК синтезируется на ДНК и за-
тем транслируется рибосомами.
Напомним также, что у бактерий нет ядра, а мРНК являют-
ся полицистронными (п. 2.5.2), т. е. достаточно длинными.
Все эти причины приводят к тому, что в какие-то моменты
времени одна и та же цепь мРНК может одновременно участво-
вать в трех процессах (рис. 2.34):
742
Глава 2
Фрагмент кольцевой бактериальной ДНК
Рис. 2.34 Сэпрржание т;>чис*,,»иггции, трансляции и
)'.тсп,<,длмРНКуС^МтжриЙ
- своем образовании на ДНК (в ходе чего продолжает удли-
няться со своего З'-конца);
своем функционировании т. е. поцистронной трансля-
ции рибосомами;
своем распаде, т. е. постепенном укорочении с 5'-конца
за счет действия 5'РНКазы.
В свою очередь, данный феномен может приводить к т. н.
эффекту положения. Суть его в том, что кратность трансля
ции какого-либо цистрона (т. е. количество раз, сколько он
успевает прочитываться рибосомами) зависит от положения
этого цистрона в опероне. В одних случаях при переходе от
первого цистрона к последнему кратность трансляции законо-
мерно уменьшается, а в других — так же закономерно увели-
чивается.
Действительно, допустим, что 5'РНКаза связалась с 5'-
концом мРНК после того, как с ним успели связаться 10 рибо-
сом: такова, следовательно, кратность трансляции первого цис-
трона.
И пусть 5’-РНКаза укорачивает мРНК с 5'-конца быстрей,
чем РНК-полимераза удлиняет мРНК с З'-конца.
Тогда каждый последующий цистрон будет существовать
меньшее время, чем предыдущий. Соответственно, меньшее ко-
личество рибосом успеет связаться с ним и осуществить тран-
сляцию. Т. е. в данном примере кратность трансляции будет
в опероне закономерно уменьшаться.
Кокретные же значения продолжительности жизни цис
тронов мРНК у бактерий очень невелики: обычно варьируют
в пределах 2 3 минут.
ЯДРО экспрессия генов и транскрипционные факторы
143
2.9.2. Разрушение мРНК эукариот с З'-конца
2 9.2.1. Роль полиСА) фрагмента
У эукариот продолжительность существования мРНК в клет-
ке (точнее, время полужизни) существенно больше - от 10 минут
(для короткоживущих мРНК) до 2 суток. При этом короткоживу-
щими обычно бывают мРНК регуляторных белков для того,
чтобы при изменении каких-то параметров клетка могла быстро
отреагировать изменением синтеза данных белков.
Вторая особенность обусловлена тем, что мРНК эукариот —
моноцистронные. Поэтому эффекта положения, подобного вы-
шеописанному, здесь быть не может, даже если бы мРНК разру-
шались с 5'-конца.
Но имеется и третья особенность: распад мРНК у эукариот
осуществляется не 5'-РНКазами, а З'-РНКазами (и, возможно,
эндонуклеазами; п. 3.3.2.3). Т. е. обычно он начинается с того
конца, где практически все мРНК (кроме гистоновых) содержат
поли(А)-фрагмент из примерно 200 нуклеотидов (п. 2.5.2).
Следовательно, подобно теломерам ДНК, этот фрагмент
служит своего рода буферной зоной, постепенное укорочение ко-
торой защищает до поры до времени от такой же участи коди-
рующую часть нуклеиновой кислоты.
Причем, согласно дважды упоминавшейся гипотезе «биле-
тиков» (пп. 1.4.2.1 и 2.5.2), поли(А)-фрагмент разрушается 3’-
7*ис, 2.35 м*ха
нлзм смчзм укгрг чеиия
' трансляции
РНКазой не постоянно, а перио-
дически: в тесной связи с функ-
ционированием мРНК. После за-
вершения трансляции мРНК оче-
редной рибосомой от поли(А)
фрагмента отщепляется 10 15
нуклеотидов. Когда же в этом
фрагменте остается всего около
50 нуклеотидов, мРНК становит
ся доступной для РНКаз и быстро
разрушается.
Отсюда следует, что обычная
кратность трансляции мРНК
должна составлять 10-15 раз.
Например, потеряв 15 раз по 10
нуклеотидов, поли(А) фрагмент
укоротится с 200 нуклеотидов до
критической длины в 50 нуклео-
тидов.
144
Гпава 2
Как объяснить такую связь распада поли(А)-фрагмента
с трансляцией? Возможный механизм показан на рис. 2.35.
Согласно ему, поли(А)-фрагмент образует петлю за счет
взаимодействия своим З'-концом с каким-то участком трансли-
руемой части мРНК. И в такой двухцепочечной структуре 3' -ко-
нец недоступен для 3’-РНКазы.
Когда же по указанному участку проходит рибосома, петля
на какое-то время разрывается и З'-конец становится досту-
пным для РНКазы, которая успевает поочередно отщепить
10-15 нуклеотидов. Затем (при освобождении участка от рибо-
сомы) петля вновь восстанавливается, но уже укороченная.
Наконец, когда от поли(А)-фрагмента остается всего 50 ну-
клеотидов, петля образоваться не может и РНКаза беспрепят-
ственно разрушает всю цепь мРНК.
2.9.2.2. Роль АУ-элементов
А с чем связаны значительные различия в продолжительно-
сти жизни разных мРНК?
Оказывается, у короткоживущих мРНК в З'-нетранслируе-
мой области (расположенной между кодирующей частью и по-
ли(А)-фрагментом) находятся специальные АУ-богатые эле-
менты (AYRE — AU-rich elements). Их присутствие резко уско-
ряет деградацию поли(А)-фрагмента.
Возможно, такие элементы препятствуют образованию по-
ли(А)-фрагментом петли, защищающей З’-конец (рис. 2.36).
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы
145
Это может достигаться разными способами — как за счет образо-
вания «шпильки» АУ-элементом, так и за счет связывания ка-
ких-то протективных белков.
Интересным примером, иллюстрирующим роль АУ-эл-
ементов, является мРНК гена c-fos. Последний — один из прото-
онкогенов, очень сходный с вирусным онкогеном v-fos. (При-
ставка с означает клеточный (cellular) ген, а приставка v-ви
русный ген). Оба гена кодируют один из транскрипционных
факторов.
Так вот, в мРНК гена с fee имеется АУ-элемент, и эта мРНК
является короткоживущей. В составе же мРНК онкогена v-fos
такого элемента нет; соответственно, время ее полужизни суще-
ственно больше, чем, очевидно, и обусловлено возникновение
опухоли. А для превращения протоонкогена в онкоген требует-
ся лишь делеция небольшой области (соответствующей АУ-эле-
менту мРНК).
2.9 2 3. Влияние продуктов трансляции на
распад мРНК
Вышеизложенные представления говорят о том, что распад
мРНК, видимо, тесно увязан с процессом трансляции. Но, воз-
можно, играют роль и сами продукты трансляции. По принци-
пу обратной связи они стимулируют разрушение соответствую-
щих мРНК
Первым эту идею высказал в 1975 г. В. А. Арбузов; он же
пытался подтвердить ее экспериментальным путем, причем не
только для эукариот, но и для бактерий.
Ключевым служил следующий результат: если трансляцию
подавить антибиотиками, то среднее время полужизни мРНК
возрастает.
Правда, такой же эффект должен наблюдаться и тогда, ког-
да разрушение мРНК осуществляется 5-РНКазой по механиз-
му, изложенному в п. 2.9.1. Действительно, если под действием
антибиотика прекращается движение рибосом по мРНК то это
должно тормозить также продвижение б'-РНКазы, что и озна-
чает стабилизацию мРНК.
Однако два других факта, полученных В. А. Арбузовым, го-
ворили против подобного объяснения и в пользу первоначаль-
ной идеи.
а) Во первых, некоторые антибиотики вызывают т. н.
абортивную транслокацию, при которой рибосомы продолжают
продвигаться по мРНК, но белок не синтезируют. В этом случае
эффект стабилизации мРНК наблюдался по-прежнему.
146
Глава 2
б) Во вторых, согласно тому же источнику, у бактерий бе-
локсинтезирующая система связана с мембранами клетки,
а разрушение мРНК происходит лишь после ее отделения от
мембраны (т. е. не так, как показано на рис. 2.34).
Отсюда складывалось следующее представление о механиз-
ме распада мРНК:
белок (продукт трансляции) стимулирует связанные
с мембраной РНКазы,
последние вызывают фрагментацию мРНК этого белка,
фрагменты мРНК теряют связь с мембраной и быстро
разрушаются в цитозоле растворимыми нуклеазами.
ис. 2.37. возможный меха
нййм гистонами
расда да своих мРНК
Действительно ли имеет место такой механизм, пока ска-
зать трудно. С его позиций нельзя, например, объяснить распад
мРНК, транслируемых непосредственно в цитозоле (т. н. мем-
бранонесвязанными рибосомами).
Но примечательно, что теперь стали появляться и другие
свидетельства в пользу исходной идеи — о том, что белки могут
стимулировать распад своих мРНК. Вот два из них.
а) Распад гистоновых мРНК. Синтез гистонов активно
происходит в S-фазу синтетического цикла, и в это время гисто-
новые мРНК имеют срок полужизни около 40 мин.
После же накопления гистонов (к началу Ог-фазы) время
полужизни их мРНК снижается до 10 мин.
Это сам по себе очень красноречивый факт Но не менее ин
тересно его конкретное объяснение.
Как неоднократно отмеча-
лось, гистоновые мРНК не име-
ют поли(А) фрагмента. Зато
в их З'-нетранслируемой обла-
сти содержится шпилечная
петля (рис. 2.37). Возможно,
она так же как петля поли(А)-
фрагмента, защищает 3' конец
мРНК от РНКазы. Но ее осо-
бенностью является сродство
к гистонам. Причем связыва-
ние гистонов приводит к уско-
рению деградации мРНК По-
видимому, причиной является
разрушение структуры петли,
что и делает З'-конец досту-
пным для РНКазы.
ЯДРО: экспрессия генов и транскрипционные факторы 147
б) Тубулиновая мРНК. Распад этой мРНК также ускоря-
ется продуктами ее трансляции — мономерами тубулина и даже
не до конца синтезированным пептидом.
Механизм этого эффекта пока неясен. Но в любом случае
речь вновь идет о той же отрицательной обратной связи, кото-
рую постулировал В. А. Арбузов.
2 9 2 4. Влияние лиганда белка на распад мРНК
Однако, похоже, в регуляции распада мРНК иногда бывают
задействованы и более сложные связи. Примером является
мРНК трансферрина — белка, который необходим для транс-
порта ионов железа в плазме крови и переноса их в клетки.
(В самих же клетках ионы Fe2* связываются с другим белком —
ферритином). Образуется трансферрин в гепатоцитах.
Так вот, при недостатке ионов железа в клетках печени
стабильность трансферриновой мРНК высокая. Поэтому тран-
сферрин интенсивно образуется и обеспечивает связывание же-
леза (в местах разрушения эритроцитов, из продуктов питания
и т. д.). Это в конечном счете способствует повышению концен-
трации ионов Fe21 и в клетках (как в гепатоцитах, так и в прочих
Гис. 2.3** . Гипстг ТИЧК ИЛЯ МОЛ~-ЛЬ еяиьии* же г -
на стабильность мГНКтранс*ч ррина
148
Глава 2
При избытке же этих ионов в гепатоцитах стабильность
трансферриновой мРНК значительно снижается. Соответствен-
но, ослабевает и синтез трансферрина.
Как видим, в данном случае на интенсивность распада
мРНК оказывает влияние не сам кодируемый ею белок, а ли-
ганд, связывающийся с этим белком.
Возможный механизм такого влияния показан на
рис. 2.38. В З'-нетранслируемой области мРНК трансферрина
имеются 5 «шпилек», составляющие т. н. железочувствитель-
ный элемент (IRE — iron-responsive element). В отсутствие ио-
нов Fe2' здесь связывается специальный белок — IRE-связы-
вающий белок. И это каким-то образом защищает поли(А)-фраг-
мент мРНК от немедленного действия З'-РНКазы. Не исключе-
но, что данный белок, взаимодействуя одновременно с IRE и 3 -
концом поли(А)-фрагмента, облегчает образование поли(А)-
фрагментом петли с защищенным З'-концом.
Ионы же Fe2\ накапливаясь в гепатоцитах, вызывают дис-
социацию IRE-связывающего белка. Поэтому поли(А)-фрагмент
мРНК трансферрина становится доступным для З'-РНКазы.
Литература к главе 2
Арбузов В.А. Сравнительное исследование некоторых меха-
низмов регуляции метаболизма информационной РНК у прока-
риот и эукариот. Автореферат докт. дис М 1980 35 с
Копнин Б. П. Мишени действия онкогенов и опухолевых
супрессоров ключ к пониманию базовых механизмов канцеро-
генеза//Биохимия, 2000, 65. С. 5-33.
Мушкамбаров Н. Н. Аналитическая биохимия. М.: Экс-
педитор, 1996 Т. 2. С.395-798
Общая вирусология. М Медицина, 1982, 380 с.
Страиер Л Биохимия М . Мир, 1985. Т. 3. С. 1-396.
Уайт А и др Основы биохимии М Мир, 1982. Т. 2.
С. 540-1152.
Чумаков П. М. Функция гена р53: выбор между жизнью
и смертью//Биохимия, 2000, 65. С. 5-33.
Эллиот В., Эллнот Д Биохимия и молекулярная биоло-
гия. М НИИБМХ, 1999, 372 с.
Глава 3.ЦИТОПЛАЗМА: ОБРАЗОВАНИЕ
БЕЛКОВ - ТРАНСЛЯЦИЯ, ФОЛДИНГ,
МОДИФИКАЦИЯ
3.1 . ВВЕДЕНИЕ
а) В прошлой главе мы рассмотрели синтез и созревание
в клеточных ядрах трех видов РНК.
При этом, как было сказано, 4 вида рРНК тут же в ядре
(а точнее, в ядрышках) объединяются с рибосомальными белка-
ми, формируя субъединицы рибосом. Эти субъединицы через
ядерные поры перемещаются в цитоплазму.
Туда же перемещаются и многочисленные мРНК (в ком-
плексе со специальными белками), а также тРНК (нескольких
десятков видов).
С другой стороны, в цитоплазме присутствуют, помимо про-
чего, 20 видов аминокислот (синтезированных в самой клетке
или поступивших из крови).
Наконец, здесь же находятся 20 видов ферментов амино-
ацил-тРНК-синтетаз (п. 2.5.3.2) — и дополнительные белковые
факторы.
Все эти вещества участвуют в трансляции — последова-
тельном включении аминокислот в строящиеся пептидные цепи
в соответствии с последовательностью кодонов в мРНК (п. 2.1).
б) Но и по окончании трансляции процесс образования бел-
ков обычно еще не завершен. Так, затем происходят:
— фолдинг, т. е. сворачивание пептидной цепи в простран-
ственную структуру;
- а в случае многих белков еще и модификация (напри-
мер, присоединение углеводных компонентов, окисление
определенных аминокислотных остатков и т. д.).
Для всего этого также необходимы специальные белки,
в т. ч. ферменты. В частности, достижение белком правильной
конфигурации в ходе фолдинга значительно ускоряется недавно
открытыми вспомогательными белками — шаперонами.
в) Наконец, последняя важная задача — обеспечить до-
ставку белка к месту его будущего функционирования. Для это-
го тоже существуют специальные механизмы. Причем решение
данной проблемы начинается еще с трансляции.
Т. н. «экспортные» (предназначенные к выделению из
клетки), мембранные и лизосомальные белки образуются мем-
браносвязанными рибосомами, т. е. рибосомами, прикреплен-
150
Глава 3
кыми к поверхности мембран эндоплазматической сети (ЭПС).
Благодаря этому конец синтезируемого пептида проникает во
внутреннее пространство ЭПС, где потом оказывается и весь бе-
лок. В этом же пространстве, следовательно, происходят затем
фолдинг и модификация данного белка. Далее в транспорте и мо-
дификации принимают участие другие мембранные структуры,
и прежде всего, аппарат Гольджи. В конечном счете белок
- либо выделяется в ходе экзоцитоза из клетки,
либо включается в состав той или иной мембраны,
либо остается внутри сформировавшейся лизосомы.
В отличие от этого, внутренние белки (белки гиалоплазмы,
митохондрий, ядра и т. д.) синтезируются на свободных, т. е.
мембранонесвязанных, рибосомах.
В целом, подводя итог вводному обзору, можно сделать та-
кое сравнение. — Как в родах и воспитании одного человека
принимает участие немало других людей, так и в образовании
и созревании любого белка участвует много других белков,
не говоря о нуклеиновых кислотах и прочих веществах; и все
они входят в сложную и хорошо отлаженную «производствен-
ную» систему.
Теперь более подробно рассмотрим отдельные «узлы» этой
системы.
3.2 . ТРАНСЛЯЦИЯ мРНК
3 2.1. Подготовительные стадии.
Центры рибосом
3.2 1 1 Связывание аминокислот с тРНК
В трансляции участвуют, как уже говорилось в п. 2.1,
не свободные аминокислоты, а аминоацил тРНК (аа-тРНК):
Ала-тРНКл”, Мет тРНКм" и т. д. для всех 20 аминокислот. Ина-
че говоря, каждая аминокислота связана с акцепторной петлей
«своей» тРНК (см. рис. 2.22).
Образование аа-тРНК (рис. 3.1) это не просто активация
аминокислоты, т. е. повышение ее реакционной способности.
В данном процессе решается, пожалуй, самая важная проблема
трансляции сопряжение аминокислоты с ее антикодоном
Что касается способа решения этой проблемы, то, как ни
пытались некоторые исследователи найти стерическое соответ-
ствие между этими структурами, доказать его наличие так и не
I [ИТОПЛАЗМА: образование белков...
151
удалось. Остается считать, что ключевую роль в правильном
связывании играют специфические ферменты — аминоацил
тРНК синтетазы (п. 2.5.3.2), и для выполнения данной роли
они должны иметь по 2 центра узнавания — для аминокислоты
и для тРНК.
Существует еще одна проблема: взаимодействие аминоки-
слоты с тРНК сталкивается с энергетическим барьером.
Для преодоления последнего используется молекула АТФ. Поэ-
тому реакция идет в две стадии:
- вначале аминокислота связывается с аденилатом,
и лишь затем переносится на тРНК.
Обе стадии проходят в активном центре аминоацил-тРНК-
синтетазы.
Каждая молекула тРНК может использоваться в качестве
«носителя» аминокислоты многократно. Иными словами, осво-
бодившись в процессе трансляции от предыдущей молекулы
аминокислоты, тРНК становится способной связывать (с помо-
щью аминоацил-тРНК-синтетазы) очередную молекулу того же
вида аминокислот.
А может ли молекула аминокислоты несколько раз участво-
вать в реакции связывания с тРНК? В принципе — да, но в этом
случае цикл более сложный. Необходимо, чтобы белок, в кото-
рый была включена данная молекула аминокислоты, «отрабо
тал» свой срок, разрушился и рассматриваемая молекула вновь
попала в пул используемых для трансляции аминокислот.
3.2.1.2. Функциональные центры рибосом
Собственно процесс трансляции начинается со сборки ак-
тивной рибосомы, что обозначается как инициация трансля-
ции. Эта сборка происходит строго упорядоченным образом, что
обеспечивается функциональными центрами рибосом.
152
Глава 3
гРНК аа-тРНК
субъединица субъединица
3.2 форм?»
Поэтому, чтобы понять по-
следовательность сборки и сам
ход трансляции, необходимо вна-
чале рассмотреть данные центры.
Все эти центры находятся на
контактирующих поверхностях
обеих субъединиц рибосомы.
Вообще говоря, форма субъ-
единиц рибосом, а также их кон-
тактирующих поверхностей
весьма сложная (рис. 3.2). Со-
бранная рибосома до известной
степени напоминает по форме
сердце (без полостей), правые
отделы которого образованы ма-
лой субъединицей, а левые (бо-
лее объемные) — большой субъе-
диницей. Причем между теми
И другими находится не перего-
родка, а серия небольших поло-
стей — углублении в контактирующих поверхностях. В этих по-
лостях располагаются в собранной рибосоме другие участники
трансляции — мРНК, пептидил-тРНК (синтезированный на
данный момент пептид, связанный с тРНК) и очередная амино-
ацил-тРНК.
Соответственно, на контактирующих поверхностях имеют-
ся центры связывания этих компонентов, а также центры, ката-
лизирующие образование пептидной связи и постепенное пере-
мещение рибосомы относительно мРНК.
Таким образом, рибосома в собранном виде, хотя и включа-
ет около 80 макромолекул (рис. 2.25), является фактически су-
перферментом. Действительно, как и обычные ферменты, она
во-первых, правильно ориентирует участников процесса
друг относительно друга,
а во-вторых, катализирует определенные реакции между
ними.
В дальнейшем (для простоты) мы будем представлять субъ-
единицы рибосом в виде двух шаровых сегментов (как это было
сделано на рис. 2.25). И, чтобы показать взаимное расположе-
ние центров, вначале спроецируем последние на условную пло
скость между субъединицами (рис. 3.3).
Тогда на этой плоскости окажется следующее.
а) Центр связывания мРНК (М центр). Он образован участ-
ком 18S рРНК, который комплементарен на протяжении
ЦИТОПЛАЗМА, образование белков...
153
Яис. 3.3. Г.£<Л.КЦИ»; < ункци>, НУЛИНЫМ Ц* МП t f МбОСГЧАЫ HU гию-
t. кость м< ЖКУ субиедмницсми
5-9 нуклеотидов 5'-нетранслируемому фрагменту мРНК
(п. 2.5.2).
б) Пептидильный центр (П-центр). В начале процесса тран
сляции с ним связывается инициирующая аа-тРНК. В соответ-
ствии с тем же п. 2.5.2, у эукариот инициирующий кодон всех
мРНК всегда кодирует метионин. Поэтому инициирующей аа-
тРНК является одна из двух метиониновых аа-тРНК, отмечае-
мая нижним индексом i: Мет-тРНК,
На последующих же стадиях трансляции в П-центре нахо-
дится пептидил-тРНК, содержащая уже синтезированную часть
пептидной цепи.
Иногда говорят также о Е-центре (от «exit» — выход), куда
перемещается тРНК, потерявшая связь с пептидилом, перед
тем, как покинуть рибосому. Однако мы будем рассматривать
этот центр как составную часть Р-центра.
в) Аминокислотный центр (А-центр) — место связывания
очередной аа-тРНК.
г) И, наконец, пептидилтрансферазный центр (ПТФ
центр): он катализирует перенос пептидила из состава пепти-
дил-тРНК на поступившую в А центр очередную аа тРНК.
При этом образуется еще одна пептидная связь и пептидил удли-
няется на одну аминокислоту.
Как в А , так и в П-центре антикодоновая петля соответ-
ствующей тРНК (аа тРНК или пептидил тРНК), очевидно, обра-
щена к М-центру (взаимодействуя с мРНК), а акцепторная пет-
ля с аминоацилом или пептидилом к ПТФ центру.
Итого — 4 основных центра. Как же они распределяются
между малой и большой субъединицами рибосомы? Это показа
но на рис. 3.4.
154
Гпава 3
Рис. 3.4. ТЧиспрадеДОни*» фуници «нзльных центр- ь между суб’
единицами
Малая субъединица. Поскольку именно она содержит 18S-
рРНК, с участком которой связывается мРНК, то М-центр рас-
положен на данной субъединице.
Кроме того, здесь же находятся основная часть А-центра
и небольшая часть П центра.
Большая субъединица На ее контактирующей поверхно-
сти расположены остальные части П- и A-центров. В случае П-
центра — это его основная часть, а в случае А-центра — участок
связывания акцепторной петли аа-тРНК с аминокислотным ра-
дикалом (аминоацилом); остальная же и большая часть аа
тРНК связывается с малой субъединицей.
Большой субъединице принадлежит также ПТФ центр.
Всеми этими обстоятельствами и определяется порядок
сборки рибосомы на стадии инициации трансляции.
3.2.1 3 Инициация трансляции (рис. 3.5)
Прежде всего происходит связывание мРНК (своим 5'-не-
транслируемым участком) с малой (40S ) субъединицей рибосо-
мы. При этом инициирующий кодон (АУ Г) оказывается на уров-
не П центра будущей рибосомы.
Далее за счет комплементарного взаимодействия с этим ко-
доном происходит связывание инициирующей аа-тРНК, т. е.
МеттРНК,м".
А последняя, взаимодействуя с П центром большой субъе-
диницы, вызывает связывание и этой субъединицы.
Таким образом, формируется своеобразный «бутерброд» из
четырех основных компонентов.
Однако, помимо их, для инициации трансляции необходи-
мы и другие участники — ГТФ и три белковых фактора — eIF-1,
eIF-2 и eIF-З (от eucariotic initiation factor).
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
155
мРНК
408-субъедииица
(40S) (мРНК)
(eIF-2. ГТФ,
elF-1)
Мет-тРНК?’"
(40S) (мРНК) (Mei-TPHKiMci)
бОЯ-субъединнш
(40S) (мРНК) (MeT-TPHKil'Ul) (60S)
Г м> 3,5. пГслыдесТтА-тж ctv
cf * «гания менте» гц-и-
инициации Т^кНСЛЯЦИИ
Из них фактор eIF-3,
присоединяясь к свободной
малой субъединице рибосо-
мы, препятствует преждевре-
менному связыванию боль-
шой субъединицы и, наобо-
рот, способствует связыва-
нию мРНК
Другой фактор —
eIF-2 — участвует в связыва-
нии инициирующей аа
тРНК. Возможно, этот белок
образует комплекс с этой аа-
тРНК еще вне рибосомы,
причем в состав комплекса
входит и ГТФ
Затем — в процессе установки Мет-тРНК, на свое место
в П-центре и связывания большой субъединицы — ГТФ гидро-
лизуется до ГДФ и неорганического фосфата. Одновременно
факторы eIF-З и eIF-2 покидают рибосому.
Таким образом, сборка активной рибосомы идет с разрывом
одной макроэргической связи. Выделяющаяся при этом энергия
создает термодинамический стимул для протекания процесса
в нужном направлении.
Что касается фактора eIF-1, то он, видимо, способствует но-
вой «зарядке» фактора eIF-2 путем присоединения к нему оче-
редных молекул ГТФ и Мет-тРНК1Мст.
В итоге инициации трансляции в П центре собранной рибо-
сомы оказываются инициирующий кодон мРНК (АУГ) и связан-
ная с ним инициирующая аа-тРНК.
Последняя при образовании первой пептидной связи играет
роль пептидил-тРНК.
3.2.2. Элонгация и терминация трансляции
После инициации начинается основной этап трансляции
процесс элонгации (удлинения пептидной цепи).
Он имеет циклический характер: включению каждой оче-
редной аминокислоты соответствует один и тот же цикл собы-
тий — независимо от того, сколько аминокислотных остатков
уже находится в пептидной цепи — только один (как сразу по-
сле инициации) или уже более сотни.
156
Глава 3
3 2.2 1. Стадии элонгации
В цикле элонгации различают 3 стадии. Иллюстрируя их
(рис. 3.6), мы вновь будем проецировать участников событий на
условную плоскость между субъединицами рибосомы.
При этом, для упрощения, П центром мы будем называть
всю левую (на рисунке) половину круга, а А-центром — всю пра-
вую половину. Т. е. в состав этих центров будем включать и при-
легающие участки М- и ПТФ-центров.
а) Связывание аа тРНК На первой стадии цикла со сво-
бодным А центром рибосомы связывается очередная аа-тРНК —
та, чей антикодон комплементарен кодону мРНК, находящему-
ся в А центре.
В общих чертах это происходит
примерно так же, как связывание
инициаторной аа тРНК с П-центром.
Т. е. тоже используются молекула
ГТФ и два белковых фактора — факто-
ры элонгации EF-lu и EF 1s (от elon-
gation factor).
Фактор EF-lu (подобно фактору
eIF-2) образует комплекс с ГТФ
и с проникающей в рибосому очеред-
ной аа-тРНК.
Если антикодон этой аа-тРНК не
комплементарен кодону мРНК в А
центре, комплекс не задерживается
здесь и путем диффузии покидает ри-
босому.
В случае же комплементарного
взаимодействия антикодона с кодоном
вышеуказанный комплекс распадает-
ся: его аа-тРНК связывается с А цен-
тром, ГТФ гидролизуется до ГДФ,
и последний высвобождается вместе
с фактором EF-lu.
Затем EF-lu, при участии факто-
ра EF-ls (подобного фактору elF 1),
вне рибосомы обменивает ГДФ на ГТФ
и связывает очередную молекулу аа-
тРНК.
б) Замыкание пептидной связи.
В рибосоме же после первой стадии
цикла оказываются друг возле друга
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
157
Рис. 3.7. Стр;«з' глии*п птиднгЛ< гкэи ихтщ псптикиягрлц: 44.
резне й j + йКЦИИ
пептидил-тРНК (в П центре) и аа-тРНК (в A-центре). Причем их
акцепторные петли и связанные с ними аминокислотные остат-
ки располагаются в каталитическом (ПТФ) центре.
Последний и осуществляет пептидилтрансферазную (ПТФ)
реакцию — переносит пептидил (или инициирующую аминоки-
слоту) с его тРНК на аминокислоту пришедшей аа-тРНК.
Заметим: с тРНК аминокислотный остаток связан с помо-
щью своей карбоксильной группы (рис. 3.7). В ходе же ПТФ-ре-
акции данная группа пептидила образует пептидную связь
с аминогруппой очередной аминокислоты. Следовательно,
аминный (N ) конец пептидила остается интактным.
Это означает, что рост пептидной цепи при трансляции
происходит в направлении от N- к С-концу.
ПТФ-реакция сопровождается выделением некоторого ко-
личества энергии. Поэтому ГТФ в качестве источника энергии
не требуется.
Не требуются и какие-либо дополнительные белковые фак-
торы.
В результате ПТФ реакции пептидил удлиняется на один
аминокислотный остаток и оказывается связанным через этот
остаток с другой тРНК. При этом антикодоновая петля этой
тРНК еще находится в A-области рибосомы, а акцепторная пет-
ля вместе с пептидилом, возможно, оказывается в ходе реакции
в П центре (А/П ориентация). Это может быть причиной созда-
ния стерического напряжения
Прежняя же тРНК пептидила становится свободной: ее «го-
лова» (антикодоновая петля) еще находится в П-центре, а осво-
бодившийся «хвост» (акцепторная петля) релаксирует в сторону
Е (ехИ)-участка П-центра (П/Е-ориентация).
158
Глава 3
в) Транслокация (см. рис. 3.6). Завершающая стадия ци-
кла — перемещение (транслокация) мРНК вместе с вновь обра-
зованной пептидил-тРНК относительно рибосомы на длину од-
ного кодона.
Или можно сказать, что рибосома перемещается относи-
тельно мРНК — в направлении ее З'-конца.
Движущей силой транслокации может быть стерическое
напряжение в структуре новой пептидил-тРНК. «Хвост» (пеп-
тидил, зафиксированный в П-центре) втягивает в П-центр и «го-
лову» (тРНК). А так как последняя связана с кодоном мРНК,
то и мРНК тоже перемещается относительно рибосомы.
В процессе участвуют ГТФ и белковый фактор элонгации
EF-2, называемый также транслоказой. Не исключено, что ре-
шающую роль в создании «тяги» играет стерическое напряже-
ние не в пептидил-тРНК, а в транслоказе, создаваемое за счет
энергии ГТФ.
Как бы то ни было, в результате транслокации в П центре
рибосомы оказываются новая пептидил-тРНК и соответствую-
щий ей кодон мРНК. Освободившаяся же тРНК вытесняется из
рибосомы.
Что же касается A-центра, то он содержит теперь следую
щий кодон мРНК и готов к приему новой аа-тРНК.
На этом цикл элонгации заканчивается и начинается оче-
редной цикл. Как видим, удлинение пептидной цепи на один
аминокислотный остаток требует расхода 2 молекул ГТФ (по од-
ной — на связывание аа-тРНК и на транслокацию).
Многократное повторение таких циклов и приводит
к включению в строящуюся пептидную цепь аминокислотных
остатков в соответствии с последовательностью кодонов
в мРНК
3.2.2.2. Терминация трансляции
Сигналом об окончании трансляции служит появление
в рибосоме одного из «бессмысленных» кодонов мРНК — УАА
УАГ или УГА (п. 2.2.2.3 и рис. 3.8).
Этот кодон узнается уже не антикодоном аа тРНК, а белко-
выми факторами терминации (eRF от eucariotic releasing fac-
tor). Таких факторов — два: один узнает последовательность
У-A Пур, т. е. кодоны УАА и УАГ; второй — последователь-
ность У Пур-А, т. е. опять-таки кодон УАА, а также кодон УГА.
Фактор eFR, узнав «свой» антикодон, стимулирует гидро-
лазную активность (ГА) пептидилтрансферазного центра. Бла
ЦИТОПЛАЗМА образование белков
159
годаря этому гидролизуется связь между тРНК и пептидом.
Ни ГТФ, ни какого иного кофермента для этой реакции не тре-
буется.
После этого пептидная цепь, тРНК и мРНК покидают рибо-
сому, а субъединицы последней диссоциируют друг от друга
и теперь готовы начать синтез очередной пептидной цепи.
3.2.3. Полисомы
В приведенном описании мы рассматривали только одну
рибосому. Между тем одну цепь мРНК, как правило, одновре-
менно транслируют сразу несколько рибосом (рис. 3.9).
Действительно, вначале с 5' нетранслируемым участком
созревшей мРНК связывается первая рибосома (вместе с иници-
160
Глава 3
ирующей аа тРНК). Она начинает продвигаться к З'-концу
мРНК и включать аминокислоты в пептидную цепь.
При ее удалении на достаточное расстояние от 5’-нетран-
слируемого участка последний становится доступным для сле-
дующей рибосомы. И так далее.
В итоге получается полисома (или полирибосома) — ком-
плекс рибосом, соединенных цепью мРНК и постепенно продви-
гающихся к ее З'-концу.
Иначе говоря, трансляция имеет такой же конвейерный ха-
рактер как и транскрипция (п. 2.6.2.4).
Среднее расстояние между соседними рибосомами в по-
лисоме (AN) зависит от многих факторов (в частности, соотно-
шения между пулом рибосом и мРНК). При трансляции гло-
биновых мРНК в ретикулоцитах оно составляет около 80 ну-
клеотидов
Исходя из длины кодирующей части глобиновой мРНК
(примерно 430 нуклеотидов), нетрудно определить, что полисо-
ма с такой мРНК содержит 5—6 рибосом.
Средняя скорость перемещения рибосом по мРНК у эука-
риот варьирует в пределах 2—15 нуклеотидов/с. У бактерий она
в несколько раз выше (30 50 нуклеотидов/с).
Перемещение рибосомы на 3 нуклеотида (т. е. на один ко-
дон) означает, что произошло включение в пептид еще 1 амино-
кислотного остатка. Следовательно, скорость включения амино-
кислот в строящиеся белки составляет у эукариот примерно
1—5 остатков/с.
При скорости 1,2 остатков/с общая продолжительность
трансляции глобиновой мРНК равна 2 мин.
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
161
3.2.4. Особенности трансляции у
прокариот и в митохондриях
3.2.4.1. Прокариоты
В случае прокариот белоксинтезирующая система и сам
процесс ее функционирования имеют ряд особенностей.
Данное обстоятельство очень важно хотя бы потому, что
создает предпосылки для избирательного ингибирования бел-
кового синтеза у микроорганизмов — без существенного воздей-
ствия на трансляцию в хозяйском организме. И эти предпо-
сылки блестящим образом реализуются, например, в случае ан-
тибиотиков.
Первая особенность — иные параметры рибосом (рис. 3.10).
Субъединицы рибосом и входящие в них рРНК несколько мень-
ше по размеру, чем в случае цитоплазматических рибосом эука-
риот. Кроме того, в большой субъединице содержится не 3, а 2
молекулы рРНК. Наконец, меньше количество и белковых мо-
лекул в каждой субъединице.
Отличаются также дополнительные белковые факторы, ис-
пользуемые в трансляции, — факторы инициации, элонгации
и терминации.
Вместе с тем принципиальное строение рибосом (включая
их функциональные центры) таково же, как у эукариот.
70 S (80 8)-рибосома
Малая субъединица,
или 30 S (40 S)-
частица
Большая субъединица,
или 50 S (60 S)-
частица
16 S(18 S)-pPHK
23 S (28 S) рРНК,
5S (5,8S)-pPHK
(5 S рРНК)
21 ( 30) белков
34 (~ 45) белков
Рис. 3.10. Состав бактериалыюй^и*' сомы
1 скобках гшалогнчиыь показа г-для фмеао&аматически* рибо-
!ом зукариот
6-36
162
Глава 3
Теперь перечислим три ключевые особенности самого про-
цесса трансляции у бактерий.
а) Сопряжение трансляции с транскрипцией. Как уже
отмечалось в п. 2.9.1, у прокариот могут одновременно происхо-
дить и дальнейшее удлинение мРНК в ходе транскрипции,
и трансляция уже образовавшихся частей этой мРНК (см.
рис. 2.34).
Т. е. образуется единый комплекс:
1) ДНК (являющаяся у бактерий кольцевой),
2) продвигающаяся по ней РНК-полимераза,
3) участок синтезируемой мРНК,
4) продвигающиеся по нему рибосомы,
5) участки синтезируемых пептидных цепей.
б) Сопряжение синтеза нескольких пептидных цепей.
Известно нам также, что бактериальные мРНК — полицистрон-
ные (п. 2.5.2), т. е. содержат информацию о структуре несколь-
ких пептидных цепей.
Каждый цистрон мРНК имеет инициирующий и терми-
нирующий кодоны, а перед инициирующим кодоном — спе-
циальную последовательность (т. н. последовательность
Шайна-Дальгарно аналог 5'-нетранслируемой области
у мРНК эукариот) для связывания с 16S-pPHK малой субъе-
диницы.
Поэтому цистроны мРНК могут транслироваться одновре-
менно и независимо друг от друга.
Иными словами, каждая отдельная рибосома связывается
в области Шайна-Дальгарно одного из цистронов и высвобожда-
ется, дойдя до конца этого цистрона.
И независимо от этого происходит связывание других рибо-
сом с прочими цистронами той же мРНК и их трансляция.
в) Инициаторная аа тРНК Наконец, иной является
у бактерий и инициаторная аминоацил-тРНК не
Мет-тРНК, , а формилМет-тРНК/*".
Это значит, что после связывания с инициаторной тРНК ос
таток метионина еще присоединяет формильную группу — так,
что последняя блокирует аминный конец.
Поэтому N конец всех строящихся цепей у бактерий начи-
нается с формилметионина
По окончании трансляции отщепляется или только фор
мильная группа, или весь этот аминокислотный остаток.
Что же касается механизма трансляции, то, видимо, в це-
лом он совпадает с таковым у эукариот.
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
163
3.2.4.2. Митохондрии
В клетках эукариот рибосомы содержатся не только в гиа-
лоплазме, но и в митохондриях (а в растительных клетках —
еще и в хлоропластах).
Кроме рибосом, митохондрии (и хлоропласты) содержат так-
же свою ДНК, способную к репликации и транскрипции. Т. е. име
ется автономный геном и автономная система его экспрессии.
Эта система во многом сходна с таковой у прокариот:
а) ДНК является не линейной, как в хромосомах ядра,
а кольцевой;
б) рибосомы по своим параметрам близки к бактериаль-
ным (см. рис. 3.8), т. е. несколько мельче рибосом цитоплазмы;
в) для инициации трансляции используется формилМет-
тРНК/'".
При этом митохондриальная ДНК (мтДНК) по размеру
очень невелика: содержит лишь -15 000 нуклеотидных пар, что
на 3-4 порядка меньше, чем в ДНК хромосом.
В одной митохондрии имеется 1-2 молекулы мтДНК; в це
лом же во всех митохондриях клетки оказывается довольно
много таких молекул — от 50 до 3000. Вероятно, все они прак-
тически одинаковы.
Тем не менее суммарная доля этих мтДНК в общей массе
ДНК клетки является весьма небольшой — не более 0,5-1,0 %.
Еще меньше вклад мтДНК в общее количество генов. Так,
мтДНК кодирует лишь 10-20 митохондриальных белков, что
составляет лишь -5 % всех белков митохондрий. Кроме того,
мтДНК кодирует рРНК митохондриальных рибосом и митохон-
дриальные тРНК.
Примечательно, что во внутримитохондриальной трансля-
ции используются всего 22 вида тРНК, тогда как в цитоплазме
их — около 60.
Итак, вся эта автономная система обеспечивает образова
ние весьма небольшого количества митохондриальных белков.
Остальные же 95 % белков митохондрий (не говоря о всех про-
чих клеточных и внеклеточных белках) кодируются хромосома
ми ядер и синтезируются цитоплазматическими рибосомами
Что, в частности, создает проблему переноса новосинтезирован
ных белков из гиалоплазмы в митохондрии.
Возникает вопрос: зачем воообще нужно было создавать ав-
тономный митохондриальный геном и автономную систему его
экспрессии?
Наиболее популярный ответ состоит в том, что митохон
дрии (и хлоропласты) — это «потомки» древних прокариот, ко-
164
Гпава 3
тэрые внедрились в эукариотические клетки и образовали с ни-
ми симбиоз. Отсюда — и все те совпадения, которые были пере-
числены выше.
3.3. ИНГИБИТОРЫ ТРАНСЛЯЦИИ
3.3.1. Ингибирование трансляции у бактерий
Как мы уже сказали (п. 3.2.4 1), многие антибиотики (ве-
щества, выделенные из грибов, бактерий и т. д.) являются спе-
цифическими ингибиторами трансляции у микроорганизмов —
без заметного воздействия (в терапевтических дозах) на анало-
гичный процесс в клетках хозяина. Это как бы химическое ору-
жие, используемое одними микроорганизмами против других.
Здесь мы назовем лишь некоторые из огромного числа та-
ких соединений. Непосредственным объектом их влияния слу-
жат те или иные функциональные центры рибосом (рис. 3.11) —
в составе малой или большой субъединицы.
а) Антибиотики, действующие в области малой (30S )
субъединицы.
Стрептомицин воздействует на ту часть П центра, которая
находится на малой субъединице. Тем самым он затрудняет свя-
Мет
зывание инициаторной аа-тРНК (формилМет-тРНКг ), т. е.
ингибирует инициацию белкового синтеза.
Если тем не менее инициация произошла, то все равно
в присутствии стрептомицина пептидил-тРНК плохо связана
с малой субчастицей рибосомы. Это делает рибосомный ком-
плекс непрочным, отчего он нередко распадается преждевре-
менно.
МАЛАЯ
СУБЪЕДИНИЦА
Тетрациклин
(на А центр)
Стрептомицин
(на П центр)
Левомицетин
Эритромицин
(на центр
транслокации)
(на ПТФ-центр) БОЛЬШАЯ
СУБЪЕДИНИЦА
Рис. 3 < 1 - Места д*йст»и* днТиби^тик'ж
ла трчиспчцик у
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
765
Другой известный антибиотик — тетрациклин — воздей-
ствует на A-центр ЗОБ-субчастицы Поэтому ингибируется свя-
зывание очередной аа-тРНК.
б) Антибиотики, действующие в области большой
(50S ) субъединицы.
Левомицетин (или хлорамфеникол) ингибирует активность
ПТФ-центра.
А эритромицин действует на тот участок большой субъеди-
ницы, который отвечает за транслокацию. В результате, новая
пептидил-тРНК (образовавшаяся после очередной ПТФазной
реакции) остается в A-центре (не перемещаясь в П-центр)и пре
пятствует связыванию очередной аа-тРНК.
Все эти эффекты, как уже дважды отмечалось, имеют изби-
рательный характер: в отношении эукариотических рибосом
они отсутствуют. Но это не означает полной безвредности анти-
биотиков; на организм пациента они могут оказывать немало
побочных воздействий, хотя и другими способами.
3.3.2. Ингибирование трансляции у эукариот
Познакомимся также с веществами, ингибирующими тран
сляцию у животных (в т. ч. у человека).
3.3.2.1 Антибиотики
РИС 3.12- йстгм*
пуромицина
Некоторые антибиотики способны
влиять на белковый синтез не только
у бактерий, но и у эукариот, или же вооб-
ще лишь у последних.
В частности, циклогексимид сказы
вает такое же действие, как и левомице-
тин (хлорамфеникол), т. е. блокирует
ПТФ центр. Но объектом этого действия
является большая субъединица не бакте-
риальных (70S ), а эукариотических
(80S ) рибосом.
Другой антибиотик, пуромицин,
структурный аналог аа-тРНК: содержит
ароматическую аминокислоту, связан-
ную с аденозиноподобным нуклеотидом.
Поэтому он занимает A-центр рибо
сомы (рис. 3.12) как бактериадьной,
так и эукариотической. Затем в пепти
дилтрансферазной реакции на пуроми
166
Глава 3
КАТАЛИ!
цин переносится пептидил. Но, поскольку здесь нет настоящей
тРНК, продукт реакции (пептидилпуромицин) не подвергается
транслокации в П-цецтр, а просто покидает рибосому.
Таким образом, пуромицин обрывает элонгацию пепти-
дной цепи с высвобождением пептидилпуромицина.
3.3.2.2 Дифтерийный токсин
Среди токсинов особенно хорошо изучено действие на тран-
сляцию дифтерийного токсина (ДТ), выделяемого одноименны-
ми бактериями.
ДТ поражает не только те ткани, которые заселяются при
инфекции дифтерийными палочками (т. е. слизистые оболочки
верхних дыхательных путей), но и внутренние органы, куда
токсин попадает с током крови.
В клетках ДТ инактивирует один из факторов элонгации,
а именно фактор EF-2, или транслоказу (п. 3.2.2.1). Поэтому ин-
гибируется и синтез белка в целом.
Более детально механизм
действия ДТ показан на
рис. 3.13.
В нативном ДТ единая по-
липептидная цепь образует 2
домена — А и В.
Домен В узнает на поверх-
ности клетки ганглиозид GM1,
который, видимо, соединен
с белком, обладающим проте-
азной активностью. Во всяком
случае, после взаимодействия
с GM] ДТ расщепляется на до-
мены А и Б, из которых пер-
вый проникает внутрь клетки.
Здесь он катализирует пе-
ренос АДФ рибозы от кофер
мента НАД' на фактор EF-2
(транслоказу). Эта модифика-
ция и приводит к инактивации
данного фактора.
Заметим, что почти таков
же механизм действия холер-
ного токсина на аденилатцик-
лазу эпителиальных клеток
кишечника. Токсин состоит из
АДФ-ри юга
г- 3,13. Ме»ани«ч дейотои:
дифтерийноготоксина 1ДТ]
ЦИТОПЛАЗМА, образование белков...
167
субъединиц А и В, одна из которых узнает поверхностный оли-
госахарид, а другая катализирует аналогичную модификацию
(АДФ рибозилирование) белка-мишени.
Следовательно, это в большей или меньшей степени общий
механизм; только в случае ДТ белком-мишенью является один
из факторов трансляции.
3.3.2.3. Интерфероны
Еще один общий механизм используется при ингибирова-
нии трансляции интерферонами (Иф).
Интерфероны — небольшие белки (гликопротеины). Они
вырабатываются в клетках животных, инфицированных неко-
торыми вирусами, а также в ряде других случаев. Особенно эф-
фективно индуцируют образование Иф вирусы с двухцепочеч-
ной РНК — в частности, реовирусы (п. 2.8.1.4)
Иф, видимо, могут действовать как на ту же клетку, кото-
рая их секретировала, так и на окружающие клетки. При этом
они, подобно многим другим внеклеточным регуляторам,
внутрь клеток не проникают, а лишь связываются со специфи-
ческими рецеп орами клеточной мембраны Это запускает раз-
личные сигнальные пути.
Один из путей включает сборку определенного транскрип
ционного фактора и, следовательно, кончается специфическим
изменением активности некоторых генов.
Другие же сигнальные пути имеют очевидную антивирус-
ную направленность. Они инициируются при образовании на
клеточной поверхности комплекса Иф с вирусной РНК и вызы-
вают следующие конечные эффекты:
а) стимуляцию распада в клетках мРНК и
б) торможение трансляции.
Тем самым резко ограничивается синтез белков как соб-
ственных белков клетки, так и вирусных. Следовательно, ценой
подавления клеточной активности и, возможно, даже гибели
клетки предупреждается многократное увеличение числа ви-
русных частиц. Т. е., включая данные сигнальные пути в клет-
ках, подвергнутых вирусной атаке, Иф защищают от вирусной
инфекции прочие клетки.
Видимо, поэтому реовирусы (наиболее эффективно индуци-
рующие Иф) заболеваний у человека почти не вызывают.
Механизм указанных явлений показан на рис. 3.14
Стимуляция распада мРНК. Видимо, комплекс Иф-РНК
(сам или через посредника) активирует олигонуклеотидсинтета
зу (ОНС) фермент, катализирующий синтез олигоаденилата
(олиго(А))
168
Глава 3
РЙС. 3.14. МйХЯНИЗМ «нтигирусн^гс ДСЙСГаиЯ4КНГ€.{м>'.: р(.1Миг (И*>)
ЭНС -» олипмукл^тилсинп та. i. ПК п; ч.ицуин; :
В свою очередь, олиго(А) активирует эндонуклеазу, способ-
ную (наряду с 3‘-РНКазами, п. 2.9.2) разрушать мРНК.
Торможение трансляции. Комплекс Иф РНК повышает
активность и протеинкиназы (опять-таки, скорее всего, с помо-
щью посредника), которая модифицирует определенные белки
путем их фосфорилирования.
Среди этих белков еще одна протеинкиназа (ПК eIF-2),
обладающая специфическим действием на фактор инициации
трансляции eIF-2 (п. 3.2.1.3). Фосфорилирование этой протеин-
киназой данного фактора приводит к потере его активности.
Таким образом, трансляция блокируется в самом начале
из-за того, что создается дефицит основных компонентов ини-
циаторного комплекса — инициирующей аа-тРНК (для связы-
вания которой с рибосомой необходим фактор е! ?-2) и мРНК.
Фосфорилирование-дефосфорилирование белков очень
распространенный способ регуляции их активности, используе-
мый для многих ключевых белков (в т. ч. ферментов). Подробно
он будет рассматриваться в главе 5. Сейчас же мы видим, что
с помощью этого механизма может регулироваться трансляция.
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
169
3.4. ФОЛДИНГ БЕЛКОВ: ОБЩИЕ
ПРЕДСТАВЛЕНИЯ
Итак, трансляция мРНК приводит к образованию пептид-
ной цепи со строго определенной последовательностью амино-
кислотных остатков.
Как отмечалось в п. 3.1, следующий этап формирования
белка — фолдинг, т. е. сворачивание пептидной цепи в правиль-
ную трехмерную структуру. Если белок состоит из нескольких
субъединиц, то фолдинг включает и объединение последних
в единую макромолекулу.
Но, чтобы лучше понять существо фолдинга и его возмож-
ные механизмы, нам потребуется вначале кратко вспомнить
строение белков.
3.4.1. Строение белков
Различают несколько уровней структуры белков: первич-
ную, вторичную, третичную, а для олигомерных белков — и
четвертичную структуры.
3.4.1.1. Первичная структура
Первичная структура это последовательность аминокис-
лотных остатков, связанных друг с другом пептидными связями
(рис. 3.15).
Именно данная структура непосредственно кодируется по-
следовательностью кодонов в мРНК и воспроизводится при
трансляции.
Принципиально важно, что практически все 20 аминокис-
лотных остатков, встречающихся в природных белках (и пере-
численных в табл. 2.1, п. 2.2.2.3), имеют сходный план строе-
ния. Они содержат трехчленный остов, со средним (а-углерод-
ным) атомом которого связан тот или иной радикал R:
R
I
NH СаН С
II
О
Именно радикалами и различаются аминокислотные остатки.
Соединяясь друг с другом пептидными связями, остовы ос-
татков формируют непрерывный остов пептидной цепи, где че
170
Глава 3
редуются три типа связи (см. рис. 3.15). Вокруг одной из них
(пептидной связи -СО—NH-) вращения невозможны. Зато во-
круг двух остальных связей ( NH—СаН- и -СаН—СО) возможно
вращение. Это-то и позволяет пептидной цепи изгибаться са-
мым причудливым образом, что приводит к образованию вто-
ричной и третичной структур.
3 4 1.2. Вторичная структура
Вначале многие фрагменты пептидной цепи приобретают
периодическую укладку того или иного типа: а-спираль или Р
структуру. Этот низший уровень пространственной организации
называется вторичной структурой.
В одной и той же молекуле глобулярного белка могут встре-
чаться разные виды вторичной структуры, а также т. н. бес-
структурные участки (лишенные какой либо вторичной струк-
туры). Соотношение между ними в разных белках различно
(табл. 3.1).
Таблица 3.1 Распределение аминокислотных остатков между
тремя вариантами вторичной структуры
Белок а-Спираль Р-Структура Бесструктурные участки
ТУБУЛИН 22% 30% 48%
ИНСУЛИН 52% 6 % 42%
МИОГЛОБИН 75 % 0% 25%
Напротив, в фибриллярных белках вторичная структура,
как правило, однообразна.
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
171
ф атом N
О - атом Са
О - атом С
© атом О
© атом Н
• • водородная связь
Так, целиком представлены «-спи-
ралью следующие белки: миозин, тро
помиозин, а-кератин. В этих белках
несколько цепей с а-спиралью закруче-
ны в суперспираль.
Белки же только с Р-структурой
фиброин шелка и p-кератин (получает-
ся из а-кератина путем обработки по-
следнего горячим паром).
Особый вид вторичной структуры
в еще одном фибриллярном белке
коллагене. Он имеет общие черты и с а
спиралью, и с P-структурой и называет
ся коллагеновой спиралью.
Что же представляют собой а-спи-
раль и Р структура?
а) a-Спираль (рис. 3.16). Здесь
остов пептидной цепи закручивается
в спираль — так, что радикалы амино-
кислот обращены кнаружи от спирали.
Эта структура удерживается водо
родными связями между остовами ами-
нокислот. Более точно, в образовании
одной такой связи участвуют группа
—NH— одной аминокислоты и группа
—СО— другой аминокислоты, которая
в пептидной цепи отделена от первой
тремя другими аминокислотами.
Рие..$Лв
$№м№и амипокиалйг
не показаны
В итоге на один виток а-спирали
приходится в среднем 3,6 аминокислот
ных остатков
Важно подчеркнуть, что а-спираль
(как в других случаях — P-структура) образуется только пото
му, что является наиболее термодинамически выгодным состоя-
нием для данного участка пептидной цепи.
б) [5-Структура (рис. 3.17). Здесь остовы пептидных це-
пей не скручены в спираль, а имеют зигзагообразную конфигу-
рацию (структура складчатого листа).
Такая структура тоже удерживается водородными связями
и между теми же группами (—NH— и —СО—). Но теперь (если
речь идет о глобулярном белке) для сближения этих групп и об
разования связей пептидная цепь образует складки.
Т. е. имеется двойная складчатость:
- во-первых, крупные складки в результате поворота цепи
на 180 ,
172
Глава 3
• •• водородная связь.
Рис. 3 17. ^-Структур. г»нтип ,рллл'-льн1 >й < к.-.адчлтмй глей
: J (;г.ч.4икллм?ммн'>х^лг-уп казаны)
- во-вторых, мелкие изгибы цепи в пределах одной складки.
Прилежащие друг к другу участки цепи в P-структуре мо-
гут быть как параллельными (идти в одном направлении), так
и антипараллельными.
В фибриллярных белках : P-структурой в образовании во-
дородных связей участвуют соседние и расположенные парал-
лельно пептидные цепи
От чего же зависит вторичная структура того или иного бел-
ка или его фрагмента? Ответ однозначен: она определяется пер-
вичной структурой белка или рассматриваемого фрагмента.
Иными словами, боковые радикалы аминокислот, хотя не-
посредственно и не участвуют в стабилизирующих эту структу-
ру связях, тем не менее определяют, каким образом пептидная
цепь может свернуться для образования таких связей и может
ли свернуться вообще.
Так, например, остатк пролина и гидроксипролина пол-
ностью исключают образование в своем локусе как а-спирали,
так и P-структуры. Одноименно заряженные радикалы амино-
кислот, если они находятся в цепи близко друг от друга, из-за
взаимного отталкивания не могут сблизиться в а-спирали.
И так далее.
Отсюда и получается типичное для каждого белка ра-
спределение между разными типами вторичной структуры
(см. табл. 3.1).
ЦИТОПЛАЗМА образование белков...
173
3.4 1.3. Третичная структура
О третичной структуре обычно говорят применительно
лишь к глобулярным белкам.
Под ней понимают конформацию белковой глобулы, т. е.
укладку в пространстве а-спиральных, Р-структурных и бес-
структурных участков пептидной цепи.
В отличие от вторичной, третичная структура образуется
и удерживается за счет образования связей непосредственно
между радикалами аминокислот.
Конкретный характер этих связей зависит от природы ра-
дикалов (табл. 3.2).
Как видно из таблицы, по своим физико-химическим свой-
ствам радикалы всех аминокислот подразделяются на 3 группы,
а образуемые между ними связи сводятся к 4 -5 видам.
Среди последних одна связь является ковалентной — ди-
сульфидная связь между остатками цистеина.
Остальные связи — нековалентные, т. е. относятся к т. н.
слабым взаимодействиям. Это:
- ионные связи между разноименно заряженными (а сле-
довательно, гидрофильными) радикалами,
Таблица 3 2 Типы радикалов аминокислот н
образуемые ими связи
Типы радикалов Соответствующие аминокислоты Примерное содержание в белках Связи, образуемые радикалами
1) Неполярные радикалы Глн, Ала, Вал, Лей, Иле, Мет, Фен Три, Про 50% «Гидрофобные» и ван-дер-ваальсовы (индукционные и дисперсионные) взаимодействия
2) Полярные радикалы, ие способные к ионизации ie, Цис, Тир, Гип (гидрокнспролин), Асн, Глн 20% Водородные связи Для Цнс еще и дисульфидные связи
3) По.г ярные ра икалы, способные к ионн: ии при фн ЙОЛО НЧ8- ском pH Асп, Глу, Apr, Лиз, Гнл (гидрокси- лизин), Гис 30 'о Ионные и водородные связи
Примечание. Полные названия аминокислот приведены в приме
чании к табл. 2.1 (п. 2.2.2.3).
174
Глава 3
- водородные связи между полярными (как заряженными,
так и незаряженными) радикалами,
гидрофобные и ван-дер-ваальсовы взаимодействия меж-
ду неполярными (т. е. гидрофобными) радикалами (рис. 3.18).
Слабый характер ионных и водородных связей в значитель-
ной мере обусловлен влиянием водной среды, в которой обычно
находится белок. Так, дипольные молекулы воды, ориентиру-
ясь вокруг полярных (в т. ч. заряженных) радикалов, в 80 раз
снижают электрическое поле заряженных радикалов и могут са-
ми образовывать водородные связи с полярными радикалами.
На разрушение этих связей расходуется большая часть энергии
межрадикального взаимодействия.
Тем не менее замыкание большого числа межрадикальных
связей приводит к образованию термодинамически наиболее
устойчивой конфигурации — нативной третичной структуры
белка.
При этом взаимодействующие друг с другом радикалы мо-
гут находиться в вытянутой пептидной цепи весьма далеко друг
от друга. Сближение же их происходит лишь в результате слож-
ных изгибов этой цепи в трехмерном пространстве.
В итоге образуется глобулярная частица, причем одни ра-
дикалы находятся внутри нее, а другие на ее поверхности.
В частности, для модельного миоглобиноподобного белка ра-
спределение радикалов оказалось следующим (табл. 3.3).
ЦИТОПЛАЗМА образование белков...
175
Таблица 3.3. Распределение радикалов в
многлобиноподобном белке
60 внутренних радикалов (40 % ) 93 наружных радикала (60 %)
В том числе: 48 гидрофобных и 12 гидрофильных В том числе: 28 гидрофобных и 65 гидрофильных
Как видно из данных табл. 3.3, основная часть гидрофоб-
ных радикалов находится внутри глобулы (куда они уходят от
водной фазы), а большинство гидрофильных радикалов на ее
поверхности. В то же время это правило не является абсолют-
ным: некоторое количество гидрофобных радикалов остается на
поверхности.
Последнее очень важно для взаимодействия белка с лиган-
дами, имеющими гидрофобные группы.
Вообще, формирование третичной структуры играет ре-
шающую роль в приобретении белком присущей ему функцио-
нальной активности. Как правило, именно на уровне этой
структуры в белке появляются т. н. активные центры (один или
несколько) — группы из нескольких радикалов, способные спе-
цифично взаимодействовать с определенными лигандами.
Эти радикалы опять-таки на уровне первичной структуры
зачастую находятся далеко друг от друга и сближаются лишь
в процессе фолдинга.
Вместе с тем третичная структура обладает определенной
подвижностью. На конформации глобулы могут сказываться
следующие факторы:
- тепловые флуктуации и колебания отдельных групп,
когда связи между ними то разрываются, то вновь замы-
каются;
- специальные вещества-регуляторы;
- химическая модификация белка (например, фосфорили-
рование);
само выполнение белком его функции.
Изменение конформации белков важнейший способ из-
менения их биологической активности, который широко ис-
пользуется в клетке для регуляции различных процессов.
Мы с этим не раз уже сталкивались — например, при об-
суждении механизма действия дифтерийного токсина
(п. 3.3.2.2) и интерферонов (п. 3.3.2.3). В обоих случаях моди-
фикация одного из белковых факторов трансляции меняла его
третичную структуру и вела к потере этим фактором своей ак-
тивности.
176
Глава 3
3.4.1.4. Четвертичная структура
О наличии у белка четвертичной структуры говорят тогда,
когда он состоит из нескольких субъединиц. Примером являет-
ся гемоглобин, молекула которого включает 4 субъединицы
двух видов (и. 2.4.1.3).
Субъединицы связываются за счет взаимодействия амино-
кислотных радикалов, находящихся на контактирующих по-
верхностях субъединиц. Эти поверхности по расположению дан-
ных радикалов являются взаимно комплементарными. В част-
ности, они нередко обогащены гидрофобными и разноименно за-
ряженными радикалами.
Таким образом, связывание субъединиц может происхо-
дить лишь после образования третичной структуры.
С другой стороны, это связывание само сказывается на тре-
тичной структуре субъединиц: доводит ее до функционально ак-
тивного или, напротив, неактивного состояния. Поэтому такие
белки обычно активны лишь в олигомерной форме (как гемогло-
бин) или, наоборот, только в диссоциированном состоянии (как
некоторые протеинкиназы).
В последнем случае одни субъединицы служат для подавле-
ния активности других и диссоциируют под влиянием спе-
циального сигнала (циклического АМФ).
3.4.2. Факторы, определяющие
пространственную структуру белка
3.4.2.1. Роль первичной структуры
Мы уже говорили (п. 3.4.1.2), что первичная структура бел-
ка полностью определяет вторичную структуру различных его
фрагментов. То же самое можно сказать и в отношении более вы-
соких структур третичной и четвертичной.
Это было показано К. Анфинсеном в 1973 г. в классическом
эксперименте с рибонуклеазой (рис. 3.19).
Данная РНКаза состоит из одной пептидной цепи, включа-
ющей 124 аминокислотных остатка. Среди последних — 8 остат-
ков цистеина (Цис), образующих попарно 4 дисульфидные связи.
Принципиальный момент: всего может быть 105 комбина
ций таких попарных взаимодействий; в каждой из них п = 8 ос-
татков Цис образуют друг с другом 4 дисульфидные связи. (Со-
гласно комбинаторике, количество этих комбинаций рассчиты-
вается как произведение нечетных чисел до п: в данном слу-
чае 3x5x7 105.)
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
177
Мочиаииа (разрыв
водородных связей
р-меркаптоэтанол
(разрыв дисуль-
фидных связен)
М
Удаленно
мочевины и р-
меркаптоэтаиола
Р«С 3.1». Гпыт *»и*мн-
сен« С р—'f г Ук еаэои
Из всех комбинаций в нативной
РНКазе реализуется только одна —
и строго определенная: 26-84, 40 95,
58 110, 65 72 (цифры указывают по-
ложение остатков Цис в вытянутой по-
липептидной цепи). Как видно, в боль-
шинстве случаев взаимодействующие
радикалы Цис находятся в пептидной
цепи достаточно далеко друг от друга.
Кроме дисульфидных, в третич-
ной структуре РНКазы имеются и дру
гие связи — в частности, водородные.
Так вот, на первой стадии экспе-
римента в среду с РНКазой вносили
два компонента:
- мочевину, которая разрывает
водородные и, возможно, другие сла-
бые связи,
— а также агент (Р-меркаптоэта-
нол), обратимо разрывающий дисуль-
фидные связи.
При этом нативная структура
РНКазы разрушалась и пептидная цепь
начинала образовывать случайный
клубок. Ферментативная активность
исчезала в связи с разрушением актив-
ного центра. Таким образом, белок был
приведен в примерно такое состояние, какое он имел сразу после
трансляции, т. е. до фолдинга.
На второй стадии эксперимента оба названных агента из
среды удаляли (путем диализа). И с течением времени у белка
вновь появлялась ферментативная (т. е. РНКазная) активность.
Следовательно, восстанавливалась нативная структура бел-
ка: опять замыкались дисульфидные связи, причем между теми
же парами радикалов Цис; и опять образовывались слабые свя
зи. Если пользоваться современным языком, происходил ре
фолдинг РНКазы.
Этот результат произвел глубокое впечатление и на автора
эксперимента, и на научное сообщество. Было сделано два клю
чевых заключения.
1) Вся информация о третичной структуре белка (по край
ней мере, если он не имеет небелкового компонента) заключена
в его первичной структуре, т. е. в последовательности амино
кислот в пептидной цепи.
178
Глава 3
Сейчас это кажется само собой разумеющимся, но, вообще
говоря, могло быть и иначе. Могли существовать специальные
инструктивные молекулы, которые, накладываясь на случай-
ный клубок (как на восковую заготовку), всецело определяли бы
пространственную структуру белка.
Данная идея долгое время лежала в основе одной из гипотез
иммуногенеза, которая так и называлась — инструктивной.
Имелось в виду, что антигены таким образом приводят к появле-
нию специфичных к ним антител.
Эксперименты же Анфинсена показали, что белок прини-
мает строго определенную конфигурацию без каких-либо «ин-
структоров» — на основе только физико-химических взаимо-
действий своих химических групп.
Но и идея об инструктивной роли других веществ также
нашла свое подтверждение! Только не в изначальном,
а в существенно модифицированном виде. Имеется в виду уже
упоминавшийся факт, что на третичную структуру белка могут
влиять его лиганды, а также химическая модификация.
В связи с этим можно упомянуть популярную теорию инду-
цированного соответствия. Согласно ей, в отсутствие субстрата
активный центр фермента еще не до конца сформирован. Суб-
страт же в процессе связывания индуцирует такие перемещения
радикалов активного центра, которые как бы «подгоняют»
структуру этого центра под структуру субстрата.
2) Второй вывод, следовавший из опытов Анфинсена, со-
стоял в том, что белок не только «знает», какую третичную кон-
формацию принять, но и делает это вполне самостоятельно.
Действительно, восстановление нативной структуры РНКазы
происходило в отсутствие каких-либо агентов, т. е. самопроиз-
вольно.
Этот вывод был распространен на все белки и долгое время
тоже считался вполне очевидным.
И лишь не так давно стало выясняться, что он справедлив,
пожалуй, только для небольших белков, к которым, в частно-
сти, относится и рибонуклеаза Анфинсена.
Для фолдинга же крупных белков необходимы специаль-
ные белки — шапероны (упоминавшиеся в п. 3.1) и ферменты
фолдазы. Они не определяют то, какой должна быть простран
ственная конфигурация белка (т. е. не являются «инструктора-
ми»), но создают возможность для быстрого ее формирования.
Подробнее о фолдазах и шаперонах речь пойдет в разде-
ле 3.5.
Таким образом, первичная структура пептидной цепи, ко-
нечно, играет определяющую роль в фолдинге этой цепи, но она
11ИТ0ПЛАЗМА: образование белков... 179
не всегда оказывается достаточной для обеспечения фолдинга
или (и) его окончательного завершения.
3.4.2.2. Роль лигандов
По влиянию лигандов на конформацию белков белок-
лигандные взаимодействия можно разделить на несколько классов.
Взаимодействия класса I: лиганд, связываясь с белком,
не вызывает существенных изменений конформации, но стаби-
лизирует структуру белка.
Пример — связывание ионов Са2* с лизоцимом. В присут-
ствии лиганда (ионов Са2) для денатурации лизоцима требуют-
ся большие концентрации соответствующего агента (мочевины
или гуанидингидрохлорида).
Видимо, в данном случае с помощью Са2’ образуются допол-
нительные связи между радикалами.
Взаимодействия класса II: лиганд значительно меняет
третичную структуру белка, и только в таком состоянии белок
становится достаточно активным.
Пример — связывание ионов Са2’ с кальмодулином — вну-
триклеточным рецептором этих ионов. Связав два иона Са2',
кальмодулин приобретает способность влиять на активность
многих белков клетки.
Взаимодействия класса III: в отсутствие лиганда белок
находится в т. н. состоянии расплавленной глобулы: имеет до-
статочно компактную глобулярную форму, но без какой-либо
определенной третичной структуры — последняя формируется
лишь при связывании лиганда.
Пример такого белка — лактальбумин (компонент фермент-
ного комплекса синтеза лактозы). Это небольшой белок, содержа-
щий 4 дисульфидные связи и прочно связывающий 1 ион Са2 . Ви-
димо, данный ион является ключевым структурообразующим
элементом. При его удалении третичная структура белка разру-
шается. Но глобулярная форма и размер глобулы сохраняются
благодаря стабилизирующему влиянию дисульфидных связей.
Взаимодействия класса IV: без лиганда у белка не до кон
ца сформирована вторичная структура и полностью отсутствует
третичная структура. При этом пептидная цепь частично раз-
вернута.
Пример белка - остеокальцин, содержащийся в матриксе
костей. Он содержит всего около 50 аминокислотных остатков
и способен связывать 5 ионов Са2'. Связывание сопровождается
существенным уменьшением объема глобулы, формированием
третичной структуры и объединением глобул в димеры. Т. е.
180
Глава 3
в данном случае лиганд необходим для появления у белка и че-
твертичной структуры.
Взаимодействия класса V: в отсутствие лиганда белко-
вая цепь практически полностью развернута, т. е. представля-
ет собой случайный клубок. Взаимодействие же с лигандом
приводит к полному формированию пространственной струк-
туры белка.
Пример — цитохром с, один из белков цепи переноса элек-
тронов в митохондриях. Его лиганд гем (сходный с гемом ге-
моглобина). Удаление гема приводит к почти полному развора-
чиванию белковой молекулы.
Взаимодействия класса VI: связывание лиганда вызывает
масштабные подвижки доменов или субъединиц белка.
Пример — взаимодействие гемоглобина (НЬ) с кислородом
В ходе этого процесса происходят многочисленные и сложные
конформационные превращения. В том числе соседние субъеди-
ницы поворачиваются друг относительно друга на 10 15".
В результате при связывании молекулы О2 с гемом одной
субъединицы повышается сродство к кислороду соседних субъе-
диниц. Это обозначается как кооперативный эффект и имеет
большое физиологическое значение.
Завершая данный пункт, сделаем два замечания:
а) во-первых, как видно, лиганды действительно могут
очень существенно влиять на конформацию белка;
б) во-вторых, для белка, имеющего несколько лигандов
(особенно если последние связываются с разными частями моле-
кулы), характер подобного влияния для разных лигандов может
быть совершенно разным.
Например, по-разному воздействуют на структуру гемогло-
бина такие его лиганды, как гем и кислород.
Поэтому, в отличие от авторов изложенной здесь система-
тизации (В Н. Уверского и Н. В. Нарижневой), мы говорили не
о классах белков, а о классах белок-лигандных взаимодей-
ствий.
3.4.3. Модели сворачивания белков
3.4 3 1 Модель промежуточных состояний
Рассматривая влияние лигандов, мы упоминали различные
формы существования пептидных цепей. Эти формы можно свя-
зать в последовательность, показанную на рис. 3.20.
ЦИТОПЛАЗМ/ образование белков...
181
СЛУЧАЙНЫЙ КЛУБОК (нет ни вторичной, ни третичной структуры, пептидная цепь полностью развёрнута)
1
СОСТОЯНИЕ- (вторичная структура сформирована
ПРЕДШЕСТВЕННИК не до конца,
РАСПЛАВЛЕННОЙ третичная структура отсутствует,
ГЛОБУЛЫ цепь часшчно развёрнута)
1 (вторичная структура полностью
РАСПЛАВЛЕННАЯ сформирована.
ГЛОБУЛА цепь свёриу!а в компактную глобулу, но жесткая третичная структура отсутствует)
1
НАТИВНЫЙ (цепь свёрнута в компактную глобулу.
БЕЛОК которая имеет определённую третичную структуру)
Рио. 320. Г‘ ЗМ« ЖН.Я ПОСЛСДГ < МТ* ЛЬЮ СТ* лдингл белка
Как видно, по мере перехода от первой формы к последней
закономерно возрастает степень структурированности белка.
Поэтому естественно предположить: а не происходит ли именно
в такой очередности фолдинг белков? Эту мысль впервые выска-
зал О. Б. Птицын в 1972 г.
Таким образом, согласно данной схеме, фолдинг белка (ког-
да в отсутствие, когда в присутствии соответствующих лиган-
дов) совершается не одномоментно, а в несколько стадии.
а) Исходная форма глобулярного белка (непосредственный
продукт трансляции) — случайный клубок, или развернутая
пептидная цепь.
«Развернутая» — не означает растянутая. Действительно,
если исключить абсолютно все взаимодействия между аминоки-
слотными остатками в пептидной цепи (естественно, кроме пеп
тидных связей), то термодинамически наиболее выгодным со-
стоянием цепи будет рыхлый клубок
Чтобы растянуть этот клубок (и уж тем более вытянуть его
в прямую нить), необходимо приложить силу. После прекраще-
ния действия силы цепь вновь возвращается в наиболее вероят-
ное состояние клубка. Т. е. такой белок, подобно каучуку, обла-
дает эластичностью; соответственно, его можно назвать каучу
кополобным.
Видимо, на этом основана эластичность известного белка,
который так и называется — эластином. Он имеет глобулярную
182
Глава 3
природу, и его глобулярные молекулы объединяются в цепочки,
составляя фибриллы и затем волокна.
В других же глобулярных белках эластичность отсутствует,
потому что в случайном клубке начинают проявляться многочи-
сленные взаимодействия между аминокислотными остатками.
б) Согласно рис. 3.20, вначале формируется вторичная
структура: различные участки пептидной цепи образуют «-спи-
рали, P-структуры или остаются бесструктурными.
По завершении этого процесса происходит коллапсирова-
ние (сжимание) клубка в т. н расплавленную глобулу. Движу-
щей силой сжатия является взаимодействие между радикалами
аминокислот. Причем с помощью радикалов фактически взаи-
модействуют отдельные элементы вторичной структуры (а спи-
рали и др.).
В чем же принципиальное отличие расплавленной глобулы
от нативной структуры?
В том, что в этой глобуле аминокислотные радикалы еще не
нашли своих окончательных партнеров, не заняли «правильно-
го» положения, а взаимодействуют «с кем придется». Поэтому
общее количество одновременно существующих связей относи-
тельно невелико и связи, а с ними и конфигурация молекулы
являются весьма неустойчивыми.
в) Но рано или поздно белок находит термодинамически
наиболее оптимальную структуру, при которой между радика-
лами образуется максимально возможное количество связей.
В случае достаточно большого белка вначале формируется
третичная структура доменов, а уж потом последние занимают
правильное положение друг относительно друга.
Позже всего происходит связывание мономеров в олигоме-
ры (если нативный белок состоит из нескольких субъединиц).
3.4.3.2. Сворачивание по принципу «все или ничего»
В отличие от вышеизложенного, у очень маленьких белков
(до 100 аминокислотных остатков) промежуточные стадии (рас-
плавленная глобула и состояние-предшественник) отсутствуют
и фолдинг фактически проходит по принципу «все или ничего».
Действительно, из-за малого числа аминокислотных остат-
ков «неправильные» взаимодействия, лежащие в основе рас-
плавленной глобулы, практически не случаются. Поэтому нет
феномена коллапсирования (сжатия) клубка до образования на-
тивной третичной структуры.
В этих случаях фолдинг происходит следующим образом.
Развернутая пептидная цепь в течение достаточно длительного
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
183
времени флуктуирует без образования контактов между амино-
кислотными остатками — просто потому, что способные к взаи-
модействию остатки не сближаются друг с другом.
Затем случайно цепь достигает состояния, в котором может
образоваться несколько «правильных», или нативных, контак-
тов, Тем самым как бы появляется ядро сворачивания (ядро ну-
клеации).
После этого фолдинг завершается очень быстро. Наличие
нескольких «правильных» связей удерживает цепь в такой кон-
фигурации, в которой легко находят друг друга остальные «пра-
вильные» пары.
Хорошо изученным белком с подобным механизмом фол-
динга является химотрипсиновыи ингибитор 2 (белок CI2),
включающий 65 аминокислотных остатков. Во вторичной
структуре он имеет одну а-спираль и пять тяжей Р структуры
(Р1, ... Р5)- Критическим моментом фолдинга этого белка служит
образование а-спирали и тяжей р4, р5, а также гидрофобное
взаимодействие трех аминокислотных остатков в составе этих
элементов — Ала16 (а-спираль), Лей49 (Р4) и Иле59 (Р5). Это и оз-
начает формирование ядра нуклеации.
3 4.3.3. Феномен кооперативности
В обеих изложенных моделях фолдинга очень важную роль
играет феномен кооперативности. Суть его в том, что образова-
ние одной или нескольких «правильных» связей резко ускоряет
замыкание других нативных связей.
На этом, по существу, построено представление о ядре ну-
клеации. И таков же, очевидно, механизм каждой стадии фол-
динга более крупных белков — например, превращения рас-
плавленной глобулы в нативную структуру.
Продемонстрируем значение данного феномена на следую
щем примере.
Пусть белок включает п = 100 аминокислотных остатков
и нативная конформация включает 50 пар строго определенных
взаимодействий остатков.
Как отмечалось в п. 3.4.2.1, общее число всевозможных
комбинаций попарных взаимодействий равно произведению не-
четных чисел до и: в данном случае — Зх5х .. х97х99 = 3-10™.
Если представить, что в секунду перебирается 1013 различ
ных комбинаций (литературные данные), то в отсутствие эффек-
та кооперативности среднее время поиска нативной конформа-
ции составляло бы 4,510'" лет! Что исключает саму возможность
не только фолдинга хотя бы одной молекулы белка, но и образо-
вания жизни на Земле.
184
Глава 3
Теперь фолдинг того же белка рассмотрим с учетом феноме-
на кооперативности.
Пусть его вторичная структура включает 5 а-спиральных
участков примерно по 20 аминокислотных остатков. Спирализа
ция каждого такого участка поначалу представляет собой сво-
бодный перебор всех возможных пар (190) взаимодействия
групп —NH2 - и —СО—. Из них «правильных» пар — 16.
Даже при относительно небольшой скорости перебора в 10
пар/с требуются ничтожные доли секунды (порядка 10‘5с), что-
бы образовалась хотя бы одна «правильная» связь.
Дальше же действует эффект кооперативности: от этой свя-
зи в обе стороны рассматриваемого участка пептидной цепи
с большой скоростью (10s 1/с) начинают замыкаться остальные
«правильные» связи ot-спирали. Продолжительность этой ста-
дии еще на несколько порядков меньше (около 108 с,) чем пер-
вой — лимитирующей стадии.
В итоге спирализация всего участка укладывается практи-
чески в те же доли секунды (порядка 10 5 с), что занимал поиск
одной «правильной» связи.
Причем, поскольку все 5 участков спирализуются незави-
симо друг от друга, то за то же время происходит формирование
всей вторичной структуры белка.
А как обстоит дело с образованием третичной структуры?
На этом этапе взаимодействуют радикалы аминокислот, на
ходящихся в разных элементах вторичной структуры (в нашем
случае — в разных а-спиралях); взаимодействия же в пределах
одного элемента невозможны. Данное обстоятельство само по се-
бе уменьшает количество взаимодействий. Но еще выше роль
эффекта кооперативности.
Можно найти, что общее число межрадикальных пар (ис-
ключая пары в пределах одной а-спирали) равно 4000. Пусть за-
мыкание из них двух определенных связей имеет критическое
значение (подобно образованию ядра нуклеации в случае ма-
леньких белков). При той же скорости перебора, что при образо-
вании вторичной структуры (106 пар/с), на поиск этих связей
уходит порядка 10 с.
Остальные связи, благодаря кооперативности, замыкаются
гораздо быстрее.
В итоге весь фолдинг белка вместо бесконечного количества
лет занимает время меньше секунды. В крайнем случае,
для крупных белков со сложной структурой, он укладывается
в несколько минут.
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков- 185
3 4.3.4 Отношение фолдинга к трансляции
Важный вопрос: когда происходит фолдинг новых бел-
ков — еще в ходе трансляции, лишь по ее окончании, или он
столь протяженен, что охватывает и трансляцию, и последую-
щее время?
Известный биохимик А. С. Спирин отстаивает представле-
ние о ко-трансляциониом сворачивании белков. Согласно ему,
фолдинг полипептидной цепи происходит по мере ее роста на
рибосоме в направлении от N- к С-концу.
В качестве доказательства приводятся три эксперименталь-
ных факта.
а) Фермент (протеиндисульфидизомераза, или ИДИ;
п. 3.5.2.1), катализирующий перемещение в новосинтезируе-
мых белках дисульфидных связей, для правильного замыкания
этих связей должен присутствовать во время трансляции.
Если его добавить в белоксинтезирующую смесь, составлен-
ную in vitro, позже, у белка оказывается неправильная структу-
ра и он лишен активности. Это продемонстрировано на примере
одной из цепей иммуноглобулина
б) При синтезе белковых субъединиц гемоглобина они
приобретают способность связывать гем еще до окончания тран-
сляции — по достижении примерно двух третей своей полной
длины.
Следовательно, гем-связывающий центр формируется во
время трансляции.
в) Фермент светлячков люцифераза после денатурации вос-
станавливает свою активность весьма долго. В то же время он ока
зывается активным сразу после образования на рибосоме. Зна-
чит, и в этом случае фолдинг произошел во время трансляции.
Пока трудно сказать, не допускают ли эти результаты ка
кой-либо другой интерпретации, а если нет, то насколько они
являются общими.
Более вероятно, что для одних белков фолдинг, действи-
тельно, является только ко-трансляционным, а для других —
и ко-, и пост-трансляционным процессом.
3.5. ФАКТОРЫ ФОЛДИНГА
3.5.1. Открытие факторов фолдинга
В отличие от только что описанных экспериментальных
подходов А.С. Спирина, в большинстве случаев фолдинг белков
186
Глава 3
изучают in vitro не в тесной связи с трансляцией, а примерно
так, как это делал Анфинсен (п. 3.4.2.1). Т. е. с помощью спе-
циальных агентов вначале разрушают нативную структуру бел-
ка (иначе говоря, вызывают его денатурацию), а затем наблюда-
ют за восстановлением исходной структуры (за ренатурацией,
или рефолдингом). О состоянии белка судят с помощью разнооб-
разных спектральных методов, а также по его функциональной
активности.
Подобные эксперименты показали: повторить результаты
Анфинсена, полученные для рибонуклеазы, удается лишь для
таких же, как она, небольших белков.
В случае же более крупных белков денатурация часто со-
провождается агрегацией белка, а самопроизвольный рефол-
динг если и происходит, то очень медленно и с весьма неболь-
шим процентом выхода.
Вместе с тем оказалось, что добавление в среду некоторых
белковых фракций клетки значительно облегчает рефолдинг де-
натурированных белков. Отсюда и возникло представление
о вспомогательных белках (или факторах) фолдинга.
Затем было обнаружено, что данные факторы можно разде-
лить на две группы.
а) Первая группа — это белки с каталитической активно-
стью, т. е. ферменты фолдинга, или фолдазы. Пока обнаружено
только два таких белка.
Как и прочие ферменты, они требуются лишь в каталитиче-
ских количествах, т. е. в концентрациях, на порядки меньших,
чем у «обслуживаемых» ими белков.
б) Вторая группа — т. н. молекулярные шапероны. Пола-
гают, что сюда входят белки с самыми разными механизмами
действия. Объединяют же их следующие два обстоятельства:
- они требуются в количествах, близких к стехиометриче-
ским, т. е. сравнимых по величине с концентрацией сворачива-
емых белков;
- несмотря на это, они, как и фолдазы, не входят в состав
конечных продуктов фолдинга, какими бы сложными олиго-
мерными образованиями эти продукты ни были.
Показательно в связи с этим исходное значение слова «ша-
перон» в английском языке: это пожилая дама, сопровождаю
щая молодую девушку на балах.
Аналогично и молекулярные шапероны: способствуя пра-
вильному фолдингу, они как бы впервые выводят «в свет» но-
восинтезированные белки, но сами потом иной, более самостоя
тельной роли, как правило, не играют.
Теперь рассмотрим фолдазы и шапероны более подробно.
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков... 187
3.5.2. Ферменты фолдинга
3.5.2.1. Протеиндисульфидизомераза
Одна из двух фолдаз уже упоминалась в и. 3.4.3.4: это про-
теиндисульфидизомераза, или ПДИ.
Там же было сказано, что данный фермент катализирует
перемещение в белках дисульфидных связей. Это означает, что
под его влиянием в сворачивающемся белке разрываются одни
и вместо них замыкаются другие дисульфидные связи.
Что было бы в отсутствие ПДИ? Допустим, в белке, как
в РНКазе Анфинсена (см. рис. 3.19), 8 остатков цистеина, что
допускает 105 разных комбинаций замыкания между ними 4-х
дисульфидных связей (п. 3.4.2.1). Из этих комбинаций только
одна является «правильной».
Так вот, без ПДИ замыкание первых попавшихся 4-х ди-
сульфидных связей, по существу, навсегда зафиксировало бы
пептидную цепь в соответствующей конформации, даже если
последняя была бы очень далека от нативной и энергетически
весьма невыгодной. Действительно, дисульфидные связи явля-
ются ковалентными, отчего для их разрыва требуется преодо-
леть высокий кинетический барьер.
Именно наличие такого барьера, как известно, делает ста-
бильными очень многие энергоемкие вещества.
Возможность фиксации белка в «неправильной» конфигу-
рации «неправильными» дисульфидными связями показал еще
в своих экспериментах с РНКазой Анфинсен.
Как описывалось в п. 3.4.2.1, денатурацию РНКазы он осу-
ществлял двумя агентами мочевиной (разрывающей слабые
связи) и Р-меркаптоэтанолом (разрывающим дисульфидные
связи), а ренатурацию, или рефолдинг, наблюдал, одновремен-
но удалив из среды оба эти агента.
Совсем иной результат получался, если вначале удаляли
только Р-меркаптоэтанол (рис. 3.21). В этом случае (т. е. в при-
сутствии мочевины) слабые связи не способствовали формирова-
нию нативной конформации. Поэтому при медленном замыка-
нии дисульфидных связей (путем окисления SH-групп цистеина
кислородом воздуха) с равной вероятностью образовывались
белковые молекулы со всеми 105 комбинациями распределения
дисульфидных связей. Т. е. на 1 молекулу с правильной конфи-
гурацией получалось 104 «неправильных» молекул.
Когда затем удаляли из среды и мочевину, конформация
молекул не менялась: она была уже зафиксирована дисульфид-
188
Гпава 3
ними связями. Естественно, что РНКазная активность суммар-
ного продукта была всего лишь около 1/105^1%.
Но эту активность можно было вновь довести до полной,
если прибавить следовые количества Р-меркаптоэтанола. Они
способствовали разрыву в белковых молекулах существующих
дисульфидных связей и не препятствовали образованию других
дисульфидных связей. Т е. эти количества агента служили ка-
тализатором перераспределения, или перемещения, дисуль-
фидных связей. Иначе говоря, они играли ту же роль, которую
выполняет в клетке пди
Таким образом, лабилизация
(или изомеризация) дисульфидных
связей в формирующемся белке дает
ему возможность найти (путем слу-
чайного перебора) такую комбинацию
этих связей, которой соответствует
энергетически наиболее оптимальная
простран твенная структура.
Из приведенного эксперимента
ясно также, что необходимость
в ПДИ при фолдинге того или иного
белка связана не с размером этого
белка, а с количеством в нем дисуль-
фидных мостиков.
В клетке ПДИ связана, в основ-
ном, с эндоплазматической сетью
(ЭПС). Из этого следует, что особенно
велика ее роль в формировании тех
белков, которые синтезируются мем-
браносвязанными рибосомами. Это,
согласно п. 3.1, «экспортные», мем-
бранные и лизосомальные белки.
Во многих из них содержатся ди-
сульфидные мостики.
Кроме дисульфидизомеразной
активности, ПДИ имеет способность
к неспецифическому связыванию
пептидов в стехиометрических кон-
центрациях. Такой же способностью
НАТИВНАЯJ
ФОРМА
. Мочевина +
I Р-меркаптоэтанол
84 72
тт
58
случ ай-
ны й
КЛУБОК
Удаление вначале
Р-меркаптоэта иола
и лишь через
некоторое время —
мочевины
105
PABHOBB-
РОЯ Г11Б1Х
КОНФОР-
МАЦИЙ
(показана
только
одна)
Следовые
| количества
Р-меркаптоэтанола
НАТИВНАЯ
ФОРМА
•ЧШ .3.21. Образование^
СЛИНКИНЫ»; ко**
свдзеЙ в
-Ш1*3 <
обладают типичные шапероны.
На этом основании некоторые авто-
ры делают заключение, что ПДИ
функционирует не только как ПДИ,
но и как шаперон
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
189
Это было бы достаточно естественно: ведь поиск «правиль
ных» дисульфидных мостиков и образование «правильных»
слабых связей — две стороны одного и того же процесса, разде-
лить которые весьма трудно. Одно способствует другому и нао-
борот.
Одним из доказательств шаперонной роли ПДИ служит то
обстоятельство, что in vitro она способствует фолдингу и таких
белков, которые не содержат дисульфидных мостиков.
3.5.2 2 Пептидилпролилизомераза
Среди 20 обычно встречающихся в белках аминокислот
есть одна, которая аминокислотой, по существу, не является.
Это пролин (а также продукт его гидроксилирования — гидрок-
сипролин). Его радикал связан не только с Са-углеродным ато-
мом, но и с азотом (рис. 3.22); поэтому получается не амино-,
а иминокислота.
Данное обстоятельство сказывается на пространственной
конфигурации пептидной цепи в месте содержания Про. Как от-
мечалось в п. 3.4.1.2, здесь не образуется ни а-спирали, ни Р-
структуры, и пептидная цепь часто делает изгиб в ту или иную
сторону.
ТРАНС конфигурация
Остаток проюволь- Остаток
кой ямикоккелоты пролила
ПЫ1ТИ41М-
I №0.111.1-
||{ОМ1'РА М
ЦИС-конфи гу рация
R СШ СИ,
I \ /
3.22. Реакция
I ГгоЛТИДИЛПрОЛИГ
1 изомеразы
Причем возможность изгиба опре
деляется тем, как расположены ради-
кал соседней аминокислоты и радикал
пролина относительно плоскости соот-
ветствующей пептидной связи (враще-
ния вокруг которой невозможны;
п. 3.4.1 2).
Говорят, что эти радикалы нахо-
дятся в транс-конфигурации, если рас-
положены по разные стороны указан-
ной плоскости, и в цис-конфигурации,
если находятся с одной стороны.
В отсутствие резкого изгиба пепти-
дной цепи транс-конфигурация является
предпочтительней, так как при ней сосед-
ние радикалы не «мешают» друг другу.
В случае же изгиба по принципу
«поворот на себя» (т. е. почти на 180'’)
часто более оптимальной становится
цис-конфигурация, когда оба соседних
радикала оказываются с наружной сто-
роны изгиба.
190
Глава 3
Отсюда ясен смысл существования второго фермента фол-
динга пептидилпролил-цис-трансизомеразы (ППИ). Этот
фермент катализирует переход радикалов в области пептидной
связи пролина из транс конфигурации в цис-конфигурацию
и обратно.
Очевидно, при этом происходит временный разрыв данной
пептидной связи, отчего становится возможным поворот вокруг
ее плоскости; после же поворота связь снова замыкается.
Таким образом, благодаря ППИ пептидная связь получает
возможность делать в области нахождения остатка пролина та-
кие изгибы, которые приводят к наиболее оптимальной про-
странственной структуре.
3 5 3. Шапероны
3.5.3.1. Функции шаперонов
Если конкретные функции двух фолдаз достаточно ясны,
то в отношении шаперонов такой однозначности нет.
Функции, приписываемые шаперонам, весьма широки.
1) Прежде всего, это, конечно, обеспечение правильного
фолдинга новообразованных белков.
В данной функции есть несколько аспектов.
а) Так, до того, как большинство гидрофобных аминокис-
лотных радикалов уйдет внутрь белковой частицы, они могут
вступить во взаимодействие с аналогичными радикалами дру-
гих пептидных цепей. Иначе говоря, до окончания фолдинга
возможна агрегация новосинтезированных белковых молекул
Случившись же, такая агрегация и воспрепятствовала бы даль-
нейшему фолдингу этих молекул, и создала бы ненужный бал-
ласт в клетке.
Предупреждение агрегации новых белков, т. е. предупреж-
дение «неправильных» внешних взаимодействий в ходе фол-
динга — одна из важнейших задач шаперонов.
6) Другая сопряженная задача — предупреждение «непра-
вильных» внутренних (в пределах одной пептидной цепи) взаи-
модействий.
в) Третий аспект той же функции — лабилизация «непра-
вильных» слабых связей (если они все-таки образовались) —
с тем, чтобы пептидная цепь не оказывалась зафиксированной
в «неправильной» конформации, а могла достичь наиболее оп-
тимальной. Очевидно, здесь — прямое сходство с функциями
обеих фолдаз, но только речь идет о лабилизации не ковалент-
ных, а слабых связей.
11ИТОПЛАЗМА: образование белков... 191
Все вместе это и означает «обеспечение правильного фол-
динга» . Говоря это, под фолдингом понимают не только сворачи-
вание пептидной цепи, но и (в случае олигомерных белков) свя
зывание друг с другом субъединиц в четвертичную структуру.
2) Следующая функция шаперонов — контроль за рефол-
дингом. Имеется в виду, что под действием самых разных при-
чин (перегрева, облучения, действия оксидантов и т. д.) белки,
относительно давно синтезированные и до того успешно функ-
ционировавшие, могут терять свою нативную конформацию.
Иначе говоря, частично или полностью денатурировать, что,
как мы уже отмечали (п. 3.5.1), сопровождается склонностью
к агрегации.
Так вот, видимо, такие белки в клетке могут подвергаться
рефолдингу (или ренатурации) — при активной помощи шапе-
ронов.
Причем синтез шаперонов значительно возрастает, если
клетка относительно долго пребывает в стрессовых условиях.
Это показано, в частности, для бактерий (Е. coli): инкубация их
при температуре 42 *С приводит к резкому увеличению т. н. бел-
ков теплового шока, которые являются ничем иным как шапе-
ронами.
Аналогичный эффект наблюдается и у эукариот. Поэтому
у тех и у других шапероны часто обозначаются буквами Hsp (от
английского: heat shock proteins — белки теплового шока).
Что нужно для обеспечения этими белками рефолдинга? —
Практически то же, что и для обеспечения фолдинга: преду-
преждение агрегации и лабилизация связей пространственной
структуры. Тогда пептидная цепь получит возможность вновь
найти нативную (и энергетически наиболее выгодную) конфор
мацию.
3) Третья функция шаперонов — участие в некоторых ви-
дах внутриклеточного транспорта белков: в частности, в лизосо-
мы (для белков, «отслуживших» свой срок и не поддающихся
рефолдингу) и в митохондрии.
Чем вызвано участие шаперонов в переносе «старых» бел-
ков в лизосомы? Очевидно, опять-таки необходимостью преду-
предить агрегацию.
В митохондрии переносятся, напротив, новосинтезирован-
ные белки. Как мы уже отмечали в п. 3.2.4.2, за счет собствен-
ной активности митохондрий синтезируется только 5 % их бел-
ков; остальные белки поступают из цитозоля, где образуется на
свободных рибосомах (п. 3.1).
Фолдинг же этих остальных (95 %) белков откладывается
до того момента, пока они не окажутся внутри митохондрий.
192
Глава 3
Это объясняется тем, что пептидной цепи гораздо легче проник-
нуть через липидные слои мембран (а у митохондрий мембран_
целых две), если она находится в развернутом состоянии и ги-
дрофобные радикалы не спрятаны внутрь частицы.
Что же делают шапероны? — Те из них, которые находятся
вне митохондрий, сразу связываются с продуктами трансляции
и поддерживают их в развернутом состоянии (в состоянии пре-
белков) до контакта с митохондриальными мембранами. Иначе
говоря, эти шапероны предупреждают преждевременный фол-
динг. Другие же шапероны (находящиеся внутри митохондрий)
принимают «гостей» и помогают им принять нативную форму.
4) Четвертая функция — поддержание ряда белков в опре-
деленной конформации, в состоянии как бы незавершенного
фолдинга. В этом случае, очевидно, шапероны не теряют связи
с соответствующим белком после его сворачивания.
Примером может служить локализующийся в цитоплазме
белковый рецептор к гликокортикоидным гормонам. В отсут-
ствие этих гормонов он связан с комплексом шаперонов (Hsp —
белков теплового шока). В таком состоянии у рецептора закры-
та (экранирована) т. н. ядерная метка — та часть пептидной це-
пи, которая необходима для проникновения белка внутрь ядра.
После же связывания гликокортикоидов белки Hsp диссо-
циируют, фолдинг завершается и ядерная метка оказывается на
поверхности. Поэтому рецептор проникает в ядро, переходит
в димерную форму и связывается с определенным участком
ДНК.
Второй пример — содержащиеся в ядре рецепторы к дру-
гим стероидным гормонам — эстрогенам и прогестерону. Эти
белки тоже связаны с шаперонами (Hsp). Но теперь незавершен-
ность фолдинга приводит не к блокированию ядерной метки
(комплекс, как сказано, находится в ядре), а к неспособности
связываться с ДНК.
Опять-таки, присоединение соответствующего гормона вы-
зывает диссоциацию шаперонов, изменение структуры рецепто-
ра и связывание последнего с нужным локусом ДНК.
Как же выполняют шапероны все эти многочисленные
функции? Надо думать, механизмы действия шаперонов раз-
личны — как разнообразны, вероятно, и сами шапероны.
Рассмотрим некоторые наиболее изученные системы, от-
ветственные за выполнение, по крайней мере, двух первых из
вышеперечисленных функций, т. е. за фолдинг новообразован-
ных и рефолдинг поврежденных белков.
I ЦИТОПЛАЗМА образование белков...
193
3.5.3.2. Система DnaK/ DnaJ у бактерий
Белки теплового шока часто обозначаются по их молеку-
лярной массе. Например, семейство белков Hsp70 — это шапе-
роны с массой около 70 кДа.
У шаперонов часто имеются «помощники», или ко-шапе-
роиы. Это тоже белки, но обычно с меньшей молекулярной мас-
сой.
Один из представителей Hsp70 — шаперон DnaK; его ко-
шапероном является белок DnaJ
Система этих белков осуществляет, видимо, ко-трансля-
циониый фолдинг (рис. 3.23). Иначе говоря, они связываются
с синтезирующимися полипептидными цепями еще до оконча-
ния трансляции — когда эти цепи еще находятся на рибосомах.
Такое раннее связывание предупреждает «неправильные» взаи-
модействия внутри незавершенных пептидов и агрегацию це-
пей, высвобождающихся с рибосом.
В процессе фолдинга неоднократно расходуется АТФ. А по
окончании фолдинга для отделения шаперонов требуется еще
один фактор — GrpE.
Если после этого белок еще не принял окончательной на-
тивной конформации, то на его поверхности остаются радика-
Рис. 3.23. К';-т(.,нсл..ци' ними ! л/динг mart*, нами Ннр 70
7-36
194
Глава 3
лы, способные связывать шапероны DnaK/DnaJ повторно.
И так далее: полагают, что может быть несколько циклов связы-
вания и высвобождения этой системы.
Таким образом, в отличие от представлений А. С. Спирина
(п. 3.4.3.4), допускается, что фолдинг может продолжаться и по
окончании трансляции.
Более того, у Е. coli примерно 200-300 белков (составляю-
щие 5-10 % от общего белкового пула) и после неоднократной
«обработки» системой DnaK/DnaJ остаются в состоянии неза-
вершенного фолдинга в виде расплавленной глобулы. Т. е.
у них практически сформирована нативная вторичная структу-
ра, но межрадикальные связи являются пока случайными и не-
прочными (п. 3.4.3.1). В основном, к таким белкам относятся
достаточно крупные белки с относительно сложной простран-
ственной конфигурацией.
Завершение фолдинга таких белков происходит с помощью
другой системы шаперонов — GroEL/GroES.
3.5.3 3 Система GroEL/GroES у бактерий
ВИП. 3 24 Стра .ние ко
плекса Uk 'EL GroES
Эта шаперонная система изучена особенно хорошо. Шапе-
рон GroEL относится к белкам Hsp 60, т. е. имеет массу около
60 кДа (а точнее, 57 кДа). Масса ко-шаперона GroES существен-
но меньше — 10 кДа.
Нередко белки Hsp 60 называют не шаперонами, а шапе-
ронинами. Соответственно, и рассматриваемая здесь система
GroEL/GroES тоже называется шаперониновой.
Эта система (как и все семейство
Hsp 60) содержится в бактериальных
клетках, а также в митохондриях
и хлоропластах эукариот. (Еще один
признак, сближающий эти органел-
лы с прокариотами; п. 3.2.4.2.)
Система особенно интересна тем,
что ее белки формируют уникальный
комплекс (рис. 3 24). Он имеет вид
двух «котлов», прилежащих друг
к другу днищами, причем один из
них (и только один!) может быть зак-
рыт «крышкой».
Стенки и дно каждого «котла» об-
разованы 7 молекулами (субъедини
цами) белка GroEL, расположенными
по окружности.
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
195
! .3.3® <Хг. '* сУбъ'
I единицы белка GroEl ’
В составе каждой субъедини-
цы этого белка — три домена
(рис. 3.25):
- апикальный (находится
в области отверстия «котла»),
промежуточный (участвует
в образовании стенки «котла») и
- экваториальный (вместе
с аналогичными доменами других
субъединиц формирует дно «котла»
и обеспечивает связь между двумя
«котлами»).
Отверстие «котла» несколько
/
уже, чем остальная часть его поло-
сти. В центральной же части по-
лость имеет диаметр 9 нм, что впол-
не достаточно для размещения
в ней весьма крупного белка.
Всего в клетке Е. coll — примерно 700 подобных комплек-
сов белка GroEL (содержащих по 14 субъединиц).
Что же касается «крышки», которой может быть закрыт
один из «котлов», то ее формируют 7 субъединиц второго бел-
ка — ко-шаперонина GroES
При этом имеется принципиальное обстоятельство: связы-
вание «крышки» меняет конфигурацию белка GroEL В откры
том «котле» конфигурация такова, что на внутренней поверхно-
сти полости преобладают гидрофобные радикалы. В закрытом
же «котле» внутренняя поверхность является гидрофильной
(из-за переориентации соответствующих радикалов).
Эти изменения конфигурации энергетически обеспечива
ются гидролизом АТФ. И для диссоциации «крышки», и для ее
связывания должен происходить распад 7 молекул АТФ (до
АДФ и фосфата). Катализируют этот распад сами субъединицы
белка GroEL — по 1 молекуле АТФ на субъединицу за каждый
акт диссоциации или связывания «крышки» и сопутствующего
изменения конформации.
Предполагаемый механизм функционирования данной си
стемы показан на рис. 3.26.
В исходном состоянии комплекса полости обоих «котлов»
пусты, а отверстие одного из них закрыто «крышкой».
Дальнейшие события таковы.
а) В открытый «котел» проникает субстрат - как мы уже
говорили, это белок в состоянии незавершенного фолдинга,
а именно расплавленная глобула
196
Глава 3
Рис. 3.2’г M/xj ни;, к-действия системы GroEL GroES
Связыванию способствует тот факт, что на поверхности
и такой глобулы, и внутренней стенки открытого «котла» в из-
бытке находятся гидрофобные радикалы.
Некоторые авторы считают, что в процессе этого связыва-
ния апикальные домены белка GroEL могут также физически
разворачивать глобулу, если она имеет «неправильную» струк-
туру. Это позволяет объяснить вторую функцию шаперонов —
рефолдинг давно образованных, но частично денатурированных
белков.
б) Взаимодействие субстрата с «котлом» инициирует дис-
социацию «крышки» от второго «котла». Соответственно, про-
исходит гидролиз 7 молекул АТФ, и второй «котел» также ста-
новится гидрофобным.
Не вполне ясно: может ли он теперь тоже связать молеку-
лу белка с незавершенной структурой? Возможно, при заня-
том первом «котле» этому мешает какое-либо стерическое
препятствие (тоже обусловленное изменением конформации
белка GroEL).
в) Диссоциировавшая «крышка» тут же связывается
вновь — с равной вероятностью с одним из двух «котлов». Сле-
довательно, в 50 % случаев она закрывает тот «котел», который
содержит белок.
В таком случае срабатывают два обстоятельства.
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
197
Во-первых, белок оказывается в замкнутом пространстве и,
следовательно, теряет способность к агрегации с себе подобны-
ми частицами.
Во-вторых, в данном «котле» внутренняя поверхность ста-
новится гидрофильной. Поэтому белок теряет связь с нею и ока-
зывается предоставленным в полости сам себе.
В этом, как полагают, и состоит ключевая роль данной си-
стемы: она просто изолирует сворачивающийся белок, предва-
рительно устраняя в нем «неправильные» взаимодействия,
и затем дает ему возможность самому найти оптимальную про-
странственную структуру.
г) Через 15-20 с происходит очередной гидролиз АТФ —
«крышка» диссоциирует и «котел» опять становится гидро-
фобным.
Если за это время белок успел принять нативную конформа-
цию (т. е. сделался с поверхности гидрофильным), он больше не
«липнет» к стенкам полости и диффундирует из нее.
д) Если же фолдинг не завершился, белковая глобула
вновь связывается со стенками, оставаясь в полости.
Тогда после очередного связывания «крышки» цикл повто-
ряется снова. И так далее пока не будет достигнут необходи-
мый результат.
В частности, для одного из ферментов — роданезы — уста-
новлено: его фолдинг в системе GroEL/GroES включает в сред-
нем 7 циклов.
Очевидно, все эти циклы могут проходить только по окон-
чании трансляции.
Если белок является олигомерным, то роль системы Gro-
EL/GroES состоит в том, что она обеспечивает правильный фол-
динг отдельных субъединиц и затем поставляет их в готовом ви-
де в цитозоль. Сама же сборка субъединиц в олигомерные струк-
туры происходит вне полостей данной системы.
3.5.3.4. Роль шаперонов в формировании бактериофагов
Необходимы шапероны и для фолдинга вирусных белков,
без чего последние не могут участвовать в сборке вирусных ча-
стиц. Наиболее детально это показано для бактериофага Т4
(рис. 3.27), который размножается в клетках Е. colt.
Вирион Т4 включает 3 компонента — головку, хвост
и хвостовые фибриллы двух типов: короткие и длинные. Го-
ловка представляет собой белковую полую капсулу (капсид)
в виде многогранника и плотно упакованную в ней линейную
молекулу ДНК.
198
Глава 3
Попутно заметим, что эта ДНК обладает уникальным соста-
вом: вместо цитозина она содержит его производное 5-гидрок-
симетилцитозин. Такая специфическая модификация (подобно
системе модификации и рестрикции у бактерий; п. 1.6.2) пре-
дохраняет фаговую ДНК от индуцируемой фагом ДНКазы: по-
следняя узнает скопления (кластеры) остатков цитозина. Поэто-
му под действием данного фермента разрушается только ДНК
зараженной бактериальной клетки.
По последним данным, ДНК фага Т4 содержит около 250 ге
нов. Продукты этих генов обозначаются буквами gp (от gene pro-
duct) и соответствующей цифрой. В состав же собранной фаго-
вой частицы входит не более сотни различных белков.
Остальные белки, кодируемые фаговой ДНК, играют вспо-
могательную роль: обеспечивают протекание разных стадий фа-
говой инфекции, в том числе и сборку готовых вирионов.
Среди этих вспомогательных белков имеются и шапероны
Т. е. фаг приносит с собой в клетку, помимо прочего, информа-
цию о своих собственных шаперонах, которые будут обеспечи-
вать фолдинг его собственных структурных белков. Совершенно
поразительная «предусмотрительность»!
В то же время при фолдинге ряда фаговых белков использу-
ются и бактериальные шапероны — в первую очередь, хорошо
уже нам знакомый шаперонин GroEL.
Рис. 3.27 конкретизирует «сферу ответственности» разных
шаперонов.
В соответствии с ним, для фолдинга главного белка капси-
да — gр23 — необходима совокупность бактериального шапе-
ронина GroEL и фагового шаперона gp31.
хвост
ФИБРИЛЛЫ
(короткие и
длинные)
Компоненты Входящие в них
фага белки
Необходимые
шапероны
gp20 (коннектор)
gp22(Kop прокапсцдя)
gp23 (главный белок
лрокапсида)
gp2l (протеиназа)
Ряд минорных белков **"" gpl?
gp40
GroEL
8Р31
Более 15 различных
банков
gp.M-gp37
еря.
gp57A
gp57A,
gp3«
Г Ф>«г N: участие шаперокое в «Ьоядин е его бел* о*
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков
199
При этом первый, как расматривалось выше (см. рис. 3.24
и 3 26), находится в виде 14 субъединичных комплексов (два
«котла», прилегающие друг к другу днищами). Фаговый же белок
gp31 является, по существу, ко-шаперонином: замещает ко-шапе-
ронин GroES, т. е. играет роль «крышки» одного из «котлов».
Причем gp31 во многих отношениях очень похож на GroES:
имеет сходную молекулярную массу, пространственную струк-
туру, а для формирования «крышки» тоже использует 7 субъе
диниц.
Чем же вызвана необходимость в образовании специально-
го белка gp31 вместо уже существующего в бактериальной клет-
ке GroES? Пока точного ответа на этот вопрос нет. Но предпола-
гают, что дело может быть в большей выпуклости фаговой
«крышки». Благодаря этому полость закрытого «котла» оказы-
вается больше и становится способной вмещать расплавленную
глобулу белка gp23.
Как уже упоминалось (п. 3.5.3.3), в бактериальной клет-
ке — около 700 комплексов, образованных шаперонином Gro-
EL. В одной же вирусной частице 960 молекул белка gp23.
А всего при заражении в клетке образуется примерно 200 ви
рионов. Отсюда нетрудно найти, что каждый комплекс GroEL
должен обеспечить (в кооперации с gp31) фолдинг нескольких
сотен молекул капсидного белка gp23.
Механизмы действия других фаговых шаперонов, упомя-
нутых на рис. 3.27, пока неизвестны. Бесспорными представля-
ются только сами факты такого действия.
В частности, один из белков капсида, gp20, образует кон-
нектор — структуру в виде двойного кольца, которая находится
в месте крепления головки к хвосту. Именно с ее образования
начинается сборка прокапсида. По окончании сборки через
отверстие коннектора внутрь проникает фаговая ДНК. И, нако-
нец, затем к коннектору присоединяется хвост.
Так вот, для фолдинга данного ключевого белка (gp20) с мас-
сой 65 к Да необходим небольшой белок gp40 с массой 13 кДа.
И так далее: всего, согласно рис. 3.27, фаг Т4 кодирует не
менее 7 собственных шаперонов.
3.5.4 Прионы как антишапероны
Из предыдущего изложения можно представить, что фол
динг особенно с участием фолдаз и шаперонов — всегда при
водит полипептидную цепь к «правильной», наиболее опти
мальной в энергетическом и функциональном отношениях,
структуре.
200
Глава 3
К сожалению, это не так. Существует группа тяжелых не-
врологических болезней, которые обусловлены закономерно
повторяющимся «неправильным» фолдингом одного, вполне
определенного белка.
Данный белок, если он находится в нормальной конформа-
ции, называется прионовым белком и обозначается буквами
РгР (от prion protein, constitutive). Обнаруживается он в мозгу;
функция его неизвестна.
При ряде же заболеваний тот же полипептид оказывается
в другой конформации. В последней преобладают участки с р-
структурой, почти отсутствующие в нативной форме, а молеку-
лы белка имеют повышенную склонность к агрегации. Такой бе-
лок называется прионом (от proteinaceous infection particle —
белковая инфекционная частица) и обозначается буквами РгР“.
В данной форме он, видимо, не способен к выполнению своей
обычной функции.
Но самое худшее заключается в том, что «неправильная»
форма белка вызывает переход в такую же форму и «правиль-
ных» форм. Как это происходит, неясно. Возможно, имеет место
захват «правильных» молекул агрегатами приона, в результате
чего эти молекулы разворачиваются и организуются заново,
но по подобию прионов.
Таким образом, прионы в отношении своих исходных моле-
кул играют роль антишаперонов, осуществляющих как бы фол-
динг наоборот. Более того, процесс, очевидно, является автока-
талитическим: вновь образовавшиеся порции «испорченного»
белка начинают «портить» очередные порции нативного бел-
ка — и так далее, пока весь белок не оказывается «испорчен».
Процесс происходит относительно медленно — болезнь развива-
ется в течение нескольких лет, но неотвратимо приводит к гибе-
ли животного или человека.
Как возникают в организме первые порции приона?
а) Иногда, чрезвычайно редко, это происходит спонтан-
но — в результате ошибки фолдинга.
б) Несколько чаще встречаются мутации гена РгР — та-
кие, которые способствуют неправильному сворачиванию бел-
ка. Тогда болезнь передается по наследству.
в) Но наиболее часто болезнь возникает в результате упо-
требления в пищу тех тканей животного, в которых содержатся
прионы. Потому-то данные белки и названы инфекционными
частицами.
Их отличает еще одна очень важная особенность — устой-
чивость к протеазам. Именно благодаря ей отдельным молеку-
лам прионов удается проникать в неизмененном виде из желу-
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
201
дочно-кишечного тракта в нервную ткань, где и запускается вы-
шеизложенный автокаталитический процесс.
Все вместе это делает прионы уникальным инфекционным
агентом: это, видимо, единственный случай, когда подобный
агент лишен нуклеиновой кислоты.
Как же называются вызываемые прионами болезни?
У коров это т. н. губчатая энцефалопатия (BSE — bovine
spongiform encephalopathy), или коровье бешенство.
Употребление человеком мяса таких коров вызывает бо
лезнь Креинцфельда Якоба
Кроме того, среди туземцев Новой Гвинеи известна еще од-
на болезнь той же природы — куру, при которой на лице челове
ка то и дело появляются гримасы, как при смехе. Считают, что
куру передается в результате каннибализма.
Наконец, у овец болезнь называется почесухой: постоян-
ный зуд заставляет животных все время тереться о твердые
предметы.
Таким образом, как видим, фолдинг — очень важный этап
в образовании белков.
3.6. СОРТИРОВКА И МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ
Теперь обратимся к особенностям синтеза тех белков, кото-
рые образуются мембраносвязанными рибосомами. Как отмеча-
лось в п. 3.1, это «экспортные», мембранные и лизосомальные
белки. Сюда же следует добавить белки пероксисом.
В формировании всех этих белков ключевую роль играют:
во-первых, гранулярная, или шероховатая ЭПС (эндо-
плазматическая сеть),
— во-вторых, комплекс Гольджи.
Благодаря этим структурам, происходят два дополнитель-
ных (помимо трансляции и фолдинга) процесса:
специфическая сортировка (вместе с направленным
транспортом) и
— модификация новообразованных белков
3.6.1. Процессы в гранулярной ЭПС
3 6 11 Структура гранулярной ЭПС
Как известно, ЭПС (эндоплазматическая сеть), или ЭР (эн-
доплазматический ретикулум), на электронных микрофотогра
202
Глава 3
фиях выглядит в виде множества мембранных цистерн (мешоч-
ков), трубочек и пузырьков.
На самом же деле практически все эти структуры предста-
вляют собой единый непрерывный компартмент (отсек), отгра-
ниченный мембраной от гиалоплазмы. Но этот компартмент об-
разует всевозможные инвагинации и складки, которые и вос-
принимаются на срезе как отдельные трубочки, пузырьки и рас-
положенные параллельно друг другу плоские цистерны.
Лишь некоторые пузырьки могут быть действительно от-
шнурованными от данного компартмента. Это «транспортные
средства», направляющиеся с порцией новосинтезированных
белков к комплексу Гольджи для дальнейших процессов сорти-
ровки и модификации.
ЭПС подразделяется на гладкую и гранулярную (шерохова-
тую). Особенность последней состоит в том, что со стороны гиа-
лоплазмы она покрыта рибосомами что и придает ей характер-
ный шероховатый вид (рис. 3.28). Эти-то рибосомы и называют-
ся мембраносвязанными — в отличие от свободных, находя
щихся в гиалоплазме.
Таким образом, при образовании «экспортных» и других
рассматриваемых здесь белков (мембранных, лизосомальных,
пероксисомальных) трансляция происходит на гранулярной
ЭПС.
По некоторым данным, имеет значение и локализация этой
ЭПС: «экспортные» белки синтезируются в одних областях гра-
нулярной ЭПС, мембранные белки — в других, лизосомаль-
ные — в третьих.
В то же время используемые при этом рибосомы ничем не
отличаются от свободных рибосом. Становятся же мембрано-
связанными они только в процессе трансляции.
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
203
Заметим: как мы уже знаем (п. 3.2.1.3), вне данного процес-
са рибосомы находятся в виде отдельных субъединиц. А объеди-
нение последних происходит только при инициации трансля-
ции, т. е. при образовании комплекса с мРНК и инициирующей
аа-тРНК.
Поэтому, говоря как о свободных, так и о мембраносвязанных
рибосомах, мы должны понимать, что те и другие находятся в со-
стоянии трансляции, и, следовательно, связаны с мРНК и синте-
зируемым пептидом. При этом нередко рибосомы входят в состав
полисом — опять таки свободных или мембраносвязанных.
Отдельные же субъединицы рибосом с ЭПС никогда не
связаны.
После этих замечаний рассмотрим особенности трансляции
на гранулярной ЭПС.
3 6 1.2. Особенности трансляции
При трансляции «экспортных» и других подобных (по ме-
ханизму синтеза) белков встают две проблемы:
- связывание начавшей трансляцию свободной рибосомы
с мембраной ЭПС (причем, видимо, в определенной обла-
сти ЭПС);
проникновение синтезируемого пептида во внутреннее
пространство ЭПС.
В решении обеих этих проблем ключевую роль играет т. н.
сигнальная последовательность (СП) (рис. 3.29), с которой всег-
да начинается первичная полипептидная цепь любого рассма-
триваемого здесь белка.
СП находится с N-конца пептидной цепи и включает 15-35
аминокислотных остатков. В начале и в конце СП расположены
остатки с полярными радикалами, в середине же — с неполяр-
ными, а значит гидрофобными. Это обеспечивает взаимодей-
(NH )о©-0-0-©-фт©-@ © © ©©-© ©‘О'© О Х+0©‘©0П0©'0“
остатки с
полярными
радикалами
остатки с
неполярными
радикалами
остатки с
полярными
радикалами
НАЧАЛО
последовательности,
остающейся в
СИГНАЛЬНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ (СП) зрелом белке
. СЦ/^ктура ггигнът.ьЯ^й иасгел- uare.W
........................ ___ . минмкцпрт . . .
204
Глава 3
ствие СП с соответствующими слоями мембраны ЭПС. В частно-
сти, гидрофобные радикалы СП оказываются «как дома» в ли-
пидном бислое, составляющем основу данной мембраны.
В окончательной же структуре белка СП отсутствует. Она
отщепляется специальной пептидазой после проникновения
всей полипептидной последовательности белка во внутреннее
пространство ЭПС.
Итак, какова, с учетом вышесказанного, последователь-
ность событий при трансляции? Она показана на рис. 3.30.
а) Вначале, как обычно (п. 3.2.1.3), в гиалоплазме собира-
ется инициаторный комплекс, включающий мРНК одного из
рассматриваемых белков, рибосому и инициирующую аа-тРНК.
мРНК
Формирг юшаяся V СП __OSRP
мембрана * X ЭПС • ~ о докинг- белок
с~')
пора \ .*Г
'i ] ’> -я
Г) Z—X мРНК
вор
г ” л) чХ Сигналъ- И ' ф пая ** п«птюаэ« 1
। Велок в » просвете ЭПС
Рис. 3.31. Т,к.ис.»«щи4;
нл г^анупл^н й ЭПС
Начинается трансляция, и рибо-
сома, оставаясь свободной, синтези-
рует СП.
б) В гиалоплазме имеются спе-
циальные СП-узнающие частицы
(SRP — signal recognition particles).
Они представляют собой комплексы
РНК-белок.
Когда на свободной рибосоме по-
является СП, одна из таких частиц свя-
зывается с рибосомой и останавливает
трансляцию.
В свою очередь, образующийся
комплекс мРНК-рибосома-СП-SRP
становится способным (благодаря
двойной «валентности» SRP) связы-
ваться с т. н. докинг-белками, которые
находятся на цитоплазматической по-
верхности мембраны ЭПС.
Так решается первая из указан-
ных выше проблем — связывание ри-
босомы с ЭПС. Как видим, СП играют
при этом роль «меток», которые опре-
деляют, какие именно из транслирую-
щих свободных рибосом должны быть
прикреплены к ЭПС.
Возможно, одновременно узнает-
ся (с помощью РНК, входящей в SRP)
и какой-то локус транслируемой
мРНК. Это могло бы объяснить то от-
меченное выше обстоятельство, что
ЦИТОПЛАЗМА: образование белков...
205
синтез белков разного назначения происходит в разных обла-
стях ЭПС.
Как бы то ни было, на данном этапе происходит первый
этап сортировки будущих белков:
- с помощью прикрепления части рибосом к ЭПС и,
возможно, путем распределения прикрепляющихся ри-
босом по разным областям ЭПС.
в) Что дальше? Затем СП, видимо, проникает (за счет
своих гидрофобных радикалов) в липидную фазу мембраны ЭПС
на всю ее глубину. И после этого начинает служить организато-
ром, вокруг которого особым способом группируются мембран-
ные белки. В ходе этого взаимодействия происходит гидролиз
ГТФ, a SRP возвращается в гиалоплазму.
В результате в месте нахождения СП мембранные белки об-
разуют канал — т. н. полипептид-транслоцирующую пору (или
транслокон).
г) Трансляция возобновляется (из-за диссоциации SRP),
и все удлиняющаяся полипептидная цепь начинает протяги-
ваться через пору во внутреннее пространство ЭПС.
При этом СП остается фиксированной в области поры (что,
вероятно, сохраняет структуру канала). Так что в этом месте
проникающая пептидная цепь образует петлю
Из сказанного вытекает, что при данном механизме тран-
сляции не рибосомы движутся по мРНК (как нередко бывает
в случае свободных полисом), а, наоборот, мРНК перемещается
относительно «заякоренных» на ЭПС рибосом. А синтезируе-
мая полипептидная цепь вообще имеет двойную фиксацию:
к поре (через СП, с N-конца) и к рибосоме (с С-конца).
д) По окончании трансляции цепь теряет фиксацию с об
еих сторон: с С-конца — за счет отделения от рибосомы, а с N-
конца — за счет сигнальной пептидазы, отщепляющей СП.
Таким образом, она высвобождается в пространство ЭПС,
где происходит ее фолдинг. В этом, как обычно, принимают уча-
стие фолдазы и шапероны. Те и другие должны находиться вну-
три ЭПС. Что касается одной из фолдаз — протеин-дисульфид-
изомеразы, то хорошо известно, что она связана, в основном,
сЭПС(п. 3.5.2.1).
3.6.1.3. Модификация белков в ЭПС
Многие из белков, чей синтез здесь рассматривается, в зре-
лом состоянии являются гликопротеинами; т. е. содержат угле-
водный компонент. Последний обычно представлен одной или
несколькими разветвленными олигосахаридными цепочками.
206
Глава 3
Вот примеры гликопротеинов:
- среди «экспортных» белков — некоторые белки плазмы
(кислый аг гликопротеин);
среди мембранных белков — гликофорин (содержится
в мембране эритроцитов), многие антигенные детерми-
нанты, транслоказы (белки-переносчики), рецепторы
к гормонам и т. д.;
- почти все лизосомальные ферменты.
Как оказалось, углеводные компоненты подобных белков
имеют сходный план строения. Неудивительно, что сходной яв-
ляется и последовательность событий, ведущих к образованию
этих компонентов.
Эти события начинаются в гиалоплазме, продолжаются во
внутреннем пространстве ЭПС и завершаются в аппарате Голь-
джи. Рассмотрим пока начальные стадии гликозилирования.
а) В гиалоплазме образуется одинаковая для всех белков
« заготовка» - разветвленное олигосахаридное ядро из 14 моно-
меров (рис. 3.31). В него входят 2 остатка N ацетилглюкозами-
на, 9 остатков маннозы и 3 остатка глюкозы.
Синтез происходит путем последовательного присоедине-
ния моносахаридных остатков к специальному липидоподобно-
му веществу — долихолфосфату.
Заметим: известен антибиотик — туникомицин, который
блокирует прикрепление к долихолфосфату первого остатка (N
ацетилглюкозамина). Вследствие этого нарушается весь синтез
гликопротеинов.
ЭГК’
Рис. 3.31 Гликлзи.,ир кяимо »'/ПС
IМТОПЛАЗМА: образование белков...
207
Что же касается долихолфосфата, то он представляет собой
длинную углеводородную цепочку (включающую около 100 С-
атомов), поэтому является гидрофобным и легко проходит через
мембраны.
б) С помощью долихолфосфата олигосахаридные ядра транс
портируются из гиалоплазмы во внутреннее пространство ЭПС.
Здесь специальная трансфераза переносит эти ядра от до-
лихолфосфата на вновь синтезированные белки — после завер
шения их трансляции и фолдинга.
Связывание олигосахарида с пептидной цепью происходит
через амидную (NH2—СО ) группу остатка аспарагина. Поэтому
такой процесс обозначается как N-гликозилирование.
Еще известно О-гликозилирование: при этом олигосаха-
рид связывается через гидроксигруппу (ОН-) серина или трео-
нина. Но О-гликозилирование осуществляется лишь в аппара-
те Гольджи.
В результате же N гликозилирования соответствующие
белки приобретают одно или несколько стандартных олигосаха-
ридных ядер.
в) В ЭПС могут происходить и другие виды модификации
белков. Так, очень важная модификация (особенно при образо-
вании коллагена) - гидроксилирование остатков пролина и ли-
зина. Оно осуществляется специальным ферментным комплек-
сом, для функционирования которого требуется аскорбиновая
кислота.
г) Последнее, что происходит с формирующимися белками
в ЭПС, «упаковка» их в транспортные пузырьки (рис. 3.32).
Эти пузырьки, видимо, образуются в местах высокой кон
центрации гликозилированных белков внутри ЭПС. Мембрана
ЭПС здесь начинает все больше и больше выгибаться во внеш-
208
Глава 3
нюю сторону и, наконец, отшнуровывается в виде пузырька.
В последнем оказывается высококонцентрированный раствор
белков.
С внешней (цитоплазматической) поверхности пузырьки по-
крыты особым белком — клатрином — и потому иногда называ-
ются окаймленными. Клатрин образует как бы дополнительную
оболочку, гно она имеет не сплошную, а решетчатую структуру.
Заметим: данный белок всегда оказывается на внешней по-
верхности тех участков мембраны (в т. ч. плазматической), ко-
торые способны к инвагинации и отшнуровыванию. Видимо,
клатрин и придает данным участкам мембраны эти свойства.
Транспортные пузырьки, отпочковавшиеся от ЭПС, диф-
фундируют к комплексу Гольджи и сливаются с его мембрана-
ми. В итоге первично гликозилированные белки оказываются во
внутреннем пространстве этого комплекса.
3.6.2. Процессы в комплексе Гольджи
3.6.2.1. Структура и функции комплекса Гольджи
Основ ная часть комплекса Гольджи (рис. 3.33) — это ско-
пление плюских мембранных цистерн, лежащих параллельно
друг другу?. Каждое такое скопление называется диктиосомой.
В клетке может быть много диктиосом, соединенных друг с дру-
гом цистернами и трубочками.
В непосредственной близости от диктиосомы обычно нахо-
дится множество мембравных пузырьков.
Одни из них перемещаются от ЭПС к комплексу Гольджи.
Гранулярная Транспортный Комплекс Гольджи
Транс-полюс комплекса Гольджи Ядро клетки
Р"ис. 3 33. К <мплс кс Г л»у?ки и его связь о ЭПС
I [ИТОПЛАЗМА: образование белков...
209
При этом обращенная сюда (к ЭПС) сторона диктиосомы называ-
ется проксимальной, или цис-полюсом.
От противоположной же стороны диктиосомы отшнуровыва-
ются другие пузырьки. Одни из них содержат гидролитические
ферменты и представляют собой первичные лизосомы. Прочие пу-
зырьки транспортируют «экспортные» и (или) мембранные белки;
они перемещаются к плазмолемме и затем сливаются с ней.
Соответствующая сторона диктиосомы (от которой отделя-
ются пузырьки с готовыми белковыми продуктами) называется
дистальной, или транс-полюсом.
Таким образом, в диктиосоме созревающие белки постепен-
но перемещаются от проксимальной части к дистальной.
Что же происходит с белками в комплексе Гольджи? Здесь
продолжаются два уже знакомых нам процесса: модификация
и сортировка белков.
Важной составной частью модификации является специфи-
ческая для каждого вида белков перестройка углеводного ком-
понента. Как мы помним, в ЭПС белки приобретали одинаковое
олигосахаридное ядро (рис. 3.31). Теперь же, в аппарате Голь-
джи, это ядро подвергается различным изменениям.
Так, почти всегда удаляются последний остаток глюкозы
и несколько остатков маннозы. Для некоторых белков на этом
перестройка и заканчивается.
В других случаях к определенным местам «ядра» присоеди-
няются те или иные дополнительные остатки — галактозы (и ее
производных), нейраминовой кислоты (или такой ее производ-
ной, как сиаловая кислота) и т. д.
Кроме того, иногда путем О-гликозилирования (п. 3.6.1.3)
формируются новые олигосахаридные ветви.
Все это делает еще более индивидуальным и неповторимым
«облик» созревающего белка, что имеет важные последствия —
в частности, облегчает сортировку белков.
Рассмотрим этот момент более подробно.
3.6.2.2. Сортировка белков
а) Белки ЭПС. При отшнуровывании пузырька от цистер-
ны ЭПС в нем случайно могут оказаться и такие белки, местом
«службы» которых является ЭПС. Это, например, ферменты
фолдинга (фолдазы), шапероны, ферменты N-гликозилирова-
ния и гидроксилирования.
Очевидно, такие белки должны вернуться из аппарата
Гольджи обратно в ЭПС. Оказалось, они имеют сходную после-
довательность из 4 х аминокислотных остатков:
210
Глава 3
—Лиз—Асп—Глу—Лей—.
По ней белки опознаются и собираются в специальные пу-
зырьки, возвращающиеся в ЭПС.
б) Ферменты лизосом. По какому признаку узнаются в ап
парате Гольджи формирующиеся белки лизомом, пока неиз-
вестно. Скорее всего, таким маркером тоже служит какая-ни-
будь аминокислотная последовательность.
Но после «опознания» этих белков происходит их дополни-
тельное «мечение» — с помощью специфической модификации
олигосахаридного компонента. А именно фосфорилируется
один из остатков маннозы.
На внутренней поверхности мембраны аппарата Гольджи
в некоторых местах имеются рецепторы к маннозофосфату. По-
этому здесь собираются лизосомальные ферменты, и их взаимо-
действие с рецепторами, видимо, является стимулом к началу
образования и отпочковывания пузырька (рис. 3.34).
Но этого мало! В мембране, помимо рецепторов, есть также
протонные насосы, создающие внутри будущих лизосом ки-
слую среду. Снижение pH в пузырьках приводит к диссоциации
лизосомальных ферментов от рецепторов. После чего рецепторы
группируются в кластеры и удаляются из лизосомы в составе
мелких пузырьков, чтобы вернуться в аппарат Гольджи для
«улавливания» очередных лизосомальных ферментов.
ior аппарата
Гольджи
ПУЗЫРЕЁК - ПРЕДШЕСТВЕННИК
ПЕРВИЧНОЙ ЛИЗОСОМЫ
Рецепторы
маннозо-
фосфата
Н> ' ”.УЗДУ ~
3.34.
зооомш
Т. е. в отношении белков ап-
парата Гольджи природа не менее
экономна, чем в отношении белков
ЭПС.
Имеется наследственная бо-
лезнь муколипидоз II, или бо-
лезнь 1-клеток. При ней не проис
ходит фосфорилирование маннозы
в составе прелизосомальных фер-
ментов. Это нарушает процесс сор-
тировки.
Часть данных ферментов (от-
ветственная за разрушение гликоз-
амингликанов) попадает не в лизо-
сомы, а во внеклеточную среду —
в конечном счете в кровь. Лизосо-
мы же оказываются переполненны-
ми гликозамингликанами (по ста-
рому — мукополисахаридами).
В итоге, из-за нарушения обмена
последних в соединительной ткани,
ЦИТОПЛАЗМА образование белков
211
у больного ребенка наблюдаются задержка развития и деформа-
ции скелета.
в) Мембранные белки. Будущие интегральные белки мем
бран, видимо, отсортировываются еще в процессе трансляции.
Полагают, что они не протягиваются полностью через пору
в мембране ЭПС, а так и остаются фиксированными в данной
мембране (рис. 3.35).
Это происходит благодаря наличию протяженного гидро-
фобного участка в средней части полипептидной цепи. По окон-
чании трансляции и отщепления СП (сигнальной последова
тельности) N конец такой цепи оказывается в просвете ЭПС, а С-
конец — на цитоплазматической поверхности.
В более сложных случаях после отщепления первой СП
в белке как с N-, так и с С-конца могут обнаруживаться и дру-
гие СП, протягивающие соответствующий конец через мем-
брану. Тогда пептидная цепь не один, а несколько раз «про-
шивает» мембрану. И может получиться так, что N-конец на-
ходится на ее цитоплазматической поверхности, а С-конец —
в просвете ЭПС или что оба конца — на какой-нибудь одной
поверхности мембраны.
Затем эти белки (вместе
с окружающим участком мем-
браны) последовательно оказы-
ваются:
- в стенке транспортного
пузырька, перемещающегося от
ЭПС к аппарату Гольджи;
- в мембране цистерн этого
аппарата;
- в стенке транспортного
пузырька, перемещающегося
к плазматической (или иной)
мембране и сливающегося с ней.
Так, в конце концов, мем-
бранные белки достигают места
своего назначения.
При этом все время сохра-
няется полярность мембран
и ориентация в них интеграль-
ных белков. Например, внутрен-
няя поверхность мембран ЭПС,
аппарата Гольджи, пузырьков и лизосом соответствует по по-
лярности внешней поверхности плазматической мембраны.
С учетом этого и происходит формирование пузырьков из одних
мРНК
Цитоплазма
Цито
плазма
Просвет ЭПС
Сигнальная
пептидаза
С-конец мемб-
ранного белка
"эпГ <Я>
Т Iv -—----
°**с
бранисго бепка в мемяр .»е
а ходе грвнсляции
Ой
212
Глава 3
мембран и последующее слияние пузырьков с другими мембра-
нами.
Заметим, что вместе со встраиванием в мембрану ЭПС но-
вых белков происходит включение в нее и новых липидных мо-
лекул Это приводит к увеличению площади мембраны, что
и создает ее избыток, необходимый для отшнуровывания части
мембраны в виде пузырьков и роста клетки.
3.6 3. Сортировка и транспорт белков
митохондрий и ядер
Итак, все белки, синтезируемые мембраносвязанными ри-
босомами, имеют гидрофобную СП, необходимую для проникно-
вения полипептидной цепи через мембрану ЭПС.
Митохондриальные белки, как мы знаем (пп. 3.1 и 3.5.3.1)
в подавляющем большинстве (95 % ) образуются свободными ри-
босомами; да и остальные 5 % приходятся не на мембраносвя-
занные, а на внутримитохондриальные рибосомы.
И тем не менее, при трансляции этих белков тоже образует-
ся СП! Зачем? — Для прохождения пептидной цепи через мем-
браны митохондрий из гиалоплазмы в митохондриальный
матрикс. Потом (в матриксе) эта СП отщепляется.
(*ис. 3.3'4. Пер«.н*с мито-
X 1ИДС,И-«ЛЬН'.|Х -лк < ч
мип>х> нхрии
Более того, если белок должен
в конечном счете оказаться в меж-
мембранном пространстве, он имеет
и вторую СП, которая экспонируется
после удаления первой СП. Тогда
с помощью второй СП белок прони-
кает из матрикса в межмембранное
пространство.
Причем до окончания всех этих
транспортных процессов полипепти-
дная цепь остается в развернутом со-
стоянии, что обеспечивается спе-
циальными шаперонами (п. 3.5.3.1).
В итоге последовательность со-
бытий выглядит так, как показано
на рис. 3.36.
а) Синтезируемая на свободных
рибосомах цепь митохондриального
белка, во-первых, имеет СП (одну
или две) и, во-вторых, сразу связы-
вается с шаперонными белками, пре-
пятствующими фолдингу.
ЦИТОПЛАЗМА образование белков..
213
б) По окончании трансляции цепь сохраняет связь с шапе-
ронами и диффундирует к митоходрии. Здесь она с помощью СП
пересекает (уже без шаперонов) обе митохондриальные мембра-
ны в месте их соприкосновения.
в) В матриксе митохондрии (если это конечный «пункт
маршрута») другие шапероны обеспечивают правильный фол-
динг вновь прибывшего белка.
Что касается ядерных белков, то многие из них тоже имеют
СП и тоже проникают с их помошью через поры в ядерной обо-
лочке (которая опять таки состоит из двух мембран). Возможно,
в процессе этого проникновения в диафрагме, закрывающей по-
ру, образуются временные каналы, о которых упоминалось
в п. 1 1.1.
Требование о наличии СП относится и к транскрипцион-
ным факторам (п. 2.4.2). Правда, СП не обязательно должна на-
ходиться на N-конце цепи: она может быть расположена и в се-
редине. Очевидно, в этих случаях она просто является «мет-
кой», которая узнается теми структурами, которые обеспечива-
ют перенос в ядро.
В то же время для гистоновых белков (п. 1 1 2.2) СП не тре-
буется. Очевидно, это связано с тем, что данные белки являются
небольшими и содержат значительные гидрофобные области
(для взаимодействия друг с другом). То и другое облегчает пере-
нос через ядерную оболочку.
3.6.4. Образование коротких пептидов
Помимо белков, в клетках синтезируются и пептиды. Это
может происходит двумя способами:
- путем вырезания из более длинной полипептидной цепи,
- путем прямого безматричного синтеза.
а) В первом случае в ДНК имеется ген, кодирующий пер-
вичную пептидную цепь, которая, как обычно, синтезируется
на рибосомах.
В определенных участках этой цепи содержатся аминоки-
слотные остатки, по месту нахождения которых действует спе-
циальная протеаза. Это и ведет к высвобождению пептида.
Так синтезируются пептидные гормоны (окситоцин, вазо-
прессин, нейропептиды) и прочие биологически активные веще-
ства (кинины, ангиотензины и т. д.).
б) Во втором случае в ДНК нет гена, прямо кодирующе-
го последовательность аминокислот в пептиде. Но зато коди-
руются специальные ферменты, способные синтезировать
пептид.
214
Глава 3
Образуясь на рибосомах, эти ферменты катализируют цепь
реакций, в ходе которых определенные аминокислоты присое-
диняются друг к другу в определенной последовательности.
У животных и человека так синтезируются очень неболь-
шие пептиды, трипептид глутатион, специфические дипептиды
мышечной ткани (карнозин, ансерин) и пр.
У бактерий этот способ синтеза пептидов имеет большее
значение. С его помощью образуются пептидные компоненты
клеточных стенок, антибиотик грамицидин (циклический дека-
пептид) и другие соединения.
3.7. РАСПАД БЕЛКОВ
В клетках постоянно происходит не только синтез белков,
но и их распад.
а) Какой в этом смысл? Зачем разрушать столь важные макро-
молекулы, да еще созданные в результате таких сложных процес-
сов, каковыми являются транскрипция ДНК, процессинг и тран-
сляция РНК, а также фолдинг, модификация и сортировка белков?
Ответ на этот вопрос достаточно очевиден.
Во-первых, белки, как и ДНК, подвергаются «старению»
так или иначе модифицируются под действием свободных ради-
калов, излучения, тепловых флуктуаций и т. д. И если в случае
ДНК просто взять и разрушить всю молекулу нельзя, а прихо-
дится ее «ремонтировать» (раздел 1.7), то в случае белков легче
заменить «старую», поврежденную молекулу на новую.
Во вторых (и это не менее важный мотив!), содержание тех
или иных белков в клетке или внеклеточной среде вовсе не всег-
да должно быть постоянным. В процессе адаптации к меняю-
щимся условиям жизнедеятельности нередко возникает необхо-
димость в изменении концентрации определенных белков — по-
вышении или снижении. Это осуществляется, как правило, пу-
тем соответствующего изменения скорости их синтеза. Но, что-
бы последнее эффективно сказывалось на концентрации, дол-
жен постоянно происходить распад белковых молекул.
б) В то же время белки значительно различаются по сред-
ней продолжительности жизни своих молекул. Наиболее корот-
коживущими являются регуляторные белки; так, говоря
в п. 2.4.2.3 о белке р53 (ключевом транскрипционном факторе),
мы специально подчеркивали данную его особенность.
Структурные белки (например мышечные) имеют гораздо
большую продолжительность жизни. Но и они периодически об-
новляются. Причем при ряде состояний (недостаточной функ-
ции или голодании) распад начинает преобладать над синтезом
и мышечная масса снижается.
I ЦИТОПЛАЗМА: образование белков..
215
в) Многие белки разрушаются в тех же клетках, где и син-
тезируются. Это большинство внутриклеточных белков.
Но есть и такие белки, которые образуются в одних, а раз-
рушаются в других клетках. В основном, это внеклеточные бел-
ки (соединительной ткани, плазмы крови и т. д.). Однако сюда
же относятся и некоторые внутриклеточные белки, например
гемоглобин. Его синтез происходит в клетках эритроидного ря-
да (предшественниках эритроцитов), а распад в макрофагах
селезенки, захватывающих «старые» эритроциты.
г) Как бы ни были пространственно разделены синтез
и распад белка, содержание последнего является постоянным
(стационарным), если скорости синтеза и распада совпадают.
Так, постоянство содержания гемоглобина в крови обеспе-
чивается тем, что ежесуточно и образуется (в красном костном
мозгу), и разрушается (в селезенке) примерно 6,25 г этого белка.
Как мы уже сказали, чаще всего количество белка меняет-
ся в результате изменения скорости его образования в результа-
те тех или иных регуляторных воздействий.
Но не надо думать, что при этом не меняется и скорость рас-
пада! Обычно последняя прямо пропорциональна текущей кон-
центрации белка. Поэтому, например, при повышении скорости
синтеза постепенное накопление белка ведет к «автоматическо-
му» росту и скорости распада. Так что в итоге эти скорости вновь
сравниваются и достигается новое стационарное состояние — но
на более высоких уровнях концентрации белка и скоростей его
обмена. Причем количество белка увеличится ровно во столько
раз, во сколько возросла скорость синтеза (а затем и распада).
д) Как и в каких структурах разрушаются белки? В этом
отношении еще много неясного.
Однако известно, что у эукариот распад короткоживущих
белков (например, того же белка р53) является убиквитин-зави
симым. Убиквитин (Убн) — небольшой белок (76 аминокислот-
ных остатков), который связывается с данными белками и тем
самым как бы «метит» их.
Для присоединения Убн к белку-мишени требуются три
фермента:
Убн активирующий фермент (Е,), формирующий по
С-концу Убн тиоэфирную связь;
Убн-конъюгирующий фермент (Е2), принимающий
Убн на себя; таких ферментов — целое семейство; из них
каждый служит донором Убн для определенных белков;
Убн лигаза (Е3), переносящая Убн с Е2 на белок; она так-
же представлена различными формами, специфичными
в отношении тех или иных белков.
216
Глава 3
Связывание Убн осуществляется через остатки лизина
белка, причем с одной молекулой белка соединяется сразу
много молекул Убн. Это происходит по следующим причи-
нам:
- во-первых, в белке может быть несколько остатков лизина;
- во-вторых, последующие молекулы Убн, видимо, могут
присоединяться к предыдущим, образуя цепочки.
Помеченные таким образом белки затем быстро разруша-
ются в специальных частицах — протеосомах. Это мультибел
ковые цилиндрические структуры, которые содержат многочи-
сленные протеазы.
Вполне возможно, что для рассмотренной системы «без-
различно», имеет ли какие-либо дефекты белок, с которым
связывается Убн, или нет. Т. е. связывание Убн происходит
с любой «попавшейся под руку» молекулой белка соответ-
ствующего вида. Такая «беспринципность» обеспечивает тре-
буемый эффект — очень быстрый обмен молекул данного бел-
ка в клетке.
Другие белки с большей продолжительностью жизни
разрушаются в лизосомах. Здесь уже может иметь значение
функциональное состояние белка точнее, состояние его
структуры, «диагностируемое» шаперонами. Как отмечалось
в п. 3.5.3.1, последние, видимо, участвуют в переносе «старых»
белковых молекул в лизосомы.
Литература к главе 3
Билич Г., Катинас Г. С., Назарова Л. В. Цитология. СПб.: Деан,
1999, 112 с.
Мартин Й. Фолдинг белка, протекающий с участием шаперонино-
воай системы GroEL/GroES//Buoxu«u^, 1998, 63. С. 444-452.
Марусич Е. И., Курочкина Л П., Месяижинов В В. Шапероны
в сборке бактериофага Т4//Биохимия, 1998, 63. С. 473-482.
Мушкамбаров Н. Н. Аналитическая биохимия. М.: Экспедитор,
1996. Т. 1-3. 1300 с.
Птицын О. Б. Сворачивание белков: нуклеация и компактные ин-
термедиаты//Биохшиия, 1998, 63. С. 435-443.
Спирин А. С. Ко-трансляционное сворачивание белков. II съезд
биофизиков России. Тезисы докладов. М.: Ин-т биофизики клетки РАН,
1999. Т. 1. С. 5-6.
Страйер Л. Биохимия. М.: Мир, 1985. Т. 1, 3.
Уайт А. и др. Основы биохимии. М.: Мир, 1982. Т. 1 2. С. 1-1152.
Уверский В. Н„ Нарижиева Н. В. Влияние природных лигандов на
структурные свойства и конформационную стабильность белков//Био-
химия, 1998, 63. С. 500 515.
11ИТОПЛАЗМА: образование белков...
217
Уонг Чи-чен. Изомеразная и шаперонная активности протеинди
сульфидизомеразы необходимы для ее функционирования как фолда-
зы//Биохимия, 1998, 63. С. 483-490.
Фншер М Т Участие шаперонина GroE в фолдинге и сборке доде-
камерной глутаминсинтетазы//Бпохилия, 1998, 63. С. 453-472.
Чумаков П. М. Функция гена р53: выбор между жизнью
и смертью//Биохимия, 2000, 65. С. 5-33.
Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология. М.:
НИИБМХ, 1999, 372 с.
Глава 4. БИОМЕМБРАНЫ: СТРУКТУРА
И УЧАСТИЕ В МЕЖКЛЕТОЧНЫХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ
В предыдущих главах мы рассмотрели организацию гене-
тического материала, все основные стадии его экспрессии и мно-
гие связанные с этим ключевые проблемы.
Теперь обратимся к биомембранам вообще и (более подроб-
но) к их важнейшему представителю — плазмолемме.
Вначале, как обычно, кратко изложим классические сведе-
ния — о строении и транспортной функции биомембран.
Затем перейдем к актуальной проблеме современной нау-
ки — молекулярным факторам взаимодействия клеток друг
с другом и с межклеточным веществом. Очевидно, эти факторы
либо находятся в составе плазмолеммы, либо, диффундируя из-
вне, реагируют с определенными ее компонентами. Так что плаз-
молемма играет в указанных взаимодействиях решающую роль.
4.1. СТРУКТУРА БИОМЕМБРАН
4.1.1. Общие представления
4.1.1.1. Принцип строения
Как известно, в клетке много разных мембран — плазмо-
лемма, или плазматическая мембрана (окружает клетку); вну-
тренняя и наружная мембраны ядерной оболочки, внутренняя
и наружная мембраны митохондрий; мембраны ЭПС (эндоплаз-
матической сети), лизосом, пероксисом и прочих мембранных
структур.
Между этими мембранами существуют определенные раз-
личия, но имеется и немало общего. Самое главное — то, что все
они построены по одному и тому же принципу (рис. 4.1).
В основе биомембраны — двойной слой амфифильных ли-
пидов (или липидный бислой). Конкретно, практически каждая
молекула мембранного липида (рис. 4.2) имеет гидрофильную
«головку» и два гидрофобных «хвоста». Каждый из последних
представляет собой длинную углеводородную цепь, причем
обычно одна из этих цепей — предельная (т. е. не содержит
двойных связей), а вторая — непредельная (имеет одну или бо-
лее двойных связей).
РМОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
219
Углеводные компоненты мембранных
белков (с наружной поверхности клетки)
Рис. 4.1. Ьи. и>< (и i г.^им плач»* ж ммы)
В водной среде такие амфифильные молекулы самопроиз-
вольно образуют бислой, в котором гидрофобные части молекул
ориентированы друг к другу, а гидрофильные — к воде.
Кроме того, в состав мембран входят белки (см. рис 4 1).
При этом т. н. интегральные белки глубоко встроены в мембра-
ну, насквозь пронизывая липидный бислой. А периферические
белки лишь связаны с одной из поверхностей мембраны.
Контакт белков с липидами бислоя происходит по тому же
принципу: с гидрофобными частями липидов взаимодействуют
неполярные (гидрофобные) ради-
Г идрофильная
Предельный к непредельный
гидрофобные "хвосты"
НИС. 4.3. «куяа
калы аминокислот, а с гидро-
фильными «головками» — поляр-
ные и заряженные радикалы.
Кроме липидов и белков,
во многих (хотя не во всех) мем
бранах обнаруживаются углево-
ды. Но не в качестве самостоя-
тельных компонентов, а как со-
ставные части соответствующих
липидов (гликолипидов) и белков
(гликопротеинов). Чаще всего
углеводы представлены олигоса-
харидными цепями и в случае
плазмолеммы расположены с на
ружной ее поверхности.
Все эти молекулы объединя-
ются в мембраны, как считают,
путем самосборки.
220
Глава 4
Под световым микроскопом мембраны неразличимы.
При электронной же микроскопии они выглядят в виде сре-
динной светлой полосы и двух периферических электроноплот-
ных полос. Светлая полоса это гидрофобная часть липидного
бислоя; темные полосы образованы гидрофильными «головка-
ми» липидов и белками.
4.1.1.2. Количественные характеристики
Вот некоторые количественные показатели, характеризую-
щие содержание и размеры мембранных молекул.
а) Соотношение по общей массе липидов и белков в мембра-
нах обычно близко к 1:1, но иногда варьирует от 4:1 до 1:4.
б) При этом липиды (в отличие от белков) являются низко-
молекулярными веществами: молекулярная масса большинства
мембранных липидов — около 740 Да, а для холестерина - поч-
ти вдвое ниже. Это практически на два порядка меньше молеку-
лярной массы многих белков.
в) По этой причине количество липидных молекул в мем-
бране клетки (в частности, в плазмолемме) на те же два порядка
больше, чем количество молекул белков. Например, для клетки
диаметром 15 мкм эти показатели близки, соответственно,
к 2x10’ и 2х107.
г) Естественно, значительно различается и площадь мемб-
ранной поверхности, приходящаяся на отдельные молекулы.
Для липидной молекулы — это примерно 0,5 нм2, а для белко-
вой молекулы — порядка 20-30 нм2.
д) Толщина же мембраны во многом определяется продоль-
ными размерами липидных молекул.
Длина углеводородного «хвоста» амфифильного липида
(см. рис. 4.2) около 2 нм. Поэтому общая ширина гидрофоб-
ной фазы бислоя вдвое больше — 4 нм.
А общая толщина липидного бислоя (с учетом двух гидро-
фильных «головок» липидов) — 5,3 нм.
Наконец, за счет белков толщина мембраны увеличивается
до 7-10 нм.
е) В случае плазмолеммы с внешней поверхности находит
ся еще гликокаликс, толщина которого может варьировать от 4
до 200 нм, причем не только в зависимости от вида клетки,
но и в разных участках одной и той же клетки.
Гликокаликс — это совокупность различных белков (ча-
сто — гликопротеинов), связанных с плазмолеммой. Некоторые
из данных белков являются ферментами.
рИОМЕМБРАНЫ: структура и участие.
221
4 1.1.3. Основные свойства мембран
Отметим следующие общие свойства мембран.
1) Замкнутость. Липидные бислои (и мембраны) всегда са-
мостоятельно замыкаются на себя с образованием полностью от-
граниченных отсеков. Действительно, лишь в этом случае все
гидрофобные части липидов оказываются изолированными от
водной фазы.
По той же причине при нарушении целостности мембраны
происходит ее «самосшивание».
2) Латеральная подвижность. Несмотря на замкнутость
мембран, их структура при температуре тела не является же-
сткой. Компоненты мембраны могут перемещаться в пределах
своего слоя. В большей степени это относится к липидам,
но в немалой мере — и к белкам.
Так, в результате случайной диффузии молекула крупного
белка массой 100 000 Да за 10 с перемещается в мембране в сред-
нем на 2,5 мкм, а молекула липида за то же время — в среднем
на 5,5 мкм. По сравнению с размерами самих молекул это очень
большие расстояния.
Тем самым мембраны обладают свойствами двумерных
жидкостей. По этой причине модель строения биомембран назы-
вается жидкостно-мозаичнои (мозаичной — поскольку белки
находятся в мембране не на всем ее протяжении, а в виде отдель-
ных островков).
Кроме латеральной подвижности, некоторые мембранные
белки способны совершать вращательные движения, меняя
свою ориентацию относительно поверхностей мембраны. Так
функционируют некоторые мембранные переносчики: связав ве-
щество с одной стороны, они поворачиваются в мембране на 180°
и высвобождают вещество с другой стороны мембраны. Белки
с углеводными компонентами к подобному вращению никогда не
способны — в силу высокой гидрофильности олигосахаридов.
3) Асимметрия. Наружная и внутренняя поверхности мем-
браны обычно различаются по своему составу:
а) углеводные компоненты, как уже отмечалось, находят-
ся с внешней поверхности плазмолеммы;
б) многие белки расположены всегда только с наружной,
а другие — только с внутренней сторны;
в) нередко различается и липидный состав слоев бислоя.
Выше (п. 3.6.2.2) уже отмечалось, что полярность (асимме-
трия) мембраны возникает на ранних стадиях ее формирования
и затем все время сохраняется.
222
Глава 4
4.1.2. Мембранные липиды
4.1.2.1. Классы мембранных липидов
В состав мембран входят липиды следующих классов:
а) фосфолипиды (ФЛ),
б) сфинголипиды (СЛ),
в) гликолипиды (ГЛ),
г) стероиды, а именно холестерин (ХС).
Именно липиды первых трех перечисленных классов име-
ют то характерное строение (гидрофильная «головка» и два ги-
дрофобных «хвоста»), которое было показано в общем виде на
рис. 4.2. Это следует из их состава (рис. 4.3,а-в).
РИОМЕМБРАНЫ: структура и участие. .
223
а) Так, у фосфолипидов (рис. 4.3,а) в состав «головки»
обычно входят последовательно связанные друг с другом остат-
ки азотистого основания (холина, коламина или серина), фос-
фатной группы и трехатомного спирта глицерина. Всё это по-
лярные группировки (поскольку содержат много гетероатомов),
и потому они являются гидрофильными.
Остатки же жирных кислот (ЖК), образующие гидрофоб-
ные «хвосты», соединены с глицерином. В качестве насыщен-
ной кислоты часто выступает пальмитиновая кислота (16 С ато-
мов), а в качестве ненасыщенной — олеиновая кислота (18 С-
атомов и 1 двойная связь, что обозначается как С 18;1). В месте на-
хождения двойной связи углеводородная цепь делает изгиб на
40". Поэтому, несмотря на различие С-атомов в олеиновой
и пальмитиновой кислотах, длина обоих «хвостов» (точнее, про-
екция длины на продольную ось) оказывается практически оди-
наковой. Это облегчает образование бислоя.
Заметим: соединение, включающее те же компоненты, что
и показанный на рис. 4.3,а ФЛ, но без азотистого основания, на-
зывается фосфатидной кислотой. Таким образом, ФЛ можно
рассматривать как производные этой кислоты. Отсюда происхо-
дит название ряда важнейших ФЛ. В частности, типичным их
представителем в мембранах является фосфатидилхолии, т. е.
фосфатидная кислота, связанная с холином.
В мембранах имеются и такие ФЛ, чья структура несколь-
ко отличается от схемы, приведенной на рис. 4.3,а. Например,
кардиолипины (рис. 4 4) — это две фосфатидные кислоты, свя-
занные друг с другом через глицерин. Соответственно, в этих
молекулах — 4 углеводородных «хвоста» и более объемная,
чем обычно, гидрофильная «головка». А в плазмалогенах вме-
сто одного из остатков жирной кислоты содержится остаток
224
Глава 4
б) Особенность сфинголипидов (СЛ, рис. 4.3,6), по сравне
нию с ФЛ, состоит в том, что вместо глицерина и одной из жир.
ных кислот они включают сфингозин (он же сфингенин) ____
двухатомный аминоспирт, содержащий 18 С-атомов и 1 двой-
ную связь. Поэтому начальная часть сфингозина входит в гидро-
фильную «головку» СЛ, а последующая углеводородная цепь
служит одним из гидрофобных «хвостов».
Типичный представитель СЛ — сфингомиелин, где в каче-
стве азотистого основания выступает холин.
в) Гликолипиды (ГЛ, рис. 4 3,в) тоже содержат остаток
сфингозина. Но в состав гидрофильной «головки» вместо азо-
тистого основания и фосфатной группы входит какой-либо
углевод (У).
По природе последнего ГЛ подразделяются на две группы:
цереброзиды (здесь У — галактоза или глюкоза) и ганглиозиды
(У — олигосахарид, причем обычно разветвленный).
В качестве же ЖК гликолипиды часто содержат особые ки-
слоты нервоновую или цереброновую. Так, первая из них со-
держит 24 С-атома и 1 двойную связь (C24;i).
г) Несколько особняком стоит структура четвертого класса
мембранных липидов стероидов, точнее, их основного пред-
ставителя — холестерина (ХС).
ХС (рис. 4.5), как известно, представляет собой вытянутую
систему четырех углеводородных циклов и углеводородную же
боковую цепь. Поэтому, за исключением одной гидроксигруп-
пы, ХС гидрофобное соединение. Если через гидроксигруппу
связана какая-либо ЖК, то такой (этерифицированный) ХС во-
обще теряет малейшие признаки амфифильности.
Холестерин', структура молекулы и расположение по-
следней между амфифильными липидами а мембране
(н ?лой липидного бислоя
ГМОМЕМБРАНЫ.
структура и участие...225
В силу своей гидрофобности, в мембране ХС находится,
основном, в срединной зоне бислоя, и лишь гидрокси группа
примыкает к «головкам» амфифильных липидов. При этом вы-
тянутые молекулы ХС ориентированы параллельно углеводо-
родным цепям указанных липидов.
Каждый вид мембран отличается строго определенным со-
держанием вышеперечисленных классов липидов. И это во мно-
гом определяет свойства данных мембран. Рассмотрим, в чем со-
стоит эта взаимосвязь.
4.1.2.2. Влияние липидного состава на свойства
мембран
Вначале проиллюстрируем первое из только что высказан
ных утверждений — о различии состава разных мембран.
Для этого обратимся к табл. 4.1. Из нее видно следующее.
Таблица 4.1. Состав некоторых биомембран (доля различных
соединений в общей массе мембраны, % )
^\ВЕШ,ЕСТВА МЕМБРАНЫ БЕЛ- КИ УГЛЕ- ВОДЫ (связан- ные с белками) «Дестабилизи- рующие» липиды «Стабилизи- рующие» липиды
ФЛ СЛ гл ХС
Внешние мембраны Миелиновые оболочки нервных волокон 18 3 32 7 21 19
Плазмолемма эритроцитов 49 8 26 6 2 11
Внутренние мембраны Внутренняя мембрана митохондрий 76 0 22 0 0 2
Мембрана эндоплазма- тического ретикулума 55 0 42 0 0 3
а) Отношение белок/липиды действительно (как отмеча-
лось в п. 4.1.1.2) в среднем близко к 1:1, но в ряде случаев оно
значительно отклоняется от этого уровня.
Миелиновые оболочки сильно обогащены липидами, а вну-
тренняя мембрана митохондрий — белками.
б) Внешние мембраны значительно богаче внутренних по
содержанию таких компонентов, как углеводы, сфинго- и гли-
колипиды, холестерин.
8 36
226
Глава 4
При этом по причинам, которые будут разъяснены чуть ни-
же, ГЛ и ХС условно обозначены в таблице как «стабилизирую-
щие» . Нетрудно видеть, что во внутренних мембранах таких ли-
пидов почти нет, т. е. соотношение сильно сдвинуто в сторону
«дестабилизирующих» липидов — в основном ФЛ.
Таким образом, действительно, мембраны очень сильно отли-
чаются друг от друга по составу. Теперь выясним, как это сказыва-
ется на их свойствах (речь пока будем вести лишь о липидах).
а) Влияние ФЛ и СЛ. Эти липиды, как мы знаем, включа-
ют непредельные углеводородные «хвосты». Причем среди них
встречаются остатки не только олеиновой кислоты (1 двойная
связь — С18:1), но и полинеиасыщенных кислот — линолевой
(С18 2), линоленовой (С18;3), арахидоновой (С20:4) и других (С22 5,
^22:б)*
Но, как нам тоже уже известно, в каждом месте нахожде-
ния двойной связи углеводородная цепь имеет изгиб. А изгибы
затрудняют взаимодействие соседних цепей, что делает структу-
ру бислоя менее упорядоченной.
Поэтому по мере увеличения содержания в мембране ФЛ
и СЛ возрастают все показатели ее лабильности, как то:
1) повышается латеральная диффузия компонентов мемб-
раны (из-за уменьшения взаимодействия между молекулами);
2) увеличивается диффузия соответствующих веществ (на-
пример, неполярных соединений) через мембрану (т.к. возра-
стают промежутки между «хвостами» липидов);
3) повышается также способность мембран к разрыву.
Все это и объясняет, почему ФЛ и СЛ обозначены в табл. 4.1
как «дестабилизирующие» липиды.
б) Влияние ХС и ГЛ. Данные же липиды оказывают на ла-
бильность мембраны два противоположных действия.
С одной стороны, они вносят дезорганизацию в расположе-
ние углеводородных «хвостов»: ХС — за счет внедрения между
последними, а ГЛ из-за более длинных, чем обычно, остатков
нервоновой и цереброновой кислот. Это несколько дестабилизи-
рует мембраны.
Но, с другой стороны, те же факторы (наличие ХС между
липидами и длинные «хвосты» ГЛ, почти лишенные двойных
связей) препятствуют активному перемещению липидов. А это,
напротив, оказывает стабилизирующее действие, которое в ито-
ге и перевешивает.
По данной причине ХС и ГЛ отнесены к разряду «стабили
зирующих» мембранных липидов.
Поскольку во внутренних мембранах клеток этих липидов
(ХС и ГЛ) очень мало, можно сделать вывод: данные мембраны
существенно более лабильны, чем внешние. Т. е. они более теку-
РИОМЕМБРАНЫ: структура и участие
227
чи (выше латеральная диффузия), более проницаемы и более
склонны к разрыву.
Заметим еще одно обстоятельство: все эти свойства могут
меняться со временем и для одной и той же мембраны. Причи
ной этому обычно служит изменение ее липидного состава.
Наглядный пример мембраны сперматозоида: плазмо-
лемма и мембрана акросомы. В них высоко содержание ФЛ
с большим количеством двойных связей в «хвостах». Это, как
мы знаем, само по себе значительно лабилизирует мембраны.
Но, кроме того, в женских половых путях секретируется бе-
лок, нагруженный ФЛ. Эти ФЛ с данного белка переходят в со-
став мембран сперматозоидов в обмен на ХС. Таким образом, со-
отношение между «дестабилизирующими» и «стабилизирую-
щими» липидами еще больше сдвигается в пользу первых.
Поэтому лабильность мембран сперматозоидов, уже и так
высокая, достигает критического предела. — Плазмолемма го-
ловки и мембрана акросоы легко разрываются при контакте
с оболочками яйцеклетки.
Пример противоположного свойства. — С возрастом доля
ХС в плазмолемме клеток обычно повышается. Соответственно,
снижается лабильность мембран, а значит, и их проницаемость.
Кроме лабильности, от липидного состава зависят и другие
свойства мембран.
Так, гидрофильные «головки» ФЛ, С Л и ГЛ значительно
отличаются друг от друга по величине, заряду и прочим параме-
трам. Вероятно, это может сказываться на электропроводности
мембран, их способности связывать те или иные белки и т. д.
В частности, миелиновые оболочки имеют очень низкую
электропроводность. Причиной, видимо, является высокое со-
держание в этих мембранах как вообще липидов (по сравнению
с белками), так и конкретно ГЛ. Действительно, «головки» по-
следних нередко лишены ионогенных групп. Не исключено, что
аналогичное влияние на электропроводность оказывает и высо-
кое содержание ХС.
4 1 2.3. Различные способы «упаковки» амфифильных
липидов
Образование бислоя, как мы знаем, это способ «упаковки»
в водном растворе амфифильных липидов. Когда такой бислой
формируется в экспериментальных условиях (например, после
внесения указанных липидов в воду), образуются т. н. липосо-
мы (рис. 4.6,а).
Это сферические пузырьки со стенкой из липидного бислоя.
Внутренняя поверхность липосом, как и наружная, является
228
Глава 4
Рис. 4.’>. ини-- лип «с 'мимицелл
(fct..c»y гл$м и<и >д.:л» чч^мы)
полярной. Так что внутри липосомы — тоже водная среда.
Но возможна и другая организация амфифильных липи-
дов — объединение их в мицеллы (рис 4.6,6). Мицеллы — тоже
сферические частицы, но, в отличие от липосом, они образованы
только одним слоем липидов. Гидрофильные «головки» всех ли-
пидных молекул находятся на наружной поверхности частицы,
а гидрофобные «хвосты» обращены внутрь, к центру мицеллы.
Поэтому внутренняя среда является не водной, а гидрофобной.
От чего зависит вид структуры, образуемой амфифильными
липидами? Во многом — от количества «хвостов» в их молеку-
лах, которое определяет общую геометрию последних.
Форма липидов, имеющих по два «хвоста» (см. рис. 4.2
и 4.3), близка к цилиндрической: поперечное сечение головки
примерно равно общей площади сечений двух «хвостов». В та-
ком случае наиболее компактной «упаковкой» молекул будет
образование ими плоского бислоя. Поэтому в эксперименталь-
ных условиях формируются липосомы (рис. 4.6,а). Действи-
тельно, хотя липосомы и имеют сферическую форму, на рас-
стояниях, сопоставимых с размерами липидных молекул, би-
слой является практически плоским. Заметим, что аналогично
обстоит дело и с природными биомембранами.
Иная ситуация, если у амфифильного липида лишь один
гидрофобный «хвост». Тогда форма молекулы приближается
к конической: «головка» оказывается шире сечения «хвоста».
При этом тот же принцип наиболее компактной «упаковки»
диктует необходимость объединения молекул в мицеллы
(рис. 4.6,6).
Как показывают расчеты, в одной мицелле содержится
примерно 90-100 липидных молекул, а диаметр мицеллы соста-
ПИОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
229
вляет примерно 5 нм, что практически совпадает с толщиной
липидного бислоя (п. 4.1.1.2). Это вполне естественно: и тот
и другой размер представляет собой сумму длины двух липид-
ных молекул.
Может ли одна форма организации амфифильных липидов
переходить в другую ? Да, и на этом, в частности, основано гемо-
литическое действие змеиного яда. В последнем содержится
фермент — фосфолипаза А; она отщепляет от фосфолипидов
плазмолеммы эритроцитов один из двух жирнокислотных ос-
татков. Остается т. и. лизофосфатид, устойчивой формой суще-
ствования которого является уже не бислой, а мицеллы. Поэто-
му мембраны эритроцитов разрушаются.
В то же время и липосомы, и мицеллы (только несколько
иного строения) удобные транспортные формы, которые
облегчают перенос веществ в клетки или из них. Эти способы
транспорта используются как самой природой, так и в медици-
не, причем, липосомы — для переноса водорастворимых ве-
ществ, а мицеллы — жирорастворимых
Так, транспортные пузырьки, отпочковывающиеся от ЭПС
и аппарата Гольджи, а также секреторные и пиноцитозные пу-
зырьки — все это, очевидно, липосомоподобные структуры. От-
личием является лишь наличие в их стенке, помимо липидного
бислоя, также встроенных в него белков.
Что же касается мицелл, то это — форма, в которой проис-
ходит, во-первых, всасывание в кишечнике продуктов перева
ривания жиров и, во-вторых, перенос в крови нейтральных жи-
ров, жирорастворимых витаминов и липидов. Правда, в этих
случаях мицеллообразование стимулируется не лизофосфатида-
ми, а другими веществами соответственно, желчными кисло-
тами и специальными белками (апопротеинами).
4.1.3. Белки мембран
4 1.3.1. Функциональные виды мембранных белков
Обратимся теперь к мембранным белкам. Их существует
огромное множество. Только в плазмолемме эритроцитов — не
менее 100 различных видов белков.
В отличие от липидов, мембранные белки трудно классифи-
цировать по их структуре; во всяком случае, такой классифика-
ции пока не существует.
Более перспективно попытаться подразделить эти белки по
их функциональной роли. Но и здесь нет законченной системы,
т. к. любые попытки ее создания наталкиваются на типичные
230
Глава 4
трудности, когда один и тот же белок может быть отнесен к раз-
ным группам.
Тем не менее попробуем перечислить основные виды мемб-
ранных белков, исходя из их функции.
1. Структурные белки. Белки этой группы
а) придают клетке и органеллам определенную форму;
б) придают мембране (например, плазмолемме) те или
иные механические свойства (эластичность и т. п.);
в) обеспечивают связь мембраны с цитоскелетом или
(в случае ядерной мембраны) с хромосомами.
2. Транспортные белки. Проницаемость мембран опреде-
ляется их липидным бислоем. Последний же проницаем лишь
для ограниченного круга веществ — не очень больших гидро-
фобных молекул (например, жирных кислот) и совсем мелких
молекул (газов, воды и т. д.).
Все прочие вещества могут перемещаться через мембрану
только при наличии в ней соответствующих белковых транс-
портных систем. Причем одни из этих систем обеспечивают
двусторонний перенос своих лигандов, а другие — только одно-
сторонний.
В итоге деятельность этих систем дает два основных ре-
зультата:
а) создаются устойчивые транспортные потоки определен-
ных веществ через мембраны (например, в проксимальных ка-
нальцах почек — поток глюкозы из первичной мочи в кровь че-
рез последовательно расположенную серию мембран);
б) кроме того, транспорт ионов приводит к возникновению
трансмембранного потенциала во всех клетках, а также к его из-
менениям в нервных и мышечных клетках и волокнах. Послед-
нее же лежит в основе таких важнейших явлений, как возбуди-
мость и проводимость.
3. Белки, обеспечивающие непосредственное межклеточ-
ное взаимодействие. Многочисленные белки этой группы мож-
но поделить прежде всего на две совокупности:
а) Т. н. адгезивные белки необходимы для связывания
клеток друг с другом или неклеточными структурами (базаль-
ной мембраной,волокнами).
б) Другие белки участвуют в образовании специализирован-
ных межклеточных контактов (десмосом и др.).
В свою очередь, в каждой из этих совокупностей можно про
извести дальнейшее деление белков, о чем будет речь позднее.
4. Последняя большая группа мембранных белков —
белки, участвующие в передаче сигналов от одних клеток
к другим.
Ы/ЮМЕМБРАНЫ: структура и участие..
231
Такая передача осуществляется в очень многих случаях
и самыми разными способами.
Например, в нервных и нервно-мышечных синапсах
с т. н. ионотропными рецепторами сигнальной молекулой
(внеклеточным медиатором) является определенное низко-
молекулярное вещество, а плазмолемма воспринимающей
клетки содержит:
а) рецепторные белки,
б) белки эффекторного устройства — ионные каналы,
изменяющие свою функцию при связывании лиганда с рецеп-
торами ,
в) фермент инактивации медиатора.
Как видно, участвующие в этом ионные каналы попадают
сразу в две функциональные группы: кроме данной, еще
и в группу транспортных белков. Помимо того, обычно эти ион-
ные каналы сами же осуществляют и рецепторную функцию (за
счет дополнительных субъединиц). Так обстоит, например, дело
в случае т. н. н-холинорецепторов — они одновременно являют-
ся ионными каналами для катионов. Все это иллюстрирует
сложность классификации мембранных белков, о чем уже гово-
рилось выше.
Есть синапсы и с т. н. метаботропными (медленными) ре-
цепторами. Здесь используется иной способ передачи сигнала
от клетки к клетке — такой, какой применяется и в случае гор-
монов нестероидной природы. Имеются в виду гормоны-белки,
пептиды и производные аминокислот. Практически все они не-
способны проникать через плазмолемму клетки-мишени. Одна-
ко и в этих случаях мембранные белки, участвующие в процес-
се, обычно можно разделить на три функциональные вида:
а) рецепторные белки,
б) белки трансмиттерного устройства (передающего
сигнал через мембрану),
в) ферменты, одни из которых на внешней поверхности
инактивируют сигнальное вещество, а другие на внутренней по-
верхности реагируют на сигнал образованием внутриклеточного
медиатора.
Как видно, это близко к тому, что было сказано для синап-
сов с ионотропными рецепторами. Таким образом, данную триа-
ду можно распространить на большинство случаев передачи сиг-
нала.
Итак, мы перечислили четыре основные функциональные
группы мембранных белков, каждая из которых обычно подраз-
деляется далее и объединяет большое количество конкретных
белков.
232
Глава 4
Теперь перейдем к более детальному рассмотрению этих
функциональных групп и сопутствующих вопросов. Этому бу-
дет посвящена вся оставшаяся часть настоящей главы и во мно-
гом следующая глава.
4.1.3.2. Некоторые белки плазмолеммы эритроцитов
Обратившись к плазмолемме эритроцитов, познакомимся
с некоторыми конкретными белками — структурными и транс-
портными.
Как уже упоминалось, в данной мембране — не менее 100
различных белков. Самые известные из них показаны на
рис. 4.7.
Спектрин — фибриллярный белок массой около
240 000 Да, который с помощью другого белка — анкирина
связан с внутренней поверхностью плазмолеммы. Молекулы
спектрина имеют вид палочек диаметром 2 нм и длиной около
100 нм. Всего в мембране — более 200 000 таких молекул.
Последние на цитоплазматической поверхности мембраны
образуют своего рода сетку, которая придает мембране эластич-
ность и упругость. Если в этой сетке молекулы спектрина стыку-
ются друг с другом конец в конец, то, как показывают расчеты,
размер ее ячеек равен примерно 14 нм. Т. е. одна молекула спек-
трина простирается примерно на 7 ячеек. Если же при контакте
друг с другом молекулы спектрина перекрываются, то ячейки,
очевидно, будут крупней.
РИОМЕМБРАНЫ: структура и участие... 233
Гликофорин, в отличие от спектрина, не периферический
белок, а интегральный Он пронизывает всю мембрану и с обеих
сторон выступает над ее поверхностью. Всего в плазмолемме
эритроцита — примерно 360 000 молекул гликофорина.
Белок состоит из двух субъединиц. Каждая из них включа-
ет пептидную цепь из 131 остатка аминокислот, а также 16 оли-
госахаридных цепей, содержащих вместе около 90 остатков мо-
носахаров. При этом на углеводный компонент приходится
60 % массы гликофорина. С этим фактом и связано название
белка (буквально: «несущий углеводы»).
В пептидной цепи гликофорина три участка, а именно:
а) N-концевой участок (-50 остатков аминокислот) вы-
ступает с внешней стороны мембраны; с ним-то и связаны все 16
олигосахаридных цепей. Почти каждый второй моносахарид
в этих цепях представлен сиаловой кислотой, имеющей отри-
цательно заряженную группу. Остатки данной кислоты присут-
ствуют также в других белках плазмолеммы; но на гликофорин
приходится 75 % от ее общего количества на поверхности эри-
троцита.
Благодаря сиаловой кислоте, эритроцит несет (на внешней
стороне плазмолеммы) значительный отрицательный заряд, ко-
торый препятствует слипанию эритроцитов друг с другом. Этим
эритроциты отличаются от многих других клеток, например
нервных и мышечных, у которых внешняя поверхность заряже-
на положительно.
По мере старения эритроцитов происходит постепенная по-
теря ими остатков сиаловой кислоты и, соответственно, сниже-
ние отрицательного заряда. Когда последний достигает крити-
чески низкого уровня, эритроцит захватывается макрофагами
селезенки и разрушается.
Таким образом, N-концевой участок гликофорина играет
очень важную роль в определении продолжительности жизни
эритроцита.
б) Срединный участок (-30 остатков аминокислот) прохо-
дит через гидрофобную область липидного бислоя. Вероятно, он
имеет вид вытянутой а-спирали, включающей, в основном, ами-
нокислоты с неполярными (гидрофобными) радикалами.
в) С-концевой участок расположен на внутренней поверх-
ности мембраны и обогащен заряженными и полярными ради-
калами. Видимо, с ним связываются т. н. актиноподобные бел-
ки, а с последними, в свою очередь, — элементы цитоскелета
клетки (в частности, тонкие микрофиламенты).
В таком случае гликофорин выполняет и очень важную
структурную функцию служит местом крепления цитоскелета.
234
Глава 4
Теперь кратко рассмотрим два транспортных белка.
Белок, образующий анионный канал (масса — 95 000 Да);
как и гликофорин, это интегральный гликопротеин, содержа,
щий не менее двух субъединиц. Собственно канал — это узкая
пора между субъединицами, «стенки» которой выстланы гидро-
фильными радикалами аминокислот. Через данный канал в обе
стороны (в клетку и из нее) могут проходить анионы (С1 , НСО3 ,
ОН ) и, по некоторым сведениям, глюкоза.
Заметим; катионы же через плазмолемму эритроцита почти
не проходят: специальных транспортных систем, которые бы
пропускали катионы по градиенту концентрации, здесь нет.
Анионные каналы играют важную роль. Во-первых, благо-
даря им реализуется т. н. эффект Гиббса-Доннана: отрицатель-
но заряженный гемоглобин как бы выталкивает из эритроцитов
анионы, отчего их концентрация в эритроцитах оказывается
значительно меньше, чем в плазме крови. В частности, из-за
меньшей концентрации ионов ОН , pH в эритроцитах (7,22) ни-
же, чем в плазме (7,40).
Во-вторых, анионные каналы связывают плазменный пул
бикарбонатных ионов (НСО3 ) с карбоангидразой, локализую-
щейся в эритроцитах. В результате, создается единая система
переноса СО2 от тканей к легким (рис. 4.8), где основной транс-
портной формой являются ионы НСО3 .
Так, в капиллярах тканей СО2 превращается с помощью
карбоангидразы в бикарбонат-ионы, которые выходят из эри-
рМОМЕМБРАНЫ структура и участие. 235
троцитов в плазму через анионные каналы. В расчете на 1 эри-
троцит скорость выхода составляет примерно 3,5-108 ионов за
1 с, или -600 ионов/с для каждого канала. В капиллярах же ма-
лого круга кровообращения бикарбонат-ионы, напротив, диф-
фундируют из плазмы в эритроциты, где той же карбоангидра-
зой превращаются в СО2.
Видимо, ввиду важности этих функций, всего в плазмолем-
ме эритроцита оказывается около 600 000 анионных каналов,
на которые приходится -10 % поверхности мембраны и 15 %
массы всех белков плазмолеммы.
Na ,К -насос (Na ,К -зависимая АТФаза) — тоже инте-
гральный гликопротеид. В отличие от предыдущего белка, при-
сутствует в очень незначительных количествах — всего нес-
колько сотен молекул на эритроцит.
Na ,К' зависимая АТФаза состоит из 4 субъединиц — двух
а (по 95 000 Да) и двух Р (по 40 000 Да). При этом Р-субъедини
цы находятся с наружной стороны мембраны, и именно с ними
связаны олигосахаридные цепи.
Как и в других клетках, Na ,К*-насос за счет энергии
АТФ выкачивает из эритроцита ионы Na в обмен на ионы К
и Н*. Но из-за отсутствия К -каналов (через которые часть ио-
нов К' выходила бы из эритроцита) на внешней поверхности
плазмолеммы не создается положительный заряд, характер-
ный для возбудимых клеток. Поэтому не происходит нейтра-
лизация отрицательного заряда, обусловленного сиаловой ки-
слотой.
Механизм действия Na*,К -насоса мы обсудим позже.
4.2. ПЕРЕНОС ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ
Познакомившись с двумя транспортными белками (анион-
ными каналами и Na ,К -насосом), рассмотрим более последова-
тельно проблему трансмембранного транспорта веществ.
4.2.1. Низкомолекулярные соединения: три
способа переноса
Существуют три способа прохождения низкомолекуляр-
ных веществ через биомембраны:
- простая диффузия,
облегченная диффузия,
- активный транспорт.
236
Глава 4
4.2.1.1. Простая диффузия
В этом случае (рис. 4.9,а) вещество непосредственно,
без чьей-либо помощи, диффундирует через мембрану из ком-
партмента с большей концентрацией в компартмент с меньшей
концентрацией.
Как уже отмечалось, к такому способу переноса способны
низкомолекулярные гидрофобные органические соединения
(жирные кислоты, мочевина), а также небольшие нейтральные
молекулы (Н20, С02, 02).
При увеличении разности концентраций между отсеками,
разделенными мембраной, прямо пропорционально будет расти
и скорость диффузии. При выравнивании концентраций диффу-
зия прекращается, а если соотношение концентраций меняется
на противоположное, то меняется и направление диффузии.
Это имеет место, в частности, в случае прохождения СО2 че-
рез мембрану эритроцитов (см. рис. 4.8): в капиллярах тканей
С02 диффундирует из плазмы в эритроциты, а в капиллярах лег-
ких — наоборот, из эритроцитов в плазму. Все определяется со-
отношением концентраций С02 в этих компартментах.
а) ПРОСТАЯ б) ОБЛЕГЧЁННАЯ в) АКТИВНЫЙ
ДИФФУЗИЯ ДИФФУЗИЯ ТРАНСПОРТ
С1
С2
С2 < Cl С2 < Cl С2> Cl
Рис. 4,4. Сп<»с<>6ы жд гнил ст с чмррз м. мбранм
4.2.1.2. Облегченная диффузия
При данном способе переноса (рис. 4.9,6) вещество прохо-
дит через мембрану тоже по направлению градиента своей кон-
центрации (т. е. в компартмент с меньшей концентрацией),
но не самостоятельно, а с помощью специального транспортного
белка — транслоказы.
Транслоказы интегральные белки, обладающие большей
или меньшей специфичностью в отношении переносимых ве-
ществ. Примеры — анионные каналы в плазмолемме эритроци-
тов, К'каналы в плазмолемме возбудимых клеток, Са' каналы
в мембранах саркоплазматического ретикулума и т. д.
РИОМЕМБРАНЫ: структура и участие..
237
Практически всегда с помощью транслоказы переносится
такое вещество, которое не способно к простой диффузии через
мембрану. Но есть и исключение — перенос воды через мембра-
ны почечных канальцев и секреторных эпителиальных кле-
ток. Вода, как мы знаем, может и самостоятельно пересекать
липидный бислой. Однако для интенсификации ее диффузии
в указанных мембранах есть специальная транслоказа — аква-
пория.
Каков механизм действия транслоказ? Как правило, тран-
слоказы состоят из нескольких субъединиц. С учетом этого воз-
можно несколько вариантов.
1) Между субъединицами имеется всегда открытый гидро
фильный канал, доступный лишь для веществ определенного
размера и заряда.
2) Канал открывается только при связывании с одной из
его сторон специфического лиганда.
3) Канала как такового не образуется вовсе, а перенос осу-
ществляется путем поворота транслоказы (вместе со связанным
лигандом) в плоскости мембраны на 180". В результате лиганд,
связавшийся на одной стороне мембраны, высвобождается
с другой стороны.
Скорее всего, встречаются все эти варианты.
Независимо от механизма, направление и скорость перено-
са вещества транслоказой вновь определяются разностью кон-
центрации этого вещества по обе стороны мембраны. Действи-
тельно, молекулы лиганда могут связываться с транслоказой
как с одной, так и с другой стороны и, соответственно, перено-
ситься в обоих направлениях. Но там, где концентрация выше,
связывание и перенос будут происходить чаще, что и определит
общий результат диффузии.
При изменении градиента концентрации опять-таки воз-
можно изменение направления облегченной диффузии. Такой
пример нам тоже уже известен — перенос бикарбонат-ионов че-
рез анионные каналы плазмолеммы эритроцитов (см. рис. 4.8).
В капиллярах тканей и легких этот перенос происходит в проти-
воположных направлениях.
Вместе с тем, возможен феномен, отсутствующий при про-
стой диффузии — т. н. явление насыщения. Это значит, что при
неуклонном повышении концентрации лиганда с одной стороны
мембраны скорость переноса может расти не беспредельно,
а лишь до некоторого предела. При этой максимальной скорости
каждая транслоказа функционирует без периодов «простоя»:
после высвобождения молекулы лиганда с одной стороны тут же
следует связывание очередной молекулы с другой стороны.
238
Глава 4
Дальнейшая же интенсификация деятельности транслоказы
уже невозможна.
Аналогичный феномен, как известно, присущ и фермен-
там. В связи с этим транслоказы можно рассматривать как
«ферменты», катализирующие перемещение веществ через
мембраны.
4.2.1.3. Активный транспорт
Наконец, при активном транспорте (рис. 4.9,в) вещество
проходит через мембрану тоже с помощью специального транс-
портного белка (транслоказы), но против градиента своей кон
центрации, т. е. из компартмента с меньшей концентрацией
в компартмент с большей концентрацией.
Такое перемещение требует затрат энергии. Следователь-
но, транспортная система должна осуществлять и энергетиче-
ское обеспечение переноса. Данная проблема решается разными
способами.
1. Один принципиальный подход — сопряжение переноса
вещества с энерго дающей реакцией. Как правило, такой реак-
цией служит гидролиз АТФ
а) В простейшем варианте сама транслоказа обладает АТ-
Фазной активностью (как показано на рис. 4.9,в). Таков, в част-
ности, Са' насос, закачивающий ионы Са2 в цистерны сарко-
плазматического ретикулума.
Ри. А 1 бМекэ-изм ь-:асывании аминокислот в к ишечнике
(с не* торым^ уд, шени^ми)
^ИОМЕМБРАНЫ структура и участие
239
б) В других случаях к гидролизу АТФ приводит более
сложная совокупность реакций, сопряженных с переносом ве-
щества. Пример транспорт аминокислот в эпителиальные
клетки кишечника в процессе всасывания (рис. 4.10).
Здесь аминокислота, прошедшая с помощью транслоказы
через мембрану, сразу же реагирует с трипептидом глутатио-
ном — так, что образуются два дипептида. Тем самым снижа-
ется концентрация данной аминокислоты в примембранном
пространстве клетки, что облегчает диффузию через мембрану
новых порций аминокислоты. Затем же происходит серия эк-
зергонических реакций (т. е. реакций, идущих с выделением
энергии):
- распад обоих дипептидов и
- ресинтез глутатиона с затратой трех молекул АТФ.
В итоге получается, что для всасывании 1 молекулы амино-
кислоты расходуется энергия 3 молекул АТФ (-150 кДж/моль
аминокислоты). Это более чем достаточно для преодоления кон-
--------j
Рис. 4.11. При» '«*. аэование энергии акислительно-тсгановм •
। «акции « энергию протонного Лр^^нта
и/н U. Ь, с,. с, ам а3 - компоненты ЦПЭ -₽Я^е>-и • т * лактронов);
*ЛП — межмембргннси пространство митп». к*
240
Глава 4
в) Кроме гидролиза АТФ, непосредственным источником
энергии для активного транспорта может быть окислительно-
восстановительный процесс.
Так, в частности, обстоит дело в митохондриях (рис .4.11).
В ходе перемещения электронов по дыхательной цепи выделяет-
ся энергия, которая служит для откачки протонов из матрикса
в межмембранное пространство (через внутреннюю митохон-
дриальную мембрану). Тем самым создается протонный гради-
ент, энергия которого затем используется для синтеза АТФ
(в ходе обратного перемещения протонов в матрикс по градиен-
ту концентрации через другую транспортную систему — т. н.
АТФазу).
2. Второй принципиальный механизм энергообеспечения
активного транспорта — сопряжение переноса вещества X (про-
тив градиента концентрации) с пассивным переносом другого
вещества Y (по градиенту его концентрации). Очевидно, в этом
случае высвобождение энергии в ходе перемещения Y должно
превышать затраты энергии на перемещение X.
Здесь опять-таки имеются два варианта: симпорт и анти-
порт.
В случае симпорта (рис. 4 12,а) оба вещества переносятся
транслоказой в одну сторону. Т. е. молекулы Y, диффундируя
по градиенту своей концентрации, как бы тянут вместе с собой
соединение X.
Таков, в частности, механизм реабсорбции глюкозы в ка-
нальцах почек: она проникает в эпителиальную клетку путем
симпорта с ионами Na . (К этой транспортной системе мы вер-
немся в п. 4.2.2.7.)
а) СИМПОРТ
6) АТФ-независимый
АНТИПОРТ
в) АТФ зависимый
АНТИПОР1
Рис. 4.12. Сопряжение тр .нсп'^ртч л-ух еыййстй.
БИОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
241
Если оба вещества, участвующие в симпорте, являются ио-
нами, то они имеют разноименные заряды.
Что касается антипорта (рис. 4.12,6), то здесь вещества пе-
реносятся транслоказой во взаимно противоположных напра-
влениях. Т. е. молекулы Y как бы обмениваются на молекулы X.
Но у эукариот антипорт весьма редко используется как
средство энергообеспечения трансмембранного переноса.
Гораздо более распространена система, где путем антипорта
сразу оба вещества перемещаются против градиента своей кон-
центрации (рис. 4.12,в). При этом источником энергии служит
АТФ. Имеется в виду Na\K'насос, или Na' ,Ю-зависимая
АТФаза, присутствующая в плазмолемме почти всех клеток.
На том же примере видно, что при антипорте ионов послед
ние имеют одноименные заряды.
После этих общих сведений рассмотрим подробней некото-
рые из упомянутых выше транспортных систем.
4.2.2. Конкретные системы переноса
низкомолекулярных веществ
4.2.2 1. Na ,К*-насос
Предварительные сведения о Na ,К'-насосе были приведе-
ны в п. 4 1.3.2. Напомним: этот белок (рис. 4.13) включает две
Рис. 4.13 N» ,К -насо .
а- и две 0-субъединицы.
И, как только что отмеча-
лось, используя энергию
АТФ, он переносит ионы
Na’ и К против градиента
их концентрации: ионы
Na* — из клетки, а ионы
К — в клетку.
Именно благодаря
деятельности этого насоса
создается резко асимме-
тричное распределение
данных ионов между кле-
точной и внутриклеточ-
ной средой (см. табл. 4.2).
Концентрация ионов Na
значительно выше вне
клеток, а ионов К
три клеток.
вну-
242
Глава 4
Таблица 4.2. Распределение ионов между внешней и внутренней
средой в мышечной ткани
сех (мэкв/л) cin (мэкв/л)
К 4 155
Na’ 145 10
Mg1’ 2 30
Cas‘ 4 0
ИТОГО 155 195
Cl 113 2
НСО3 30 8
Белки7, 1 65
so4*- 1 18
НРО42 2 42 (?)
Орг. к-ты 8 60 (?)
ИТОГО 155 155
Важная особенность деятельности насоса — характерная
стехиометрия: за счет распада 1 молекулы АТФ происходит вы-
качивание 3 ионов Na’ и одновременно закачивание в клетку 2
ионов К .
Расчеты показывают, что при этом рассеивается только
~10 % энергии АТФ; остальные же 90 % преобразуются в энер-
гию концентрационных градиентов. Такая эффективность пре-
образования энергии, очевидно, является очень высокой.
Возможный механизм деятельности насоса показан на
рис. 4.14. Согласно ему, насос имеет некую полость.
В начале очередного цикла полость открыта с внутренней
стороны мембраны, где ее заполняют 3 иона Na'. Для преодоле-
ния электрического отталкивания между ионами требуется
энергия. Видимо, непосредственно на это и расходуется АТФ.
Действительно, связывание ионов Na' инициирует гидролиз мо-
лекулы АТФ.
Однако этот гидролиз не только энергетически обеспечива-
ет первую стадию цикла, но и, в свою очередь, инициирует сле-
дующую стадию. Так, фосфатная группа переносится от АТФ на
белок, что изменяет его конформацию. В результате полость
с ионами Na открывается с другой стороны мембраны — наруж-
ной. Сила электрического отталкивания между ионами заста-
вляет последних высвобождаться во внеклеточную среду, нес-
мотря на высокую их концентрацию здесь.
Вместо ионов Na полость заполняют 2 иона К'. Не ис-
ключено, что меньшее количество этих ионов обусловлено
просто тем, что они крупнее. Правда, в водном растворе ионы
рИОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
243
Na эффективней притягивают воду
и за счет гидратной оболочки оказыва-
ются больше.
Другое объяснение может состоять
в том, что для двух ионов гораздо меньше
сила электрического отталкивания. И,
наконец, по третьей точке зрения, дело
вовсе не в размерах полости и ионов,
а «просто» в числе связывающих центров
у насоса: для Na' их — 3, а для К' — 2.
Как бы то ни было, связывание ионов
К инициирует дефосфорилирование тран-
слоказы. Это, с одной стороны, видимо,
высвобождает остатки энергии АТФ, со-
хранявшиеся в связи фосфатной группы.
А, с другой стороны, дефосфорилирование
возвращает конформацию транслоказы
в исходное состояние: ее полость вновь от-
крывается с внутренней стороны мембра-
ны, отчего здесь высвобождаются ионы
К . Так завершается цикл работы насоса.
Имеется важная группа лекарствен-
ных средств, которые тормозят дей-
ствие Na',К -насоса. Это сердечные гли-
козиды (алкалоиды наперстянки). Они
конкурируют с ионами К' за связывание
с транслоказой с ее наружной стороны.
Более всего действие данных
средств проявляется в отношении сер-
дечной мышцы. Поэтому в саркоплазме
кардиомиоцитов возрастает концентра
ция Na’. Это снижает возбудимость мио-
карда. Одновременно увеличивается
и концентрация ионов Са2' (видимо, из
за того, что их транспорт из клетки про-
исходит в обмен на внеклеточные ионы
Na', так что при большей внутриклеточ-
ной концентрации Na обмен происходит слабее). Ионы же Са2'
повышают сократимость миокарда. В итоге сокращения сердца
становятся более редкими и более сильными.
При передозировке сердечных гликозидов их действие
можно ослабить путем введения больному препаратов К Тогда
ионы К' вытесняют гликозиды из связи с Na' ,К насосом.
244
Глава 4
4.2.2.2. К каналы
Имеется целая группа транслоказ, которые обеспечивают
облегченную диффузию одновалентных катионов. Сюда отно-
сятся К* каналы, Под каналы и катионные каналы; последние
пропускают примерно с одинаковой скоростью и ионы К', и ио-
ны Na . Функциональная роль всех трех транслоказ различна.
К'каналы (внутренний диаметр 0,3 нм) содержатся
в плазмолемме многих клеток и постоянно «открыты», т. е.
функционируют как транслоказы при любом функциональном
состоянии клетки.
Благодаря этому, через них возвращается во внеклеточную
среду некоторое количество ионов К’ — из-за наличия очень
сильного концентрационного градиента, созданного Na',К -на-
сосом. Выход уже относительно небольшого количества К‘-ио-
нов (примерно 6 ионов на каждые 1000 нмг поверхности мембра-
ны) создает такую разность потенциалов между сторонами мем-
браны (—75 мВ), которая уравновешивает по энергии концентра-
ционный градиент. Поэтому наступает динамическое равнове-
сие, и дальнейшая диффузия ионов К' через каналы прекраща-
ется.
В результате вне- и внутриклеточные концентрации этих
ионов практически не меняются, но клетки приобретают т. н.
трансмембранный потенциал. При этом внешняя сторона
плазмолеммы заряжена положительно, а внутренняя — отрица-
тельно. При таком распределении зарядов трансмембранный
потенциал пишут со знаком минус (-75 мВ). Итак, благодаря К
каналам мембрана превращается в заряженный электрический
конденсатор.
Заметим: эти каналы, видимо, способны пропускать и ионы
Na , хотя и с гораздо меньшей скоростью, чем ионы К . Действи-
тельно, на фоне непрерывной деятельности Na',К насоса воз-
вращение в клетку небольшого количества Na необходимо для
поддержания его постоянной внутриклеточной концентрации.
4.2.2.3. Na -каналы
Na'-каналы (внутренний диаметр — 0,55 нм) имеются
лишь в тех мембранах, которые способны к возбуждению. Это
плазмолемма нервных клеток, миоцитов и мышечных волокон,
сперматозоидов, сенсорных клеток органов чувств (в т. ч. эпите-
лиального происхождения).
Плотность расположения Na -каналов в этих мембранах
различна. Так, в немиелиновых нервных волокнах они распола-
гаются равномерно и занимают 0,2-1,0 % поверхности плазмо-
риОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
245
леммы (50-200 каналов на 1 мкм2)- В миелиновых же волокнах
f4a -каналы сосредоточены лишь в перехватах Ранвье (которы-
ми прерывается миелиновая оболочка), но с очень высокой
плотностью (13 000 1/мкм2), занимая до 50 % поверхности.
Принципиальное отличие от К -каналов, также содержа-
щихся во всех вышеперечисленных мембранах, состоит в том,
что Na'-каналы «открыты», т. е. функционируют, не все вре-
мя, а лишь при определенном состоянии клетки. Как правило,
таким состоянием является возбуждение. Исключением явля-
ются светочувствительные клетки сетчатки глаза: здесь, наобо-
рот, при возбуждении Na'-каналы закрываются (тогда как в по-
кое открыты).
К чему же это приводит? Возьмем более типичную ситуа-
цию: Na'-каналы в покое закрыты. Открытие каналов в каком
либо участке мембраны инициируется снижением (по модулю)
трансмембранного потенциала данного участка до уровня
-50 мВ. Само же такое снижение потенциала обычно является
следствием возбуждения соседнего участка мембраны.
Через открывающиеся Na'-каналы ионы Na' устремляются
внутрь клетки (волокна) по градиенту концентрации и заряда.
Таким образом, снаружи «тает» избыток положительных заря-
дов, создаваемый К'-каналами. Поэтому разность потенциалов
снижается (по модулю) еще более, что индуцирует открытие еще
закрытых Na'-каналов. Процесс усиливает сам себя и быстро
развивается.
Согласно расчетам, за 1 импульс через каждый канал про-
ходит в клетку около 500 ионов Na'. Это не приводит к заметно-
му повышению их внутриклеточной концентрации (последняя
возрастает лишь на десятые доли процента), однако, как мы ска-
зали, существенно меняет трансмембранный потенциал.
В течение миллисекунд разность потенциалов не только
сводится к нулю, но и становится положительной величиной
(около +30 мВ). Это означает, что на пике возбуждения избыток
положительных ионов оказывается уже не вне, а внутри клет
ки. Дело в том, что ионы Na' движутся внутрь клетки быстрей,
чем успевают выходить ионы К'.
В свою очередь, возникновение положительной разности
потенциалов индуцирует закрытие Na'-каналов. Поэтому в дан-
ном месте мембраны быстро восстанавливается (за счет постоян-
но открытых К’-каналов) нормальное значение потенциала
(-75 мВ). Весь цикл возбуждения локуса мембраны занимает
примерно 1 миллисекунду.
Итак, Na'-каналы — ключевой участник таких процессов,
как возбуждение мембраны (вне синапса) и проведение возбуж
дения по мембране.
246
Глава 4
Какие вещества влияют
на функционирование этих
каналов?
а) Во-первых, ионы Са‘*:
чем выше их внеклеточная
концентрация, тем трудней
открываются Na’-каналы.
Иначе говоря, чтобы они от-
крылись, требуется большее
инициирующее снижение (по
модулю) трансмембранного
потенциала. В итоге ионы
Са2' уменьшают возбудимость
мембран.
Причина в том, что Na‘-
каналы через свои карбокси-
группы обратимо связывают
ионы Са2' (рис. 4.15); причем
при открытии каналов их
сродство к этим ионам сильно
снижается. Соответственно,
сами ионы Са2', связываясь
с Na'-каналами, препятству-
ют переходу последних в от-
крытое состояние.
Таким образом, трансмембранный транспорт ионов Na
и Са2 тесно взаимосвязан. Выше (п. 4 2.2.1) мы упоминали, что
откачка из клетки ионов Са2' зависит от внутриклеточной кон-
центрации ионов Na': с ростом последней транспорт Са2' умень-
шается. Теперь оказывается, что, в свою очередь, перенос
в клетку ионов Na' зависит от концентрации ионов Са2' — толь-
ко не внутри-, а внеклеточной: с ее ростом транспорт Na' тоже
ослабевает.
У данного феномена имеется важное следствие. При гипо-
кальциемии (которая может возникать после удаления паращи-
товидных желез) в нервных и мышечных тканях значительно
повышается возбудимость мембран. Это проявляется в виде ча-
стых судорог (что обозначается как тетания).
б) Известны также сильные ингибиторы Na'-каналов, ис-
пользующиеся в экспериментальных исследованиях. Это те-
тродотоксин (из рыбы иглобрюха) и сакситоксин (из одного
вида морских водорослей).
Они, как и ионы Са2 , связываются с карбоксильными груп-
пами транслоказы, но только более прочно.
РМОМЕМБРАНЫ: структура и участие.
247
4.2.2.4 Катионные каналы и н-холинорецепторы
Катионные каналы (рис. 4.16) находятся в постсинапти
ческой мембране холинергических синапсов, содержащих н-
холинорецепторы. Последние, как уже упоминалось
(п. 4.1.3.1), выполняют двойную функцию: являются не только
рецепторами ацетилхолина, но и каналами для одновалентных
катионов (Na‘ и К')-
Такие синапсы содержатся в вегетативных ганглиях
как парасимпатических, так и симпатических, а также в окон-
чаниях двигательных нервов на скелетных мышцах. Причем
н-холинорецепторы ганглиев и мышц, видимо, тоже различают-
ся, поскольку могут быть избирательно блокированы разными
веществами.
Объединяет же их то, что все они возбуждаются не только
ацетилхолином, но и никотином (с чем связано обозначение ре-
цепторов). В связи со своей двойной функцией, данные белки
имеют сложное субъединичное строение. Всего в молекуле — 6
(по другим данным — 5) субъединиц трех видов общей массой
280 кДа. Одна пара субъединиц выполняет рецепторную функ-
цию, остальные две пары образуют катионный канал (с внутрен
ним диаметром 0,7 нм).
Плотность расположения этих белков в постсинаптической
мембране весьма высока — 10 000 1/мкмг, так что на них прихо-
дится 35 % поверхности этой мембраны.
Заметим: помимо данных каналов, в постсинаптической
мембране, видимо, имеются также К -каналы и анионные кана-
лы. Поэтому в состоянии покоя мембрана имеет обычный транс-
мембранный потенциал (около -75 мВ). В то же время Na’-кана-
лов нет, их заменяют катионные каналы.
Рис. 4. ill. Постсинчптичъскай и Х' Лин -угичг к'их
• инjncax зб уждэющг»г типа
4 АХЭ->ЛЦ*типх««лннэст»{<чр.1
248
Глава 4
Последние в невозбужденном состоянии мембраны закры-
ты. При этом с ними (как и в случае Na каналов) связаны ионы
Са2*: около 60 ионов на 1 молекулу.
В процессе синаптической передачи с молекулами холино-
рецептора связывается по 2 молекулы ацетилхолина (по числу
рецепторных субъединиц). Это приводит к изменению конфор-
мации белковых молекул, в ходе чего диссоциирует большая
часть ионов Са2 и открываются катионные каналы. Ионы Na’
начинают интенсивно поступать внутрь клетки (постсинаптиче-
ского окончания), а ионы К' — выходить во внешнюю среду.
В итоге трансмембранный потенциал постсинаптической
мембраны снижается (по модулю) примерно до уровня -25 мВ,
и этого оказывается достаточно, чтобы запустить процесс воз-
буждения в близлежащих участках плазмолеммы — там, где
уже имеются Na -каналы.
Как прекращается действие медиатора? За это ответствен-
ны два механизма.
Первый из них — разрушение свободного (не связанного
с рецептором) медиатора специальным ферментом ацетилхо-
линэстеразой (часто его называют просто холинэстеразой). Это
вызывает сдвиг равновесия в сторону диссоциации медиатора от
рецепторов, т. е. освобождение рецепторов и разрушение новых
порций медиатора.
Молекулы холинэстеразы тоже расположены на постсинап-
тической мембране с высокой плотностью — 12 000 1/мкм2.
Причем, они обладают очень высокой активностью. Тем не ме-
нее их действия оказывается недостаточно, чтобы за обычное
время процесса (-2 мс) освободить от медиатора все холиноре-
цепторы и таким образом закрыть все катионные каналы.
Поэтому выработан еще один механизм: при достаточно
длительном воздействии медиатора на рецептор последний про-
сто теряет к нему чувствительность — развивается т. н. десенси-
билизация рецептора. Так что катионные каналы закрывают-
ся через 1,5-2,0 мс, даже если с их рецепторами еще связаны
молекулы ацетилхолина.
Это ведет к быстрому восстановлению трансмембранного
потенциала, характерного для невозбужденного состояния.
В завершение упомянем сведения, важные в фармакологи-
ческом отношении.
Вещества, действующие на н-холинорецепторы, подразде-
ляются на две группы:
н-холиномиметики — возбуждают рецепторы,
н-холинолитики — блокируют рецепторы (не вызывая воз-
буждения, препятствуют присоединению медиатора).
риОМЕМБРАНЫ: структура и участие... 249
Особенно важны две совокупности н холинолитиков:
- ганглиоблокашоры — блокируют н-рецепторы вегета-
тивных ганглиев (не влияя на скелетные мышцы) и
- миорелаксанты — напротив, действуют только на н-хо-
линорецепторы скелетных мышц.
Одни из миорелаксантов (такие, как яд кураре) обладают
конкурентным действием; поэтому они могут быть вытеснены
из связи с рецептором при повышении концентрации медиатора.
Другие миорелаксанты (например, сукцинилхолин), напро-
тив, возбуждают н-холинорецепторы и вызывают деполяриза
цию мембраны (вещества деполяризующего действия), но из-за
медленного распада этих веществ рецепторы надолго оказыва-
ются в десенсибилизированном состоянии. Здесь уже повыше-
ние концентрации медиатора только усугубило бы блокаду си-
напсов.
Мы рассматривали здесь лишь один тип холинергических
синапсов. Существует и второй тип - с м-холннорецепторами.
Таковы синапсы, образуемые постганглионарными парасимпа
тическими волокнами в эффекторных органах (т. е. в сердце,
сосудах, бронхах, желудочно-кишечном тракте и т. д.).
Рецепторы в этих синапсах стимулируются не только аце-
тилхолином, но и мускарином (это яд некоторых грибов); отсю-
да и идет их обозначение.
В сосудах и сердце стимуляция м-холинорецепторов, види-
мо, приводит к тормозящему эффекту в отношении эффектор-
ных клеток (гладких миоцитов или кардиомиоцитов). Поэтому
сосуды расширяются, а сокращения сердца становятся более
редкими и слабыми.
В большинстве остальных органов м-холинергические си-
напсы — это синапсы возбуждающего типа, т. е. раздражение
рецепторов приводит к усилению функции эффекторных кле-
ток — гладкомышечных или железистых.
Но в любом случае рецепторы относятся к метаботропному
(медленному) типу (п. 4.1.3.1): возбуждение рецептора запуска
ет в клетке серию тех или иных метаболических превращений.
Их конечный результат и служит ответом клетки-мишени на
сигнал медиатора. (Механизм рассматривается в главе 5.)
Опять-таки есть группа фармакологических средств, изби-
рательно влияющих только на м-холинорецепторы: м холино-
миметики и м-холинолитики. Самый известный из м-холино-
литиков — атропин. В соответствии с вышесказанным, он су-
живает сосуды и расширяет бронхи.
Таким образом, с холинорецепторами связана весьма об-
ширная и важная область фармакологии.
250
Глава 4
Что касается адренорецепторов (в постганглионарных
окончаниях симпатической нервной системы), то они подразде-
ляются, по крайней мере, на 4 вида (cq, а2, р,, Р2), но при этом
все относятся к метаботропному типу. Поэтому механизм пе-
редачи сигнала в адренергических синапсах (как и в синапсах
с м-холинорецепторами) будет рассмотриваться в главе 5.
4.2.2.5. Системы транспорта ионов Са2*
в поперечнополосатой мышечной ткани
Согласно табл, 4.1 (см. п. 4 2.2.1), в цитоплазме клеток —
крайне низкая концентрация свободных (т. е. не связанных
с белками) ионов Са2". В поперечнополосатой мышечной ткани
(скелетной и сердечной) это достигается за счет деятельности
двух насосов (рис. 4.17).
Один — Na’-зависимый Са2+-насос — вероятно, находится
в плазмолемме и откачивает ионы Са2' во внеклеточную среду.
рМОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
251
По всей видимости, при этом происходит обмен каждого иона
Са2' на 2 иона Na*, которые поступают в клетку по градиенту
своей концентрации. Таким образом, это тот относительно ред-
кий у эукариот случай, когда для энергообеспечения активного
транспорта используется антипорт ионов.
Но гораздо большее значение имеет второй насос, который
обычно называют просто Са2 -насосом. Он локализован в мем-
бранах саркоплазматического ретикулума, располагаясь с плот-
ностью от 10 000 до 20 000 1 /мкм2 и составляя около 90 % от об-
щей массы белков этих мембран.
Данный насос закачивает ионы Са2' из саркоплазмы в ци-
стерны саркоплазматического ретикулума, где они связывают-
ся белком кальсеквестрином. В процессе транспорта преодоле-
вается примерно 10 000 кратная разность концентраций ионов
Са2 . Источником энергии служит АТФ, отчего второе название
данного насоса — Са2*-зависимая АТФаза.
Распад 1 молекулы АТФ обеспечивает перенос в цистерну
2-х ионов Са2*. Такая стехиометрия означает, что в энергию кон-
центрационного градиента переходит 90 % энергии концевой
макроэргической связи АТФ.
Са2‘-насос по структуре похож на Na'.K'-Hacoc (см.
рис. 4.13): он тоже содержит 2 большие субъединицы по
95 000 Да и 2 гликопротеиновые субъединицы по 50 000 Да.
В саркоплазматических мембранах имеется еще одна
транспортная система — Са2+-каналы Когда мышца не возбуж
дена, эти каналы закрыты.
При возбуждении мышечного волокна или кардиомиоцита
Са2'-каналы открываются. Индуцирующий это сигнал передает-
ся от сарколеммы и далее по Т-трубочкам (инвагинациям сарко
леммы) на контактирующие с последними мембраны ретикулу
ма. Однако конкретный механизм передачи неясен.
Через открытые каналы ионы Са2' активно выходят в cap
коплазму: за импульс — примерно по 120 ионов в расчете на
1 мкм2 саркоплазматической мембраны. Казалось бы, это не так
много. Но поскольку общая площадь саркоплазматических
мембран весьма высока, а исходная концентрация ионов Са2'
в саркоплазме была очень низкой, то в итоге их концентрация
здесь возрастает в 100 раз.
Благодаря этому активируется взаимодействие тонких
и толстых миофиламентов в миофибриллах — последние начи-
нают сокращаться.
По окончании процесса Са2+-каналы закрываются, и избы-
ток ионов Са2' вновь откачивается Са2'-насосом из саркоплазмы
в саркоплазматические цистерны.
252
Глава 4
Заметим попутно: из вышеизложенного следует, что вне-
клеточный и внутриклеточный Са2 оказывает на сократимость
мышц противоположное влияние.
Так, внеклеточный Саг , затрудняя открытие Na каналов
понижает возбудимость мембран (п. 4.2.2.3) и тем самым, оче-
видно, уменьшает число сокращений. При снижении же внекле-
точной концентрации Са2' наблюдаются судороги.
Напротив, внутриклеточный Саг‘ необходим для сокраще-
ния, и при снижении его концентрации сокращения ослабевают
или прекращаются.
4.2.2.6 Антибиотики как переносчики ионов
До сих пор мы рассматривали транспортные системы, по-
стоянно присутствующие в тех или иных мембранах. Но имеют-
ся вещества, которые не являются природными компонентами
мембран, но могут облегчать проникновение через них опреде-
ленных ионов.
В основном, это антибиотики. По своей транспортной спо-
собности они подразделяются на две группы:
подвижные переносчики, проходящие с ионом через мем-
брану;
- каналообразователи — образуют в мембране канал, через
который могут проходить ионы.
а) Подвижные перенос-
чики (валиномицин и др.).
Представляют собой замкну-
тые цепи, состоящие из моно-
меров различной природы
(рис. 4.18). Углеводородные
радикалы этих мономеров об-
разуют гидрофобную оболочку
молекулы. Внутри же имеет-
ся полость, выстланная таки-
ми полярными группами, ко-
торые способны образовывать
единый хелатный комплекс
с одним одновалентным ка-
тионом. В частности, валино-
мицин активней всего связы-
вает ион К'; сродство к Na’
в 1000 раз меньше.
Комплекс антибиотика
с ионом проходит через мем-
ЕИОМЕМБРАНЫ; структура и участие...
253
брану путем простой диффузии. Если с другой стороны мембра
яы (например, внутри искусственного мембранного пузырька)
концентрация ионов К* достаточно низкая, то происходит дис-
социация комплекса и высвобождение иона.
Свободный антибиотик способен диффундировать обратно,
связать очередной ион и тоже перенести его через мембрану.
И так много раз. За 1 с молекула антибиотика может пересечь
мембрану в обоих направлениях до 1000 раз и, соответственно,
перенести около 500 ионов.
б) Каналообразователи (грамицидин А и др.). Основа гра-
мицидина А — линейный полипептид, все 15 аминокислотных
остатков которого содержат исключительно гидрофобные ради-
калы. С одним концом полипептида связан этаноламин, а с дру-
гим — формильная группа.
Молекулы этого соединения обратимо объединяются в спи
рализованные димеры, которые способны встраиваться в мем-
браны (рис. 4.19). В димере остатки этаноламина играют роль ги-
дрофильных «головок», а пептидные Р-спирали — гидрофобных
«хвостов», пронизывающих всю неполярную фазу мембраны.
Однако, в отличие от жирнокислотных «хвостов», эти спи-
рали формируют в своем внутреннем пространстве гидрофиль-
ный канал: его стенки выстланы полярными группами, обра-
зующими пептидные связи ( NH СО-). Размеры канала тако-
вы, что по нему могут перемещаться через мембрану небольшие
(одновалентные) ионы. При этом участок канала, где в данный
момент находится ион, временно становится шире и короче (как
при перемещении комка пищи
С. 4.1*. OS-avU AHHVftfflMAI
грлмнци; .ином А
Э — ост.«т ж этэиоламинз
по пищеводу).
Канал остается открытым
в течение примерно 1 с (после че-
го, видимо, димер распадается
и молекулы антибиотика вступа-
ют в новые взаимодействия друг
с другом). За это время через ка-
нал может пройти -107 ионов,
т. е. скорость переноса здесь го-
раздо выше, чем в случае по-
движных переносчиков.
Не исключено, что натив-
ные ионные каналы (Na -кана-
лы, К -каналы и т. д.) в некото-
рых деталях своего строения
и функционирования напоми-
нают грамицидиновые димеры.
254
Глава 4
4.2.2.7. Транспорт глюкозы в почках
В заключение коротко остановимся на системах, обеспе-
чивающих реабсорбцию глюкозы в проксимальных канальцах
почек.
Заметим: исходная концентрация глюкозы в первичном
фильтрате такая же, как в плазме крови: примерно 1 г/л. Суточ-
ный объем этого фильтрата — 180л; следовательно, за сутки
в первичный фильтрат попадает -180 г глюкозы. Из них реаб-
сорбируется в проксимальных канальцах 99,8 %.
Первые порции реабсорбируемой глюкозы почти не встре-
чают концентрационного барьера, поскольку, как только что
сказано, концентрации в исходном фильтрате и плазме крови
практически одинаковы.
Но по мере реабсорбции концентрация глюкозы в каналь-
цах все понижается и в итоге достигает уровня, который в нес-
колько сотен раз ниже исходного. Поэтому последующие пор-
ции реабсорбируемой глюкозы переносятся против все возраста-
ющего концентрационного градиента. Поэтому этот процесс
и требует энергетического обеспечения.
Способ решения данной проблемы показан на рис. 4.20.
Через апикальную мембрану эпителиоцитов канальца (т. е.
внутрь этих клеток) глюкоза проходит путем симпорта с иона-
ми Na . Соответствующую транспортную систему можно обозна-
чить как Na’-зависимый глюкозный насос. Движущей силой
его работы является очень высокая разность концентраций ио-
нов Na' вне и внутри клеток.
Для обеспечения второй стадии транспорта (через мембрану
с базальной стороны клеток) необходимо, чтобы насос накачи-
(ПРОСВЕТ
(В КРОВЬ)
Рис. 4.20. PeaSvoi
БИОМЕМБРАНЫ, структура и участие...
255
вал глюкозу в клетки до концентрации, которая была бы замет-
но выше, чем в крови: порядка хотя бы 1,5 г/л.
Несмотря на это, в течение практически всей реабсорбции
всасывание 1 молекулы глюкозы вполне может быть обеспечено
(энергетически) симпортом всего одного иона Na' — столь высо-
ка энергия Na -градиента.
Вместе с тем надо помнить, что данный градиент создается
благодаря деятельности Na ,К'-насоса и что для выведения из
клетки 3 ионов Na' (в обмен на 2 иона К ) расходуется 1 молеку-
ла АТФ (п. 4.2.2.1). Следовательно, в конечном счете за счет
энергии 1 молекулы А ТФ в эпителиоцит попадают 3 молеку
лы глюкозы.
Затем глюкоза проходит через плазмолемму, расположен-
ную с базальной стороны клетки. Здесь транспорт является пас-
сивным, т. е. он осуществляется путем облегченной диффузии:
глюкоза проходит через специальные каналы по градиенту своей
концентрации из клеток в окружающее пространство. Видимо,
таким же образом преодолеваются и обе мембраны эндотелиоци-
тов кровеносных капилляров. Для того-то и нужно, чтобы кон-
центрация глюкозы в эпителиоцитах была выше, чем в крови.
Таким образом, вся реабсорбция глюкозы из фильтрата
в кровь энергетически обеспечивается за счет той АТФ, что рас-
ходуется Na ,К-насосом эпителиоцитов. Локализуется же этот
насос, видимо, тоже в базальном отделе плазмолеммы.
В свою очередь, АТФ восполняется за счет катаболизма ве-
ществ — в первую очередь, самой глюкозы. Можно найти:
для энергообеспечения реабсорбции 180 г глюкозы в сутки
необходим полный (аэробный) распад 1,65 г глюкозы.
4.2.3. Перенос через мембраны частиц
и высокомолекулярных соединений
4.2.3.1. Способы переноса
Через биомембраны могут проходить не только низкомоле-
кулярные вещества, но также высокомолекулярные соединения
и даже относительно мелкие частицы.
Мы с этим уже сталкивались выше — например, говоря
о транспорте новосинтезированных митохондриальных и ядер-
ных белков в соответствующие органеллы (п. 3.6.3). В этих при-
мерах известен и способ переноса: митохондриальные белки
преодолевают мембрану в развернутом состоянии, а ядерные
белки — через специальные поры в ядерной оболочке.
256
Глава 4
Переход частиц через плазмолемму происходит иначе —
в составе мембранного пузырька
При этом по направлению транспорта и по характеру пере-
носимых веществ различают следующие процессы (рис. 4.21).
1) Эндоцитоз — перенос частиц в клетку. Его разновидности:
а) пиноцитоз захват и поглощение клеткой раствори-
мых макромолекулярных соединений;
б) фагоцитоз — то же самое, но в отношении твердых
частиц;
в) эндоцитоз, опосредованный рецепторами, — здесь
поглощаемый субстрат предварительно специфически связы-
вается с поверхностными рецепторами плазмолеммы. Это
очень частый вариант фаго- и пиноцитоза, особенно в иммун-
ных процессах.
Во всех перечисленных случаях в месте проникновения суб-
страта вначале происходит впячивание плазмолеммы в цито-
плазму. Затем оно все углубляется, пока не превращается в мем-
бранный пузырек, содержащий субстрат и полностью находя-
щийся в цитоплазме.
2) Экзоцитоз — перенос частиц и крупных соединений из
клетки.
а) Наиболее распространенный способ экзоцитоза — секре-
ция Это такое выведение из клетки растворимых соединений,
которое является одной из функций данной клетки.
ФАГОЦИТОЗ
ПИНОЦИТОЗ
Эндоцитоз, опосреду-
емый рецепторами
Рис. 4.21. Сп с ,Г’М эн. у.цитоэл [fckscpxy) и эк:’.цит /х : (сни^у)
БИОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
257
Из приведенного определения следует, что секреция мо-
жет быть проявлением не только экзоцитоза, но и экспорта
низкомолекулярных соединений. Действительно, под се-
крецией понимают выделение из клетки веществ разного
размера:
- и высокомолекулярных (например, белковых гормонов
в передней доле гипофиза),
- и низкомолекулярных (ионов Н в желудке и почках, био-
логически активных аминов в соединительной ткани, ме-
диаторов в пресинаптических окончаниях и т. д.).
В одних случаях накопление веществ в клетке происходит
в виде секреторных пузырьков. Затем мембрана пузырьков
сливается с плазмолеммой (с соблюдением полярности мембран;
п. 3.6.2.2) — так, что содержимое пузырьков оказывается вне
клетки. Так могут секретироваться как высоко-, так и низкомо-
лекулярные соединения Пример — секреция гормонов и меди-
аторов.
Реже секреция совершается по типу облегченной диффузии
или активного транспорта. Очевидно, такой механизм может от-
носиться лишь к низкомолекулярным веществам. Пример — се-
креция ионов Н’ в желудке и почках.
Заметим, что в понятие секреции обычно не включают вы-
ведение из клетки обычных продуктов ее обмена, а также выве-
дение из нее таких ионов (например, Na ), которые остаются
в окружающей клетку среде.
б) Если из клетки удаляются твердые частицы, то такую
разновидность экзоцитоза называют экскрецией. Примером эк-
скреции может служить происходящее в конце эритропоэза уда-
ление из ретикулоцитов сетчатой субстанции (агрегированных
остатков органелл).
Видимо, механизм экскреции вновь состоит в том, что вна-
чале выделяемые частицы оказываются в цитоплазматическом
пузырьке, который затем сливается с плазмолеммой.
в) Наконец, существует еще одно понятие — рекреция. Это
перенос твердых веществ через клетку; фактически здесь соче-
таются фагоцитоз и экскреция.
Видимо, о данном феномене можно говорить примени-
тельно к тем специализированным макрофагам (М-клеткам,
дендритным клеткам, клеткам Лангерганса), которые по-
стоянно локализованы в эпителии слизистых оболочек и
кожи. Поглощая с одной своей стороны бактериальные части-
цы и выделяя их «обломки» с другой стороны («представляя»
таким образом антигены подлежащим лимфоцитам), эти
клетки осуществляют, по существу, рекрецию.
9-36
258
Глава 4
Какие мембранные белки обеспечивают эндо— и экзоцитоз?
Во многих случаях это еще неясно. Наиболее изучен данный во-
прос в отношении экзоцитоза ацетилхолина в холинергических
синапсах
4.2.3.2. Экзоцитоз ацетилхолина
Ацетилхолин образуется в цитоплазме пресинаптического
окончания и только после этого поступает в синаптические пу-
зырьки (или синаптосомы; рис. 4.22). Одновременно в оконча-
нии обычно присутствует несколько сотен пузырьков.
Конечная концентрация медиатора в пузырьках весьма вы
сока (-0,5 М), так что его «упаковка», очевидно, требует энер-
гии. Непосредственным источником последней является гради-
ент водородных ионов, создаваемый протонными насосами. На-
сосы локализуются в мембране пузырьков и (как в прелизосо-
мах, п. 4.6.2.2)засчет АТФ поддерживают внутри высокую кон-
центрацию протонов. Накачка же ацетилхолина в пузырьки,
видимо, происходит путем антипорта с этими ионами, кото-
рые выходят в гиалоплазму по градиенту своей концентрации.
Соответствующую транспортную систему можно обозначить как
Н -зависимый ацетилхолиновый насос.
пн — протонный насос;
к» — Са-насоо- <?с ^йнапх>гамтг <2-\-- синаит
БИОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
259
Теперь обратимся к собственно экзоцитозу. Ключевую роль
в данном процессе (а возможно, в экзоцитозе и других медиато-
ров в прочих синапсах) играют ионы Са2+. С этим напрямую свя-
зана природа целой группы белков пресинаптической мембраны
и синаптических пузырьков.
Так, в пресинаптической мембране содержатся Са2’-кана
лы. Они образуют скопления в т. н. активных зонах мембра
ны — участках, с которыми будут впоследствии сливаться си-
наптические пузырьки. Каналы закрыты в состоянии покоя
и открываются при снижении трансмембранного потенциала.
Благодаря этому, при возбуждении в цитоплазме пресинаптиче-
ского окончания повышается концентрация ионов Са2' — за
счет поступления из внешней среды.
С другой стороны, в мембране синаптических пузырьков
имеются АТФ зависимые Са2+-насосы (Са2‘-АТФаза), которые,
постоянно функционируя, создают в пузырьках высокую кон-
центрацию Са2’. Таким образом, для экзоцитоза медиатора
необходимо, чтобы концентрация этих ионов оказалась высокой
с обеих сторон мембраны пузырька.
Спектр белков, на которые влияют ионы Са2' в пресинапти-
ческом окончании, весьма широк. Укажем лишь на ключевые
белки.
Один из них — синапсин. Этот белок состоит из двух субъе-
диниц (общей массой 166 кДа) и связан с внешней поверхностью
мембраны синаптосомы. При низкой концентрации ионов Са2'
в цитоплазме он находится в дефосфорилированном состоянии
и соединяет пузырек с актиновыми микрофиламентами цито-
скелета — пузырек пребывает в фиксированном положении.
При возбуждении же пресинаптической мембраны, когда
в цитоплазму поступают ионы Са24, последние стимулируют спе-
цифическую киназу (Са2, кальмодулинзависимую киназу). Этот
фермент фосфорилирует синапсин, отчего ослабевает связь с ак-
тином пузырек перемещается вдоль микротрубочек к одной
из активных зон пресинаптической мембраны.
Следующие события — контакт и слияние пузырька с этой
мембраной. Они тоже обеспечиваются Са2'-зависимыми белка-
ми мембраны пузырька.
Среди них, в частности, белок синаптогамин Взаимодей-
ствуя в присутствии Са2' с группой других мембранных белков,
он приводит в конце концов к активации синаптопорина. По-
следний же формирует первичную пору, которая пронизывает
обе мембраны и, видимо, инициирует слияние липидных бисло-
ев. Через эту же пору начинается излияние медиатора в синап-
тическую щель.
260
Глава 4
Предполагают также, что в мембране пузырька имеются
и актомиозинподобные белки вызывающие сокращение его
стенки и облегчающие тем самым выброс медиатора.
В результате встраивания мембран пузырьков в пресинап-
тическую мембрану поверхность последней увеличивается.
Затем начинается процесс рециклизации — от пресинапти-
ческой мембраны отпочковываются мембранные структуры, ко-
торые вначале сливаются в цистерны. И лишь потом от послед-
них отшнуровываются новые синаптические пузырьки, вновь
заполняемые медиатором.
На этом мы завершим рассмотрение мембранных белков
с преимущественно транспортной функцией и, в соответствии
с систематизацией, приведенной в п. 4.1.3.1, обратимся к оче-
редной группе мембранных белков — а именно к белкам, обес-
печивающим непосредственное взаимодействие клеток
(друг с другом или с внеклеточными структурами).
4.3. АДГЕЗИВНАЯ ФУНКЦИЯ МЕМБРАН1
4.3.1. Семейства адгезивных мембранных
белков
4.3.1 1. Введение
Сделаем несколько предварительных замечаний.
а) Наиболее удобный и оттого излюбленный объект изуче-
ния адгезивных мембранных белков — клетки крови и эндоте-
лиоциты. Соответственно, и среди адгезивных взаимодействий
лучше всего охарактеризованы взаимодействия данных клеток
между собой, а также с компонентами внеклеточного матрик-
са. Поэтому в нижеследующем изложении будут иметься в ви-
ду, в основном, эти клетки и взаимодействия.
б) Второе замечание касается терминологии. Адгезивные
мембранные белки часто относят к рецепторам клетки. В опре-
деленном смысле это справедливо, поскольку на начальной ста-
дии адгезивного взаимодействия они действительно выступают
как рецепторы, узнающие определенные вещества (на поверхно-
сти других клеток или в составе внеклеточного матрикса).
В то же время понятие рецепторы существенно шире — оно
охватывает и те мембранные белки, которые реагируют на ра-
‘ Основным источником при изложении данной проблемы будет монография
М.А. Пальцева и А. А. Иванова « Межклеточные взаимодействия» М.: Медицина.
1995.
БИОМЕМБРАНЫ: структура и участие
261
створимые сигнальные молекулы, выделенные другими клетка-
ми. По классификации, приведенной в п. 4.3.1.3, это мембран-
ные белки четвертой группы.
Таким образом, адгезивные белки можно считать клеточ-
ными рецепторами, но не все клеточные рецепторы являются
адгезивными белками.
в) Независимо от функции рецептора вещество, с которым
он взаимодействует, называется лигандом. Поэтому часто гово-
рят о взаимодействии в паре лиганд-рецептор.
Для адгезивных белков лиганд — соответствующий компо-
нент мембраны другой клетки или внеклеточного матрикса.
В то же время данный адгезивный белок сам является лигандом
для реагирующего с ним вещества.
г) Наконец, о классификации и номенклатуре адгезивных
мембранных белков.
Классификация является еще незавершенной. Среди из-
вестных на настоящий момент адгезивных белков различают
следующие семейства:
1) интегрины,
2) селектины,
3) иммуноглобулины, 1g (точнее, Ig-подобные белки),
4) кадгерины.
Но существут и целый ряд белков, которые не отнесены по-
ка к какому-либо семейству.
Что же касается номенклатуры, или системы обозначений
конкретных белков, то она способна вселить ужас — настолько
беспорядочной и громоздкой она является. Т. е. системы, в точ-
ном смысле этого слова, пока фактически нет.
Вот примеры обозначений адгезивных белков: VLA-1, CD2,
CDlla/CD18; gpIIb/IIIa, ICAM 1, VCAM-2, N-Cal-CAM и т. д. —
несколько десятков символов.
При этом белки со сходными буквенными обозначениями ча-
сто относятся к разным семействам. Так, белок LFA 1 — инте-
грин, а белок LFA 3 — иммуноглобулин; белок CD2 — вновь имму-
ноглобулин, белок же CD44 не относится ни к одному семейству.
В то же время для одного и того же белка порой использует-
ся целая серия совершенно разных названий и символов, напри-
мер: L-селектин, лимфоцитарный хоминговый рецептор, Le-8,
Ly-22, LAM-1, MEL-14.
По данной причине мы постараемся свести употребление
подобных обозначений к минимуму.
Отметим попутно, что неупорядоченность номенклатуры
белков (и генов) — общая проблема современной биологии. Т. е.
это относится не только к адгезивным мембранным белкам,
262
Глава 4
но и к сотням вновь выявляемых других белков, особенно тем,
что участвуют в многочисленных регуляторных процессах.
После этих замечаний коротко познакомимся с адгезивны-
ми белками.
4.3.1.2. Интегрины
Интегрины — это интегральные белки гетеродимерной
структуры аД (рис. 4.23). Вообще говоря, интегральными явля
ются и многие другие адгезивные белки (например, селектины
и иммуноглобулины), но термин «интегрины» используется
только для данного семейства (еще один пример несовершенства
номенклатуры).
Известно более 10 разных видов субъединицы атл около 15
видов субъединицы /3 При этом Р-субъединицы по размеру зна-
чительно меньше, чем а-субъединицы. Тем не менее и в тех,
и в других — по три домена: внутриклеточный (небольшой по
размеру), мембранный и внеклеточный.
Внутриклеточные домены интегринов участвуют в фик-
сации цитоскелета (актиновых микрофиламентов). Связь меж-
ду этими доменами и микрофиламентами осуществляется с по-
мощью специальных белков — винкулина, талина или непо-
средственно актина. Таким образом, за счет внутриклеточных
доменов интегрины, подобно гликофорину эритроцитов
(п. 4.1.3.2), выполняют и структурную функцию.
Внеклеточные же домены ответственны за узнавание спе-
цифических лигандов и адгезию с ними. Очень часто (хотя не
всегда) узнаваемым локусом в этих лигандах является одна и та
Рис 4.23. Ичтегрии
же трипептидная последователь-
ность Арг-Гли—Асп-.
Хотя, как уже отмечалось, выяв
лено около 15 разных Р-субъединиц,
наиболее изучены белки с Р-субъеди-
ницами первых трех типов (Pi, Рг> Рз)-
Р, интегрины обнаружены в
плазмолемме лимфоцитов и тромбо-
цитов. При этом некоторые Pj-инте-
грины участвуют во взаимодействии
лимфоцитов с эндотелием (на началь-
ной стадии проникновения в ткани),
контактируя с адгезивными иммуно-
глобулинами на поверхности эндоте-
лиоцитов.
БИОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
263
Как известно, лимфоциты подразделяются на несколько
популяций, в т. ч. В- и Т клетки. Оказывается, у этих клеток
различен спектр мембранных ргинтегринов. Это, наряду с дру-
гими факторами, видимо, влияет на то, в сосудах каких органов
лимфоциты могут взаимодействовать с эндотелием.
Когда же лимфоцит оказывается вне сосудистого русла,
другие Pi-интегрины реагируют с белками межклеточного ве-
щества — коллагеном, фибронектином, ламинином. Причем
взаимодействие является весьма специфичным: для каждого из
перечисленных внеклеточных белков на поверхности лимфоци-
та имеется свой Pj-интегрин.
К р2 интегринам относятся всего три белка. Они выявлены
не только в лимфоцитах, но и в других лейкоцитах — грануло-
цитах и моноцитах. В этих «других» лейкоцитах Р2-интегрины
обеспечивают взаимодействие, во-первых, с клетками эндоте-
лия, а во-вторых, с фагоцитируемыми объектами. В случае мо-
ноцитов те же белки еще участвуют во взаимодействии с лимфо-
цитами — в процессе представления последним антигенов.
Наконец, /}3 интегрины обнаруживаются на поверхности
ряда лейкоцитов и активированных тромбоцитов. В последних
они необходимы для связывания с фибриногеном.
Уже из этого беглого обзора интегринов можно заключить,
что нет какой-либо закономерности, которая бы жестко связы-
вала природу их P-цепи (на основе чего произведена системати-
зация) и функциональную роль белка. Так, все три перечислен-
ных подсемейства встречаются в лейкоцитах, два подсемей
ства — в тромбоцитах, и т. д. При этом представители разных
подсемейств могут участвовать в одних и тех же процессах — на-
пример, связывании с эндотелием.
То же самое выявляется в отношении других адгезивных
белков — селектинов, иммуноглобулинов, кадгеринов и «внеси-
стемных» белков.
4.3.1.3. Селектины
В отличие от интегринов, эти белки представляют собой не
димеры, а мономеры. Название происходит от того факта, что
N-концевой домен (крайний во внеклеточной части белка;
рис. 4.24) обладает свойствами лектинов.
Лектины — группа белков (в основном, растительного про-
исхождения; наиболее известный представитель конканава
лин), которые имеют специфическое сродство к тому или иному
концевому моносахариду олигосахаридных цепей.
264
Глава 4
Таким образом, благодаря лекти-
новому домену, селектины узнают
определенные углеводные компонен-
ты на поверхности клеток. В частно-
сти, для двух селектинов (Р- и Е-) ли-
гандом является концевая последова-
тельность Сиалил Фукоза.
За лектиновым доменом следует
(в направлении от N- к С-концу цепи) се-
рия из трех-десяти других доменов.
Из них одни, видимо, влияют на кон-
формацию первого домена, а другие са-
ми принимают участие в связывании
(на стадиях, происходящих за первичным узнаванием).
Среди конкретных представителей селектинов наиболее из-
вестны 3 белка L-, Р- и Е-селектины.
L-селектин, как и интегрины, обнаруживается на поверх
ности различных лейкоцитов и участвует в их взаимодействии
с гликопротеинами эндотелия. Причем специфические для L-ce-
лектина гликопротеины в особенно большом количестве сосре
доточены в посткапиллярных венулах лимфоузлов (эти вену-
лы отличаются высоким эндотелием). Поэтому именно здесь
в обычных условиях лимфоциты выходят из сосудистого рус-
ла, что обозначается как хоминг (от англ, home — дом) — воз-
вращение лимфоцитов в лимфоидную ткань. Гликопротеины же
высокого эндотелия, служащие как бы маяками для лимфоци-
тов, называются сосудистыми адрессинами.
Резюмируя, можно сказать, что хоминг лимфоцитов обеспе-
чивается взаимодействием L-селектина и сосудистых адрессинов.
В отличие от L-селектина, Р и Е-селектины обнаружива
ваются на поверхности не лейкоцитов, а эндотелия. Причем,
в большинстве сосудов — не постоянно, а только после стимуля-
ции эндотелия факторами (гистамином, тромбином, цитокина-
ми), стимулирующими воспаление и ряд других реакций. По-
явившись на поверхности эндотелиоцитов, эти селектины уча-
ствуют во взаимодействии с лейкоцитами, а затем вновь исчеза-
ют с поверхности. В невозбужденных же эндотелиоцитах селек-
тины хранятся в специальных цитоплазматических образова
ниях — тельцах Вейбеля-Паладе.
Таким образом, здесь обращают на себя внимание два об
стоятельства.
Во-первых, некоторые адгезивные молекулы оказываются на
поверхности клетки лишь при определенных условиях и временно.
РМОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
265
Во-вторых, селектины участвуют во взаимодействии лейко-
цит-эндотелиоцит как бы «с двух сторон»: одни (L-селектин)
со стороны лейкоцитов, а другие (Р и Е-селектины) — со сторо-
ны эндотелия.
Что касается Р-селектина, то он, помимо того, выявляется
на активированных тромбоцитах.
4.3.1 4 Адгезивные иммуноглобулины
«Классические» иммуноглобулины (1g), циркулирующие
в крови, как известно, продуцируются плазматическими клет-
ками (образующимися из В-лимфоцитов при антигенной стиму-
ляции).
Эти 1g имеют характерную олигомерную структуру
(рис. 4.25А) — (L2H2)n, где L означает легкие цепи, Н тяже
лые, а п варьирует от 1 до 5. Причем L-цепи образуют два доме-
на: один вариабельный (VL) и один константный (CL), а Н-це-
пи четыре домена: один вариабельный (VH) и три или четыре
константных (Сн). Вариабельные домены (VL и VH) попарно
формируют антигенсвязывающий центр, специфичный в отно
шении того или иного антигена. Таким образом, 1g являются ан
тителами к антигенам.
Что касается адгезивных 1g и Ig-подобных белков, то они на-
ходятся на поверхности лимфоидных и ряда других клеток
(в частности, эндотелиоцитов), выступая в качестве рецепторов
а) При этом на В лимфоцитах структура данных белков
наиболее близка к той, что изображена на рис. 4.25,А. Причем
В клетки одного клона имеют на поверхности 1g лишь одной им-
266
Глава 4
муноспецифичности. Поэтому В-лимфоциты наиболее специ-
фично реагируют с антигенами.
Не вдаваясь пока в события, следующие за этим взаимодей-
ствием, отметим лишь, что среди них — и два противополож-
ных процесса:
исчезновение с поверхности клетки молекул 1g (вслед-
ствие эндоцитоза их комплексов с антигеном),
появление на поверхности новых молекул того же 1g
(вследствие усиления их синтеза).
Когда второй процесс начинает преобладать, молекулы 1g со-
бираются в мембране в пятнышки, которые затем перемещаются
в одну область, образуя «шапочку». Такова же реакция лимфоци-
тов на специфические антитела против их поверхностных 1g.
б) Что касается Т-лимфоцитов, то на их поверхности 1g
присутствуют, вероятно, в «неполном» виде — представлены,
как считают, только тяжелой цепью (которая, однако, вновь
имеет вариабельный и константные домены). Такие белки назы-
ваются Т-клеточными рецепторами (TCR; рис. 4.25,Б).
Специфичность их взаимодействия с антигенами нес-
колько иная, чем у полных 1g В-клеток. Например, у одного
из видов Т-клеток (т. н. Т-хелперов) TCR узнает не саму по
себе антигенную детерминанту, а ее комплекс с определен-
ным мембранным белком на поверхности клетки
в частности, В лимфоцита. Таким образом, Т-клетки, участ
вуя в иммунной реакции, связываются с помощью TCR с дру-
гой клеткой (подробней об этом — в п. 4.3.4). И вновь все Т-
клетки одного клона имеют на своей поверхности TCR лишь
одного вида.
Заметим: активацию Т клеток можно вызвать также лекти-
нами. Последние же, как отмечалось выше, специфически взаи-
модействуют с концевыми остатками олигосахаридов. Следова-
тельно, в состав TCR входят также олигосахаридные цепи. Воз-
можно, то же относится и к 1g В-клеток.
в) Наконец, существуют и такие Ig-подобные поверхност-
ные белки, которые совсем лишены иммуноспецифичности.
Они играют роль обычных адгезивных белков и участвуют,
в частности, в тех же процессах взаимодействия клеток крови
с эндотелием, что и интегрины и селектины.
Таковы, например, белок LFA-2 (на Т-лимфоцитах), белок
LFA3 (на лейкоцитах, эритроцитах, фибробластах, различных
клетках эндотелия и эпителия), белок ICAM 1 (на эндотелиоци-
тах) и т. д.
Интересно, что некоторые белки этой группы являются
облигатно или факультативно гомофильными.
РИОМЕМБРАНЬГ структура и участие. .
267
В первом случае (при облигатной гомофильности) лиган-
дом молекулы белка может служить лишь такая же молекула
(на поверхности другой клетки). Примером является белок
NCAM, выявленный в нервной ткани, а также на некоторых
лимфоцитах.
Во втором же случае (при факультативной гомофильности)
белок может участвовать как в гомо-, так и в гетерофильных
взаимодействиях. Пример — белок CD31; он находится на эндо-
телиоцитах, тромбоцитах и моноцитах. При этом на эндотелио-
цитах одни его молекулы, проявляя гомофильность, обеспечи
вают межклеточные контакты эндотелиоцитов друг с другом;
остальные же молекулы, благодаря гетерофильности, могут ре-
агировать с другими адгезивными белками тромбоцитов и моно-
цитов.
4.3 1.5. Кадгерины и «внесистемные» адгезивные белки
Ключевая особенность кадгеринов состоит в том, что их ад-
гезивная способность проявляется только в присутствии ионов
Са2'. Функциональная же их роль — участие в формировании
относительно постоянных клеточных контактов в эпителиаль-
ной (подсемейства Е и Р-кадгеринов), нервной и мышечной
(подсемейство N-кадгеринов) тканях.
Поэтому, естественно, что впервые кадгерины появляются
на стадиях морфо- и органогенеза.
Несколько слов об адгезивных белках, не отнесенных ни
к одному из вышерассмотренных семейств. Это, в частности,
белки CD26. CD36, CD44 и CD73.
Как и многие предыдущие белки (интегрины, селектины,
Ig-подобные белки без иммунной специфичности), эти белки то-
же обеспечивают взаимодействия клеток крови и эндотелиоци-
тов между собой и (или) с компонентами межклеточного ма-
трикса.
Но у некоторых из данных белков имеется интересная осо-
бенность: они обладают той или иной ферментативной активно
стью — например, протеазной (CD26) или нуклеотидазной
(CD73). Правда, пока остается неясной роль этой активности
способствует ли последняя каким-то образом адгезивному взаи-
модействию или выполняет некую параллельную функцию.
Благодаря своему многообразию, адгезивные белки обеспе-
чивают множество строго упорядоченных и сложных процессов.
Далее мы рассматриваем лишь три таких процесса, но надо по-
нимать, что их число неизмеримо больше.
268
Глава 4
4.3.2. Хоминг Т-лимфоцитов
4.3.2 1 Специфичность хоминга
Как уже отмечалось, хоминг лимфоцитов — это выход по-
следних из кровеносного русла в лимфоидную ткань. Наиболее
хорошо изучен хоминг Т-лимфоцитов.
Следует заметить, что и в лимфоидной ткани Т-клетки рас-
положены не повсеместно, а в т. н. Т-зонах:
- в лимфоузлах это паракортикальная зона,
- в белой пульпе селезенки — периартериальные влагали-
ща и периартериальные зоны фолликулов,
- в лимфоидной ткани слизистых оболочек — межфоллику-
лярные скопления лимфоцитов.
Таким образом, циркулирующие в крови лимфоциты дол-
жны узнавать не просто лимфоидную ткань, но еще и «свою» зо-
ну в этой ткани.
Можно добавить и тот факт, что путь хоминга зависит так-
же от функционального состояния Т-клетки. Нестимулирован-
ные Т-лимфоциты мигрируют, в основном, в лимфатические уз-
лы. Если же лимфоциты были ранее стимулированы и преврати-
лись в клетки памяти, то они мигрируют из крови в лимфоид-
ную ткань слизистых оболочек и главным образом в ткань того
органа, где были первоначально стимулированы. Биологиче-
ский смысл этого ясен: именно здесь могут быть сосредоточены
основные «силы» антигена Но такая избирательность мигра-
ции еще более усложняет проблему хоминга.
Как же решается эта проблема? Многое пока остается неяс-
ным, но главный принцип уже был сформулирован выше
(п. 4.3.1.3): хоминг обеспечивается специфическим взаимодей
ствием хоминговых рецепторов лимфоцитов и сосудистых
адрессинов эндотелиоцитов. Т. е. все определяется набором ад-
гезивных белков на поверхности Т-клеток и эндотелиоцитов.
4.3.2.2. Механизм миграции Т-клеток
Однако хоминг не сводится к простому одностадийному
взаимодействию. Напротив, проникновение лимфоцита через
стенку сосуда (обычно это венула с высоким эндотелием) — весь-
ма сложный процесс. Вот его основные стадии (рис. 4.26).
1) Подготовительная стадия. Прежде всего, для взаи-
модействия лимфоцита с эндотелиоцитом должны иметься под-
ходящие условия. Такие условия создаются в посткапиллярных
венулах с высоким эндотелием. Здесь кровоток является, во-
рИОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
269
Рис. i.'itb. Нзаимадействие Т-
Лимфоцитов с елмем ве-
нул вимфоидных органов
t-c. — 1-свлвктин. .
£ с. - Е свлехтин
первых, достаточно медленным
(даже еще медленней, чем в ка-
пиллярах), а во-вторых, турбу-
лентным — благодаря шерохо-
ватой поверхности эндотелия.
По этим причинам лимфо-
циты начинают постоянно стал-
киваться друг с другом и со стен-
ками сосуда: возникает т. н. эф-
фект «катящихся клеток».
2) Первичная слабая адге-
зия. На этой-то стадии и проис-
ходит специфическое взаимодей-
ствие хоминговых рецепторов
(со стороны лимфоцитов) и сосу-
дистых адрессинов (со стороны
эндотел иоцитов).
Нестимулированные Т-
клетки несут на поверхности
в качестве хоминговых рецепто-
ров L-селектин и некоторые
гликопротеины (обозначим их
ГлЕ). В венулах лимфоузлов L-
селектин узнает на эндотелии
специфические для себя лиган-
ды (обозначим их Гль), а
ГлЕ — Е-селектин. Таким обра-
зом, сосудистыми адрессинами
служат Гль и Е-селектин. Следо-
вательно, специфическое взаи-
модействие в парах
L-сел — Гл.Е,
ГлЕ — Е сел
приводит к тому, что нестимули-
рованные Т-лимфоциты «прилипают» к стенке сосудов (подвер-
гаются первичной адгезии) именно в лимфоузлах.
В отличие от венул лимфоузлов, на поверхности эндотелия
других сосудов Е-селектин в обычных условиях отсутствует
и появляется лишь при воспалении (п. 4.3.3.3).
У Т-клеток памяти — свои хоминговые рецепторы; основ-
ной среди них — «внесистемный» адгезивный белок CD44. Спе-
цифичный для него сосудистый адрессин (белок MAD) распола
гается в высоком эндотелии венул лимфоидной системы слизи-
270
Глава 4
стых оболочек. Поэтому Т-клетки памяти задерживаются имен-
но здесь.
3) Стимуляция Т лимфоцитов, приводящая к вовлече
нию во взаимодействие других адгезивных белков. Первичная
адгезия вызывает ряд изменений в структуре плазмолеммы Т-
к леток.
а) Так, прежде всего в адгезию вовлекаются Ig-подобные
белки. Вначале это иммунонеспецифический белок CD31, нахо-
дящийся на поверхности и лимфоцитов, и эндотелиоцитов
и участвующий в гомофильном взаимодействии (п. 4.3.1.4). По-
следнее каким-то образом активирует TCR (Т-клеточный рецеп-
тор) — иммуноспецифический Ig-подобный белок Т-клетки.
б) Активация же TCR служит сигналом, «вызывающим»
на поверхность Т-лимфоцита интегрины (VLA-4 и LFA-1).
При этом со стороны эндотелиоцитов партнерами интегринов
являются опять-таки иммунонеспецифические Ig подобные бел-
ки (VCAM-1, ICAM 1, ICAM-2):
VLA4-VCAM1; LFA1-ICAM1; LFA 1-ICAM 2
Данные взаимодействия обеспечивают самое сильное при
легание Т-клеток к эндотелию. При этом эндотелиоциты даже
несколько уплощаются.
Таким образом, в процессе хоминга Т-клеток закономерно
сменяются белки, участвующие в адгезии. При этом типы взаи-
модействующих белков выстраиваются в последовательность:
селектины специфические гликопротеины,
Ig-подобные белки — Ig подобные белки,
интегрины — Ig подобные белки.
4) Ослабление адгезивной силы. Чтобы лимфоцит, свя-
завшийся с эндотелием, проник затем через стенку сосуда,
необходимо его постепенное освобождение из «плена» адгезив-
ных связей. Это достигается за счет уменьшения на поверхности
Т-клетки количества адгезивных молекул. Причиной могут слу-
жить два процесса.
Во-первых, часть интегринов через какое-то время подвер-
гается интернализации, т. е. вновь уходит с поверхности
внутрь лимфоцита.
Во-вторых, другая часть интегринов (равно как и прочие
адгезивные молекулы) может просто слущиваться с поверхно-
сти лимфоцитов.
5) Проникновение Т-клеток через эндотелий и базалъ
ную мембрану. Т клетки проникают, по разным сведениям, ли-
бо между эндотелиоцитами (как показано на рис. 4.26), либо,
рИОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
271
скорее всего, непосредственно через эндотелиоциты (что обозна-
чается как цитопемзис). Одновременно в Т-клетках индуциру-
ется синтез специальных протеаз, которые осуществляют ло-
кальное растворение базальной мембраны. В конечном счете Т-
клетки оказываются в месте своего назначения.
Заметим, что в рассмотренном процессе участвуют также
цитокины, выделяемые самими адгезирующими клетками,
а также их окружением. Именно оии часто служат тем сигна-
лом, который связывает одну стадию процесса с другой.
4.3.3. Воспаление
Теперь обратимся к воспалению. В этом сложном патобио-
логическом процессе — два ведущих явления:
- сосудистая реакция (расширение и повышение проница-
емости мелких сосудов),
- активный выход лейкоцитов из кровеносного русла.
К обсуждаемой здесь теме (роли адгезивных белков) непо-
средственно относится, по крайней мере, второе из данных явле-
ний. Однако понимание этого пришло лишь в 1985 г. До того
долгое время считалось, что лейкоциты привлекаются в очаг во-
спаления хемоаттрактантами, выделяемыми микроорганизма-
ми и собственными клетками организма. Оказалось же, что
главным событием, индуцирующим миграцию лейкоцитов, яв-
ляется повышение адгезивности эндотелия в области воспа-
ления. Причем выяснилось также и то, что эндотелий — ключе-
вой участник и обоих компонентов сосудистой реакции.
В итоге картина воспаления (если ограничить ее сосудистой
реакцией и миграцией лейкоцитов) представляется в достаточ-
но упрощенном виде такой, как показано на рис. 4.27. Рассмо-
трим ее подробнее.
4.3.3.1 Медиаторы воспаления
Центральную роль в процессе играют т. н. медиаторы во-
спаления — сигнальные вещества, непосредственно «запускаю-
щие» воспалительный процесс. К ним относятся гистамин,
тромбин и такой цитокин, как ИЛ-1 (интерлейкин-1).
а) Гистамин — низкомолекулярное соединение, продукт
Декарбоксилирования аминокислоты гистидина. Он локализо-
ван (вместе с рядом других веществ) в гранулах базофильных
лейкоцитов и тучных клеток (тканевых базофилов).
На поверхности этих клеток имеются рецепторы к одному
из классов иммуноглобулинов (см. рис. 4.25,А), а именно
272
Глава 4
Рис. 4.27. М^игчиэм р кзвития топали гелием о процесса
РИОМЕМБРАНЫ. структура и участие
273
к I Б. Причем узнается константная область (Fc) этих 1g,
по которой, собственно, и различаются растворимые 1g разных
классов. Следовательно, на поверхности одного базофила нахо
дятся Ig Е самой разной иммуноспецифичности.
Микроорганизмы, а также продукты их жизнедеятельно-
сти или распада (эндотоксины), будучи антигенами, могут свя
зываться с поверхностными Ig Е базофилов. Это вызывает дегра-
нуляцию клеток и высвобождение гистамина (наряду с прочими
активными веществами).
б) Второй медиатор воспаления, тромбин — один из бел-
ковых компонентов (фактор Па) системы свертывания крови,
циркулирующий в сосудистом русле. В обычном состоянии все
многочисленные факторы этой системы находятся в неактивном
состоянии; в т. ч. тромбин — в виде протромбина (фактора II).
Что же приводит к активации системы? — Замедление тока
крови, повреждение стенки сосуда (отчего в кровь попадает тка
невой фактор свертывания, или фактор III); возможно, активи-
руют систему и бактериальные эндотоксины.
Заметим: тромбин как медиатор воспаления сам вызывает
замедление кровотока (вследствие расширения сосудов) и изме-
нение структуры эндотелия. Таким образом, в воспалении име-
ются признаки автокаталитического процесса, который, од-
нажды начавшись по той или иной причине, затем сам себя уси
ливает.
в) Наконец, третий основной медиатор воспаления — бе-
лок интерлейкин 1 (ИЛ-1), относящийся к цитокинам.
Более подробно речь о цитокинах будет идти в следующей
главе. Здесь лишь упомянем, что это гормоноподобные веще-
ства, оказывающие, в основном, местное действие. Т. е. они вы-
деляются при определенных условиях различными неэндокрин
ными клетками (крови, соединительной ткани, эндотелия)
и обычно связываются с близлежащими клетками, стимулируя
в них те или иные процессы.
Что касается конкретно ИЛ-1, то главными его продуцента-
ми являются моноциты крови и образующиеся из них в тканях
макрофаги. Стимулируется же секреция ИЛ 1 в ответ на фаго-
цитоз макрофагами микроорганизмов и действие эндотоксинов.
Итак, бактериальная инфекция (наиболее частая причина
воспаления) может вызывать появление в очаге всех трех пере
численных медиаторов — гистамина (из гранул базофилов),
тромбина (путем активации протромбина) и ИЛ-1 (секретируе-
мого моноцитами и макрофагами).
274
Глава 4
4.3.3.2. Что делают медиаторы воспаления
Клетками-мишенями для медиаторов воспаления являют-
ся эндотелиоциты мелких сосудов в очаге воспаления.
Общим является также то, что, как и другие сигнальные
молекулы нестероидной природы, все эти медиаторы не прони-
кают внутрь клетки-мишени, а связываются с мембранными ре-
цепторами, что запускает ту или иную цепочку событий.
Однако имеется принципиальное различие между гистами-
ном и тромбином, с одной стороны, и ИЛ-1, с другой.
Первые два медиатора вызывают активацию определен-
ных внутриклеточных ферментов, отчего ответ на их действие
развивается быстро (в течение 5-30 мин).
Что же касается ИЛ-1, то он стимулирует синтез тех же
или иных ферментов, и поэтому сходный в общих чертах ответ
обнаруживается существенно позже (примерно через 4 ч).
Полностью цепочки событий, следующих за связыванием
медиаторов, мы пока рассматривать не будем (это опять-таки,
как и цитокины, предмет следующей главы). На рис. 4.27 дета-
ли соответствующих механизмов опущены. Отмечено лишь, что
одним из ключевых внутриклеточных событий является повы
шение концентрации ионов Саг* в эндотелиоцитах.
Это, в свою очередь, вызывает ряд следствий (вновь слож-
ным, многоступенчатым образом).
1) Во-первых, эндотелиоциты начинают синтезировать
и выделять два сосудорасширяющих фактора.
а) Один из них — простациклин (PG-I2); это вещество из
обширной группы простагландинов (PG) производных ара-
хидоновой кислоты (жирная кислота С2о;4). Спектр биологиче-
ских эффектов простагландинов очень широк и зачастую проти-
воречив: действие одних веществ противоположно влиянию
других.
Что же касается простациклина, то у него — всего два глав-
ных свойства: он расширяет сосуды и препятствует агрегации
тромбоцитов.
б) Второе сосудорасширяющее вещество, продуцируемое
возбужденным эндотелием, — EDRF (Endothelium Derived Rela-
xation Factor), т. e. эндотелиальный фактор релаксации. Счи-
тается, что главное действующее начало этого фактора — оксид
азота, NO (связанный с белком либо через SH-группы, либо че-
рез железо).
Оба эти фактора (простациклин и EDRF) воздействуют на
гладкие миоциты артериол. В отличие от медиаторов воспале-
ния, видимо, и простациклин (как гидрофобное вещество), и от-
РИСМЕМБРАНЫ: структура и участие...
275
щепляющийся от EDRF NO (как небольшое соединение) прони-
кают внутрь клетки-мишени.
Здесь каждое вещество инициирует свою цепочку реакций.
Но итогом в обоих случаях является снижение внутриклеточ-
ной концентрации ионов Са2 . Что, в свою очередь, приводит
к расслаблению миоцита.
Таков в общих чертах механизм расширения артериол при
воспалении.
2) Вернемся опять к эндотелиоцитам. Увеличение в них
концентрации Са2' под действием медиаторов воспаления при-
водит также к изменению их собственной структуры.
В частности, изменяется форма клеток: последние стано-
вятся короче и выше, чем прежде. Причин этого, по крайней ме-
ре, две. Во-первых, в эндотелиоцитах тоже имеются сократи-
тельные элементы, и ионы Са2' способствуют их взаимодей-
ствию. Во вторых, соответствующим образом реорганизуется
цитоскелет.
В результате между эндотелиоцитами появляются проме-
жутки, отчего проницаемость эндотелия для компонентов
плазмы крови (в т. ч. белков) значительно возрастает. —
В очаге воспаления развивается отек.
В более тяжелых случаях происходит и повреждение эндо-
телиоцитов активно контактирующими с ними клетками кро-
ви вплоть до отслойки или лизиса.
3) Наконец, осталось сказать о том, что же приводит к ми-
грации лейкоцитов. Видимо, «быстрые» (гистамин, тромбин)
и «медленные» (ИЛ-1) медиаторы воспаления достигают этого
эффекта разными способами.
а) Гистамин и тромбин быстро увеличивают адгезив-
ность эндотелия — за счет появления на его поверхности до-
полнительных адгезивных молекул. Главной такой молеку-
лой считают трипептид формил Мет-Лей-Фен, или FMLP.
Часто его обозначают также как ФАТ (фактор активации
тромбоцитов).
В обычных условиях он отсутствует на поверхности эндоте-
лия, и аффинность последнего к лейкоцитам очень низкая. По-
явившись же на эндотелиоцитах, FMLP играет двоякую роль:
не только «улавливает» нейтрофильные лейкоциты, но и вызы-
вает их активацию.
Активация состоит, в частности, в том, что у нейтрофилов
тоже начинает меняться состав поверхностных белков, и это
еще более усиливает взаимодействие с эндотелием.
б) Медленное же влияние интерлейкина-1 на эндотелио
циты приводит к синтезу в них другого интерлейкина — ИЛ-8.
276
Глава 4
Последний, в отличие от FMLP, не остается на поверхности кле-
ток, а секретируется во внешнюю среду.
Здесь он тоже вызывает активацию нейтрофилов — увели-
чение содержания в их плазмолемме сильноадгезивных белков
(интегринов). В результате достигается аналогичный эффект
(усиление взаимодействия нейтрофилов с эндотелием), но как
бы «с другой стороны».
Однако состав адгезивных молекул эндотелиоцитов тоже не
остается фиксированным после первоначального изменения (по-
явления среди них трипептида FMLP). Подобно тому, что мы ви-
дели в случае миграции лимфоцитов (п. 4.3.2.2), здесь происхо-
дит последовательная смена поверхностных молекул.
Во-первых, в месте проникновения нейтрофила эта смена
вначале усиливает, а затем ослабляет (чтобы нейтрофил мог
проникнуть через стенку сосуда) взаимодействие клеток.
Во вторых, в целом в очаге воспаления через несколько ча-
сов у эндотелия снижается сродство к нейтрофилам, но зато по-
вышается сродство к другим лейкоцитам — в частности, к моно-
цитам и лимфоцитам. Соответственно, меняется состав мигри-
рующих клеток.
Таким образом, все основные события воспаления (сосудистая
реакция и миграция лейкоцитов) действительно развиваются бла-
годаря воздействию медиаторов воспаления на эндотелиоциты.
4.3.3.3. Миграция лейкоцитов: адгезивные
взаимодействия
Уточним, какие конкретно вещества участвуют при воспа-
лении в адгезивных взаимодействиях эндотелиоцитов с лейко-
цитами. Пока было названо лишь одно из них — трипептид
FMLP, появляющийся на поверхности эндотелия после его ак-
тивации. Называя другие вещества, целесообразно разбить про-
цесс миграции лейкоцитов на стадии. При этом многое будет на-
поминать механизм миграции лимфоцитов.
1) Так, вновь можно выделить подготовительную ста-
дию. Кровоток становится медленным (из-за расширения сосу-
дов) и турбулентным (из-за изменения формы или даже повреж-
дения эндотелиоцитов).
Вследствие этого опять развивается эффект «катящихся»
клеток — в т. ч. «катящихся» нейтрофилов.
2) Первичная слабая адгезия. В случае хоминга Т-клеток
первичная адгезия обеспечивалась взаимодействиями
(п. 4.3.2.2):
РМОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
277
Т-клетки Эндотелиоциты венул лимфатических органов
L-селектин — Специф. гликопротеины (Гль),
Специф.
гликопроте- — Е-селектин.
ины (ГлЕ)
При начальной ясе адгезии нейтрофилов в зоне воспаления
имеют место следующие взаимодействия:
Нейтрофилы
L-селектин
Специф.глико-
протеины (Глр )
G-белок
Активированные эндотелиоциты
Специф. гликопротеины (Гль),
Р-селектин,
Трипептид FMLP.
Налицо, по крайней мере, два отличия. Во-первых, на этой
стадии на эндотелии отсутствует сосудистый адрессин, специ-
фический для лимфоцитов, — Е-селектин. И поэтому лимфоци-
ты в миграции пока не участвуют. Во-вторых, на эндотелии име-
ется мощный «уловитель» нейтрофилов трипептид FMLP.
Его партнером в плазмолемме нейтрофилов служит белок, отно-
сящийся к группе т. н. G-белков.
Кроме того, приходится заключить, что без последнего
взаимодействия одни L- и Р селектины не были бы способны
обеспечить достаточно эффективную первоначальную адгезию
(тогда как хоминг Т-клеток определяется лишь селектинами).
3) Усиление адгезии. Как мы уже знаем, трипептид FMLP
одновременно активирует нейтрофилы, что приводит к измене-
нию состава их поверхностных белков.
Особенно важны изменения, касающиеся интегринов. Не-
стимулированные нейтрофилы уже содержат интегрины подсе-
мейства Р2. Одна часть их находится в плазмолемме, другая —
в гранулах нейтрофилов.
Напомним (п. 4.3.1.2), что к Р2-интегринам относятся лишь
три белка; обозначения же последних весьма громоздки, напри
мер CDlla/CD 18 (данный белок обозначают также LFA-1).
Так вот, при активации нейтрофилов адгезивная способ-
ность поверхностных р2-интегринов резко повышается. Очевид-
но, причиной этого являются какие-то изменения их конформа
ции. Несколько позже значительно возрастает количество
Р2-интегринов в мембране — за счет запаса, содержавшегося
в гранулах.
278
Глава 4
В результате устанавливается новый тип взаимодействия,
значительно усиливающий адгезию:
Активированные Активированные
нейтрофилы эндотелиоциты
Р2-Интегрин — Ig-подобные белки (ICAM).
Со стороны эндотелия партнером Р2-интегринов являются
(как это обычно бывает для любых интегринов) Ig-подобные бел-
ки. Причем среди них — в основном, те же иммунонеспецифиче-
ские белки (ICAM-1 и ICAM-2), что участвуют во взаимодей-
ствии с интегринами лимфоцитов (п. 4.3.2.2).
Наряду с вовлечением в адгезию интегринов из нее посте-
пенно выводятся селектины. Вначале это относится к L-селекти-
ну нейтрофилов: его молекулы, находящиеся на поверхности
клеток, теряют свои лектиновые домены, что обозначают как
«слущивание L-селектинов». Несколько позже происходит
т. н. «интернализация» Р-селектина — перемещение молекул
с поверхности внутрь эндотелиоцитов. Все это опять напомина-
ет хоминг лимфоцитов.
Правда, вместо Р-селектина на эндотелии появляется Е-се-
лектин, который участвует во взаимодействии с нейтрофилами,
а затем, вероятно, и с лимфоцитами.
Остальные стадии перемещения нейтрофилов через сосуди-
стую стенку, видимо, не содержат принципиально новых мо-
ментов. В частности, для преодоления базальной мембраны то-
же (как и в случае лимфоцитов) используются протеазы. По не-
которым данным, источником последних являются не мигри-
рующие клетки, а эндотелиоциты.
Через несколько часов на поверхности эндотелиоцитов ока-
зываются другие адгезивные белки. Так, считают, что для ми-
грации моноцитов и лимфоцитов имеет значение следующее
взаимодействие:
Моноциты Эндотелиоциты
РгИнтегрины (VLA-4) — Ig-подобные белки (VCAM).
Как видно, со стороны эндотелия здесь фигурирует уже
другой Ig-подобный белок — не серии ICAM (как при адгезии
нейтрофилов), a VCAM. Именно он начинает преобладать на по-
верхности эндотелиоцитов.
рМОМЕМБРАИЫ: структура и участие...
279
Таким образом, при очевидном сходстве основных принци-
пиальных моментов миграция каждого типа лейкоцитов обеспе-
чивается специфическими белками.
4.3.4. Иммунные реакции
Третий пример, который мы рассмотрим для иллюстрации
роли адгезивных взаимодействий, — иммунные реакции. Вооб-
ще говоря, это чрезвычайно сложные процессы; к тому же пред-
ставления о них достаточно противоречивы и далеки от исчер-
пывающей ясности.
Поэтому, прежде чем обратиться к адгезивным взаимодей-
ствиям в иммунных реакциях, необходимо сообщить некоторые
предварительные сведения.
4.3.4 1 Антигены
Инициатором иммунных процессов являются антигены.
Это, как правило, чужеродные белки, полисахариды, пептиды
(содержащие не менее 8 остатков аминокислот). Они могут при-
сутствовать как в растворимом виде, так и на поверхности «ча-
стиц» — вирусов, бактерий, различных клеток (обычно чуже-
родных или опухолевых). Антигены, связанные с «частицами»,
часто называют корпускулярными.
Принципиально важно, что иммунную реакцию могут вы-
звать и растворимые, и корпускулярные антигены. Но меха-
низм реакции при этом может различаться, о чем будет сказа-
но ниже.
Известны еще т. н. неполные антигены, или гаптены — чу-
жеродные ДНК, липиды, различные низкомолекулярные орга-
нические соединения. Они вызывают специфическую иммун-
ную реакцию только после соединения с крупномолекулярными
веществами (неантигенами) — белками, полисахаридами и т. д.
Кроме данного подразделения антигенов (на полные и не-
полные, растворимые и корпускулярные), они различаются —
и это является самым существенным — по своей иммуноспеци
фичности. В случае растворимых антигенов это означает, что
к антигенам с разной иммуноспецифичностью образуются раз-
ные антитела (иммуноглобулины; см. рис. 4.25,А), а в случае
корпускулярных антигенов — то, что в реакции участвуют Т-
клетки с разными рецепторами TCR (см. рис. 4.25,Б).
Чем определяется иммунная специфичность? — Как прави-
ло, не всей молекулой антигена (особенно если она достаточно
крупна), а лишь отдельной ее частью (например, олигопепти-
280
Глава 4
дным или олигосахаридным фрагментом) т. н. антигенной де-
терминантой.
При этом один антиген может иметь несколько антигенных
детерминант. Тогда, попадая в организм, он (если это раствори-
мый антиген) вызывает образование нескольких антител.
В случае же микроорганизмов на поверхности находится
много разных антигенов и, соответственно, еще больше раз
ных антигенных детерминант. Поэтому при бактериальной
инфекции в крови возрастает содержание сразу большого чи-
сла антител.
4.3.4.2. Антигены ГКГ-1 и клеточная иммунная
реакция
Итак, термин «антиген» чаще всего означает чужеродное
вещество, способное вызвать иммунную реакцию. Однако иног-
да в него вкладывают и несколько более широкий смысл, обоз-
начая как «антигены» и такие собственные белки организма,
которые вызывают иммунную реакцию или участвуют в тако-
вой при определенных условиях.
Это, в частности, относится к очень важной группе мем-
бранных гликопротеинов, за которыми закрепилось название
«антигены главного комплекса гистосовместимости» (со-
кращенно «антигены ГКГ», или М НС-антигены — от англ.
Major Нistocompatibllity Complex).
Заметим: собственно же ГКГ (главный комплекс гистосов-
местимости) - совокупность генов, кодирующих данные глико-
протеины. Таким образом, не надо путать гены ГКГ (соответ
ствующие участки хромосом) и антигены ГКГ (мембранные гли-
копротеины).
Антигены ГКГ подразделяются на два класса — I и II.
Антигены ГКГ класса 1 содержатся на поверхности практи
чески любой ядросодержащей соматической клетки организма.
Всего в этом наборе, по разным оценкам, от нескольких десят-
ков до нескольких сотен разных гликопротеинов. И, видимо,
весь набор представлен на поверхности каждой клетки, вклю
чая -500 000 молекул и составляя -1 % белков плазмолеммы.
В молекуле антигена ГКГ-1 — две разных полипептидные цепи:
тяжелая (с массой 44 000 Да) и легкая (11 000 Да).
Гены, кодирующие эти белки, локализуются в 6-й хромосо-
ме. Главное же состоит в том, что существует много аллелей
каждого гена ГКГ-1. Поэтому клетки разных людей различают-
ся по набору антигенов ГКГ-1.
£ИОМЕМБРАНЫ: структура и участие. .
281
Следовательно, именно совокупность антигенов ГКГ-1 —
тот критерий, по которому иммунная система организма опреде-
ляет, «своя» клетка или «чужая».
Клетка распознается как «чужая» в следующих случаях:
- если это клетка трансплантата (исключая пересадки
между однояйцевыми близнецами);
- если это собственная клетка, подвергнувшаяся малигни-
зации (опухолевому перерождению);
е сли с одним из антигенов ГКГ-1 связался вирус (при этом
«лицо» клетки тоже оказывается «искаженным»);
если это клетка крупного микроорганизма — например,
патогенного гриба.
1) Во всех перечисленных случаях клетка атакуется спе-
циальными лимфоцитами-киллерами («убийцами»; рис. 4.28).
Среди последних есть
- иммуноспецифические (Т киллеры — одна из популяций
Т-клеток; по типичному поверхностному белку — CD8*-
клетки) и
иммунонеспецифические (NK-клетки, или «натураль-
ные киллеры»).
Т-киллеры подразделяются на клоны по специфичности
своих TCR (рецепторов).
282
Глава 4
I. Обычно принято считать, что с помощью TCR Т-киллеры
узнают «чужие» антигенные детерминанты (в составе ГКГ-I) на
поверхности вышеперечисленных клеток. Но тогда требовалось
бы слишком большое множество разных TCR (и, соответствен-
но, клонов Т-киллеров), каковое, исходя из структуры TCR,
вряд ли может существовать. (Более детально это обсуждается
в п. 6.2.5.3.)
II. Поэтому, с нашей точки зрения, дело могло бы обстоять
несколько иначе. Суть гипотезы в том, что
— каждый вид TCR у Т киллеров настроен на узнавание
определенного антигена ГКГI;
— причем, в случае «правильного» состояния этого ан-
тигена Т киллер остается невозбужденным;
- активация же Т-киллера развивается тогда, когда он
не может отыскать на поверхности «инспектируемой»
клетки «свой» неизмененный антиген ГКГ I.
В таком случае Т-киллеры с их TCR действуют по принци-
пу реакции на неузнавание: активируются не тогда, когда узна-
ют определенный антиген, а тогда, когда не могут его узнать.
III. Можно было бы представить еще одну возможность: Т-
киллеры распознают не конкретные антигенные детерминанты,
а лишь их типы. Но тогда велика возможность того, что тип
собственного и чужеродного ГКГ I окажется одинаковым.
Так что вариант II кажется горавдо более надежным, а пото-
му и более предпочтительным.
Что касается NK-клеток, то они все одинаковы и настроены
на узнавание некоторых белков (обычно появляющихся на по-
верхности опухолевых клеток либо, по второй версии, исчезаю-
щих с поверхности клеток при их малигнизации).
2) Итак, контактируя с клеткой мишенью и, возможно,
не обнаруживая «своего» антигена ГКГ-I, Т-киллеры активиру-
ются. Это значит, что они подвергаются бласттрансформа
ции: превращаются в Т-иммунобласты, которые интенсивно де-
лятся в Т-зонах периферических лимфоидных органов.
3) Новые Т-киллеры (или NK клетки, которые активны
и без первичного контакта), атакуя «чужеродные» клетки, вы-
деляют белок перфорин, образующий в мембране клеток-мише-
ней гидрофильные каналы.
Через эти каналы в клетку проникают специальные протеа-
зы — т. н. гранзимы, разрушающие внутриклеточные белки.
Кроме того, в клетку могут проходить низкомолекулярные соеди
нения и вода, что способствует развитию осмотического шока.
Параллельно действует еще один механизм: на многих
клетках-мишенях имеется поверхностный белок Fas, а на Т-
РМОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
283
киллерах — его контрагент: Fas-лиганд. Их взаимодействие за-
пускает в клетках-мишенях механизм «самоубийства», т. е.
апоптоза (раздел 6.2).
Весь этот процесс (описанный под пп. 1 -3) обозначается как
клеточная иммунная реакция.
4.3.4 3. Антигены ГКГ-II и гуморальная иммунная
реакция
В отличие от предыдущих гликопротеинов, антигены ГКГ
класса II имеются на поверхности не всех, а лишь некоторых ви-
дов клеток. Это т. н. антигенпредставляющие клетки — В-
лимфоциты, макрофаги (и их специализированные разновид-
ности), некоторые эпителиальные клетки слизистых оболочек,
тимуса и, возможно, эндотелиоциты сосудов.
С участием данных клеток и расположенных на них антиге-
нов ГКГ-II развивается гуморальная иммунная реакция. Ее вы-
зывают:
— растворимые антигены,
достаточно мелкие корпускулярные агенты — бактерии,
органеллы (особенно лизосомы) при их введении в орга-
низм в изолированном виде и т. д.
В ходе гуморальной иммунной реакции происходят следую-
щие основные события (рис. 4.29).
1а) При самом первом попадании антигена в организм им-
мунная реакция начинается с его специфического взаимодей-
ствия с поверхностными Ig В-клеток соответствующих клонов.
Если же антиген попадает в организм повторно, то он мо-
жет связываться с уже имеющимися антителами против него
(содержащимися в секретах, крови, тканевой жидкости). Такие
комплексы, в свою очередь, взаимодействуют с Ес-рецепторами
(т. е. рецепторами к константной части Ig) на поверхности мак
рофагов и других антигенпредставляющих клеток.
б) В том и другом случае антиген (как растворимый, так
и корпускулярный) подвергается фагоцитозу соответствующей
клеткой и затем — предварительной переработке. При этом он
фрагментируется — видимо, до состояния антигенных детерми-
нант, т. е. фактически превращается в гаптен.
в) Затем продукты переработки выводятся на поверхность
клетки и соединяются с теми или иными антигенами ГКГ-II, об-
разуя с ними комплексы. Таким образом, реализуются два «тех-
нологических» принципа:
- с помощью антигенов ГКГ-II части исходного антигена
опять превращаются в полные антигены, но «стандарт-
ного» образца;
284
Глава 4
Рис. 4.29. Стадии гуморальной иммун»<™
(при леей ичном контакте с антигеном)
Нммъ нонвспецифические адгезивные взаимодействия не показаны
РИОМЕМБРАНЫ: структура и участие. .
285
— причем эти новые, «стандартные» антигены всегда явля-
ются «корпускулярными», поскольку связаны с поверх-
ностью антигенпредставляющей клетки.
Второе обстоятельство сближает механизм гуморальной
и клеточной реакций.
2а) И в самом деле, на следующем этапе «стандартный
корпускулярный антиген» (обозначим его аббревиатурой
СКА) опознается специализированным видом Т-клеток (подоб-
но тому, как в клеточной реакции антиген ГКГ-I распознается Т-
киллерами). Только теперь соответствующие Т-клетки являют-
ся хелперами («помощниками», или, по характерному поверх-
ностному белку, — СО4*-клетками). Но они тоже подразделя-
ются на клоны по иммуноспецифичности своих TCR.
В отношении того, в чем состоит эта специфичность, опять-
таки ясности нет. Вновь (как и в случае Т-киллеров; п. 4.3.4 2)
возможны три варианта.
I. Обычная точка зрения по-прежнему заключается в том,
что TCR Т хелпера настроен на определенную антигенную детер
минанту (связанную с ГКГ-И, т. е. находящуюся в составе СКА).
И по-прежнему возникает трудность, связанная с относительно
простым строением TCR, которое не позволяет получить достаточ-
но большое множество рецепторов с различной специфичностью.
II. Второй вариант — радикальная гипотеза о реакции на
неузнавание: Т-хелпер настроен не на некий чужеродный пеп-
тид, а на свободный от него антиген ГКГ II, и активируется, ког-
да не может узнать этот антиген.
Но тогда трудно объяснить некоторые события (в частно-
сти, т. н. отрицательную селекцию), которые происходят в про-
цессе Т-лимфопоэза (подробней об этом в п. 6.2.5.4).
III. Поэтому в данном случае, по нашему мнению, предпоч-
тительней третье предположение:
- Т хелперы с помощью своих TCR, действительно, на-
строены на узнавание чужеродных пептидов в составе СКА,
— но имеют не абсолютную, а относительную специфич-
ность, из-за чего узнают не конкретные пептиды, а лишь их
какие-то типовые черты.
Иными словами, один и тот же Т-хелпер может активиро-
ваться не единственным пептидом, а любым пептидом, принад-
лежащим к некоторому структурному типу (и, естественно, на-
ходящимся в составе СКА).
Чем же тогда обеспечивается высокая специфичность гумо-
ральной иммунной реакции? — Исключительно В-лимфоцита-
ми с их более сложно устроенными Ig-подобными рецепторами
(см. рис. 4.25,А). Но это чуть впереди.
286
Глава 4
Пока же, согласно последней версии (III), происходит от
носительно иммуноспецифическое взаимодействие антиген
представляющих клеток (несущих СКА) и Т-хелперов (несущих
соответствующие TCR).
б) Такое взаимодействие приводит к активации Т-хелпе-
ров: они подвергаются бласттрансформации в Т зонах пери-
ферических лимфоидных органов, и дочерние клетки приобре-
тают способность с новой «энергией» атаковать тот же СКА.
Как видно, и то и другое вновь напоминает реакцию Т-кил-
леров. В чем же отличие Т-хелперов?
За) Оно состоит в конечном результате «атаки». Когда акти-
вированный Т-хелпер встречает В-лимфоцит с тем же СКА, ко-
торый вызвал активацию, он (Т-хелпер), в свою очередь, вызы-
вает активацию этого В лимфоцита (а не лизис, как при атаке
Т-киллером клетки-мишени).
Причем напомним: В-клетки взаимодействуют с антигена-
ми гораздо специфичней, чем Т клетки. Поэтому, несмотря на
относительно невысокую специфичность активированного Т-
хелпера, его стимулирующий сигнал достигает только той В-
клетки, которая связала и переработала вполне конкретный ан-
тиген (а не множество антигенов некоего типа).
б) Активация В-клеток, как обычно, проявляется бласт-
трансформацией и активным размножением клеток; только те-
перь последнее происходит в реактивных зонах лимфатических
узелков периферических лимфоидных органов. (Одновременно
часть клеток погибает; раздел 6.2). Дочерние клетки вступают на
путь дифференцировки в плазматические клетки.
Таким образом, относительно иммуноспецифическое
взаимодействие неактивного Т-хелпера с В-клеткой (или
иной антигенпредставляющей клеткой) ведет к его (Т-хелпе-
ра) активации, а такое же взаимодействие активного Т хел-
пера с В-клеткой вызывает активацию последней — с образо-
ванием плазмалоцитов.
4а) Плазмалоциты накапливаются в мозговых тяжах лим-
фоузлов и в селезеночных тяжах; некоторые из них выходят
в кровь и мигрируют в соединительную ткань органов.
б) При любой локализации они продуцируют специфические
антитела (иммуноглобулины; см. рис. 4.25,А) против антиген-
ных детерминант исходного антигена, вызвавшего реакцию.
Итак, в данном случае основным «оружием» против антиге-
на являются растворимые антитела, и поэтому вся эта сложная
иммунная реакция называется гуморальной, хотя в ней уча-
ствуют, как и в первом случае, клетки (причем даже более раз-
нообразные).
PI/IOMEM БРАНЫ: структурам участие...
287
5) И как действует это «оружие»? — Вариантов несколько.
а) Один нам уже знаком: комплексы антиген-антитело мо-
гут связываться с Ес-рецепторами на поверхности макрофагов
и нейтрофилов с последующим фагоцитозом
б) Другой вариант реализуется в случае корпускулярных
антигенов — например, бактерий. Наличие на их поверхности
антител инициирует связывание и поочередную активацию бел-
ков системы комплемента.
В этой системе — около 20 белков плазмы крови, большин-
ство из которых представляет собой неактивные в норме протеа-
зы. Активация же системы происходит по каскадному механиз-
му. Причем последние ее компоненты формируют в мембране
атакуемой клетки ионные каналы. В итоге клетка погибает от
осмотического шока — еще одно частичное сходство с клеточ-
ной иммунной реакцией. Как видно, природа, в отличие от чело-
вечества, не слишком «утруждала» себя поисками все новых
способов убийства.
4. 3.4 4. Адгезивные взаимодействия в гуморальной
иммунной реакции
Итак, в гуморальной реакции непосредственное межкле-
точное взаимодействие происходит, по крайней мере, дважды:
- при активации Т-хелпера антигенпредставляющей клет-
кой и
- при активации Т-хелпером В-лимфоцита со «стандарт-
ным корпускулярным антигеном» (СКА) на поверхности.
В каждом из этих случаев имеет место не только иммуно-
специфическое взаимодействие (CKA-TCR), но и иммунонеспе-
цифическое — с помощью многочисленных адгезивных моле-
кул. Второй вид взаимодействия необходим для образования
между клетками устойчивой связи.
Какие же адгезивные молекулы участвуют в данных про-
цессах? В кратком виде это показано в табл. 4.3,А-Б. Видно, что
в обоих случаях много общего.
Так, вначале происходит иммунокеспецифическое взаимо-
действие клеток с помощью Ig-подобного белка и Р2 интегрина.
Оно является достаточно слабым, и, если не подкрепляется
вскоре тлмуноспецифическим взаимодействием (CKA-TCR),
клетки легко расходятся безо всяких последствий.
Если же СКА и TCR комплементарны друг другу, то запу-
скается механизм усиления адгезии и активации одной из
клеток:
288
Глава 4
Таблица 4.3,А. Активация Т хелпера макрофагом
НЕАКТИВНЫЙ Т-ХЕЛПЕР МАКРОФАГ
1) Первичное слабое взаимодействие LFA-1 (02 -интегрин) ICAM 1 (Ig-под. белок)
2) Иммуноспецифиче ское взаимодействие TCR (Ig-под. белок) CD3 и CD4 (Ig- подобные белки) СКА (антиген ГКГ-II + антигенная детерминанта)
3) Усиление адгезии LFA 1 (повышение - сродства к ICAM-1) CD2 (Ig-под. белок) - ICAM 1 _ LFA-3 (Ig-под. белок)
4) Секреция цитокинов ИЛ-2 1 Бласттрансформация — ИЛ-1 (интерлейкин-1)
Таблица 4.3,Б. Активация В-клетки Т-хелпером
АКТИВНЫЙ Т-ХЕЛПЕР В КЛЕТКА
1) Первичное слабое взаимодействие LFA-1 ICAM-1
2) Иммуно- специфическое взаимодействие TCR СКА
3) Усиление адгезии LFA-1 (повышение - сродства к ICAM 1) CD2 ICAM-1 LFA-3
4)Секреция цитокинов ИЛ-2 i ИЛ 4,’ИЛ 5 • ИЛ-1(?) - Бласттрансформация
- повышается взаимное сродство уже взаимодействующих
адгезивных белков (ИКАМ 1-ЛФА 1);
- на поверхности клеток появляются (или демаскируются)
другие адгезивные молекулы — в основном, Ig подобные;
РМОМЕМБРАНЫ. структура и участие...
289
- клетки в определенной очередности начинают секретиро-
вать интерлейкины, один из которых и вызывает бласт-
трансформацию либо самой секретирующей его клетки
(см. активацию Т-хелпера), либо клетки-партнера (см.
активацию В-лимфоцита).
В то же время между рассматриваемыми клеточными взаи-
модействиями имеются и некоторые различия.
а) При активации Т-хелпера иммуноспецифическое взаи-
модействие (CKA-TCR) подкрепляется с его (Т-хелпера) стороны
еще двумя адгезивными белками — CD3 и CD4.
Причем последний белок (CD4), специфичный только для
Т-хелперов, весьма примечателен: именно с ним первично свя-
зывается вирус СПИДа. После чего данный вирус проникает
внутрь Т-хелперов, размножается с помощью обратной тран-
скриптазы (п. 2.8.1.1) и в конечном счете разрушает клетки. По-
этому фактически блокируются все гуморальные иммунные ре-
акции, что и проявляется как Синдром Приобретенного Имму
ноДефицита (т. е. СПИД).
6) Другое отличие представленных в табл. 4.3,А-Б процес-
сов состоит в том, что бласттрансформацию вызывают разные
интерлейкины.
Так, при активации Т-хелперов это ИЛ-2, который выделя-
ется самими же этими клетками под влиянием ИЛ 1 — продук-
та антигенпредставляющей клетки. Стимуляция клетки про-
дуктом своей же секреции называется аутокринной.
В случае же В-клеток имеет место гетерокринная стимуля-
ция: она вызывается продуктами секреции клетки-партнера
(т. е. активного Т хелпера). К этим продуктам относятся:
- ИЛ-4 (индуцирует бласттрансформацию) и
- ИЛ-5 (стимулирует в проплазмалоцитах и самих плазма-
лоцитах синтез и секрецию первичных антител, каковые
являются иммуноглобулинами класса М).
Таковы наиболее важные моменты рассматриваемых меж-
клеточных взаимодействий. Вместе с тем отметим, что на самом
деле в этих взаимодействиях участвует не менее полутора десят-
ков различных адгезивных белков, т. е. существенно больше,
чем показано в табл. 4.3.А-Б.
Еще одно замечание. Выше мы описывали два типа других
межклеточных взаимодействий — Т-клетка-эндотелиоцит
(п. 4.3.2.2) и нейтрофил-эндотелиоцит (п. 4.3.3.3). Изложенная
там информация кратко суммирована в табл. 4 4
Если сопоставить эту таблицу с предыдущими (табл. 4.3,А-
Б), то детального сходства мы не обнаружим.
10-36
290
Глава 4
Таблица 4 4 Адгезивные взаимодействия в процессе
прохождении клеток через эндотелий
Т-клетка—эндотелиоцит (при хоминге Т-клеток) Нейтрофил—эндотелиоцит (при воспалении)
1) Первичное слабое взаи модействие L-селектин- Гликопротеин Гликопротеин -Е селектин L-селектин-Гликопротеин Гликопротеин -Р-селектин G-белок три пептид FMP
2) Усиление адгезии CD31 — CD31 (Ig- подобный.) Р1-и р2- —Ig-подобные интегрины белки (VLA-4, (VCAM-1 LFA-1) ICAM-1 и 2) Р2- — Ig-подобные интегри белки ны (LFA- (ICAM 1 и 2) 1 и др.)
3) Выделение цитокинов Цитокины (из взаимодействующих и окружающих клеток) 1 Переход от одной стадии к другой ИЛ-8 (из эндотелиоцитов) 1 Активация нейтрофилов
Например, при контакте лейкоцитов с эндотелием в пер-
вичном взаимодействии участвуют селектины, тогда как инте-
грины обеспечивают дальнейшую более сильную адгезию. В им-
мунных же реакциях интегрины вступают во взаимодействие
(считающееся слабым) уже с самого начала. И так далее.
Следовательно, механизм адгезии одних и тех же клеток
(например, Т лимфоцитов) с разными клетками-партнерами
в значительной степени зависит от природы этих партне.ров.
Но есть и общие моменты.
а) Во-первых, взаимодействие распадается на несколько
стадий, где протекание предыдущей инициирует начало сле-
дующей стадии.
б) Во-вторых, в разных взаимодействиях нередко участву-
ют одни и те же адгезивные белки. Например, во всех рассмо-
тренных выше случаях среди реагирующих белков мы встреча-
ем пару LFA-1 -ICAM 1.
в) В-третьих, в ходе взаимодействия одна из клеток (или сра-
зу обе) выделяет биологически активные вещества, которые:
либо служат триггерными сигналами, вызывающими пе-
реход от одной стадии процесса к последующей;
БИОМЕМБРАНЫ: структура и участие...
291
- либо индуцируют конечный эффект взаимодействия (на-
пример, бласттрансформацию).
Посмотрим, распространяются ли эти общие черты также
на клеточную иммунную реакцию.
4.3.4.5. Адгезивные взаимодействия в клеточной
иммунной реакции (идущей с участием NK клеток)
В клеточной иммунной реакции (описанной в п. 4.3.4.2)
ключевую роль играют клетки киллеры, среди которых нам из-
вестны Т киллеры и иммунонеспецифические NK-клетки. Пер-
вые активируются лишь после контакта с «чужеродной» клет-
кой и последующей бласттрансформации; вторые же активны
независимо от того, были или нет подобные контакты.
Здесь мы остановимся лишь на тех адгезивных взаимодей-
ствиях, в которых участвуют NK-клетки. Краткая сводка этих
процессов дана в табл. 4.5.
а) Как видно, общая схема взаимодействия остается такой
же, что и прежде.
1) Вначале происходит первичная слабая адгезия клеток.
2) Благодаря ей становится возможным распознавание
NK-киллером (правда, неизвестно, каким именно из его белков)
определенных антигенов главного комплекса гистосовместимо-
сти (ГКГ) класса I.
Таблица 4.5. Атака NK-клетками клетки-мишени
NK-КЛЕТКА КЛЕТКА-МИШЕНЬ
1) Первичное взаимодействие CD2 (Ig-под. белок) LFA-3 (Ig-под. белок)
2) Распознавание «чужеродных» клеток ? - Антиген ГКГ I
3) Усиление адгезии LFA-1 (Р2 интегрин) ICAM 1 и 2 (Ig-под. белки) ICAM 1 и 2 (Ig-под. белки) LFA-1 (Р2 интегрин)
И так далее — ещё около 10 взаимодействий
4) Реакция NK-клеток Выделение перфорина из NK-гранул Лизис клетки-мишени
292
Глава 4
3) И если это распознавание дает «положительный» ре-
зультат (NK-клетка находит один из антигенов, против которых
она настроена), то, как и при гуморальной реакции, запускается
механизм усиления адгезии и активации одной из клеток —
в данном случае NK-клетки.
б) Среди же адгезивных белков мы вновь видим наших ста-
рых «знакомых» — пару LFA-1-ICAM 1(2), да еще в обоих соче-
таниях: каждый из данных белков присутствует на поверхности
как NK киллера, так и его «мишени».
Не раз встречалась выше (см. табл. 4.3,А Б) и пара CD2-
LFA 3.
В то же время в адгезии участвует также ряд специфиче-
ских именно для данного взаимодействия белков (в таблицу они
не включены).
в) Наконец, вновь, по крайней мере, одна из взаимодей-
ствующих клеток выделяет биологически активные вещества.
А именно: из активированной NK клетки высвобождается пер-
форин, вызывающий лизис клетки-мишени.
В итоге получается, что сделанные в п. 4.3.4.4 выводы (от-
носительно общих и частных моментов межклеточной адгезии)
остаются в силе и здесь.
4.3.5. Межклеточные контакты
4.3.5.1 Введение
Кроме рассмотренных выше временных адгезивных взаи-
модействий, клетки могут образовывать друг с другом или с вне-
клеточными структурами относительно постоянные контакты.
Наиболее характерный пример — клетки эпителия: они ле-
жат в виде пласта, который практически не содержит межкле-
точных промежутков и примыкает к базальной мембране. Це-
лостность пласта обеспечивается тем, что, во-первых, между со-
седними клетками имеется целый ряд различных контактов,
а во-вторых, клетки базального слоя образуют контакты и с ба
зальной мембраной.
Можно привести множество других примеров. Это связь
между:
- кардиомиоцитами в миокарде,
- клетками паренхиматозных органов (печени, желез
ит. д.),
- нервными клетками (имеются в виду синапсы).
рИОМЕМБРАНЫ. структура и участие.
293
- развивающимися половыми клетками и окружающими
их соматическими клетками.
Во всех этих случаях ключевую роль в формообразовании
ткани или органа играют межклеточные контакты.
В то же время постоянство этих контактов в определенной
степени относительно. Например, в многослойном эпителии
клетки постепенно оттесняются новыми генерациями эпителио-
цитов в вышележащие слои. При этом вначале пропадает их
связь с базальной мембраной, а в самом конце — и друг с другом.
Во многом похожая картина наблюдается при созревании муж-
ских половых клеток в семенных канальцах: здесь постепенно
меняются контакты сперматогеннных клеток с поддерживаю
щими их клетками Сертоли.
Тем не менее, межклеточные контакты имеют качественно
иной уровень прочности по сравнению с временными адгезив-
ными взаимодействиями.
Но и этом случае (т. е. при образовании специализирован-
ных контактов) решающую роль играют мембранные белки,
многие из которых можно тоже считать адгезивными.
По своим функциональным свойствам межклеточные кон-
такты (рис. 4.30) подразделяются следующим образом:
1) Контакты простого типа:
а) простые межклеточные соединения и
Рис. 4,31. Мвжклот. :чни>
* «Т «ГПЦГК 'Ю.С. 4vHU у)
Нум раци.1 - как в текст
б) интердигитации.
2) Контакты сцепляющего типа:
а) десмосомы,
б) адгезивный поясок.
3) Контакты запирающего типа:
плотное соединение (запираю-
щая зона, или zona occludens).
4) Контакты коммуникацион-
ного типа:
а) щелевидные соединения
(нексусы, или gap-junctions),
б) синапсы.
Контакты первых двух групп
необходимы для сцепления клеток
друг с другом, и, как следует из назва-
ния, в большей степени эту функцию
выполняют контакты второй группы.
Роль контактов запирающего ти-
па — полное разграничение сред, ле-
жащих по разные стороны клеточно-
го пласта.
294
Глава 4
И, наконец, контакты коммуникационного типа позволяют
клеткам обмениваться веществами (нексусы) или сигналами
(синапсы).
Что же представляют собой все эти контакты?
4.3.5.2 Контакты простого, сцепляющего
и запирающего типов
1а) Простое межклеточное соединение (рис. 4.31). Этот
контакт более всего напоминает те адгезивные взаимодействия,
которые были рассмотрены выше. Действительно, здесь нет ни-
каких дополнительных структур: клетки просто сближаются
друг с другом до расстояния 15-20 нм и взаимодействуют адге-
зивными молекулами своих плазмолемм.
Наиболее важны в этом плане кадгерины. Причем, как уже
отмечалось в п. 4.3.1.5, клетки разных тканей имеют на своей
поверхности разные кадгерины: в случае эпителиоцитов это
кадгерины подсемейств Е и Р, в случае же нервной и мышечных
тканей — кадгерины подсемейства N.
Благодаря этому, в процессе гисто- и органогенеза клетки
одного типа (например, эпителиоциты) узнают друг друга
и объединяются в надклеточную структуру (например, эпители-
альный пласт).
Позднее контакт простого типа усиливается за счет вовле-
чения во взаимодействие и интегринов.
р;ИОМЕМБРАНЫ: структура и участие..
295
16) Интердигитация, или пальцевидное соединение (см.
рис. 4.30, 16). Здесь плазмолеммы двух клеток, сопровождая
друг друга, инвагинируют в цитоплазму вначале одной, а затем
соседней клетки.
В остальном же организация контакта — такая же, как
в случае простого соединения.
Интердигитации встречаются в разных тканях. В частно-
сти, это один из трех видов контактов между кардиомиоцитами.
2а) Десмосома (рис. 4.32,A-В). Представляет собой не-
большое округлое образование, построенное с участием обеих
контактирующих плазмолемм.
Здесь к внутренней (цитоплазматической) стороне каждой
плазмолеммы прилежит слой, образованный белком десмопяа-
кином. От этого слоя в цитоплазму отходит пучок промежуточ-
ных филаментов, участвующих в образовании цитоскелета.
Природа промежуточных филаментов зависит от типа клеток.
В эпителии они образованы белком кератином, в мышечной
ткани — белком десмином, в клетках мезенхимного происхож-
дения — белком виментином, и т. д.
Десмосома
11ромежу точные
филаменты
< ЛОЙ
Слой
десмо! леиня деемоплакина
г —
{ Рис. 4.32. Д^смосомы
(поЮ.С. Ченцову)
» — положение десмосом в
онтвлиольных клетка* -
Ч структура десмосомы
— злвкт^. нила микрокрото-
!иафилде<; «сомы
296
Глава 4
Что же касается наружной стороны плазмолемм, то, во-пер-
вых, пространство между ними в области десмосомы несколько
расширено (по сравнению с простым контактом).
Во-вторых, данное пространство заполнено утолщенным
гликокаликсом, который пронизан сцепляющими белками ___
десмоглеинами. Последние — это интегральные белки с адге-
зивной. функцией. Простираясь от плазмолемм обеих клеток,
десмоглеины своими концевыми доменами крепко сцепляются
друг с другом.
На электронной микрофотографии они воспринимаются
вначале (возле плазмолемм) как фибриллоподобные структуры,
а затем (в центре межмембранного пространства) — как диско-
видная пластинка, параллельная плазмолеммам.
Если клетка лежит на базальной мембране, то связь между
ними (клеткой и мембраной) осуществляется с помощью полу
десмосом. Это значит, что со стороны клетки присутствуют все
элементы десмосомы, включая дисковидную пластинку, образо-
ванную концевыми доменами десмоглеинов. Но теперь эта пла-
стинка прикреплена непосредственно к базальной мембране.
Одна эпителиальная клетка может участвовать в образова-
нии нескольких сотен десмосом и полудесмосом. Кроме эпите-
лия, десмосомы используются для скрепления друг с другом
клеток в сердечной и гладкой мышечных тканях.
26) Адгезивный поясок (рис. 4.33,А В). Данный контакт
имеет вид двойных лент, расположенных между контактирую-
Рис. 4.13. Адгезивный ги>яС'Ч1(п4 Ю.С. Чснц-^у)
А эпити.-ли uv.HM клегк 6 и В структура п^яск»
pi/ЮМ ЕМ Б РАНЫ: структура и участие..
297
щими клетками. Встречается в однослойных эпителиях, где
каждая клетка контактирует с четырьмя другими такими же
клетками (не считая базальной мембраны). Поэтому при разъе-
динении «ленто получаются как бы пояски, окружающие каж-
дую клетку и расположенные в апикальной ее части.
По структуре же адгезивный поясок похож на десмосому,
но образован другими белками:
- к внутренней стороны плазмолемм прилежит слой не дес-
моплакина, а винкулина;
- от него в цитоплазму отходят не промежуточные, а тон-
кие филаменты, образованные актином;
плазмолеммы друг с другом сцепляются с помощью не
десмоглеинов, а других интегральных адгезивных бел-
ков, которые называются линкерными (Впрочем, по-
следний термин применим и к десмоглеинам десмосом.)
3) Плотное соединение, или zona occludens (рис. 4.34).
Данное соединение также образуется с помощью интегральных
адгезивных белков. Но внешние части последних практически
не выступают над поверхностью плазмолеммы. Поэтому плаз-
молеммы контактирующих клеток практически вплотную
прилегают друг к другу (тогда как в десмосомах и адгезивном
пояске расстояние между плазмолеммами даже увеличено по
сравнению с соседними участками).
Плотные соединения, как и адгезивные пояски, встречают-
298
Глава 4
ся в однослойных эпителиях; кроме того, они могут находиться
в эндотелии сосудов. Другое сходство с адгезивными поясками
состоит в том, что они тоже опоясывают соответствующие клет-
ки в виде поясков. Однако эти пояски представляют собой не
сплошные ленты, & ячеистые сети, в ячейках которых плотные
соединения отсутствуют.
Но поскольку «сеть» является непрерывной, то с ее помо-
щью достигается надежное разграничение компартментов, ле-
жащих с базальной и с апикальной сторон эпителия.
4.3.5.3 Контакты коммуникационного типа
Нексусы, щелевидные соединения, или gap junctions
(рис. 4.35,а-г). Принципиально иное строение, по сравнению
с предыдущими контактами, имеют нексусы.
В области нексуса плазмолеммы соседних клеток сближены
на расстояние 2 3 нм и пронизаны большим количеством полых
трубочек, выполняющих роль каналов. Каждая такая трубочка
состоит из двух половин — коннексонов. Коннексон пронизыва
ет мембрану лишь одной клетки и выступает в межклеточную
щель на 1 1,5 нм, где стыкуется со вторым коннексоном.
Сам коннексон образован шестью белковыми субъединица-
ми цилиндрической формы, длиной по 7-8 нм. А его состояние
регулируется ионами Са'*. При повышении их внутриклеточ-
ной концентрации просвет канала уменьшается вплоть до пол-
ного закрытия (см. рис. 4.35,г). Это происходит путем некоторо-
го поворота субъединиц относительно друг друга, в результате
чего они укладываются более компактно.
Напомним, что и другие каналы — натриевые (п. 4.2.2.3)
и катионные в холинореактивных синапсах (п. 4.2.2.4) — тоже
закрываются при высокой концентрации ионов Са'2 (правда,
не внутри, а вне клеток). Так что данный феномен лежит в русле
общей закономерности.
При низкой же концентрации Са2' щелевые контакты от-
крыты, и через них из клетки в клетку могут диффундировать
все полярные вещества массой до 1000 Да. Сюда относятся неор-
ганические ионы и большинство низкомолекулярных органиче-
ских соединений сахара, аминокислоты, промежуточные
продукты их метаболизма.
Нексусы весьма распространены. В частности, наряду с дес-
мосомами и интердигитациями, они находятся между кардио-
миоцитами. Это облегчает быстрое распространение возбужде-
ния в сердечной мышце. Причем, как следует из вышеизложен-
ного, на высоте сокращения кардиомиоцитов (когда в сарко-
РМОМЕМБРАНЫ: структура и участие...299
плазме высока концентрация ионов Саг‘) щелевые контакты
закрываются.
Другой пример — нексусы в сперматогенном «эпителии»
между клетками Сертоли. Благодаря им достигается синхрон-
ность развития сперматогенных клеток, которые, как по кон-
вейеру, продвигаются по клеткам Сертоли в сторону просвета се-
менного канальца. (Синхронности развития способствует и то
обстоятельство, что между самими сперматогенными клетка-
ми — потомками одной стволовой клетки — сохраняются цито-
плазматические мостики.)
По некоторым данным, нексусы имеются также между
клетками хрусталика глаза. Здесь с их помощью происходит пи-
тание клеток, удаленных от кровеносных сосудов.
Сближение
плазм ол ем м
в области
нексуса
а) Электронная
микрофотография
б) ( хема:
структура нексуса
к'оннек-
сои
T'i’t. 4.35. Нексусы (щелевые контакты)
300
Глава 4
На этом мы заканчиваем рассмотрение мембранных белков,
осуществляющих непосредственное межклеточное взаимодей-
ствие. Причем, что касается белков коннексонов, то по своей
функциональной роли они могут быть отнесены не только к дан-
ным, но и к транспортным белкам.
Теперь, в соответствии с классификацией, приведенной
в п. 4 1.3.1, нам следует обратиться к четвертой, последней
функциональной группе мембранных белков, а именно к бел-
кам, участвующим в передаче сигналов в клетку. Чтобы понять
их функционирование, надо рассмотреть и целый ряд сопут-
ствующих вопросов — природу сигнальных молекул и сложные
цепочки регуляторных влияний, составной частью которых яв-
ляются белки мембран
Поэтому весь этот комплекс вопросов вынесен в отдельную,
следующую главу.
Там же мы коснемся работы и некоторых синапсов (см. так-
же пп. 4.2.2.4 и 4.2.3.2), которые, хотя формально и относятся
к контактам коммуникационного типа, служат ни для чего ино-
го, как для передачи сигналов.
Литература к главе 4
Билич Г. Л , Катииас Г С., Назарова Л В Цитология. СПб.: Де-
ан, 1999, 112 с.
Дамбииова С А., Каменская М. А. Молекулярные механизмы пе-
редачи импульса в мембранах нейронов. Ионные каналы. В кн.: Нейро
химия (под ред. И. П.Ашмарина и П. В.Стукалова). М.: НИИБМХ,
1996. С. 246-295.
КаменскаяМ. А. Синаптическая передача. Медиаторы. В кн.: Ней
рохимия (под ред. И. П.Ашмарина и П. В.Стукалова). М.: НИИБМХ,
1996. С. 207-245.
Мушкамбаров Н Н. Аналитическая биохимия. М.: Экспедитор,
1996. Т. 1-3. 1300 с.
Пальцев М. А., Иванов А. А Межклеточные взаимодействия.
М.: Медицина, 1995, 224 с.
Страиер Л. Биохимия. М : Мир, 1985, Т. 1 и 3.
Уайт А. и др. Основы, биохимии. М.: Мир, 1982, Т. 1-2, С. 1 1152.
Ченцов Ю. С. Учение о клетке (основы общей цитологии). В кн.:
Гистология (под ред. Ю. И. Афанасьева и Н. А. Юрииой). М.: Медици-
на, 1999, С. 42-93.
Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология. М.:
НИИБМХ, 1999, 372 с.
Глава 5. ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО
СИГНАЛА В КЛЕТКУ.
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ МЕДИАТОРЫ
5 1. ВВЕДЕНИЕ
Проблема, которую нам предстоит обсудить в этой главе,
чрезвычайно обширна.
Еще относительно недавно список межклеточных сигналь-
ных веществ ограничивался гормонами крупных эндокринных
желез и двумя-тремя нейромедиаторами. Но постепенно выяс-
нилось, что
а) есть также немало одиночных эндокринных клеток (в эпи-
телии желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей, в дру-
гих органах), и они секретируют весьма разнообразные гормоны;
б) количество нейромедиаторов (т. е. веществ, осущест-
вляющих передачу сигнала в синапсах) далеко выходит за пре-
делы одного и даже двух десятков;
в) «обычные» (неэндокринные по своей основной функции)
клетки тоже выделяют многочисленные биологически актив-
ные вещества (т. н. гистогормоны), влияющие на состояние
окружающих клеток (с чем мы уже сталкивались в главе 4 при
обсуждении воспаления и иммунных процессов)
Для всего этого множества сигнальных молекул в клетках-
мишенях имеются, как правило, высокоспецифичные рецепто-
ры — либо на поверхности плазмолеммы (для полярных ве-
ществ), либо в цитозоле или ядре клетки (для неполярных моле-
кул, способных диффундировать через мембраны).
Мало того, чуть ли не в каждом случае оказывается, что для
сигнального вещества есть не один, а сразу несколько видов ре-
цепторов (как, например в случае холинорецепторов,
п. 4.2.2.4) — с разными ответами на один и тот же сигнал.
И, наконец, самое сложное — это внутриклеточные процес-
сы, следующие за связыванием сигнальной молекулы с клеточ-
ным рецептором. Выяснилось, что чаще всего в эти процессы во-
влечены т. н. внутриклеточные медиаторы - вещества, проводя-
щие сигнал от плазмолеммы к специальным регуляторным бел-
кам, воздействующим на ферменты метаболизма или на гены (че-
рез посредство транскрипционных факторов, раздел 2.4.2).
Первый из обнаруженных внутриклеточных медиаторов —
Циклический АМФ (цАМФ), ставший в свое время молекулой-
сенсацией. В настоящее же время перечень веществ с аналогич-
302
Глава 5
ной функцией стремительно растет. Простагландины (производ-
ные арахидоновой кислоты), цГМФ, ионы Са2 , инозитфосфати-
ды, оксид азота (NO), Ras-белок — вот далеко не полный список
веществ, имевших «громкий успех» в научном мире в связи с
выявлением их регуляторных свойств. И каждый раз после пер-
вых публикаций следовал мощный взрыв интереса к очередно-
му регулятору: им начинали заниматься в сотнях лабораторий
всего мира.
Заметим попутно: в подобных исследованиях рождается не-
мало информационного «шума». Типичная ситуация — берется
какое-либо доступное вещество биологической природы (как
еще один кандидат в регуляторы), и начинается изучение его
влияния абсолютно на все и вся. Можно не сомневаться, влия-
ние почти обязательно будет: на какие-то параметры — отрица-
тельное, на какие-то — положительное. На 10-20 или пусть да-
же на 50% . После чего все это подробнейшим образом во всех де-
талях описывается и столь же тщательно обсуждается.
Примерно так же несколько десятков лет назад исследова-
лось влияние витаминов, и точно так же оказывалось, что любой
витамин влияет на все. Пока не выяснилась строго определен-
ная коферментная функция каждого витамина. Из чего следова-
ло, что остальные «влияния» являются вторичными, неспеци-
фическими или вовсе артефактными.
Таким образом, обсуждая проблему вторичных медиаторов
(вторичных мессенджеров), следует постараться исключить по-
добный «шум», количество которого лавинообразно нарастает.
Но и после такого исключения картина внутриклеточных
регуляторных процессов, запускаемых внешним сигналом,
представляется весьма сложной и к тому же далекой от заверше-
ния. Прослеживается некая аналогия с метаболическими путя-
ми. К 50-м годам XX века была, в основном, выяснена общая
схема метаболизма, включающая сотни путей и тысячи соста-
вляющих их реакций. В настоящее время происходит «расши-
фровка» регуляторных цепочек. И создается впечатление (выра-
жавшееся уже в п. 2.4.2), что в конце концов они сложатся в та-
кую же обширную и столь же логичную систему, как и система
метаболизма.
Пока же известны лишь отдельные и в немалой степени раз-
розненные звенья этой регуляторной системы. О них и будет ид-
ти речь во второй половине данной главы.
Начнем же с краткой характеристики межклеточных сиг-
нальных молекул.
ПЕРЕДАЧА внешнего сигнала в клетку
303
5 2 МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ СИГНАЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА
Как следует из вводных замечаний, все межклеточные сиг-
нальные вещества можно разделить на три группы:
а) гормоны — регуляторы, образуемые эндокринными
клетками и попадающие к клеткам-мишеням через кровь;
б) нейромедиаторы — соединения, передающие сигнал в
синапсах от пресинаптического окончания к постсинаптиче-
ской мембране;
в) гистогормоны (т. н. цитокины и факторы роста)
регуляторы, выделяемые неэндокринными клетками во вне-
сосудистое пространство и обладающие поэтому местным дей-
ствием.
В ряде случаев грань между этими группами почти стирает-
ся; так, одно и то же вещество может принадлежать сразу двум
или даже трем группам. Простейший пример — гистамин: он
является и гормоном некоторых одиночных эндокринных кле-
ток, и нейромедиатором в ряде отделов головного мозга, а так-
же вполне подходит под определение гистогормонов, когда вы-
деляется тучными клетками (тканевыми базофилами) при во-
спалении (п. 4.3.2.2).
Кроме того, не всегда можно четко отделить внеклеточные
сигнальные молекулы от вторичных внутриклеточных медиато-
ров. В частности, это относится к простагландинам и NO (см.
рис. 4.27) — веществам, способным диффундировать через мем-
браны. С одной стороны, они образуются в соответствующих
клетках в ответ на внешний сигнал и, как вторичные мессен-
джеры, способны влиять на некоторые процессы внутри тех же
клеток. С другой стороны, они могут выходить из клетки и, как
гистогормоны, воздействовать на окружающие клетки (прони-
кая через их плазмолемму).
Таким образом, используя общепринятое подразделение
сигнальных веществ, надо понимать его определенную услов-
ность. После этого замечания обратимся к перечисленным клас-
сам веществ.
5.2.1. Гормоны
5.2.1 1 Место образования и биологическое действие
Все гормонпродуцирующие структуры делятся на четыре типа:
1) центральные эндокринные органы—
а) гипоталамус, б) гипофиз, в) эпифиз;
304
Глава 5
2) периферические эндокринные железы—
а) щитовидная, б) паращитовидные,
в) надпочечники (содержащие, по существу, две желе-
зы — в виде коркового и мозгового вещества);
3) органы, объединяющие эндокринные и неэндокринные
функции—
а) поджелудочная железа, б) почки1,
в) тимус1, г) гонады,
д) плацента, е) сердце1;
4) одиночные гормонпродуцирующие клетки (составляю
щие диффузную эндокринную систему) —
эндокринные клетки в разных отделах нервной, пище-
варительной и дыхательной систем.
Теперь, в соответствии с этой классификацией, дадим в
табличной форме перечень гормонов с указанием их структуры
и основного биологического действия (табл. 5.1-5.4).
1) Центральные эндокринные органы
Таблица 5.1,А. Гормоны гипоталамуса
Г ормоны Химичес- кая природа Действие
Адено- гипофи- зотроп ные гормоны2 Либерииы: тиролибернн, гонадол ибери н, кортиколибе- рин, соматолиберин Пептиды (тиролибе- рин- три пептид, гонадоли- берин — декапептид и т.д.) а) Попадая в аденогипофиз через его «чудесную сеть», стимулируют (либерины) или тормозят (статины) выработку соответствую- щих гормонов. б) Оказывают также разно- образные другие влия- ния— на эмоции, поведе- ние, соматические функ ции
Статины: соматостатин, меланостатин
Нейро- гормоны (попада- ют в кровь через заднюю долю ги- пофиза) АДГ (антидиу- ретический гормон), или вазопрессин Цикличе- ские нонапеп- тиды (т.е. содержат по 9 аминокис- лотных ос- татков) а) Усиливает реабсорб- цию воды в канальцах почек и б) вызывает сокращение гладких миоцитов в сосу- дах сердца и лёгких
Окситоцин Стимулирует сокраще- ние а) миометрия, б) миоэпителиальных клеток молочных желёз, в) миоцитов семявынося- щих путей
‘Почки, тимус и сердце обычно не рассматривают как органы, объединяю-
щие неэндокринные и эндокринные функции. Тем не менее, они вырабатывают
ряд гормоноподобных веществ (табл. 5.3.Б, В и Е).
хЛиберины и статины образуются также в других отделах мозга (табл. 5.8).
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
305
Таблица 5.1,Б. Гормоны гипофиза
Г ормоны Химическая природа Действие
Передняя доля гипофиза: гонадо- тропные гормоны ФСГ (фолликуло- стимулирующий гормон) Белки с мол. массой -30.000 Да, содержат а- и р- субъединицы Стимулирует а) в яичниках — рост фолликулов, б) в семенниках — рост семенных канальцев и сперматогенез
ЛГ или ИКСГ (лютеинизи- рующий или интерстициаль- ные клетки стимулирующий гормон) Стимулирует а) в яичниках — окон- чательное созревание одного из фолликулов и секрецию эстрогенов; б) в семенниках — се- крецию тестостерона
лтг (лактотропный или лютеотропиый гормон, пролактин) Белок с мол. массой 23.500 Да Стимулирует а) выработку прогесте- рона жёлтым телом яичиика, б) секрецию молочных желёз
Передняя доля гипофиза: негонадо- тропные гормоны ттг (тиреотропный гормон) Белок: 28300 Да, 2 субъединицы Стимулирует образова- ние и секрецию гормо- нов щитовидной желе зы (тироксина и др.)
АКТГ (адренокортико- тропный гормон) Полипептид: 39 аминокис- лотных остатков Стимулирует образова- ние гормонов в двух зо- нах коры надпочечни- ков: а) в пучковой зоне гликокортикоидов, б) в сетчатой зоне — ан- дрогенов
стг (соматотропный гормон) Белок с мол. массой 21.000 Да Стимулирует рост тела (или его частей) за счёт усиления а) синтеза белков и б) распада жиров
Промежу- точная доля3 МСГ (меланоцито- стимулирующий гормон) Полипептид; 2 формы: а- 13 ост. АК, р - 22 ост. АК Стимулирует в мелано- цитах образование ме- ланина (но не вызывает образования новых ме- ланоцитов)
Липотропин Полипептид Стимулирует освобож- дение жирных кислот из депо
* Ее гормоны, видимо, вначале образуются в нейронах ЦНС в виде единого по-
ли пептидного предшественника. Причем при его последующем расщеплении на
Фрагменты высвобождаются не только МСГ и липотропин, но и несколько эндор
фи нов — пептидов с морфиноподобным действием.
306
Глава 5
В задней доле гипофиза гормоны не синтезируются: здесь
лишь происходит поступление в кровь нейрогормонов, образо-
ванных в гипоталамусе, — АДГ и окситоцина (табл. 5.1,А).
Таблица 5.1,В. Гормоны эпифиза (шишковидной железы)
Гормоны Химическая природа Действие
Анти- гоиадотроп- ные гормоны (выделяются в темноте) Мелатонин Производное амино- кислоты триптофана Угнетает продукцию го- надолиберина в гипотала- мусе (отчего ночью в ги- пофизе тормозится выра- ботка ФСГ, ЛГ и ЛТГ)
Антигонад о- тропин Пептид Угнетает продукцию Л Г в гипофизе
Другие «гормоны гормонов» (в определён- ное время суток) Тиролибе- рии, гонадоли- берин и др. Пептиды Как и такие же гормоны гипоталамуса (табл. 5.1 А), стимулируют образование в аденогипофизе соответ- ствующих гормонов
ТГГ и др. Белки Как н такие же гормоны гипофиза (табл. 5.1,Б), стимулируют соответст- вующие периферические железы
Калитропин Белок Приводит к повышению содержания ионов К в крови
При нечание. Из таблицы следует, что,
- во-первых, функция эпифиза зависит от внешней освещенности
(за счет связи со зрительным трактом; поэтому эпифиз иног-
да называют «третьим глазом»);
во-вторых, сам эпифиз определяет ( путем циклической продукции
соответствующих гормонов) суточные и иные ритмы работы
других эндокринных желез, а через них — и подчиненных органов.
2) Периферические эндокринные железы
Таблица 5.2,А Гормоны щитовидной и паращитовидных желез
Гормоны Химическая природа Действие
Щито- видная железа Тироксин (тетраиод тиронин)и его предшест- венники — трииод- тиронин и др. Производ- ные аминокис- лоты тирозина а) Стимулируют синтез белков, вт.ч. тканеспецифических, что обеспечи- вает процессы роста и развития. б) Ускоряют процессы образования энергии в мито-хондриях и ее расхо- дования — вплоть до разобщения (при высоком содержании гормонов) окисления веществ и фосфорилиро вания (синтеза АТФ)
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ 307
Таблица 5.2,А. (Продолжение)
Гормоны Химическая природа Действие
Щито видная железа Кальцито- нин Полипеп- тид: 3600 Да, 32 остатка АК Снижает содержание кальция в крови, уменьшая его всасывание в ЖКТ и увеличивая поступле- ние в кости и мочу
Паря щито- видные железы Паратгор- мон (паратирин) Белок: 9500 Да, 84 остатка АК Повышает содержание кальция в крови, усиливая его поступление из а) ЖКТ, 6) костей (за счет резорбции костно- го вещества остеокластами) и в) пер- вичной мочи (в почках)
Примечание. Кальцитонин, по всей видимости, образуется и в щи-
товидной, и в паращитовидных железах.
Таблица 5.2,Б. Гормоны иадпочечииков
Г ормоны Химическая природа Действие
Клу- бочко- вая зона коры Минерало- кортикоид: альдостерон Стероиды (произ- водные холесте- рина) Индуцируя в почках синтез транс- портного белка, усиливает реаб сорбцию ионов Na из первичной мочи (в обмен на ионы К и Н )
Пучко- вая зона коры Глико- кортикои- ды: кортико- стерон, кортизон, гидрокор- тизон Осуществляют приспособление к хроническому стрессу: 1) стимулируют а) распад веществ в соединитель- ной, лимфоидной, мышечной тка- нях и б) использование высвобождаю щихся аминокислот и глюкозы для обеспечения деятельности моз- га и сердца (при этом концентра- ция глюкозы в крови возрастает); 2) повышают чувствительность сердца и сосудов к адреналину
Сет- чатая зона коры Андрогены: андростенд иол и др. (и у мужчин, и у женщин) Стимулируют 1) метаболические процессы: а) мобилизацию жира из депо и б) синтез белков в мышцах и др. тканях; 2) развитие вторичных муж- ских половых признаков
Мозго- вое веще- ство Катехол- амины: адреналин, норадре- налин Производ- ные аминокис- лоты тирозина Обеспечивают приспособление к острому стрессу: 1) попадая в кровоток, вызыва- ют эффекты, сходные с действием симпатической нервной системы; 2) стимулируют распад углево- дов и жиров для энергообеспечения интенсивной мышечной работы
308
Глава S
3) Органы, объединяющие эндокринные и неэндокринные
функции
Таблица 5.3,А Гормоны поджелудочной железы
Гормоны Химическая природа Действие
Гормоны, влияющие на обмен углеводов н липидов Инсулин Белок, 5700 Да, две поли- пептидные цепи, всего — 51 остаток АК Обеспечивает усвоение тканями питательных веществ после приё- ма пищи: а) облегчает проникновение в ткани (из крови) глюкозы, амино- кислот, жирных кислот; б) стимулирует превращение их в гликоген, белки и жиры. При этом, в частности, снижается концентрация глюкозы в крови
Глюкагон Полипептид: 29 остатков АК Мобилизует из тканей питатель- ные вещества (углеводы и жиры) между приемами пищи. Концен- трация глюкозы в крови повыша- ется
Гормоны, влияющие на функцию самой поджелудочной железы (помимо других действий) Сомато- статин Циклический пептид,14 остатков АК Образуется также в гипоталамусе (табл. 5.1,А), слизистой желудка и кишечника. Угнетает выработку ряда гормонов: а) в гипофизе — СТГ, б) в поджелудочной железе — инсулина и глюкагона, в) в слизистой ЖКТ — гастри- нов и секретина (где последний стимулирует экзокринную часть поджелудочной железы). Поэтому, в частности, тормозятся оба отдела поджелудочной желе- зы — и эндокринный, и экзокрин- ный
ВИП (вазоак тивный интести- нальный полипеп- тид) Полипептид: 28 остатков АК 1) Антагонист соматостатина по влиянию на поджелудочную же- лезу: стимулирует выделение ею сока и гормонов. 2) Кроме того, расширяя сосу- ды, снижает артериальное давле- ние
пп (панкреа- тический полипеп- тид) Полипептид: 36 остатков АК Стимулирует выделение не толь ко панкреатического, но и желу- дочного сока
пРрЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
309
Таблица 5.3,Б. Гормоны почек
Гормоны Химическая природа Действие
— Эритро- поэтин Белок Стимулирует в красном костном мозгу ранние и, возможно, такжебо- лее поздние стадии эри- тропоэза
Гормоны, влияющие на кровяное давление Ренин Белок В отличие от обычных гормонов, является фер- ментом: катализирует в крови активацию аигио- теизииа — пептида, син- тезируемого печенью в неактивном виде. После активации ангиотензин а) суживает сосуды и б) стимулирует про- дукцию альдостерона в надпочечниках
Проста- гландины' Белки Синтезируемый в поч- ках вид простагланди- нов, видимо, а) расширяет сосуды и б) снижает давление
Таблица 5.3,В. Гормоны тимуса
Гормоны Химическая природа Действие
Гормоны, влияющие на созре- вание лимфоци- тов Тимопо- этииы (Т-лимфо- поэтины) Белки? Способствуют тому, что в крас- ном костном мозгу некоторые предшественники лимфопоэза превращаются в предшествен- ники Т-лимфоцитов
Гормоны, влияю щие на созрева- ние лимфо- цитов Тимозин Белок Стимулирует дальнейшее соз- ревание Т-лимфоцитов: а) миграцию пре Т клеток в тимус, б) пролиферацию Т-лимфо- бластов в тимусе и в) пролиферацию Т-имму- нобластов в периферической лимфоидной ткани
лег (лимфо- цитстимули- рующие гор- моны) Белки Увеличивают антителообра зование — возможно, за счёт стимуляции Т хелперов
'Простагландины образуются также во многих других органах.
310
Глава 5
Таблица 5.З.В. Гормоны тимуса (продолжение )
Гормоны Химическая природа Действие
Гормоны, подобные гормонам других желёз ГТГ (гомео- статический тимусный гормон, или фактор роста) Белок? Является синергистом сома- тотропного гормона гипофиза (табл. 5.1,Б), т.е. тоже спо- собствует росту тела
Инсулино- подобный фактор Белок Как и инсулин (табл. 5.3,А), приводит к снижению кон- центрации глюкозы в крови
Кальцитони- ноподобный фактор Белок Как и кальцитонин (табл. 5.2, А), понижает в крови концен- трацию ионов Са2'
Таблица 5.3,Г Гормоны гонад
Гормоны Химическая природа Действие
Семенники (яички) Андрогены: тестостерон и его производ- ные Стероиды (производ- ные холесте- рина) Вызывают а) мобилизацию жира из депо и синтез белков в мышцах; б) развитие вторичных муж- ских половых признаков
Яичники Эстрогены: эстрадиол и его метабо- литы Образуются в фолликулах яич- ника. 1) Стимулируют развитие вто- ричных женских половых приз- наков. 2) Вызывают ряд изменений в органах женщины в процессе менструального цикла, в т.ч.: а) в матке — регенерацию эндометрия, б) в молочных железах — рост протоков, в) в гипофизе — торможение продукции ФСГ
Прогестин: прогесте- рон Образуется жёлтым телом яич- ника Подготавливает соответ- ствующие органы женщины к беременности, в т.ч. вызывает: а) в матке — набухание и се- крецию эндометрия, а также по- нижение чувствительности к ок- ситоцину (сокращающему матку); б) в молочных железах — рост альвеол (концевых отделов желёз); в) в гипофизе — торможение продукции ЛГ
ПРРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
311
Таблица 5.3,Д. Гормоны плаценты
Гормоны Химическая природа Действие
Аналоги гормонов гипофиза ХТГ (хориони- ческий гонадотро- пин); ЛТГ (пролактин); АКТГ; гормон роста Белки Дополняют при беременно- сти действие соответствующих гормонов гипофиза. В частности, ХГТ попадает в большей степени в организм эм- бриона и оказывает действие, близкое к действию ФСГ и ЛГ. А плацентарный ЛТГ в первые недели беременности (пока сама плацента ещё не продуцирует по- ловые гормоны) стимулирует рост и функционирование жёлто- го тела в яичнике матери
Женские половые гормоны Эстрогены, прогесте- рон Стероиды Секреция плацентой этих гормо- нов компенсирует тот факт, что при беременности яичники а) практически не продуциру- ют эстрогены и б) через определённое время не синтезируют также и проге- стерон
— Релаксин Белок, 6000 Да, две цепи, всего — 54 остатка АК. Подготавливает к родам ткани и органы жещины: вызывает а) расширение и размягчение шейки матки, б) релаксацию лонного и дру- гих тазовых сочленений, в)торможение сокращений матки
Таблица 5.3,Е. Гормоны сердца
Гормоны Химическая природа Действие
Предсерд- ные кардио- миоциты Натрий- уретический фактор типа С Белок Выделяясь в ответ на раз- дражение барорецепторов(при высоком давлении или боль- шом объеме крови), усиливает выведение иоиов Na’ и воды почками. Таким образом, является антагонистом альдостерона и АДГ
Атриопептин Глико- протеин Видимо, обладает противо- свертывающей активностью
312
Глава 5
4) Одиночные гормонпродуцирующие клетки
Таблица 5.4,А. Неиропептиды головного мозга
В головном мозге, помимо гормонов гипоталамуса (см.
табл. 5.1,А), образуется много других нейропептидов.
Большинство из них участвует в передаче сигнала в синап-
сах, т. е. выступает в качестве нейромедиаторов или ко ней-
ромедиаторов. В последнем случае имеется в виду, что в од-
ном и том же нервном окончании образуется сразу несколько
разных медиаторов — как правило, один из них имеет непеп-
тидную природу, а остальные являются пептидами. В зависи-
мости от частоты и длительности импульсации, они могут вы-
деляться совместно или раздельно.
Но некоторые нейропептиды передают сигналы на рас-
стоянии — в большей или меньшей области мозга. В этом слу-
чае они функционируют, возможно, как гормоны, т. е. перено-
сятся кровью. Продуцируют их, как считают, одиночные ней-
роэндокринные клетки мозга (не образующие ядер).
Тем не менее, объектом действия и этих пептидов являют-
ся синаптические зоны нейронов-мишеней. При этом нейро-
пептиды служат модуляторами синаптической передачи, т. е.
облегчают ее или затрудняют.
Поэтому нейропептиды будут рассматриваться нами вмес-
те с нейромедиаторами (раздел 5.2.3).
Таблица 5.4.Б. Эндокринные клетки пищеварительиои системы
Гормоны Химическая природа Действие
Желудок: дно и тело Серотонин Произ- водные аминокис- лоты трипто- фана Стимулирует секреторную и двигательную активность желудка и кишечника
Мелатонин Определяет суточную перио- дичность секреции и мото- рики ЖКТ (см. также табл. 5.1,В)
Гистамин Производ- ное ами- нокислоты гистидина Особенно стимулирует секре- цию НС1 железами желудка (помимо влияния на моторику ЖКТ и тонус сосудов; см. п. 4.3.3.1).
ПРРРОАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
313
Таблица 5.4,Б. (Продолжение)
Гормоны Химич кая природа Действие
Желудок: дно и тело Бомбезин Полипеп- тид: 14 остатков АК 1) Стимулирует а) секрецию НС1 и панкреати- ческого сока, б) моторику желчного пузыря. 2) Понижает температуру тела
Желудок: пилориче- ский отдел Гастрины 4 полипеп- тида Стимулируют а) секреторную и моторную активность желудка, б) выработку основных гормо- нов поджелудочной желе- зы — инсулина и глюкагона.
Энкефалин Пептид: 5 остатков АК Является одним из эндогенных морфинов, т.е. обладает обезбо- ливающим действием
Соматостатин Полипеп- тид: 14 остатков АК Тормозит экзо- и эндокринные функции органов ЖКТ (табл. 5.3.А)
ВИП Полипеп- тид: 28 остатков АК а) Антагонист соматостатина по влиянию иа поджелудоч- ную железу. б) Расширяет сосуды (табл. 5.3,А).
Тонкая кишка: специфи- ческие гормоны Секретин Полипеп- тид: 27 остатков АК а) Тормозит выработку гастри- на в желудке. б) Стимулирует выделение панкреатического сока и желчи
Холецисто- кинин (панкреози- мин) Полипеп- тид: 33 остатка АК Стимулирует а) экзокринную функцию поджелудочной железы и б) моторику желчных путей.
Энтеро- глюкагои Полипеп- тид Как и глюкагон (табл. 5.3,А), между приёмами пищи сти- мулирует мобилизацию ре- зервных углеводов и жиров
Тонкая кишка: несиеци- фические гормоны Серотонин Соматостатин ВИП См. выше (гормоны желудка)
314
Глава 5
Приведенный перечень нельзя считать исчерпывающим,
поскольку:
а) во-первых, известны и другие гормоны желудочно-ки-
шечного тракта (мотилин и т. д.);
б) во-вторых, одиночные эндокринные клетки имеются так-
же в других органах, не вошедших в представленный список
(например, в эпителии воздухоносных путей);
в) в-третьих, продолжается выявление новых гормональ-
ных продуктов.
Но и вышеприведенного более чем достаточно, чтобы заклю-
чить: «повседневная» деятельность большинства «рабочих» кле-
ток организма (железистых, мышечных, нервных и т. д.) неустан-
но управляется большим количеством химических «администра-
торов», каковыми являются, по существу, гормоны. Но сами эти
«администраторы» действуют, конечно, «не по своему разуме-
нию», а в соответствии с единой, эволюционно выработанной, про-
граммой, которая обеспечивает наилучшее приспособление орга-
низма к меняющимся внешним и внутренним условиям.
Удивительная многочисленность гормонов подводит нас к
трем закономерным вопросам — о том, являются ли столь же
разнообразными
а) продуцирующие их эндокринные клетки,
б) химическая природа самих гормонов и
в) принципиальные механизмы их действия?
5. 2 1.2. О принципе «одна клетка — один гормон»
В отношении первого вопроса долгое время господствовал
принцип: «одна клетка — один гормон». Имелось в виду, что
для выработки каждого гормона должна существовать своя осо-
бенная популяция эндокринных клеток.
Многие факты подтверждали этот принцип. Пример — гор-
моны эндокринной части поджелудочной железы (см. табл. 5.ЗА);
5 гормонов — и столько же видов секреторных клеток:
- глюкагон образуется в А-клетках,
- инсулин — в В-клетках,
- соматостатин — в D-клетках,
- ВИП (вазоактивный интестинальный полипептид) в
D4-клетках,
- 11П (панкреатический полипептид) — в РР-клетках.
Однако со временем стало обнаруживаться все больше и боль-
ше отклонений от принципа «одна клетка — один гормон».
В частности, оказалось, что все нейроэндокринные клетки нер-
вной системы, ряд клеток эндокринных желез и многие одиночные
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
315
гормонпродуцирующие клетки принадлежат к т. н. APUD-серии. К
ней же относятся и все пять видов эндокриноцитов поджелудочной
железы! Общей чертой клеток APUD-серии является то, что каждая
из них продуцирует одновременно специфический пептидный гор-
мон и какой-либо биогенный амин (катехоламин, серотонин, гиста
мин и т. д.) или даже несколько таких аминов.
Для образования же последних клетки поглощают и декарбок-
силируют соответствующие предшественники обычно это амино-
кислоты с циклическим радикалом: фенилаланин, тирозин, трип-
тофан, гистидин. Указанное обстоятельство и дало название серии
данных клеток: Amine Precursor Uptake & Decarboxylation (погло-
щение и декарбоксилирование предшественников аминов).
Но даже и без этих деталей ясно, что клетки APUD-серии боль-
ше отвечают такой формулировке: «один эндокриноцит — один ос-
новной гормон». Сопутствующие же биогенные амины, видимо,
играют вспомогательную роль облегчают выделение основного
гормона из клетки и поступление его в кровеносное русло.
Но и в новой формулировке принцип не всегда справедлив.
Так, передняя доля гипофиза вырабатывает 6 гормонов
(табл. 22.2.А), и, по современным представлениям, два из них —
ФСГ и ЛГ — образуются в одних и тех же клетках. Следователь-
но, на 6 гормонов получается 5 видов клеток.
Другой пример — синтез гормонов промежуточной доли
гипофиза. В сноске к табл. 5.1,Б указано, что эти гормоны (мела-
ноцитостимулирующий гормон и липотропин), по всей видимо-
сти, синтезируются вначале в нейронах мозга в виде единого по-
липептидного предшественника, и лишь затем последний расще-
пляется на указанные пептидные гормоны. Причем при этом вы-
свобождаются также и другие активные пептиды (эндорфины) —
с морфиноподобным действием. В данном случае, очевидно, ис-
точником всех этих гормонов является один вид клеток.
Таким образом, обсуждаемый принцип не является абсо
лютным: из него имеется немало исключений.
5.2.1 3. О химической природе гормонов
Обратимся ко второму из поставленных выше вопросов о
Разнообразии природы гормонов.
Внимательный просмотр табл. 5.1-5.4 приводит к заключе-
нию, что это разнообразие не столь уж и велико. Нетрудно ви-
деть, что гормоны могут являться лишь
а) белками или пептидами,
б) производными аминокислот,
в) стероидами либо (весьма редко)
316
Глава 5
г) производными полиненасыщенных жирных кислот.
От этого короткого списка можно перейти к еще более крат-
кому, если сгруппировать гормоны по их полярным свойствам.
Тогда окажется, что все они подразделяются на две неравные
группы:
I. полярные, или гидрофильные гормоны — белки, пепти-
ды и производные аминокислот (кроме тиреоидных гормонов).
II. неполярные, или гидрофобные гормоны — стероиды,
производные жирных кислот плюс тиреоидные гормоны.
Вторая группа значительно меньше первой, поэтому входя-
щие в нее гормоны легко перечислить: стероиды — это половые
гормоны и гормоны коры надпочечников, а производные жир-
ных кислот — простагландины.
Первая же группа — это все остальные гормоны из предста-
вленного в таблицах 5.1-5.4 длинного перечня.
Подразделение гормонов на гидрофильные и гидрофобные
имеет принципиальное значение: с принадлежностью гормона к
той или другой группе почти однозначно связан механизм его
действия на клетку-мишень. —
а) Гидрофильные гормоны (как уже отмечалось в
п 4.1.3.1) не способны проникать через плазмолемму, и дол-
жен существовать специальный механизм для восприятия сиг-
нала и передачи его на эффекторные структуры.
б) Гидрофобные же гормоны проходят через мембраны
клетки и обычно непосредственно достигают (в «сопровожде-
нии» специального рецепторного белка цитоплазматической
или ядерной локализации) регулируемого объекта — каковым,
как правило, являются определенные области тех или иных
хромосом.
Проиллюстрируем сказанное простейшими схемами.
5.2.1 4 Общая схема действия гидрофильных
гормонов (рис. 5.1)
Для каждого гидрофильного (полярного) гормона на по-
верхности клеток-мишеней имеются белки-рецепторы (R). Воз-
буждение рецептора гормоном ведет к изменению концентра-
ции в клетке определенного внутриклеточного медиатора
(X). Как уже упоминалось в п. 5.1, таким медиатором (вторич-
ным посредником) может быть цАМФ (циклический аденозин-
монофосфат), цГМФ оксид азота (NO), простагландины, Ras-бе-
лок и т. д.
Концентрация вторичного медиатора определяется относи-
тельной активностью ключевых ферментов его образования
ПЕРЕДАЧА внешнего сигнала в клетку
317
'Рис.
п 44;.At/ (глг.;ч Дъ.ЫкиХ)
••ормон^-е
ft - мембранны ,»<-ц« /top,
V -бел ж-ТО.шеми!I ,-р.
X — •иугрми'Л'Точный мед и а тор,
<; । и Е2 — 4- рм^иты *го Др«эовз*“«
1из прездаесниж «а np. Xi и «нал.»и- j
Нации (путём прй. Ьоиения в Y);
ПК и И£’ — проге*нкйнаэы.
U’ регулируемый f > v мент (или
структурный белок).
TF „ регулируемый транскрип-*
дионны^ фактор
(Еу) и инактивации (Е2).
Поэтому возбуждение рецеп-
тора должно сказываться на
активности одного из этих
ферментов например, пер-
вого из них. Нередко (хотя
не всегда) это достигается с
помощью специального ме
мбранного белка транс
миттера (Т), передающего
сигнал от рецептора на фер-
мент Ej или Eg-
Каким образом это про-
исходит? — Например, пу-
тем последовательного из-
менения конформаций: свя-
зывание гормона с рецепто-
ром меняет конформацию
белка Т, что, в свою очередь,
меняет конформацию фер-
мента ЕР А это и приводит к
повышению или снижению
его активности.
Внутриклеточный ме-
диатор X чаще всего влияет
на активность той или иной
протеинкиназы (ПК). На-
пример, цАМФ активирует
ПК типа А, цГМФ — ПК ти-
па G, и т. д.
Протеинкиназы — спе-
циальные регуляторные
ферменты, способные фос-
форилировать (за счет фос-
фатных групп АТФ) строго
определенные белки, при-
чем по строго определенным аминокислотным остаткам сери-
на, треонина или тирозина (все эти аминокислоты содержат в
радикале гидроксильную группу).
Напомним, что с некоторыми протеинкиназами мы уже
сталкивались:
а) в п. 2.4 2.3 речь шла о протеинкиназах транскрипцион-
ного фактора р53 (см. рис. 2.18),
318
Глава S
б) в п. 3.3.2.3 говорилось о ПК eIF-2, т. е. протеинкиназе
фактора инициации трансляции eIF-2 (см. рис. 3.14).
Фосфорилирование (и обратное ему дефосфорилирование
под действием протеинфосфатаз) — один из наиболее универ!
сальных способов регуляции активности белков — как струк-
турных, так и ферментов. Такая химическая модификация
белка меняет его конфигурацию со всеми вытекающими послед-
ствиями. В итоге в одних случаях активность белка в результа-
те фосфорилирования повышается, в других - напротив, сни-
жается.
В регуляторной цепочке нередко имеется не одна ПК (про-
теинкиназа), а каскад из двух или даже более протеинкиназ.
Первая из них (которая непосредственно активируется вторич-
ным посредником X) фосфорилирует другую ПК (ПК'), а эта вто-
рая ПК действует уже на непосредственные объекты регуляции.
В качестве последних могут быть ключевые ферменты ме-
таболизма, структурные белки (Е1), факторы транскрипции
(TF1) или трансляции. Фосфорилирование или дефосфорилиро-
вание (при снижении активности ПК1) каких-то из этих белков и
вызывает тот конечный эффект, который «требовал» от клетки
действующий на нее гормональный сигнал:
изменяется активность соответствующих фермен
тов или структурных белков,
изменяется активность соответствующих генов и
скорость синтеза ферментов или структурных белков.
Такова общая схема. Конкретные же регуляторные цепоч-
ки могут иметь те или иные отличительные черты. Примеры та-
ких конкретных цепочек мы рассмотрим во второй половине
этой главы.
5.2.1.5. Общая схема действия гидрофобных
гормонов (рис. 5.2)
Для гидрофобных (неполярных) гормонов мембранные ре-
цепторы не требуются: как уже отмечалось, эти гормоны диф-
фундируют через плазмолемму клетки-мишени. Правда, отсюда
следует, что они могут проникать и в любые другие клетки. Но в
цитоплазме (или в ядрах) клеток-мишеней содержатся специ-
фические рецепторные белки (R), связывающие соответствую-
щие гормоны. Благодаря этому, диффузия гормона в клетку-ми-
шень оказывается значительно более интенсивной, чем в прочие
клетки.
Комплекс рецептор-гормон (если он образуется в цитоплаз-
ме) проникает в клеточное ядро. Здесь он влияет на активности
ГРРРДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
319
тех или иных генов, причем
неоднозначно: активность од-
них генов может возрастать, а
других (в той же клетке) —
уменьшаться.
Из представлений о тран
скрипционных факторах (TF)
и энхансерах (п. 2.2.1.2 и
рис. 2.5) вытекает, что ком-
плекс рецептор-гормон влияет
на сродство определенных TF
к соответствующим участкам
ДНК (энхансерам). В каких-то
случаях это сродство повыша-
ется; тогда РНК-полимера за с
большей скоростью связыва-
ется с промотором регулируе-
мого гена — транскрипция (а с
ней и синтез определенного
белка) усиливается. В других
случаях, напротив, сродство
TF к энхансеру снижается —
и синтез белка тормозится.
Не исключено также, что
комплекс рецептор-гормон
( когда-то может и сам высту-
' пать в роли транскрипцион
I ного фактора.
Итак, если гидрофиль-
• ные гормоны могут влиять
как на активность ферментов (белков), так и на их синтез, то вы-
шеприведенная схема для гидрофобных гормонов предусматри-
вает влияние лишь на синтез белков, реализуемое на генном
Уровне.
Правда, это относится только к стероидным и, видимо, ти-
реоидным гормонам.
Что касается простагландинов, то они занимают как бы
промежуточное положение по механизму своего действия. По-
добно другим гидрофобным гормонам, они проникают через
плазмолемму в цитоплазму клетки-мишени. Но действуют здесь
почти по схеме гидрофильных гормонов: влияют на активность
определенных протеинкиназ — со всеми вытекающими отсюда
последствиями (среди которых изменение активности и (или)
скорости образования регулируемых белков).
*F, . г*лк.., %.*йсте«м»
нелолорных (гиц^- ф .бичах) |
ГО’ ,мюв
1 - цитонлазмотический рецйлт**,-
lipr-юнв.
Г — транскрипционный фактор,
320
Глава 5
5.2.2. Гистогормоны
5.2.2.1 Определение и классификация
Теперь обратимся к гистогормонам, или, как иногда их на-
зывают, аукоидам. Согласно данному выше определению, от
просто гормонов они отличаются тем, что:
а) вырабатываются «обычными», т. е. неэндокринными,
клетками;
б) распространяются не с кровью, а путем диффузии в меж-
клеточном пространстве;
в) и поэтому оказывают лишь местное действие — на распо-
ложенные недалеко клетки-мишени или даже на саму клетку-
продуцент.
По последнему признаку различают две ситуации:
- паракринное (или гетерокринное) действие гистогормо-
на — если он влияет на другую (нежели клетка-проду-
цент) клетку, и
- аутокринное действие когда выделившийся в меж
клеточную среду гистогормон связывается с мембранны-
ми рецепторами самой клетки-продуцента и оказывает на
последнюю соответствующее влияние.
Может быть и третья ситуация — интракринное действие:
регуляторное вещество действует на «свою» клетку (в которой
оно образовалось), не выделяясь во внешнюю среду. Но тогда
данное вещество — уже не гистогормон, а внутриклеточный
медиатор (мессенджер).
И, наконец, четвертая ситуация — когда вещество-регуля-
тор обладает одновременно и интракринным, и паракринным
действием. Она обычно встречается в том случае, если регулятор
способен диффундировать через мембраны (что относится к про-
стагландинам и NO). В этой «спорной» ситуации условимся
считать регуляторы опять-таки (как и при «чисто» паракрин-
ном действии) внутриклеточными мессенджерами. В связи с
чем названные вещества будут рассматриваться не в данном раз-
деле, а позднее.
Еще больше номенклатурных сложностей возникает при
классификации гистогормонов. Одно из используемых их по-
дразделений показано на рис. 5.3.
В соответствии с ним, все гистогормоны делятся на цито
кины и факторы роста Собственно, сочетание этих терминов
обычно и используется вместо слова «гистогормоны».
Различием между цитокинами и факторами роста изна-
чально считалась нх функциональная роль.
ПЕРЕДАЧА внешнего сигнала в клетку
321
а) Интерленкнны и ФНО (фактор
некроза опухолей)
б) Интерфероны
в) Малые цитокины
г) КСФ (колониестимулирующие
факторы)
П. ФАКТОРЫ РОСТА
5.3- Клиссификлцич гист, n i
I. Цитокины участвуют (в качестве последовательно выде-
ляемых клетками стимуляторов) в воспалительных, иммунных
и других защитных реакциях. Поэтому они вырабатываются
обычно не постоянно.
а) Одна группа цитокинов названа интерлейкинами
(ИЛ) — по той причине, что они выделяются активированными
лейкоцитами и обеспечивают взаимодействие клеток в ходе
названных процессов.
И действительно, как мы уже знаем,
- с помощью ИЛ-1 макрофаги (моноциты) активируют эн-
дотелиоциты при воспалении (п. 4.3.3.1 и рис. 4.27) и Т-
хелперы при гуморальной иммунной реакции (п. 4 3.4.4
и табл. 4.1А);
- ИЛ-2 в ходе опять-таки гуморальной иммунной реакции
аутокринным способом вызывает бласттрансформацию Т-
хелперов или образование в последних ИЛ 4 и ИЛ-5
(п. 4.3.4.4);
- ИЛ 4 стимулирует бласттрансформацию В-клеток;
ИЛ-5 стимулирует синтез IgM в образующихся из В-кле-
ток плазмоцитах (п. 4 3.4.4).
К группе интерлейкинов относят и ФНО (фактор некроза
опухолей), поскольку он усиливает многие эффекты ИЛ 1
б) Вторая группа цитокинов — интерфероны О них мы то-
же уже говорили (п. 3.3.2.3). Это небольшие сигнальные белки,
которые выделяются клетками, инфицированными вирусами.
Действуя на клетки-продуценты и на соседние клетки (особенно
если на их поверхности имеются вирусные РНК), интерфероны
ограничивают белковый синтез (путем усиления распада мРНК
и торможения трансляции). Тем самым предупреждается обра-
зование в клетках новых вирусных частиц.
Следовательно, и здесь налицо явная защитная реакция.
в) Третья группа — т. н. малые цитокины Название обу-
словлено тем, что пептидные цепи этих веществ относительно
короткие.
4-36
322
Глава 5
Здесь у нас тоже есть «знакомый»: это ИЛ-8, который об-
разуется при воспалении активированными эндотелиоцита-
ми и, в свою очередь, активирует нейтрофилы (п. 4.3.3.1 и
рис. 4 27).
Но данный пример вскрывает и первое противоречие ис-
пользуемой номенклатуры. — Оказывается, не все интерлейки
ны относятся к группе интерлейкинов! Интерлейкин-8, как ви
дим, попал совсем в другую группу.
г) Обращаясь же к четвертой группе цитокинов — КСФ (ко-
лониестимулирующим факторам), мы обнаруживаем еще одно
противоречие: КСФ — это белковые стимуляторы развития ге-
мопоэтических клеток по тому или иному направлению, что го-
раздо ближе по функции к факторам роста.
II. В самом деле, факторы роста — белки, стимулирующие
(либо ингибирующие) деление и развитие определенных клеток.
Среди данных факторов — ЭФР (эпидермальный фактор роста),
НФР (фактор роста нейронов), ФРФ (фактор роста фибробла-
стов) и др.
Так что КСФ «смотрелись» бы среди данных факторов го-
раздо естественней, чем среди цитокинов.
Но и этим не исчерпываются несовершенства номенклату-
ры гистогормонов.
Во-первых, выяснилось, что не только ИЛ-8 образуется не
лейкоцитами, а другими клетками (эндотелиоцитами), но и
«стопроцентные» интерлейкины могут вырабатываться во мно-
гих других клетках. Например, ИЛ 1 активно синтезируется в
кератиноцитах, а также в некоторых других клетках. Следова-
тельно, название «интерлейкины», основанное на источнике
этих веществ, фактически не отражает сути дела.
Во-вторых, и цитокины в целом (если даже не учитывать
КСФ) участвуют не только в воспалительных, иммунных и про-
чих защитных реакциях — их функциональная роль, видимо,
заметно шире. Так, ИЛ-1 и ФНО, среди множества оказываемых
эффектов, стимулируют пролиферацию фибробластов и даже
пролонгируют медленную фазу сна!
Конечно, и данную фазу сна можно рассматривать как за-
щитную реакцию, но при таком подходе теряется всякая опре-
деленность.
С другой стороны, среди факторов роста мы называли
ФРФ (фактор роста фибробластов), который тоже (как и ИЛ 1
и ФНО) активирует деления фибробластов. Причем это проис-
ходит в ходе регенерации — самой что ни на есть защитной ре-
акции.
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
323
5.2.2.2. Резюме
Резюмируем вышесказанное.
1) Что касается определения гистогормонов (как регуля-
торных факторов, продуцируемых неэндокринными клетками
и оказывающих местное действие — паракринное или ауто-
кринное), то тут все ясно и бесспорно.
2) Классификация же и номенклатура гистогормонов,
сложившаяся исторически, на настоящий момент представля-
ются лишь некоторыми условностями. Можно, конечно, гово-
рить о цитокинах и (отдельно) о факторах роста, но мы видели,
что четкой границы между их эффектами нет. Точно так же
условны термины «интерлейкины» и «малые цитокины».
Но, вероятно, на данном этапе наших знаний о гистогормо-
нах любая классификация будет безуспешной: вскоре после ее
создания появятся новые данные об уже известных веществах
или будут открыты новые гистогормоны, — и это разрушит всю
стройную систему.
3) Однако, кроме определения, есть еще один бесспорный
момент: все рассматриваемые здесь гистогормоны являются по
химической структуре пептидами или белками
Отсюда вытекает, что, как и истинные гормоны гидрофиль-
ной природы, они не способны диффундировать через плазмо-
лемму. И, следовательно, для каждого гистогормона на поверх
ности клеток мишеней должны иметься специфические рецеп
торы. Раздражение которых запускает сложную цепочку по-
следующих событий — примерно такую, какая в общем виде бы-
ла представлена на рис. 5.1.
Поэтому, когда мы в дальнейшем будем рассматривать раз-
ные варианты реализации данной схемы, какие-то из них дол-
жны относиться и к гистогормонам.
5.2.2.3. Некоторые интерлейкины и факторы роста
Для более конкретного знакомства с гистогормонами при
ведем (в краткой табличной форме) основные сведения о некото-
рых, выборочно взятых, интерлейкинах и факторах роста
(табл. 5.5-5.6).
Следует иметь в виду, что на самом деле известный спектр
действия каждого вещества существенно шире, чем указано в
этих таблицах. Но мы ограничились лишь наиболее важными
эффектами.
Вместе с тем, по сравнению с обычными гормонами (см.
табл. 5.1-5.4), добавлены данные о рецепторах сигнальных ве-
ществ.
324
Глава 5
Таблица 5.6. Представители интерлейкинов
Источники Гены и структура Ре ;ептор (ы) Действие
ИЛ-1 (а- и Р- формы), нлн эндоген- ный пнроген а) При воспале- нии и иммун ных реакциях— активирован- ные макрофаги (моноциты) и пр. клетки. б) Также — ин- тактные керати- ноциты и неко- торые другие эпителиальные клетки а) Гены хромосоме 2. б)ИЛ-1 — а- или р- поли- пептидная цепь, образуемая из единого предшест венника — про-ИЛ-1 (31.000 Да) На эндоте- лиоцитах, лимфоцитах, макрофагах, кератиноци- тах: р80 (80.000 Да) или р68- (68.000 Да) рецепторы. Оба — Ig-по- добные белки а) Участие в во- спалении иим- мунных реак НИЯХ. б) Повышение температуры тела. в) Многочи- сленные другие эффекты — на- рушение сна и т.д.
ФНО (а- и Р- формы): фактор некроза опухо- лей Активирован- ные макрофаги (моноциты) и Т-клетки а) Гены — в хромосоме 6 (рядом с ге- нами ГКГ; п. 4.3.4.2). 6) ФНО„ и ФНОп -поли- пептиды (-17.500 Да); они могут быть связаны с олигосаха- ридами 2 типа рецепторов (56.000 и 75.000 Да) а) Усиление многих дей- ствий ИЛ 1, в т.ч. — участие в воспалении. б) Инициация апоптоза в опу- холевых клет- ках. в) Участие в развитии шока при сепсисе
ИЛ 4 а) Стимулиро- ванные Т-хел- перы опреде- лённой субпо- пуляции (ТН2). б) Тучные клет- ки и базофилы а) Гены — хромосоме 5. в одном кластере с генами ИЛ 3, ИЛ-5, Г, М- КСФ. б) ИЛ-4 — гликопроте- ин, 20.000 Да Рецептор (белок, 140.000 Да)— на разных клетках: от 400 до 20000 моле- кул на клетку а) Бласттран- сформация ак- тивированных В- и Т-клеток. б) Торможение выработки ци- токинов воспа- ления — ИЛ-1, ФНО
ИЛ-6 Стимулирован- ные Т хелперы ИЛ-6 — полипептид Рецептор — 80.000 Да. Белок- трансмит тер — 130.000 Да (gpl30) а) Стимуляция продукции Ig плазмоцитами. б) При недоста- точности — плазмоцитар- ная дискразия
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
325
Таблица 5.6. Представители факторов роста (ФР)
Источники Гены н структура Рецептор(ы) Действие
ЭФР — эпидер- мальный ФР (в моче — уро- гастрон) а) Слюнные же- лезы. б) Также — дру гие экзо- и эндо- кринные желе- зы. в) Содержится в крови, секре- тах, моче ЭФР — полипептид, 53 АК, 6000 Да. Может находиться в комплексе с белком носителем а) 170.000 Да. Внутренний домен — тн розиикипаза. б) Сод. в эм- бриональных тканях и пролифери- рующих отде- лах эпителия а) Стимуляция деления эм- бриональных тканей и эпите- лия. б) При гиперэк- спрессии гена рецептора ЭФР возможны ней рогенные опу- холи
ТцФР — тромбо- ци- тарный ФР а) а-Гранулы тромбоцитов. 6) Макрофаги. в) Эндотелио- циты а) ТцФР гетеро- и го- мо- димеры: АВ, АА, ВВ. б) Гены: А-цепи — в хромосоме 7, В-цепи — в хромосоме 22 Гликопроте- ин, 185.000. Внешний до- мен Ig-по- добный бе- лок, внутрен- ний — тиро- зиыкиназа Стимуляция делений фибро бластов — при регенерации, фиброзе лёг- ких, атеросклерозе, миелофиброзе (в красном ко- стном мозгу)
НФР — фактор роста нейро- нов В небольших количествах образуется все- ми клетками человека а) Гены — в хромосоме 1. б) Активная форма — димер Р2. Неактивные формы содержат также субъе- диницы а и у а) 90.000 Да; ген — в хро- мосоме 17. б) Больше всего — в хо- линергиче- ских нейро- нах разви- вающегося головного мозга а) Стимуляция развития нер- вной ткани (особенно холи- нергических нейронов). б) Возможно влияние на мужскую поло- вую систему
ИПФР (I и II) — ннсу- лннопо- добные ФР (илн сомато Медины Си А) а) Широко рас пространены во многих тканях. б) В крови — содержание в 1000 раз выше, чем инсулина. в) СТГ стиму- лирует синтез ИПФР а) Гены — в хромосомах 12 (ИПФР I) и 11 (ИПФР-П). б) Полипеп- тиды. в) Обычно свя- заны с белко- выми ингиби- торами Рецептор для ИПФР-I, как и рецептор инсулина, — димер: а-субъеди- ница — свя- зывающая, р-субъеди- ница — тиро- зинкнназа а) Стимуляция делений и диф ференцировки клеток в эм- бриогенезе. б) Инсулинопо- добные эффек- ты (см. табл. 5.3.А)
326
Глава 5
Таблица 5.6 Представители факторов роста (продолжение)
Источники Гены и струк- тура Рецептор(ы) Действие
ФРФ (ФР фибро- бластов) Головной мозг, гипофиз, эндотелио- циты Обе формы - одиночные по- липептидные цепи, 17.000 25.000 Да. Для каждой це- пи - свой ген. Есть также другие формы, представляю- щие собой онкогены: ФРФ-3 (онко- ген int-2), ФРФ 4 (hst) а) Внешний домен — Ig- подобный бе- лок, внутрен- ний — тиро- зннкиназа. б) Есть также рецептор в ядре. в) Все ФРФ могут связы- ваться и с ге- парином Стимуляция де- лений клеток мезенхимально- го и нейроэкто- дермального происхожде- ния. В т.ч. — индук- ция делений фибробластов, перицитов, эн- дотелиоцитов при ангиогенезе входе регене- рации
ТФРр (1 н2)- транс- форми- рующий ФР Продуцирует- ся клетками многих тканей, в т.ч. эндоте- лиоцитами а) Полипептид, 25.000 Да. б) Секретирует ся в виде неак- тивного ком- плекса: ТФР+бе- лок+ЛАП (ла- тентно-ассо- циированный пептид). в) Активирует- ся плазмином или низким pH. г) В крови свя- зан с а2-макро- глобулином Три типа рецепторов: 65 000 96.000 и 300.000 Да а) Торможение пролиферации многих клеток, в т.ч. эндоте- лиоцитов, что приводит к за- вершению ан- гиогенеза. б) Возможны все способы действия: интракринный, аутокринный, паракринный и эндокринный
ЭТ (1, 2иЗ) — эндо- телии ы В основном, эндотелиоци- ты артерий Пептиды, со- держащие по 21 остатку А К. Кодируются разными гена- ми 2 вида рецеп торов — ЭТ-а и ЭТ Ь. Содержат по 7 трансмем- бранных до- менов а) Местное дей- ствие на клет- ки сосудов: су- жение сосудов, стимуляция митозов. б) Участие в ре- гуляции функ- ций гипотала- муса и гипофиза
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
327
5 2-3. Нейромедиаторы и нейромодуляторы
5.2.3.1. Исходные сведения
Наконец, составим сводку нейромедиаторов и нейромоду-
ляторов — последнего класса внеклеточных сигнальных ве-
ществ.
Но вначале вспомним уже известные нам сведения.
а) Согласно табл. 5.4А, нейро модуляторы — это вещества,
которые, не будучи способны самостоятельно передавать в си-
напсах сигнал (возбуждающий или тормозящий), тем не менее
влияют на передачу такового истинными медиаторами, а имен-
но облегчают или затрудняют эту передачу. В основном, подоб-
ную функцию выполняют нейропептиды головного мозга.
б) Там же упоминалось и то, что в одном синапсе может
быть несколько «полноценных» нейромедиаторов; тогда они на-
зываются ко-нейромедиаторами
в) Выделение нейромедиатора из пресинаптического окон-
чания в синаптическую щель осуществляется путем экзоцито
за; этот процесс был рассмотрен нами на примере ацетилхолина
(п. 4.2.3.2).
г) И, наконец, в п. 4.1.3.1 отмечалось, что рецепторы ней-
ромедиаторов по механизму дальнейшей передачи сигнала под-
разделяются на 2 группы. —
I. Ионотропные (быстродействующие) рецепторы слу-
жат одновременно ионными каналами, которые открываются
при связывании медиатора с рецепторной частью белка.
Добавим, что, в зависимости от природы ионных каналов,
их открытие может вести как к возбуждению постсинаптиче-
ской клетки, так и к ее торможению.
Например, н-холинорвцепторы образуют катионные кана-
лы (п. 4.2.2.4), и при открытии последних происходит деполя-
ризация (а следовательно, и возбуждение) постсинаптической
мембраны. Действительно, деполяризацию вызывает интенсив-
ный ток ионов Na в клетку по градиенту своей концентрации.
В случае же ГАМК (у-аминомасляной кислоты) рецепторы
типа А — это анионные каналы (точнее, каналы для ионов С1).
Потому их открытие приводит к току внутрь клетки отрица-
тельных ионов (тоже по градиенту концентрации), что создает
гиперполяризацию постсинаптической мембраны и означает
торможение соответствующей клетки. Аналогичным образом
обстоит дело с глицином — еще одним нейромедиатором тормоз-
ного типа.
328
Глава 5
II. Метаботропные (медленнодействующие) рецепторы:
здесь сигнал передается по той же принципиальной схеме (см.
рис. 5.1), что и в случае гидрофильных гормонов, т. е. механизм
включает внутриклеточные посредники (типа цАМФ, цГМФ и
т. п.) и завершается химической модификацией (фосфорилиро-
ванием или дефосфорилированием) определенных белков.
Если постсинаптическая клетка — нейрон, то модифици-
руемыми белками обычно служат те или иные ионные каналы.
Это приводит к их открытию или закрытию, и, в зависимости от
сочетания всех факторов (природы каналов и того, как меняется
их проницаемость), развивается эффект возбуждения или тор-
можения нейрона.
Если же речь идет о передаче сигнала на мышечные клетки
(гладкий миоцит или кардиомиоцит), то конечным объектом ре-
гуляции могут служить как Са2'-каналы (поскольку ионы Са2*
необходимы для сокращения), так и непосредственно сократи-
тельные белки.
В заключение заметим: один и тот же нейромедиатор иног-
да имеет в одних синапсах ионотропные, а в других метабо-
тропные рецепторы. Так, в частности, обстоит дело с ацетилхо-
лином (п. 4.2.2.4): н-холинорецепторы, как мы только что вспо-
минали, являются катионными каналами, а м холинорецепто
ры рецепторами метаботропного типа.
5.2.3.2. Краткая сводка нейромедиаторов
Для краткости используем табличную форму (табл. 5.7 5.9).
Таблица 5.7. Основные нейромедиаторы периферической
нервной системы
Локализация синапсов Рецепторы Эффекты
Ацетил- ХОЛИН (Низкомоле- кулярное ве щество с за рядом 1) а) Вегетативные ганглии. б) Моторные пластинки ске- летных мышц н-Холино рецепторы (иоиотроп ного типа) Возбуждение постси наптической мембраны
Постганглио- нарные оконча- ния пара- симпатической нервной систе- мы м-Холино- рецепторы (метабо- тропного типа) а) В сосудах и сердце тор- мозящий эффект: расшире- ние сосудов, замедление и ос- лабление сокращений сердца. б) В бронхах, ЖКТ, радужке стимуляция эффекторных клеток: сужение бронхов, усиление перистальтики и се- креции ЖКТ, сужение зрачка
ПЕРЕДАЧА внешнего сигнала в клетку
329
Таблица 5.7. (Продолжение)
Локализация синапсов Рецепторы Эффекты
Нор- адреналин (Производное аминокислоты тирозина) Постганглио- нарные оконча ния симпатиче- ской нервной системы Щ-, а2-> Pi иР2- адреноре- цепторы (все — метабо тропного типа) Раздражение аг и ргре- цепторов оказывает воз- буждающее действие, а раздражение а2- и р2“Ре" цепторов — тормозящее действие. Отсюда — набор симпати ческих эффектов: — усиление сокращений сердца, — сужение сосудов мышц, — расширение бронхов, — ослабление перисталь- тики кишечника, — расширение зрачков
Обычно в одном органе со- держится несколько типов адренорецепторов. При этом а-рецепторы преобладают в сосудах кожи и в сфинк- терах ЖКТ, Pj-рецепторы — в сердце, Р2-рецепторы — в бронхах, кишечнике, матке, сосудах скелетных мышц
Таблица 5.8. Непептидные нейромедиаторы центральной
нервной системы
В данном случае медиаторы обладают, как правило, либо
только возбуждающим, либо только тормозящим действием.
А. Медиаторы возбуждающего типа
Локализация нейронов Рецепторы Эффекты
Серотонин (5НТ — 5-гидро- кситриптамин) (Как о гормоне см. табл. 5.4,Б) (Производное ами нокислоты трипто- фана) В основном, это ассоциа- тивные ней- роны сенсор- ных путей в спинном моз- гу и стволе головного мозга. Их аксоны идут в под- корковые ядра, лимби- ческую си- стему и кору больших полушарий 5HTj- и 5НТ2- рецепторы (ме- таботропные). Содержатся не только на пост-, но и на преси- наптической мембране. Именно на эти рецепторы влия- ют (тем или иным способом) многие психо- тропные в-ва (галлюциноген LCD и др.). Серотонинергиче- ские нейроны уча ствуют в - сенсорном вос- приятии, - процессах сна (увеличивая его длительность), ~ терморегуляции. При гипофунк- ции некоторых из них— депрессив- ные состояния, при гипер- функции — гал- люцинации
330
Глава 5
Таблица 5.8,А. Медиаторы возбуждающего тина (продолжение)
Природа Локализация нейронов Рецепторы Эффекты
Гиста- мин (Как о гормоне см. табл. 5.4,Б) Произ- водное амино кислоты гистиди- на Туберома- миллярные ядра заднего гипоталаму- са. Аксоны отсюда идут почти во все отделы мозга Нг и Н2-рецеп- торы — постси наптические, метаботропные. Н3-рецепторы — пресинапти- ческие. Их раз- дражение гиста- мином подавля- ет экзоцитоз его новых порций Действия отчас- ти противополож- ны эффектам се- ротонина: - облегчение про- буждения ото сна, - ослабление вос- приятия боли, - снижение тем- пературы тела. Кроме того, — ряд других эф- фектов
Глута- миновая кислота (Глу) Амино- кислота Кора боль- ших полуша- рий, гиппо- камп, гипо- таламус, по- лосатое тело и пр. Аксоны фор- мируют нис- ходящие пу- ти а) NMDA-рецеп- торы (связыва ют, кроме Глу, его аналог — N- метил D-аспар- тат) — ионотро- пные (формиру- ют каналы для Na , К и Са2 ). б) не-NMDA-pe- цепторы — ме- таботропные Проведение эф- ферентной сигна- лизации. С нару- шением этого проведения свя- зывают эпилепсию, — хорею Геттинг- тона и ряд других болезне
Аспара- гиновая кислота Амино- кислота Вставочные нейроны спинного мозга Вероятно, рецепторы подобны NMDA- рецепторам глутамата Осуществление спинномозговых рефлексов
Ацетил- холин Низко- молеку- лярное вещество с зарядом +1 Базальные ядра(полоса- тое тело), таламус и пр. Аксоны идут в кору, гип- покамп и т.д. Преимуществен- но м-холиноре- цепторы (табл. 5.7) — ме- таботропного типа Участие в регуля- ции движений,за- поминании и т.д. При паркин- сонизме — гипер- активность неко торых холинерги- ческих систем мозга
ПРРЕДАЧА внешнего сигнала в КЛЕТКУ 331
Как видно из табл. 5.8,А, нейроны возбуждающего типа
содержатся и образуют синапсы во всех отделах ЦНС. Но в
целом таких нейронов в мозгу, возможно, даже меньше, чем
тормозных.
Б Медиаторы тормозного типа
Природа Локализация нейронов Рецепторы Эффекты
Дофамин Произ- водное амино- кислоты тирозина В основном, ядра средне- го мозга: чёр- ная субстан- ция и др. Аксоны идут афферент- но — к ба- зальным яд- рам, лимби ческой систе- ме, коре Dj- и D2- (основ- ные по содержа- нию), а также D3- и D4- рецепторы (все мета- ботропного типа) Регуляция слож- ных движений и участие в развитии эмоций. При гипофункции — гиперактивность базальных ядер, вызывающая пар- кинсонизм (табл. 5.8, А): повышен- ный тонус мышц и тремор. Гиперфункция — при шизофрении
Норад- реналин (в ЦНС — чаще тор- мозное, но иногда и возбуж- дающее действие) Продукт гидро- ксилиро- вания дофами- на Диффузные ядра ствола мозга: рети- кулярная формация, го- лубое пятно. Аксоны идут почти во все отделы ЦНС В основном, Р- адренорецеп- торы (табл. 5.7) — метаботроп- ного типа Регуляция настро- ения и состояния бодрствования. При дисфункции возможны маниакально- депрессивные со- стояния и симптомы ши- зофрении
ГАМК (у-амино- масля- ная кислота) Продукт декарбок силиро- вания глутами- новой кислоты -50 % всех нейронов мозга. Аксоны свя- зывают ней- роны коры, а также идут эфферентно, в т.ч. от ба- зальных ядер к чёрной суб- станции ГАМКЛ- рецепторы — ионотропные (каналы для ионов С1 ) и ГАМКВ- рецепторы — метаботроп ные Участие в - регуляции движений, - запоминании и обучении, — формирова- нии эмоций. С дисфункцией связаны проявле ния - эпилепсии, - хореи Гет- ти нгтона, паркинсониз- ма и т.д.
332
Глава 5
Таблица 5.8,Б. Медиаторы тормозного типа (продолжение)
Природа Локализация нейронов Рецепторы ’ффекты
Глицин Амино- кислота Клетки Реншоу в СПИННОМ мозгу; похожие клетки ствола мозга Рецепторы, подобно ГАМКа- рецепторам,— ионотропные (каналы для ионов С1 ) Торможение мото- нейронов спинного и продолговатого мозга. Стрихнин, бло- кируя глициновые рецепторы, вызы- вает судороги
Таурин (относит ся к ме- диаторам пока лишь ги- потетиче- ски) Произ- водное амино- кислоты цистеи- на Звёздчатые и др. тормоз- ные клетки коры моз- жечка; спин- ной мозг, та- ламус Рецепторы и их природа ещёне установлены С недоста ком таурина в пище или низкой ско- ростью его обра- зования связаны: атаксия Фри дрейха, — эпилептиче- ские припадки, — «куриная слепота»
Адено- зин, АМФ Произ- водные пурино- вых ос- нований В одних си- напсах (раз- личной лока- лизации) эти вещества вы- ступают как медиаторы, в других — как тормоз- ные модуля- торы (акти- вирующие К -каналы) Р1 рецепторы: подтипы А1 и А2; метаботропные. Блокируются кофеином и теофилином Снижение функ- ций мозга при не- достатке энергии: накапливающий- ся при этом АМФ через А1-рецепто- ры оказывает - седативное, противосудо- рожное, - гипотензив- ное и пр. дей- ствия. Кофеин вызывает противополож ные эффекты
АТФ, АФ4А (диаде но- зин- тетра- фосфат) Произ- водные пурино- вых ос- нований Локализация АТФ- ергических нейронов не установлена Р2-рецепторы: ионотропные (Са2' каналы) Стимуляция сокращений сердца, гипотензивное действие
ПРРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
333
Таблица 5.9. Пептидные нейромедиаторы
Среди огромного количества нейропептидов функцию ме-
диаторов (выделяющихся из пресинаптических окончаний) вы-
полняют очень немногие.
Во всех случаях их рецепторы относятся к метаботропному
(медленному) типу.
Природа Локализация в нервной системе Действие в качестве медиатора
юлиберин (см. также табл. 5.1,А) Пептид, 10 остатков АК Локализация в ЦНС не установлена. Также этот пептид — возбуждающий ко- медиатор в симпати- ческих ганглиях Активация полового поведения (что допол няет гормональную функцию — стимуля- цию секреции гона- дотропинов)
ВИП (вазоактив- ный инте- стиналь- ный пеп- тид) Пептид, 28 остатков АК (табл. 5.3,А) Кора больших полу- шарий. Возможно, ВИП так- же — тормозный ко- медиатор в ряде постганглионарных окончаний веге- тативной НС Расширение бронхов, - расширение сосудов, - усиление моторики и секреции ЖКТ (что во многом совпадает с гормональным дейст- вием ВИП)
Сомато- статин Цикличе- ский пеп- тид, 14 остатков АК Видимо, как и ВИП, — тормознын ко-медиатор в ряде постганглионарных окончаний (но иных, нежели ВИП) вегета- тивной НС Какие-то из тех много- численных тормозных действий, что были пе- речислены в табл. 5.3,А. Кроме то- го, — угнетение пове- денческих реакций
Вещество Р 11 остатков АК а) Возбуждающий медиатор в оконча- ниях аксонов чув- ствительных (псев- доуниполярных) нейронов. б) Тормознын ко-ме- диатор серотонина в последующих аффе- рентных путях (табл. 5.8,А) Участие в афферент- ном проведении сен- сорной информации. Также — гипотензив- ное и противострессо- вое действия
Нейро- пептид Y 36 остатков АК Видимо, — возбуж- дающий ко-медиатор норадреналина в постганглионарных окончаниях симпа тической н.с. Усиление симпатиче ских эффектов (табл. 5.7). Индукция пищедобы- вательного поведения
334
Глава 5
Первые три из перечисленных выше нейромедиаторов упо-
минались ранее в качестве гормонов. В отношении этих веществ
не всегда ясно, где кончается гормональное и где начинается ме-
диаторное действие.
Кроме того, практически все приведенные нейропептиды,
вероятно, служат не только самостоятельными медиаторами в
мозгу, но и ко-медиаторами в периферических отделах вегета-
тивной нервной системы.
5.2.3.3. Нейромодуляторы
Остальные нейропептиды выполняют функцию нейромоду-
ляторов. Причем, как уже упоминалось в п. 5.2.3.1, вещества
иной природы в данной роли практически не выступают.
Перечислить все нейропептиды-модуляторы мы не сможем:
их уже открыто более 600, и каждый год это количество возра-
стает. Поэтому ограничимся общими сведениями о них и упоми-
нанием лишь нескольких конкретных примеров.
а) Структура. Нейропептиды (включая и медиаторы) со
держат от 2 до 50-60 аминокислотных остатков. Более круп
ные полипептиды со схожей функцией относят к регулятор-
ным белкам.
Большинство нейропептидов имеет линейную структуру,
но встречаются среди них и циклические молекулы (пример —
соматостатин; см. табл. 5.9). Циклизация осуществляется пу-
тем замыкания дисульфидных связей между остатками цистеи-
на, находящихся на разных концах пептида.
б) Образование. Что касается образования нейропептидов,
то вначале на рибосомах синтезируются более длинные полипеп-
тид ные цепи-предшественники (п. 3.6.4). Они обязательно на-
чинаются с сигнальной последовательности (СП, п. 3.6.1.2), ко-
торая необходима для проникновения цепи во внутреннее про-
странство эндоплазматической сети.
Затем белки предшественники транспортируются в мемб-
ранных пузырьках до нервных окончаний и расщепляются про
теазами в определенных местах.
Нередко при этом высвобождается сразу несколько актив-
ных пептидов. Пример упоминался выше (см. сноску
к табл. 5.1,Б): в промежуточной доле гипофиза при расщепле-
нии единого белка-предшественника проопиомеланокорти
на — могут образовываться, в зависимости от способа протеоли-
за (рис. 5.4),
1) типичные гормоны (МСГ, липотропин и даже АКТГ),
которые служат и нейромодуляторами;
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ 335
2) а также пептиды с исключительно нейромодуляторной
функцией (эндорфины, т. е. пептиды с морфиноподобным дей-
ствием, и близкий им мет-энкефалин).
Готовые нейромодуляторы выделяются в синаптическую
щель или окружающее межклеточное пространство.
Интересный момент: здесь или еще в тех нервных оконча-
ниях, где они синтезируются, нейропептиды могут подвергать-
ся дальнейшему протеолизу. И очень часто при этом образуют-
ся новые нейропептиды — с похожей или даже совсем иной ак-
тивностью. Например, как видно из рис. 5.4, при протеолизе р-
липотропина могут появляться МСГ, мет энкефалин и разные
эндорфины, а при протеолизе Р-эндорфина — а- и у-эндорфины.
Это явление — одна из причин чрезвычайно большого раз-
нообразия нейропептидов.
в) Действие. Несмотря на только что указанную возмож-
ность протеолиза, нейропептиды, в отличие от типичных медиа-
торов, существуют в биосредах относительно долго (часы). Это
позволяет им достигать (путем диффузии) достаточно удален-
ных синапсов и длительное время оказывать на них свое дей-
ствие.
При этом нередко сразу несколько нейропептидов-модуля-
торов действует на одну и ту же мишень, а один и тот же моду
лятор — сразу на несколько мишеней.
Благодаря этому могут создаваться различные комбинации
модуляторов и различные комбинации клеток-мишеней. Каж-
дой комбинации соответствует определенное функциональное
состояние нервной системы и организма в целом. Причем, в си-
лу многочисленности пептидов, все эти состояния образуют как
336
Глава 5
бы непрерывное множество — т. н. функциональный контину
ум, — где одно состояние плавно переходит в другое.
В этом, как считают, и состоит биологический смысл суще-
ствования такого большого количества нейромодуляторов.
г) Классификация. По своей функции, месту синтеза и (от-
части) структуре все нейропептиды, включая медиаторы и гор-
моны, подразделяются на 18 семейств:
1) гипоталамические, либерины и статины (см. табл 5.1, А);
2) опиоидные, или морфиноподобные, пептиды (эндорфины
и энкефалины);
3) меланокортины (АКТГ, меланотропины; см.
табл 5.1,Б);
4) вазопрессины и окситоцины (см. табл. 5.1,А);
5) «панкреатические» пептиды, т. е. пептиды, идентич-
ные некоторым из тех, что образуются в поджелудочной
железе (ПП — панкреатический пептид, табл. 5.3,А;
нейропептид Y, см. табл. 5.9, и др.),
6) глюкагонсекретины (глюкагон и ВИП, см. табл. 5.3,А и
5.9; секретин, см. табл. 5.4,Б); как видно, многие из эт-
их нейропептидов тоже могли бы называться «панкреа-
тическими»;
7) гастринокинины (гастрин, холецистокинин-8; см.
табл. 5.4,Б);
10) нейротензины (нейротензин, нейромедин N и др.);
11)бомбезины (бомбезин, см. табл. 5 4,Б; гастрин-рили-
зинг-пептид и др.);
12)кинины (брадикинин и др.);
13) ангиотензины;
14) кальцитонины;
15) атриопептиды (натрийуретический фактор, атриопеп-
тин, табл. 5.3,Е);
16) эндозепины (по действию подобные препарату бензодиа-
зепину);
17) галанин;
18) зндотелины.
В некоторых из этих семейств по 20-30 различных ней-
ропептидов.
Заметим: многие из указанных в скобках пептидов нам уже
знакомы — они упоминались выше как классические гормоны
или гистогормоны, продуцируемые не нервными, а иными клет-
ками.
Почему же эти вещества отнесены к нейропептидам? — По-
тому, что все они образуются также определенными нейронами
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
337
головного мозга или (как эндорфины) в гипофизе. И, выступая
затем в качестве нейромодуляторов, оказывают то или иное ней
ротропное или даже психотропное действие.
д) Примеры. Эффекты некоторых нейропептидов приведе-
ны в табл. 5.10.
Таблица 5.10. Влияние нейропептндов на нервную деятельность
(Периферические эффекты, если они имеются, как правило, не
указаны)
А. Представители опиоидных ненропептидов
Природа Действие
мет-Энкефалнн 5 остатков аминокислот Кратковременное обезболивающее действие
Р-Эндорфин 30 остатков АК 1. Морфиноподобные эффекты: - обезболивание, - возникновения чувства удо- влетворения, - снижение других эмоций. 2. Важный периферический эф- фект: - мощная стимуляция NK-кле- ток (упоминавшихся в пп. 4.3.4.2 и 4.3.4.5)
у-Эндорфин Первые 17 остатков Р-эндорфина Нейролептическое действие (тор- можение эмоциональной сферы). Обезболивающий эффект выражен слабо
а-Эндорфии Первые 16 остатков Р-эндорфина Психостимулирующее (как у пре- парата фенамина), в некотором отношении антиморфи неподоб- ное, действие: - стимуляция эмоций, - увеличение моторной актив- ности
Примечания.
1. Всего в данном семействе — свыше 30 пептидов.
2. В организме могут также образовываться и непептид-
ные опиоиды (т. е. вещества, действующие на опиоидные рецеп-
торы):
- сальсолинол и карболины (особенно при алкоголизме),
- и даже классические наркотические средства (кодеин и
морфин), причем вне связи с употреблением наркотиков.
Место синтеза этих веществ пока не известно.
338
Глава 5
Б. Представители других семейств
Природа Действие
Вазопрессин Циклические нонапептиды (табл. 5.1,А) Способствует формированию долгосрочной памяти
Окситоцин Умеренно препятствует формированию долгосрочной памяти
Холецнсто- кинин-8 Декапептид Очень мощный ингибитор пищедобывательного поведения
Нейротензин 13 остатков АК Подобно анальгину, вызывает эффекты: - обезболивающий (не через опиатные рецепторы), - гипотермический и гипотен- зивный
Эндозепнн-6 Гексапептид а) Ингибирует ГАМКЛ рецепторы (табл. 5.8.Б). б) Видимо, поэтому вызывает бес- покойство и проконфликтное пове- дение
Пептид дельта- сна Не входит ни в одно из 18 семейств Сильный снотворный эффект, облегчение стрессовых состояний
е) Рецепторы. Для каждого нейромодулятора на плазмо-
лемме клеток мишеней имеются рецепторы.
В случае эндозепинов (только что упомянутых в таблице)
рецептором является часть ГАМКл рецептора; при этом связы-
вание эндозепина блокирует связывание ГАМК и последующее
открытие каналов для ионов СГ.
Рецепторы эндорфинов (т. н. опиоидные рецепторы) также
не отличаются абсолютной специфичностью: кроме соответ-
ствующих нейропептидов, с ними могут связываться наркоти-
ческие вещества (морфин, кодеин и прочие непептидные опиои-
ды; см. примечание к табл. 5.10,А). Об этом свидетельствует са-
мо название данных рецепторов.
Опиоидные рецепторы прочно встроены в плазмолемму и
контактируют с определенным трансмиттерным белком, пере-
дающим сигнал на внутреннюю поверхность плазмолеммы.
Иными словами, механизм действия эндорфинов соответству
ет той же схеме (см. рис. 5.1), по которой действует пода-
вляющее большинство гидрофильных сигнальных молекул.
То же, видимо, можно сказать и о прочих нейромодуляторах.
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
339
5 2.4. Резюме: механизмы действия сигнальных
веществ
Из вышеприведенного обзора классических гормонов, ги-
стогормонов (цитокинов и факторов роста), нейромедиаторов и
нейромодуляторов следует, что, в основном, используются толь-
ко три-четыре принципиальных механизма действия сигналь-
ных веществ.
1) Вещество взаимодействует с рецептором плазмо
леммы, что индуцирует передачу сигнала внутрь клетки и в
конечном счете — химическую модификацию (фосфорили-
рование или дефосфорилирование) определенных белков
(см. рис. 5.1). Для нейромедиаторов такой механизм обозна-
чается как метаботропный. Но аналогично действуют гид-
рофильные гормоны, практически все гистогормоны и ней-
ромодуляторы.
2) Вещество взаимодействует с рецептором плазмолем-
мы, который является «по совместительству» и ионным кана
лом, открывающимся при связывании регулятора. Такой меха-
низм называется ионотропным и характерен лишь для относи-
тельно небольшого числа нейромедиаторов. Он достаточно под-
робно был рассмотрен для н-холинореактивных синапсов
(п. 4.2.2.4).
3) В третьем варианте внеклеточный регулятор проникает
внутрь клетки мишени, связывается с цитоплазматическим или
ядерным белком-рецептором и, выступая после этого как транс
крипционный фактор, влияет на экспрессию определенных ге-
нов. Так действуют гидрофобные (неполярные) гормоны — в основ-
ном, стероидной природы.
4) Иногда встречается и четвертый вариант — «гибрид»
третьего и первого. Здесь неполярная сигнальная молекула
(простагландины или NO) проникает в клетку-мишень и влия-
ет на функционирование регуляторных ферментов, конечным
результатом чего является химическая модификация опреде-
ленных белков.
Но мы уже отмечали, что простагландины и оксид азота
это, скорее, вторичные мессенджеры, которые являются состав-
ной частью механизма первого типа, т. е. образуются в ответ
на связывание с плазмолеммой гидрофильного сигнального
вещества. Просто (хотя, разумеется, это весьма важно) данные
мессенджеры, в отличие от других вторичных мессенджеров (та
ких, как цАМФ), способны диффундировать из «породившей»
их клетки в окружающие клетки и оказывать соответствующее
влияние уже там.
340
Глава 5
Итак, наиболее часто используемым является механизм
первого типа. При этом конкретные способы его реализации
весьма разнообразны. Вот к этому разнообразию мы теперь и об-
ратимся.
5. 3 ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ,
НАЧИНАЮЩИЕСЯ ОТ МЕМБРАННОГО
РЕЦЕПТОРА
Для систематизации всевозможных сигнальных путей ука-
занного типа, пожалуй, наиболее удобно отталкиваться от вида
вторичного мессенджера. В соответствии с этим, можно разли-
чать пути следующих видов:
1) цАМФ опосредованные пути,
2) цГМФ-опосредованные пути (не зависимые от NO);
3) цГМФ- и NO-опосредованные пути;
4) пути, опосредованные липидами (ДАТ, ИТФ') и ионами Са2’;
5) пути, опосредованные другими липидами;
6) пути, опосредованные белком Ras;
7) пути, не содержащие вторичного мессенджера.
Используя данную классификацию, и будем рассматривать
сигнальные пути.
5.3.1. цАМФ-опосредованные пути
5.3.1 1 Компоненты подобных путей
Здесь и далее основной вопрос будет состоять в том, каковы
особенности соответствующих сигнальных путей по сравнению
с общей схемой (см. рис. 5.1).
Что касается цАМФ-опосредованных путей, то для них эти
особенности показаны на рис. 5.5. Сопоставляя данный рисунок
с рис. 5 1, можно заметить следующее
1. В качестве мембранного белка трансмиттера выступа-
ет т. н. G-белок. Он состоит из трех субъединиц — а, р и у, при-
чем в отсутствие гормонального сигнала все субъединицы связа-
ны друг с другом, а а-субъединица — еще и с ГДФ (чем и обусло-
влено название всего белка).
а-Субъединица бывает двух типов: стимулирующего (а8
в Gg-белке) и ингибирующего (а, — в G, белке).
'ДАТ — диацилглицерин. ИТФ инозитолтрифосфат
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
341
ОСиша^ыюе вещество
Рис.. 5.5. нения
цЛМФ маоср.щованн"^'
репупит s,w .га дуги.
• - меченный«wop,
4> - а бепо*.АЦ аьлч.лпгдоязе»
ЗДЭ ф*сфодиэотераза,
НК -А — протеинниназаА,
Нф — протеин^ v сфвтаза, Е^ф и
Е"ф — иеЛ|> ЬодоДОЮваннав и
фосфорилир *;•““»<» ф- , иг л регу-
Цируемого бепка *
Как и «полагается» бел-
ку-трансмиттеру, G-белок
контактирует с мембранным
рецептором (R), воспринимаю-
щим внешний сигнал.
Связывание сигнальной
молекулы с рецептором приво-
дит к изменению структуры G-
белка. Это заключается в сле-
дующем.
а) Вначале а-субъединица
теряет сродство к ГДФ, но прио-
бретает его в отношении ГТФ.
Иными словами, эта субъедини-
ца заменяет ГДФ на ГТФ.
б) В связанном с ГТФ со-
стоянии а-субъединица:
- высвобождается из
комплекса с субъединица-
ми Р и у;
- диффундирует по вну-
тренней поверхности плазмо-
леммы (или даже в толще этой
мембраны — по принципу лате-
ральной диффузии; п. 4.1.1.3);
встретив мембрано-
связанный фермент аденилат-
циклазу (АЦ), активирует
его (а-субъединица) или инги
бирует (а-субъединица).
в) Кроме того, в а-субъе-
динице «просыпается» не
очень большая ГТФазная ак-
тивность. Благодаря этому,
через некоторое время связан-
ный ГТФ гидролизуется до
ГДФ.
г) В результате а-субъединица возвращается в исходную
конформацию, что вызывает процессы, обратные предыдущим:
- диссоциацию а-субъединицы от АЦ и соответствующее из-
менение активности последней (снижение или возрастание);
- латеральную диффузию а-субъединицы;
- связывание последней с Р и у-субъединицами G-белка.
342
Глава s
Таким образом, ГТФазная активность а-субъединицы обес-
печивает обратимость ее влияния на АЦ.
Если вернувшаяся «на место» а-субъединица находит ре-
цептор свободным от внеклеточного эффектора, она остается в
комплексе с р- и у-субъединицами.
Если же рецептор по-прежнему возбужден эффектором, то в
а-субъединице опять совершается замена ГДФ на ГТФ — и цикл
процессов а)-г) повторяется снова.
Так функционирует трансмиттерный G белок. Перейдем
к другим особенностям цАМФ-опосредованных сигнальных
путей.
2. Как следует из названия этих путей, вторичным (вну-
триклеточным) мессенджером в них служит циклический
АМФ (цАМФ, рис. 5.6).
Это мононуклеотид, отличающийся от обычных нуклеоти-
дов (см. рис 1.1) тем, что фосфатный остаток связан сразу с дву-
мя положениями рибозы — 5’ и 3'.
Он образуется из АТФ под действием фермента адеиилатци-
клазы (АЦ), которая, как мы уже знаем, связана с плазмолем-
мой и активируется комплексом а3-субъединица-ГТФ либо ин-
гибируется комплексом cq-субъединица ГТФ. Таким образом,
скорость образования цАМФ (vo6p) зависит от регулируемой ак
тивности АЦ.
Второй фермент обмена цАМФ — фосфодиэстераза (ФДЭ),
катализирующая превращение цАМФ в обычный (нецикличе
ский) АМФ. При этом лишь разрывается связь фосфатной груп-
пы с З'-положением рибозы. А скорость распада цАМФ (п/?ос)
просто пропорциональна концентрации цАМФ (т. е. ФДЭ
функционирует в ненасыщающем режиме).
И вот как примерно изменяются скорости vo6p и ирас в ходе
передачи сигнала через О8-белок (рис. 5.7).
До поступления сигнала обе скорости не очень велики
и равны друг другу. Поэтому кон-
центрация цАМФ в клетке постоян-
на и тоже не очень высока. Все это
можно охарактеризовать как исход-
ное стационарное состояние.
В ходе же передачи сигнала Gs-
белок активирует АЦ, отчего ско-
рость vo6p скачкообразно возрастает
и становится значительно больше
ирас. Поэтому концентрация цАМФ
пЕРрдАЧА внешнего сигнала в клетку
343
Скорости
Скорость синтеза цАМФ
Скорость распада
цАМФ (vpae)
Диссоциация
а-субъеднвнц от
всех молекул АЦ
Связывание а-субъ- Ц
единиц G-белка с
молекулами АЦ
Риь. 5?.4Дз*1М«ени* сксмюо?и
зидее3а „ распада с
клетке при действии
ВНе»’<«»-«очн. ю
тоже начинает увеличиваться.
Это вызывает повышение
и скорости распада, но не
скачкообразное, а постепенно
следующее за концентрацией
цАМФ.
Вследствие ГТФазной ак-
тивности а-субъединицы Gs-
белка, после скачка начинает
ся постепенное (в масштабах
всей клетки) снижение актив-
ности АЦ, а значит, и скоро-
сти vo6p. В какой-то момент
времени Ц возрастающая ско
рость vpac сравнивается с убы-
вающей скоростью а за-
тем становится выше ее.
В этот момент концентрация цАМФ достигает своего мак-
симума, после чего из-за превышения vpac над иобр начинает по-
степенно снижаться. А это, в свою очередь, приводит к тому, что
начинает снижаться и скорость ирас. В конце концов активность
АЦ возвращается к исходному уровню, а вместе с ней — и обе
скорости обмена цАМФ, равно как и сама концентрация цАМФ.
Вновь устанавливается прежнее стационарное состояние.
3. Продолжая описание цАМФ-зависимого пути (см.
рис. 5.5), обратимся к протеинкиназе. Как уже отмечалось в
п. 5.2.1.4, протеинкиназы бывают разные, и та из них, которая ак-
тивируется циклическим АМФ, называется протеиикиназой А
(ПК-А). Эта ПК обнаружена во всех нормальных клетках млеко-
питающих. Для ее функционирования необходимы ионы Mg2 .
В соответствии с рис. 5.5, неактивная ПК-A состоит из че
тырех субъединиц: двух каталитических (С) и двух регулятор-
ных (R); последние-то и подавляют активность первых.
Активация совершается путем присоединения четырех мо-
лекул цАМФ к регуляторным субъединицам (по две молекулы
ЦАМФ на субъединицу). Это приводит к диссоциации фермента:
высвобождаются одиночные каталитические субъединицы,
которые в таком состоянии активны.
Дальнейшее зависит от конкретного пути. В каких-то пу-
тях ПК-A фосфорилирует непосредственно регулируемый фер-
мент (белок) (как это показано на рис. 5.5). В других случаях
ПК-A воздействует на вторую протеинкиназу, а уже та — на ко-
нечный объект регуляции (см. рис. 5.1).
344
Глава 5
В любом случае и ПК-A, и другие ПК, «стоящие» за ней в
регуляторной цепи, присоединяют фосфатные группы в моди-
фицируемом белке к остаткам серина или (реже) треонина, но
не тирозина. (Протеинкиназы, фосфорилирующие в белках ти-
розин, так и называются тирозинкиназы; они используются
в других регуляторных путях, которые будут рассматриваться
позднее).
Указанная модификация, как мы уже говорили в
п. 5.2.1.4, и вызывает конечный эффект регуляторной цепочки.
Для большей наглядности приведем несколько конкретных
путей рассматриваемого типа.
5.3.1.2. Стимуляция адреналином распада
углеводов и жиров
Обратимся вначале к адреналину — гормону мозгового ве-
щества надпочечников. Как отмечалось в табл. 5.2,Б, этот гор-
мон вызывает большой комплекс физиологических и биохими-
ческих эффектов, направленных на адаптацию к острому
стрессу.
В основе каждого из данных эффектов — своя регуляторная
цепочка, начинающаяся с определенного адренорецептора на
поверхности клетки-мишени. В табл. 5.7 перечислялись рецеп-
торы адренергических синапсов: а,-, а?-, Р,- и Р2-адренорецеп*
торы Такие же рецепторы воспринимают и гормональные сиг-
налы адреналина.
Мы не сможем обсудить механизмы всех эффектов, вызван-
ных этими сигналами. Поэтому рассмотрим лишь некоторые,
наиболее изученные.
Так, важнейшим способом адаптации метаболизма к остро-
му стрессу является усиление распада запасных питательных
веществ — гликогена (в печени и скелетных мышцах) и жиров
(в клетках жировой ткани). И вот с помощью каких регулятор-
ных цепочек это достигается.
1. Усиление распада гликогена (рис. 5.8).
а) На поверхности гепатоцитов (а также мышечных воло-
кон скелетных мышц) среди прочих рецепторных молекул со-
держатся Ъ2-адренорецепторы.
Они представляют собой интегральные белки: пептидная
цепь каждого из них 7 раз (!) проходит через толщу мембраны
(Вообще говоря, такова структура всех рецепторов, связан-
ных с G-белками).
С цитоплазматической стороны плазмолеммы ₽2-адреноре-
цепторы контактируют с Са-белком (т. е. G-белком стимулирую-
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
345
• Адреналин
i Т X . я ' s 1
; ис. 5.8. с^имучяии* ядрена. J
ном гликси«ни., и за в печени
8; АР - 1^-лдр-но^ицв.тор,
«> А — протеиикинаоа А.
К«Ь-Ь - кииалз форфорипяаы Ь
щего типа) Поэтому возбуж-
дение рецепторов приводит к
активации АЦ (аденилатци-
клазы).
Заметим: в табл. 5.7 ска-
зано, что раздражение 02'аД
ренорецепторов вызывает
тормозное действие. Проти-
воречия с фактом активации
АЦ нет: то утверждение от-
носилось лишь к конечному
результату действия медиа-
тора на гладкие миоциты
(что будет продемонстриро-
вано в п. 5.3.1.3).
б) Итак, в гепатоцитах
возрастает концентрация
цАМФ, что, в свою очередь,
активирует ПК А (протеин-
киназу А). Последняя в рас-
сматриваемой регуляторной
цепи фосфорилирует два
фермента:
- еще одну, высоко-
специфическую, ПК - кина-
зу фосфорилазы Ь (КФЪ)
которая при фосфорилирова-
нии активируется;
- гликогенсинтетазу
(ГС) — фермент синтеза гли-
когена (на рис. 5.8 не пока-
зан), инактивируемый при
фосфорилировании.
в) В свою очередь, ак-
тивная КФ-b действует на гли-
когенфосфорилазу Ъ (ГФ-Ь)
ГФ — это фермент, который путем фосфоролиза расщепля-
ет гликоген до глюкозо-1-фосфата. Если говорить точнее, проис
ходит поочередное отщепление глюкозных остатков с концов ве-
твей гликогена.
Нефосфорилированная форма ГФ обозначается буквой Ь,
фосфорилированная — буквой а
ГФ-b не всегда неактивна: она способна к аллостерической
активации нециклическим АМФ (накопление которого свиде-
346
Глава 5
тельствует о недостатке АТФ в клетке). Это регуляция, так ска-
зать, «местного»(внутриклеточного) уровня.
Переход же путем фосфорилирования в форму ГФ-а (в ответ
на внешнюю гормональную стимуляцию) приводит к стабиль-
ной активации фермента — независимо от внутриклеточного
энергетического статуса.
Таким образом, адреналин
- тормозит синтез гликогена и
активирует его распад.
То и другое способствует одному — уменьшению запасов
гликогена в печени и мышцах и накоплению за счет этого раз-
личных форм глюкозы. Среди последних, в частности, глюкозо-
6-фосфат, который легко образуется с помощью специального
фермента из глюкозо-1-фосфата.
г) Дальнейшая судьба глюкозы в печени и мышцах различна.
В гепатоцитах при остром стрессе (таком, например, как
интенсивная физическая работа) большая часть глюкозе-6-фос-
фата превращается в свободную глюкозу и выделяется в кровь
для переноса в мышцы.
В скелетных же мышцах глюкозо-6-фосфат (образовавший-
ся как из поглощенной глюкозы, так и из собственного гликоге-
на мышц) подвергается распаду для энергообеспечения физиче-
ской деятельности.
Интересно отметить два обстоятельства:
- переноситься через плазмолемму (с помощью специаль-
ных переносчиков) глюкоза может только в свободном
состоянии;
в мышцах нет фермента, дефосфорилирующего глюко-
зо-6-фосфат.
Отсюда вытекает, что гликоген мышц (в отличие от гликогена пе-
чени) не может служить источником глюкозы для других тканей.
2. Усиление распада жиров.
Схема действия адреналина на адипоциты (жировые клет-
ки) практически совпадает с вышеизложенной. Вновь в регуля-
торной цепочке последовательно фигурируют:
- р2"аДРеноРеЦептоРЬ1 плазмолеммы и Gs-белок,
мембраносвязанная АЦ (аденилатциклаза) и цАМФ,
- ПК-A (протеинкиназа А).
Но конечный эффект получается совсем иной — усиление
распада не гликогена, а нейтральных жиров! Как же достигает-
ся специфичность ответа?
Дело в том, что другим является субстрат, на который дей-
ствует ПК-A: в адипоцитах это не ферменты, связанные с обме-
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА в КЛЕТКУ 347
*—
ном гликогена (КФ-b и ГС; их здесь просто нет), а триглицерид-
липаза (ТГЛ). Последняя в результате фосфорилирования ак-
тивируется, что и приводит к усилению липолиза (распада
нейтральных жиров).
В адипоцитах, как известно, жиры образуют единую ка
плю, которая занимает большую часть клетки, оттесняя ядро к
периферии. Фермент же ТГЛ гидролизует в поверхностных мо-
лекулах капли сложноэфирные связи, так что из состава ка-
пли высвобождаются свободные жирные кислоты (ЖК) и гли-
церин.
ЖК выходят в кровь, где связываются с альбумином и пере-
носятся к работающим мышцам.
Таким образом, при острой стрессовой ситуации, связанной
с интенсивной мышечной деятельностью, скелетные мышцы не
только мобилизуют собственный гликоген, но и получают пита-
тельные субстраты извне: глюкозу из печени и ЖК из жировой
ткани. И все эти метаболические сдвиги (не говоря о многочи-
сленных симпатомиметических эффектах) инициируются адре
налином.
3. О действии глюкагона. Практически так же на обмен
углеводов и жиров влияет еще один гормон — глюкагон
(табл. 5.3,А). Он выделяется поджелудочной железой через не-
сколько часов после приема пищи (т. е. в начальную фазу голо-
дания) и мобилизует гликоген печени и резервные жиры.
Отличия существуют лишь только в отношении клеточных
рецепторов:
- для глюкагона на поверхности гепатоцитов и адипоци-
тов имеются свои специфические рецепторы (стимуля-
ция которых запускает вышеописанные регуляторные
цепочки);
- на мышечных же волокнах рецепторов для глюкагона
нет, отчего здесь распад гликогена не стимулируется.
Второе вполне оправданно: раз гликоген мышц не может
служить источником глюкозы для других тканей (что мы недав
но отмечали), то нет смысла его разрушать, если речь идет толь-
ко о начальной фазе голодания.
5.3.1.3. Спазмолитическое действие симпатомиметиков
Итак, через р2-аДРеноРеи.ептоРЬ1 и индуцируемую ими аде
нилатциклазную систему адреналин влияет на обмен углеводов
и жиров.
Но оказывается, что сходным образом развивается и спаз-
молитическое действие симпатомиметиков — норадреналина
348
Глава 5
д^Асте»ю ;>.т>|«алинг и
L.-M* - ^-пд. цвггг^р.,
hi А - пр - чЩ<> «н и А,
8К МЖГЖИИ X.,
И’ - прот.-йн$> вфдтаал
1М - каяыаь-яули*
как медиатора и адреналина как
гормона. Согласно табл. 5.7, Р2-
адренорецепторы преобладают в
бронхах, кишечнике, матке, со-
судах скелетных мышц, и благо-
даря этому гладкие миоциты дан-
ных образований при стрессе рас
слабляются.
Как это происходит, показа-
но на рис. 5.9. Начальные стадии
регуляторной цепочки — точно
такие же, как в предыдущих слу-
чаях (см. рис. 5.8). И опять все
дело в том, на что именно дей-
ствует ПК-А.
В гладких миоцитах выше-
перечисленных органов это мио-
зинкиназа (МК) — специфиче-
ская протеинкиназа, фосфорили-
рующая головки миозина в тол-
стых миофиламентах.
Когда на миоцит не действу-
ет симпатомиметик (адреналин
или норадреналин), МК находит-
ся в нефосфорилированном со-
стоянии, и именно это состояние
является активным.
В такой форме МК может об-
разовывать комплекс с калъмо
дулином (КМ) — небольшим
белком, связывающим кальций.
Данный комплекс образует-
ся, когда на клетку приходит воз-
буждающий сигнал (по парасим-
патическим нервным волокнам)
и в цитозоле миоцита повышает-
ся концентрация Са2’ (благодаря включению еще одной регуля-
торной системы; см. п. 5.3.4).
После этого комплекс атакует головки миозина, фосфори-
лирует их и тем самым приводит в активное состояние, в кото-
ром они способны взаимодействовать с тонкими (актиновыми)
миофиламентами.
При действии же симпатомиметиков все это блокируется:
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
349
- МК фосфорилируется, отчего комплекс с КМ не образу-
ется (или разрушается);
- а головки миозина переходят под действием протеин
фосфатазы (ПФ) в нефосфорилированное, т. е. неак-
тивное, состояние.
5.3.1.4. Аденилатциклазная система эпителия
кишечника
Как отмечалось в п. 5.3.1.1, протеинкиназа А (ПК-A) со-
держится практически во всех клетках организма. Это значит,
что во всех клетках имеется и аденилатциклаза (АЦ), которая
при тех или иных условиях образует цАМФ. Действительно, в
противном случае наличие в клетках ПК А, активируемой ци-
клическим АМФ, не имело бы никакого смысла.
Таким образом, в качестве очередного примера цАМФ-зави-
симой регуляторной цепочки можно было бы взять любой вид
клеток. Но в подавляющем большинстве случаев до конца по-
добные цепочки «не расшифрованы».
Относится это и к эпителиоцитам тонкого кишечника.
Однако выяснено, что при холере в этих клетках нарушается
функционирование аденилатциклазной системы, что и ведет к
развитию основной симптоматики (диареи и обезвоживания ор-
ганизма). Поэтому остановимся на данной системе подробнее,
хотя, повторим, не все еще с нею ясно.
а) Одна из важнейших функций этой системы (рис. 5.10) —
регуляция деятельности Na' ,К*-насоса (п. 4.2.2.1). Последний,
по-видимому, находится на апикальной стороне эпителиоцита
и, расходуя энергию АТФ, откачивает в просвет кишечника ио-
ны Na в обмен на ионы К'. Стехиометрическое отношение явля-
ется обычным — 3:2, т. е. из клетки выводится ионов больше,
чем поступает в нее извне. Поэтому в просвет кишечника диф-
фундирует через плазмолемму и вода.
Следовательно, влияя на Na ,К -насос, аденилатциклазная
система эпителиоцитов регулирует, по существу, секрецию в ки
шечнике солей и воды.
При этом рецептор, G-белок и аденилатциклаза (АЦ), веро-
ятно, расположены с базальной стороны клетки — там, где с ре-
цептором может связываться сигнальное вещество. Наиболее
подходящим кандидатом на роль такого регулятора представля-
ется серотонин (табл. 5.4,Б).
Сама же регуляция осуществляется путем фосфорилирова-
ния Na‘,K -насоса протеинкиназой А. Такая модификация зна-
чительно повышает активность насоса, тогда как обратное де-
350
Глава 5
фосфорилирование (под действием протеинфосфатазы) снижает
активность.
б) А что происходит при холере? Это также показано на
рис. 5.10, а кроме того, кратко освещалось в п. 3.3.2.2.
Напомним суть дела. Холерные вибрионы выделяют белок
холеротоксин (XT), который состоит из нескольких субъеди-
ниц двух типов — А и В. Оказываясь в просвете кишечника,
XT связывается с апикальной поверхностью эпителиоцитов.
При этом субъединицы В взаимодействуют с одним из липидов
плазмолеммы — ганглиозидом Gv). В результате структура
мембраны несколько нарушается, и внутрь клеток проникают
субъединицы А.
Здесь они катализируют перенос АДФ-рибозы от кофермен-
та НАД* на Gs-6enOK вышеописанной аденилатциклазной систе-
мы, точнее, на о^-субъединицу этого белка.
Такая модификация сохраняет за данной субъединицей
почти все ее свойства (способность при действии внешнего сиг-
нала связывать ГТФ, диффундировать в мембране и активиро-
ПРРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ 351
ватьАЦ) — за исключением ГТФазной активности: последняя
пропадает. Но эта активность, как мы знаем (п. 5.3.1 1), необхо-
дима для возвращения системы в исходное состояние.
Поэтому регуляторная цепочка оказывается как бы все вре-
мя «включенной», т. е. постоянно высокая активность АЦ при-
водит к постоянно высокой активности ПК А, а следовательно,
иЦа‘,К'-насоса.
В итоге у больного имеет место интенсивная секреция солей
и воды в просвет кишечника, следствием чего являются диарея
и обезвоживание организма.
Напомним, что сходными структурой и механизмом дей-
ствия обладает дифтерийный токсин (п. 3.3.2.2). Он тоже свя
зывается с ганглиозидом GM1 плазмолеммы, тоже не целиком, а
лишь одним своим компонентом (доменом А) проникает внутрь
клетки и здесь тоже осуществляет АДФ-рибозилирование опре-
деленного белка мишени.
Но имеются, по крайней мере, два отличия:
в первую очередь, поражаются клетки внутренних орга-
нов;
- а в них указанной модификации подвергается один из
факторов трансляции (фактор EF-2, или транслоказа).
Отсюда совсем иная симптоматика болезни.
Ситуация сходна с регуляцией через аденилатциклазную
систему — небольшие различия в начальном (рецепторном) и
конечном (эффекторном) звеньях очень похожих регуляторных
цепочек приводят к огромному многообразию регуляторов и вы-
зываемых ими эффектов.
5.3.1.5. Рецепторы, связанные с G^-белками
До сих пор мы говорили о таких цАМФ опосредованных ре-
гуляторных системах, которые содержат О5-белок. Т. е. в ре-
зультате связывания сигнального вещества с рецептором здесь
происходит активация аденилатциклазы (АЦ).
Но, как отмечалось вп.5.3.1.1,в некоторых регуляторных
путях внешний сигнал вызывает противоположный эффект
торможение АЦ. В этих случаях с рецептором связан Gj-белок:
он содержит а-субъединицу ингибирующего типа (а,), которая
после действия внешнего сигнала, диффундируя к АЦ, подавля-
ет ее активность. Поэтому концентрация цАМФ в клетке снижа-
ется — с вытекающими отсюда последствиями.
На рис. 5.11 приведены некоторые рецепторы, действую-
щие через G, белок. Для экономии места они изображены ря-
Глава 5
352
С.-белок
Адреналин Ацетилхолин Опиоидные Эндо-
нейропептиды каннабиноиды
____..._,..._д>щ»е в орможению
едения «тцикяазы (АЦ
АР оу-ад^нор^йвпаэр, нц ««вин .,.>eyerm>p.
га
дом в плазмолемме одной клетки; но надо понимать, что в ре-
альности они распределены по разным клеткам и вместе вряд ли
встречаются.
Итак, согласно рис. 5.11, к АЦ-тормозящим рецепторам от
носятся следующие:
- а2адренорецепторы в эндотелии сосудов (напомним,
что р2-адренорецепторы являются АЦ-возбуждающими;
п. 5.3.1.2);
- м2-холинорецепторы, расположенные в сердце (см.
табл. 5.7) и в мозгу (см. табл. 5.8А);
опиоидные рецепторы, находящиеся в определенных
отделах головного мозга и связывающие опиоидные
нейропептиды, а также препараты опия (п. 5.2.3.3,
табл. 5.10А);
каннабиноидные рецепторы мозга, воспринимающие
ряд веществ эндогенного происхождения и препараты
конопли.
Таким образом, во всех этих случаях воздействие на рецеп-
тор сигнального вещества приводит к снижению в клетке кон-
центрации цАМФ и, соответственно, активности протеинкина-
зы А (ПК-А).
Дальнейшее зависит от того, какой конкретно белок (или
белки) является в данной клетке субстратом ПК-A. Для приве
денных рецепторов это пока неясно, как неясно и влияние фос-
форилирования на субстраты ПК-A активирующее или тор-
мозящее. Поэтому регуляторные цепочки на рис. 5.11 оставле-
ны незавершенными (хотя к первой из них мы вернемся в
п. 5.3.4.6).
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ 353
5-3.2. цГМФ-опосредованные пути
(не зависимые от NO)
5.3.2.1. Общее описание
По сравнению с цАМФ-опосредованными путями, цГМФ
опосредованные пути распространены гораздо меньше. Об-
щее содержание в тканях вторичного мессенджера этих пу-
Рис. .5.1 i. йчиуЛятэр») ын путь?
включающий ме^браносввачг-
ную гуянилзтциклаэу (мГЦ>
'< — мембранный рецептор
ФДЭ ф сфодиэстереза
ПК-G — лротЕиикинрта Q.
ПС' — прогений’’ Г етиаа,
В'иф и Е'ф - «е4мк:фори ат. -’дюнная
• фООфорипиропанк»« фОиМЫ ре-;
тей — циклического ГМФ —
более чем в 10 раз ниже со-
держания цАМФ. Актив-
ность же соответствующей
протеинкиназы (ПК-G) со-
ставляет лишь 1-2 % от об-
щей протеинкиназной актив-
ности клеток.
Однако и для данных пу-
тей в организме «находится»
немало важной «работы». По-
этому уделим им должное вни-
мание.
а) Одна из особенностей
этих систем (рис. 5.12) состоит
в том, что в них, как правило,
отсутствует трансмиттерный
белок, а рецептор и фермент,
образующий вторичный меди-
атор, представляют собой,
видимо, домены единого белка.
Рецепторный домен экспони-
рован на внешней стороне
плазмолеммы, тогда как ката-
литический домен — на вну
тренней.
Каталитический домен
обычно называют мембрано-
связанной гуанилатцикла-
зой (мГЦ) Указание на связь
с мембраной в данном случае
важно: дело в том, что суще-
ствует и растворимая (цито-
плазматическая) гуанилатци-
клаза (рГЦ), которая функци-
'2 -36
354
Глава 5
онирует в регуляторных цепочках иного типа - цГМФ- и NO-
опосредованных путях.
Отсутствие трансмиттерного белка (который в предыдущих
путях был представлен двумя видами Gs и GJ делает систему
одновариантной. Иными словами, связывание внешнего регуля-
тора с рецептором, видимо, всегда вызывает активацию мГЦ.
б) Активная мГЦ, подобно АЦ (аденилатциклазе), катали-
зирует превращение ГТФ в циклический ГМФ (цГМФ,
рис. 5.13). Последний отличается от цАМФ (см. рис. 5.6) точно
тем же, чем ГМФ — от АМФ. Т. е. в качестве азотистого основа-
ния вместо аденина фигурирует гуанин. В остальном структура
обоих мессенджеров одинакова.
Разрушение цГМФ (до нециклического ГМФ) катализиру-
ется фосфодиэстеразой (ФДЭ), которая, по некоторым дан-
ным, отлична от той, что разрушает цАМФ.
в) цГМФ активирует протеинкиназу G (FIKG). Таким об-
разом, буква, фигурирующая в названиях ПК-A и ПК-G, обозна-
чает, каким вторичным мессенджером — циклическим АМФ
или циклическим ГМФ — стимулируется протеинкиназа.
По структуре ПК-G несколько отличается от ПК-A (хотя
имеется и немалая гомология, свидетельствующая об общности
происхождения). Так, неактивная ПК-G состоит не из четырех,
а из двух субъединиц, причем одинаковых.
Гуанин ___ Рибоза
Следовательно, в каждой субъе-
динице находится, по крайней мере,
по одному регуляторному (связываю-
щему цГМФ) и каталитическому
(фосфорилирующему определенные
белки) центру. На самом деле регуля-
торных центров в субъединице —
два, отчего при активации ПК-G с ее
димерной молекулой связываются 4
молекулы цГМФ (подобно тому, как
при активации ПК-A связываются 4
молекулы цАМФ).
Наконец, стоит заметить, что в ходе этой активации не проис-
ходит диссоциации субъединиц (имеющей место в случае ПК-А).
г) Самое интересное — какие белки являются субстратами
протеинкиназы G - пока с определенностью не установлено.
Но ясно, что таких белков немного. Например, в головном
мозгу выявлен всего один белок, специфически фосфорилируе-
мый данной ПК. Он содержится в клетках Пуркинье мозжечка
и является термостабильным; функция же его неизвестна. Поэ-
тому он так и называется — G субстрат.
ПЕРЕДАЧА внешнего сигнала в клетку
355
Однако из данных, полученных для других органов, сле-
дует, что ПК G может фосфорилировать различные мембран
ные белки — переносчики ионов'. Са2'-каналы, другие ка-
тионные каналы, Na^K’-nacoc и т. д. Результаты же этого
фосфорилирования бывают различными: в одних случаях дея-
тельность транспортной системы стимулируется, в других —
тормозится.
5.3.2.2. Примеры регуляторных путей
Приведем два примера цГМФ-зависимой регуляции, хотя о
многом в них пока приходится лишь догадываться.
а) Действие ацетилхолина на м2-холинорецепторы
(м2 ХР). Выше (в п. 5.3.1.5) отмечалось, что данные рецепторы
обнаружены в сердце и в мозгу, а также, что их возбуждение
ацетилхолином приводит (через G.-белок) к угнетению АЦ (аде-
нилатциклазы).
Теперь можно добавить, что раздражение м2-ХР в указан-
ных органах ведет, по имеющимся сведениям, и к стимуляции
мГЦ (мембраносвязанной гуанилатциклазы). Если мГЦ и свя-
занный с нею рецептор — действительно, домены единого белка,
то приходится допустить, что в соответствующих клетках серд-
ца и мозга имеются две разновидности м2-ХР: одни рецепторы
связаны с Gj-белком, а другие — с мГЦ.
Как бы то ни было, в этих клетках под действием ацетилхо-
лина снижается концентрация цАМФ и возрастает концентра-
ция цГМФ.
С другой стороны, в сердце, как известно, ацетилхолин ока-
зывает тормозное действие — замедление и ослабление сокра-
щений (см. табл. 5.7).
Это могло бы достигаться путем следующего влияния ПК-G
на системы транспорта ионов:
увеличения проводимости К'- и анионных каналов (тог-
да трансмембранный потенциал покоя повышался бы,
отчего возбудимость клеток снижалась бы);
- уменьшения проводимости Na каналов (тогда возбуж-
дение развивалось и распространялось бы медленнее, а
сам потенциал действия был бы меньше);
уменьшения проводимости Са2 -каналов саркоплазмати-
ческого ретикулума (тогда оказывалась бы ниже обычно-
го концентрация ионов Са2* на высоте возбуждения);
- и т. д.
Как обстоит дело на самом деле, еще предстоит выяснить.
356
Глава 5
б) Действие натрийуретического фактора В соответ-
ствии с табл. 5.3,Е, кардиомиоциты предсердий секретируют в
кровь два белковых гормона. Один из них — натрийуретиче-
ский фактор (НУФ): он усиливает выведение почками солей (ио-
нов Na ) и воды, являясь, таким образом, антагонистом двух
других гормонов — альдостерона и АДГ.
Установлено, что НУФ действует в почках, активируя мГЦ,
а значит, и ПК G.
Каким образом это приводит к указанным физиологиче-
ским эффектам? — Возможно, ПК-G фосфорилирует Na .Ку-
наеве в эпителиоцитах дистальных канальцев почек, и это при-
водит к торможению деятельности данного насоса. Что озна-
чает ослабление реабсорбции Na‘, а следовательно, и воды из
первичной мочи.
Таким образом, если при холере усиление потерь солей и
воды обусловлено избыточной активностью Na'.K’-насоса в
эпителиоцитах кишечника (п. 5.3.1.4), то сходный результат
действия НУФ видимо, связан с торможением Na К-насоса в
канальцах почек.
Все дело в том, что данный насос в кишечнике и в почках вы-
полняет прямо противоположные функции: в первом случае обес-
печивает выведение Na из организма (в просвет кишечника), а во
втором случае — возвращение Na в организм (из первичной мочи).
5.3.2.3. Гуанилатциклазная система в
фоторецепторных клетках сетчатки глаза
В фоторецепторных клетках сетчатки глаза (т. н. палочках
и колбочках) тоже существует гуанилатциклазная система. Од-
нако, в отличие от всего предыдущего, ее активность регулиру-
ет не химический сигнал, а световой, воспринимаемый спе-
циальным рецептором.
В остальном же — немало общего с вышеизложенным:
ГЦ (гуанилатциклаза), по-видимому, является мембра
несвязанной (хотя связана при этом не только с плазмо-
леммой, но в большей степени с мембранными дисками,
содержащими зрительный пигмент);
— объектом же действия ПК-G вновь служат транспорт-
ные системы для ионов, а именно — Na'-каналы плаз-
молеммы.
В то же время имеются и свои, очень интересные особенно-
сти. Поэтому рассмотрим данную систему подробней. Для опре-
деленности будем иметь в виду палочковую фоторецепторную
клетку.
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
357
₽и.. Палочковая
клеим сет“аТ1'*4
1 ~ сегмви' н в
Нём: *
1а - мриМ дидаок-
2 — связующий сегмент, j
3 - вычет ><^ый сегмент и
а нйм;'
За - митол«НДРИИ
4 — ядернличксп.,
* - аксон
1. Строение палочковых клеток.
а) Как известно, данная клетка
(рис. 5.14) является видоизмененным
нейроном и подразделяется на сле-
дующие части:
наружный сегмент (собствен-
но палочку), в котором находится
около 1000 уложенных стопкой мем-
бранных дисков;
- узкий и короткий связующий
сегмент (ресничку);
внутренний сегмент, содер-
жащий много митохондрий;
- ядерную область и
- аксон, образующий синапсы
с ассоциативными нейронами сет-
чатки.
Первые три части представляют
собой дендрит рассматриваемого
нейрона.
б) Фоторецепция осуществляется
дисками наружного сегмента.
Каждый диск — это уплощен-
ный мембранный мешок; причем
примерно 50 % массы мембраны ди-
сков приходится на светочувстви-
тельный белок родопсин (М
38 000 Да).
Последний содержится также в
плазмолемме наружного сегмента, из
которой путем инвагинации образу-
ются диски.
Молекулы родопсина пронизы-
вают мембрану диска насквозь, воз-
можно, формируя тем самым Са2'-
каналы. Кроме того, в родопсине
имеется небелковая часть — рети
наль, окисленная форма ретинола
(витамина А).
2. Состояние клетки в темноте.
а) В темноте трансмембранный потенциал палочковой клет-
ки составляет -30 мВ, что значительно меньше (по абсолютной
величине), чем в прочих возбудимых клетках (-75 мВ). При этом
происходит своеобразный кругооборот ионов.
358
Глава 5
Так, в плазмолемме внутреннего сегмента активно рабо-
тает Na', К*-насос, выкачивая ионы Na’ из клетки и закачивая
внутрь ионы К'.
В плазмолемме же наружного сегмента имеются К'- и Na'-
каналы, причем в темноте открыты не только первые (как в дру-
гих клетках), но и вторые. Это и является причиной кругооборо-
та ионов и низкого трансмембранного потенциала.
В частности, для ионов Na кругооборот таков:
— они поступают в клетку в наружном сегменте (через Na‘-
каналы),
- диффундируют во внутренний сегмент,
здесь с помощью Na' ,К -насоса откачиваются из клетки,
диффундируют во внеклеточной среде к области вну-
треннего сегмента, после чего цикл повторяется сна-
чала.
б) Состояние Na -каналов контролируется, как уже от-
мечалось, гуанилатциклазной системой (и, возможно, ио-
нами Са2').
У данной системы (рис. 5.15) — интересная особенность.
Чем регулируется (и регулируется ли вообще) активность ГЦ
(гуанилатциклазы), не вполне ясно; не исключено, что она тор-
мозится ионами Са2’.
<и
Г*4*ЗМ*( Wf) «k/TMAMTfl al v-ir жж»-
сетчатки: улfc Na ‘каналоа*
темы
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ 359
Зато установлен механизм регуляции ФДЭ (фосфодиэсте-
разы)- Последняя связана с мембраной дисков и находится под
стимулирующим влиянием Gg-белка. хорошо нам знакомого по
цДМФ-опосредованным путям (п. 5.3 1.1). Только в тех путях
G-белки регулировали скорость синтеза вторичного мессендже
ра, а здесь — скорость его распада. Такая ситуация встречается
крайне редко.
Заметим также, что прежде выбелок в рассматриваемой си-
стеме называли трансдуцином.
Gg-белок, в свою очередь, связан с фоторецепторным белком
родопсином. В темноте оба эти белка не возбуждены, отчего
активность ФДЭ невысока. Поэтому в наружном сегменте па-
лочки — высокая концентрация цГМФ, что поддерживает высо-
кой и активность ПК G (протеинкиназы G).
ПК G фосфорилирует Na* каналы плазмолеммы, которые в
фосфорилированном состоянии являются открытыми. Таким
образом, данные каналы открыты в темноте благодаря гуани-
латциклазной системе.
3. Состояние клетки при освещении.
Что же происходит при освещении сетчатки?
а) Поглощая фотоны, молекулы родопсина возбуждаются.
Не рассматривая химическую сторону этого процесса, скажем
лишь, что данное возбуждение,
во-первых, активирует Gg-белок, а через него — ФДЭ,
что приводит к снижению концентрации цГМФ в
клетках;
во-вторых, сопровождается повышением концентра-
ции ионов Са2 в цитозоле (благодаря открытию Са -
каналов, каковыми могут быть сами молекулы родоп-
сина).
б) Каждый из этих двух эффектов имеет свои следствия.
У снижения [цГМФ]1 — это инактивация ПК-G, уменьше-
ние степени фосфорилированности Na -каналов (за счет дея-
тельности протеинфосфатазы) и, наконец, закрытие этих ка-
налов.
Что касается увеличения [Са2'], тут пока можно лишь стро-
ить предположения. Так, не исключено, как мы уже сказали,
что ионы Са2’ тормозят активность ГЦ, что создает еще одну
причину снижения [цГМФ] С другой стороны, в п. 4.2.2.3 отме
чалось, что ионы Са2 сами снижают проводимость Na'-каналов.
'Напомним, что символом [X] в химии принято обозначать
концентрацию вещества X
360
Глава 5
Таким образом, в любом случае совместное действие двух
эффектов (уменьшения [цГМФ] и повышения [Са21]) приводит к
одному и тому же — закрытию Na' каналов.
в) А это меняет трансмембранный потенциал, причем в сто-
рону не деполяризации (как при возбуждении прочих клеток), а
гиперполяризацииХ Действительно, из-за продолжающегося
выхода из клетки ионов К* через по-прежнему открытые К’-ка-
налы положительный заряд с внешней стороны плазмолеммы
возрастает.
Такое парадоксальное возбуждение плазмолеммы палочковой
клетки распространяется в сторону аксона и образуемого им синап-
са, где приводит к передаче сигнала на ассоциативный нейрон.
5.3.3. цГМФ- и NO-опосредованные пути
5.3.3.1. Введение
Кроме мембраносвязанной гуанилатциклазы (мГЦ), во
многих клетках имеется и т. н. растворимая гуанилатцикла-
за (рГЦ), локализующаяся в цитозоле. Она интересна тем, что
не только катализирует образование вторичного мессенджера
(цГМФ), но и сама активируется другим таким мессенджером —
оксидом азота (NO).
Последний же образуется из аминокислоты аргинина уни-
кальным ферментом — NO синтазой (NO С) и, в отличие от
большинства веществ со сходной функцией, способен диффун-
дировать через мембраны. Поэтому, как уже отмечалось в
п. 5.2.2.1, NO может действовать как интракринно (в той же
клетке, где образовался), так и паракринно (диффундируя в
окружающие клетки).
Что касается продукта действия рГЦ — цГМФ, то он, есте-
ственно, обладает уже известными нам свойствами, а именно
стимулирует протеинкиназу G (ПК-G).
В итоге фрагмент соответствующих регуляторных путей
(рис. 5.16) включает три фермента — NO-C, рГЦ и ПК-G. При
этом первый из них может находиться в той же клетке, что и
остальные (при интракринном действии NO), или в другой клет-
ке (при паракринном действии).
Не только эта особенность, но и многое другое привлекли к
NO-C и к самому NO огромное внимание исследователей. В 1992
году NO была объявлена молекулой года. К настоящему време-
ни проведено множество работ по изучению NO-C и роли NO в
физиологических и патологических процессах.
ПЕРЕДАЧА внешнего сигнала в клетку
361
Но, несмотря на эти усилия, для подавляющего большин-
ства NO и цГМФ-опосредованных регуляторных путей так и ос-
таются неясными их начальные и завершающие стадии. Т. е. те
стадии, которые, во-первых, предшествуют приведенному на
рис. 5.16 фрагменту и, во-вторых, следуют за ним.
Лишь в единичных случаях — и то с большими сомне-
ниями — можно составить законченную цепочку типа тех,
что описывались нами выше (особенно для цАМФ-опосредо
ванных путей).
С чем это связано? — Отчасти, конечно, с недостаточной
изученностью проблемы. Но немаловажную роль, по-видимому,
играет и еще одно обстоятельство: NO и цГМФ (образуемый ра
створимой ГЦ) функционируют в гораздо более сложных регу-
ляторных системах, чем просто неразветвленные цепочки.
Рис. 5.1 МО- и цГМФ-on-ч . пути
№’ С - НО-синт4мз,. ГЦ - растворимая •>внил«Ггци*лаза.
ПК-G — прогеингиич »G_____________________________________
В этих системах объединяются прямыми и обратными свя-
зями реакции образования даже не двух, а еще большего числа
вторичных мессенджеров, каждый из которых действует на
«свой» объект. Получаются разветвленные многофункциональ-
ные системы, которые не так просто «разбить» на независимые
цепочки последовательно проходящих событий.
С примером таких систем мы познакомимся позднее — при
обсуждении регуляторных путей, опосредованных липидами.
Сейчас же более подробно остановимся на NO синтазе и сопут-
ствующих вопросах. После чего приведем те NO- и цГМФ-опо
средованные цепочки, которые удается составить, не обращаясь
к другим мессенджерам.
5.3.3.2. Образование NO и NO синтаза
1. Суть реакции (рис. 5.17). Как уже было сказано, источ-
ником NO в NO-синтазной реакции служит аргинин, а точнее —
его иминная группа (Н N=). Азот этой группы
- вначале окисляется путем гидроксилирования до ги-
дроксилимина (НО N ),
362
Глава 5
2
1,5 II
4 рг и и ui i + 2 Ch
NO + Цитруллин + 2 НО
1,5 НЛДФН 1,5 НАДФ*
и НАДО саопмсгсгч нна, восстань теин'^ и окис^.ни:.»
формы мг срманта (никотинаммд-аленимдин/члеати.,*' ->ата1
афнорэ электронов » протонов
L*; .ц-: т-тн* а ’£. " ЛА л л х, ж . .
а затем, окисляясь далее, выщепляется в виде NO.
Аргинин при этом превращается в цитруллин, в котором
вместо иминной группы оказывается кетогруппа.
На каждой из двух стадий используется молекулярный ки-
слород, а также НАДФН — донор протонов и высокоэргических
электронов.
На рис. 5.17 перед всем уравнением поставлен коэффици-
ент 2, поскольку без него мы бы имели дробные коэффициенты
перед НАДФН, продуктом его окисления НАДФ' и протонами.
Поставить такой коэффициент на листе бумаги нетрудно.
Проблема же в том, что этот коэффициент «должна» была поста-
вить и природа, создавая NO-синтазную систему. Иными слова-
ми, механизм этой реакции должен обеспечивать одновремен-
ное преобразование сразу двух молекул аргинина!
2. Структура NO-синтазы. Известная на сегодняшний
день структура всех изоформ NO-синтазы (рис. 5.18) подтвер-
ждает вышесделанное заключение.
Действительно, молекула фермента состоит из двух одина-
ковых субъединиц, но, несмотря на это, активна только в димер-
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
363
В каждой субъединице различают по два домена - оксиге-
назный (окислительный) и редуктазный (восстановительный).
Оксигеназный домен содержит три центра - для связы-
вания
а) субстрата реакции — аргинина;
б) гема, который, как в цитохромах, участвует в переносе
электронов;
в) и Н^-биоптерина — кофермента, по видимому, уча-
ствующего в переносе отщепляемой от аргинина группы.
В редуктазном домене — еще по меньшей мере три функ
циональных центра; с ними соответственно связаны:
а-б) ФАД (флавинадениндинуклеотид) и ФМН (флавино-
вый мононуклеотид) — коферменты, образующие цепочку пере-
носа электронов от НАДФН на гем;
в) белок кальмодулин, «нагруженный» ионами Са*'.
В итоге оксигеназный домен по функции и структуре на-
поминает цитохром Р45о, а редуктазный цитохром Р450
редуктазу (которая также содержит ФАД, ФМН и передает
электроны от НАДФН на гем цитохрома Р4й0). А это та самая
пара ферментов, что осуществляет многие реакции гидрокси-
лирования.
Но в случае NO-синтазы присутствуют и свои особенности:
- поскольку в катализируемом ею процессе окисление
имеет более сложную стехиометрию (см. рис. 5.17), мо-
лекула фермента, как мы знаем, активна лишь в димер
ной форме;
- для отщепления группы содержится дополнительный
функциональный центр с Н4-биоптерином.
Кроме того, обратим внимание на кальмодулин: с ним
связано очень важное обстоятельство — NO синтаза акта
вируется ионами Са! ; в их же отсутствие NO-синтаза (кроме
одной из ее изоформ) не содержит кальмодулин и практиче-
ски неактивна.
5.3.3.3. Изоформы NO синтазы
Вопрос об изоформах рассматриваемого фермента вряд ли
представлял бы для нас интерес, если бы не был теснейшим об-
разом связан с его (фермента) тканевой локализацией.
Действительно, в каких клетках может образовываться
NO? — Оказывается, далеко не во всех. И в первую очередь по
этому признаку (т. е. месту образования) различают три изофор-
мы NO-синтазы.
Основные сведения о них суммированы в табл. 5.11.
364
Глава 5
Таблица 5.11. Изоформы NO-синтазы (NO-C)
Изоформа ЭНДОТЕЛ ИАЛЬ HAH(aNO-C) НЕЙРОНАЛЬ- НАЯ (hNO-C) ИНДУЦИБЕЛЬ НАЯ (mNO С)
Локализация изоформы Эндотелиоциты сосудов Нейроны и центральной,и периферической нервной системы В основном — активированные макрофаги, в т.ч. купферовские клетки печени
Фермент связан с внутренней поверхностью плазмолеммы Фермент находится в цитозоле
Мол. масса одной субъединицы 135 000 Да 160 000 Да 130 000 Да
Локализация гена 7-я хромосома 12-я хромосома 17-я хромосома
Активность гена Эти изоформы являются конститутивными, т.е. их гены экспрессируются постоянно Ген включается под действием ци- токинов при во- спалении и им- мунных реакциях
Активность фермента Зависит от концентрации Са’ в клетке Не зависит от концентрации Са2'
Все изоформы могут фосфорилироваться,что снижает их активность
Стационарные концентрации NO Не очень велики даже при активации фермента — порядка нескольких ммоль/л Могут достигать сотен ммоль/л
Функции образуемого ферментом NO а) Расслабление гладких миоци- тов сосудов при повышении да- вления крови и действии ряда ва- зоконтри кторов. б) Торможение агрегации тром- боцитов Через эфферент- ные окончания — регуляция функ- ций ряда систем: дыхательной, пи- щеварительной, мочеполовой Цитотоксическое и цитостатическое действие на атаку- емые макрофага- ми клетки — за счёт токсичности а) самого NO в высоких концен- трациях и б) некоторых продуктов его превращений
Как видно из указанной таблицы, две изоформы NO-C явля-
ются конститутивными, т. е. постоянно присутствуют в эндо-
телии сосудов (эндотелиальная форма, 3NO-C) и нервной си-
стеме (нейрональная форма, hNO С). Особенно много hNO-C об-
наруживают в зернистых клетках мозжечка.
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ 365
Третья изоформа — индуцибельная (uNOC): она появля-
ется при воспалительных, иммунных и некоторых других реак-
циях в макрофагах (включая их всевозможные разновидности,
в т. ч. клетки Купфера), а по некоторым данным — ив ряде про-
чих клеток (например, в гепатоцитах).
С локализацией фермента тесно связана и его функция.
Действительно, NO, образуемый в эндотелии, влияет на то-
нус гладких миоцитов сосуда, вызывая расширение последнего.
Также предупреждается агрегация тромбоцитов и адгезия их на
эндотелии. Иными словами, в сосудах NO улучшает условия
кровотока.
Тот же NO, что синтезируется в нервной системе, функци
онирует как нейромедиатор или внутриклеточный мессенджер.
Наконец, в макрофагах при их активации создаются та-
кие высокие концентрации NO, которые оказывают уже токси-
ческое действие на атакуемые макрофагом объекты. Это дости-
гается, в частности, за счет взаимодействия NO с активными
формами кислорода, приводящего к образованию сильных
окислителей.
Теперь проиллюстрируем на примерах выполнение каждой
из форм NO-C своих функций.
5.3.3.4. Сосудорасширяющее действие NO
Точный механизм сосудорасширяющего действия NO, как
и многих других его эффектов, неизвестен. Поэтому начальные
и конечные стадии схемы, приведенной на рис. 5.19, во многом
гипотетические.
Схема основывается на том факте, что повышение давле-
ния на стенки кровеносного сосуда (например, изолированного
участка аорты в эксперименте) последовательно ведет к
— активации NO-C в эндотелиоцитах,
- увеличению в них синтеза NO и
- расслаблению гладкомышечных клеток стенки сосуда.
В итоге сосуд расширяется, что в той или иной степени воз
вращает давление к прежнему, «невозмущенному», уровню.
Т. е. налицо типичная «инерционная» реакция, свойствен-
ная многим физическим, химическим и биологическим систе-
мам. Суть ее в том, что в ответ на внешнее «возмущение», ме-
няющее параметры системы, последняя реагирует так, что ее
параметры возвращаются (хотя и не полностью) к первоначаль-
ному уровню.
Простейший пример из химии — принцип Ле-Шателье. В
физиологии примерами могут служить многочисленные функ-
366
Глава 5
циональные системы, поддерживающие гомеостаз (или, как те-
перь говорят, гомеокинез) различных параметров организма.
Однако вернемся к рис. 5.19. Он исходит из предположения
о том, что
в плазмолемме эндотелиоцитов имеются белки, выпол-
няющие функцию барорецепторов;
aNO-C, расположенная на внутренней поверхности плаз-
молеммы, активируется при раздражении этих белков.
Образующийся в результате NO, согласно одним данным,
может просто диффундировать из эндотелиоцитов через базаль-
ную мембрану в гладкие миоциты сосуда.
По другим данным, NO предварительно связывается с же-
лезо- и (или) серусодержащими соединениями, образуя т. н. эн-
дотелиальный фактор релаксации (ЭФР).
Как бы то ни было, действующим началом в миоцитах вы-
ступает NO (либо просто диффундировававший из эндотелия,
либо высвобождающийся из ЭФР).
ПЕРЕДАЧА внешнего сигнала в клетку
367
Здесь он активирует рГЦ (растворимую гуанилатциклазу).
Заметим: этот фермент отличается от мембраносвязанной ГЦ
тем, что содержит гем. Именно с гемом рГЦ (через его железо) и
связывается NO. (На том же основано взаимодействие NO со
многими другими гемсодержащими веществами — гемоглоби
ном, цитохромами и т. д.)
Соответственно, в миоците повышаются концентрация
цГМФ и активность ПК G (протеинкиназы G).
На что действует ПК-G — так, что миоцит расслабляется?
Здесь мы опять вступаем в область предположений. Суть одного
из них, основанного на косвенных данных, такова: ПК-G фосфо-
рилирует К*-каналы, что приводит к увеличению их проводимо-
сти (подобно тому, как в сетчатке глаза ПК-G повышает прово-
димость Na'-каналов; п. 5.3.2.3).
Тогда мембрана миоцита гиперполяризуется, что снижает
ее чувствительность к приходящим нервным импульсам.
Не исключено, что ПК-G влияет также на системы транс
мембранного переноса ионов Са2* — и это ведет к снижению их
концентрации в цитозоле миоцита. По имеющимся представле-
ниям, такое влияние осуществляется не напрямую, а через дру-
гую регуляторную цепочку, включающую регуляторные липи-
ды (п. 5.3.4.3). Поэтому данный вариант на рис. 5.19 не предста-
влен. Но каким бы способом ПК-G ни вызывала снижение [Caz ],
последнее тоже способствовало бы расслаблению миоцита.
Кроме миоцитов, образуемый в эндотелии NO может попа-
дать в тромбоциты, где также содержится рГЦ. Именно с ее
активацией связан другой эффект, упоминавшийся в
табл. 5.11, — торможение агрегации тромбоцитов. Но конкрет-
ный механизм этого эффекта пока не выяснен.
5.3.3.5. NO в нервной системе: введение
Теперь обратимся к нейрональной NO-синтазе (hNO-C).
Как отмечалось в табл. 5.11, она обнаружена и в центральной, и
в периферической нервной системе.
Заметим: говоря о локализации фермента, обычно приво-
дят и медиаторную характеристику соответствующих нейро-
нов — например, «адренергические нейроны», «ГАМК ергиче-
ские» и т. д. Но под подобными терминами разные авторы пони-
мают разные вещи! Если бы речь шла, условно говоря, об Х-ер-
гических синапсах, то тут все было бы совершенно однозначно.
Говоря же об Х-ергических нейронах, одни авторы имеют в виду
нейроны, выделяющие медиатор X, а другие авторы — нейро-
ны, реагирующие на медиатор X.
368
Глава 5
Это обстоятельство надо иметь в виду при работе с литерату-
рой. Мы же вообще воздержимся от употребления подобных тер-
минов вследствие их двусмысленности.
В ЦНС наибольшую активность hNO-C демонстрируют ней-
роны коры мозжечка — клетки-зерна и корзинчатые клетки В
подкорковых ядрах и в коре больших полушарий примерно
1-2 % нейронов также способны к образованию NO.
При этом NO может выполнять в мозгу две функции.
а) В первом случае он служит классическим внутрикле-
точным мессенджером (типа цАМФ и цГМФ), образующимся
в ответ на раздражение нейрона каким-то нейромедиатором —
чаще всего глутаминовой кислотой или ГАМК.
б) Во втором случае NO сам является нейромедиатором
(передатчиком сигнала в синапсах), но весьма необычным В от-
личие от прочих нейромедиаторов, он выделяется из пресинап-
тического окончания не путем экзоцитоза (п. 4.2.3.2), а путем
простой диффузии. И действует не на специфические рецепторы
в постсинаптической мембране, а диффундируя через эту мем-
брану к цитоплазматической (растворимой) гуанилатциклазе.
Приведем примеры этих двух «ипостасей» NO в мозгу.
5.3.3.6. NO как внутриклеточный мессенджер в мозге
Такую функцию NO выполняет, в частности, в тех нейро-
нах, которые имеют NMDA-рецепторы глутаминовой кисло-
ты (рис. 5.20). Как указывалось в табл. 5.8,А, эти рецепторы
являются ионотропными и при их раздражении открываются
ионные каналы — в том числе каналы для Са21.
Увеличение же внутриклеточной концентрации Са2’ акти-
вирует hNO-C (расположенную на внутренней поверхности
плазмолеммы либо, по другим данным, в цитозоле).
Последующие, уже знакомые нам события (см. рис. 5.16)
приводят к активации ПК-G.
Дальнейшее неизвестно. Но поскольку глутаминовая ки-
слота является возбуждающим медиатором, то можно предпо-
ложить, что, как и в сетчатке глаза, ПК-G повышает проводи-
мость Na'-каналов: последние открываются, и постсинаптиче-
ский нейрон переходит в состояние возбуждения (чему соответ-
ствует деполяризация мембраны).
Независимо от точного механизма последней стадии, полу-
чается, что здесь сочетаются ионотропный и метаботропный
принципы передачи сигнала.
Есть еще один важный момент. Согласно табл. 5.8,А, с на-
рушением функционирования глутаматергических синапсов
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
369
5 2U «часдл МОв
селачь сигнал л ч. I •» NMUA
рецепторы Ipytwwra ^Глу)
связано такое тяжелое заболе-
вание, как эпилепсия. Соот-
ветственно, оказывается во-
влеченным в патогенез этого
состояния и NO: его количе-
ство в мозгу оказывается по-
вышенным.
Мало того, длительная ги-
перактивность указанных си-
напсов приводит к дегенерации
и гибели нейронов, что обозна-
чается как глутаматная ней-
ротоксичность. Непосред-
ственной причиной, вероятно,
является токсическое действие
высоких концентраций NO (по-
добно тому, как это имеет место
в макрофагах).
Считают, что данный фе-
номен — один из факторов раз-
вития нейродегенеративных
заболеваний ЦНС: болезни
Паркинсона, болезни Альц
геймера и даже ишемического
инсульта.
5.3 3 7 NO как нейромедиатор
Функционирование NO в качестве нейромедиатора предпо-
лагается для некоторых ядер гипоталамуса. Имеются в виду те
ядра, которые образуют т. н. аркуатновентромедиальный ком
плекс (рис. 5.21) и содержат небольшие по размеру нейроны (в
отличие от крупноклеточных ядер — супраоптических и пара-
вентрикулярных ).
К ядрам указанного комплекса подходят аксоны, образую-
щие адренергические синапсы. Согласно излагаемым предста-
влениям (отнюдь не окончательным), в ядрах содержатся нейро-
ны двух типов (рис. 5.22).
Нейроны первого типа воспринимают адренергические сиг-
налы и в ответ вырабатывают NO.
Последний как медиатор действует на нейроны второго ти-
па и, запуская длинную цепочку событий, стимулирует секре-
цию этими нейронами определенных либеринов (по прежней
номенклатуре — рилизинг-факторов) или статинов (см.
370
Глава 5
»*ис. 5.21. Ги г.И’авГО-гис 4’И-
эйлл смет и. (пи Б В
1 -янсоны, Гра а1* черт-
четкие синапбМ И гилбуаллмусс;
2 - к, куа>ноwht,*•').« диалькый кОм
плцс ,щ, гилоталчяп.-j;
j - J*ccxa- .,'*.Hi^, сЛМСЫ;
М '• Одедом л Л* г > .• офй-за с сетью |
?вх'Ринных к .«иллкров:
,5 супраоптические и пй, _мигам-
х^ЧгЯые МП» гярото<*йму<га;
6 ’ levemwwozm гиа»>ф««за и в чвй -
*®че гаапЫШ>е сэя»псы
* -— - *> , X
табл. 5.1,А). Вероятно, при
этом разные либерины и
статины выделяются раз-
ными же группами клеток
второго типа.
Сама секреция происхо-
дит в т. н. аксовазальных си-
напсах медиального возвы-
шения (см. рис. 5.21), т. е. в
окончаниях аксонов на пер-
вичных капиллярах пор-
тальной системы гипофиза.
По портальной вене либери-
ны и статины достигают пе-
редней доли гипофиза, где
влияют на секрецию соот-
ветствующих гормонов.
Итак, нейроны первого
типа, выделяя NO, стимули-
руют секрецию либерина
или статина. По крайней ме-
ре, так, видимо, регулирует-
ся секреция одного из либе-
ринов — люлиберина, или
ЛГРФ (ЛГ-рилизинг-факто-
ра), т. е. пептида, стимули-
рующего выработку ЛГ в ги-
пофизе и контролирующего таким образом овуляцию (у женщин).
Но в этой регуляции имеется и второй, сдерживающий,
компонент. Согласно излагаемой модели (см. рис. 5.22), к ней-
ронам второго типа аркуатновентромедиального комплекса под-
ходят также аксоны из других отделов мозга, образующие тор-
мозные, ГАМК-ергические синапсы. Так вот, активность этих
окончаний модулируется нейронами первого типа через аксоак-
совальные синапсы. И опять-таки с помощью NO.
А именно, NO, диффундируя в аксоны тормозных нейро-
нов, каким-то образом стимулирует выработку ГАМК, что в ко-
нечном счете ограничивает секреторную активность люлибе-
рин-продуцирующих клеток.
Разобравшись в этих непростых межклеточных взаимоот-
ношениях, далее следовало бы понять, как конкретно реализу-
ются указанные влияния NO:
- стимуляция секреции люлиберина аксонами одних клеток
- и стимуляция секреции ГАМК аксонами других клеток.
ПРРРДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
371
НЕЙРОН
ВТОРО! О
ТИПА
НЕЙРОН
ПЕРВОГО
ГНИЛ
Uhwvi.iiih
I \А к
иАМФ
цГМФ
! (?)
Ф
Рис. 5.22. Участие МО в секреции люлиберина гипоталамусом
АР - адренорецептор. нНР-С нейрональнаясинтаза. и
САМК-Р - рецептор ГАМЕ. рГЦ - растворимая гуанилатциклвза
ПК-G и ПК-А — протеинкиназы G и А, ФЛ-Aj — фосф' липаза Aj,
ЦОС циклооксигеназа. АЦ зденилатниклззэ t
Аргинин
АЦ
! АМК-Р
ПРОГ BE 1 СОСУДА
Арахидоновая
кислота
Аксовазальпып
синапс
372
Глава 5
Остановимся лишь на первом из этих эффектов. Как пока-
зано на рис. 5.22, здесь, видимо, запускается длинная регуля-
торная цепочка, в которой, помимо NO, последовательно обра-
зуются четыре внутриклеточных месенджера цГМФ, ио-
ны Са2‘, простагландин Е2 (ПГ-Е2) и цАМФ.
Так, NO, активируя рГЦ, вызывает обычным способом
накопление цГМФ и активацию ПК-G. Прямо (путем непо-
средственного фосфорилирования Са2 -каналов) или скорее
всего косвенно (как отмечалось в п. 5.3.3.4) это приводит, в
свою очередь, к повышению внутриклеточной концентрации
ионов Са2'.
Заметим: NO-синтаза, также зависящая от Са2’, согласно
излагаемым представлениям, локализована в другой клетке
(нейроне первого типа). Именно это обстоятельство и делает воз-
можной такую последовательность, когда NO накапливается в
клетке (нейроне второго типа) прежде возрастания в ней [Са2 ] и
затем сам способствует такому возрастанию.
«Пойдем» по цепочке дальше. Ионы Са2* активируют фос-
фолипазу А2 (ФЛ-А2). Этот фермент, разрывая определенную
связь в фосфолипидах мембран, выщепляет из их состава арахи
доновую кислоту — полиненасыщенную жирную кислоту
(С2О:4; п. 4.1.2.2).
Ее преобразование в очередной внутриклеточный мессен-
джер вновь контролируется оксидом азота. Последний активи-
рует не только рГЦ, но и еще один фермент — циклооксигеназу
(ЦОГ). Последняя же необходима для превращения арахидоно-
вой кислоты в ПГ Е2.
Наконец, ПГ-Е2 активирует аденилатциклазу, т. е. ведет к
накоплению цАМФ — последнего посредника в этой цепочке.
И уже цАМФ (очевидно, через протеинкиназу А) служит
непосредственным стимулом для секреции люлиберина. Каким
образом? Это, к сожалению, остается неясным.
Следовательно, начав с вопроса «каким образом?», мы по-
сле длительного описания опять к нему же и пришли.
Тем не менее вышеизложенная цепочка весьма поучи-
тельна. Она показывает, насколько тесно связаны друг с дру-
гом различные внутриклеточные регуляторы и что измене-
ние концентрации одного из них может вызывать изменение
концентраций других регуляторов. По данной причине кле-
точные ответы на действие внешних сигналов, видимо,
часто включают не какой-то один конечный эффект, а це-
лую гамму различных эффектов (обусловленных разными
мессенджерами).
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
373
5.3.3.8. NO в периферической нервной системе
Как отмечалось в табл. 5.11, NO функционирует не только в
центральной, но и в периферической нервной системе.
В последнем случае имеется в виду проведение сигнала в хо-
линергических синапсах, образуемых постганглионарными
окончаниями парасимпатической нервной системы на глад-
ких миоцитах внутренних органов (см. табл. 5.7). Выделение
ацетилхолина в этих синапсах сопровождается увеличением
концентрации NO в синаптической области.
Где конкретно образуется NO — в нервных окончаниях или
в гладких миоцитах, — неясно. Второй вариант вполне возмо-
жен: NO-синтаза обнаружена и в миоцитах.
Как мы знаем (см. табл. 5.7), в указанных синапсах содер-
жатся ж холинорецепторы (м ХР), функционирующие по ме-
таботропному типу. Имеется много разновидностей этих ре-
цепторов, и с некоторыми из них мы уже встречались
(п. 5.3.2.2). Не исключено, что другие разновидности м-ХР тем
или иным способом связаны с NO-синтазой. Тогда NO, образуясь
в миоцитах, выступает в них в качестве внутриклеточного
мессенджера.
Это могло бы объяснить тот факт, что NO вовлечен в регуля-
цию функций желудочно-кишечного тракта, бронхов, мочепо-
ловой сферы (см. табл. 5.11).
В частности, NO участвует в развитии эрекции мужского
полового члена. Конкурентные же ингибиторы NO-C (например,
метил L-аргинин) предупреждают или прекращают эрекцию.
Данное действие реализуется не на уровне ЦНС, а на перифери-
ческом уровне.
5.3.3.9. Цитотоксическое действие NO
При больших концентрациях NO становится цитотоксич-
ным. Это, как уже отмечалось, может происходить и за счет ней-
рональной NO-C — при избыточной глутаматной стимуляции со-
ответствующих клеток мозга. Но чаще всего высокие концентра-
ции NO создаются после активации синтеза в клетках (макрофа-
гах, гепатоцитах и т. д.) индуцибельной NO С (uNO С) Это имеет
место при воспалительных, иммунных и других реакциях.
Наиболее известные и эфффективные индукторы
uNO C — цитокины (см. табл. 5.5): интерлейкин-1 (ИЛ 1),
фактор некроза опухолей а (ФНО-а), ^ интерферон.
При этом стимуляция, по имеющимся данным, происходит
на уровне не только транскрипции гена hNO-C, но и трансляции
мРНК. В случае транскрипции действие индукторов опосреду-
374
Глава 5
ется определенным транскрипционным фактором — NF-kB
(от nuclear factor kB).
В итоге в клетке активно образуются и фермент (hNO-C), и
продукт (NO) катализируемой им реакции.
Каковы механизмы токсического действия NO? — Их
несколько. Токсическим агентом может выступать как сам NO,
так и продукты его превращений.
а) NO имеет высокое сродство к железо- и к серусодержа-
щим веществам.
Так, он активно связывается с гемами соответствующих
белков — гемоглобина, цитохромов и др. Это неудивительно:
гем содержится и в ферменте, синтезирующем NO (NO-C), и в ос-
новном объекте регуляторного действия NO (рГЦ).
Кроме того, NO имеет высокое сродство к белкам с т. н. же-
лезосероцентрами (рис. 5.23). К подобным белкам, в частно-
сти, относятся:
- аконитаза один из ферментов цикла Кребса (конеч-
ного пути распада большинства метаболитов);
- рибонуклеотидредуктазный ферментный комплекс,
необходимый для образования нуклеотидов — предше-
ственников ДНК.
! Рис. 5.23. ДО с S
1 >»"леза-се₽оцентрол< Чмлка 3
•Цис - остатки цис I о ина й
.. _• • -тг in । (mt rTf-
Что касается гемоглоби-
на, то в кровеносном русле его
столь много, что связывание
его небольшой части с NO не
страшно. Однако для прочих
вышеназванных веществ на-
копление в клетках NO опас-
но. В итоге в токсических кон-
центрациях NO блокирует
важнейшие внутриклеточные
процессы:
образование энергии
в цикле Кребса и цепи перено-
са электронов;
- синтез ДНК и кле-
точное деление.
б) Теперь обратимся к
продуктам превращений NO.
Надо сказать, NO — ко-
роткоживущее вещество: его
молекулы исчезают через не-
сколько секунд после образо-
вания.
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
375
В обычных условиях основная масса NO окисляется до ни-
тритов (NO2 ) и нитратов (NO3 ). Именно их — эти стабиль-
ные вещества, - а не сам NO, определяют во многих исследова-
ниях NO-синтазы: прямая детекция NO гораздо более сложна.
Нитриты и нитраты при очень высокой активности hNO-C,
видимо, могут накапливаться в таких концентрациях, при кото-
рых уже проявляется их токсическое действие. В частности, с
их участием образуются нитрозосоединения, способные по-
вреждать ДНК, выщеплять аминогруппы и образовывать
сшивки между цепями.
Не менее опасно другое превращение NO — его реакция с
супероксидным радикалом О2 •
Рис. Стадии одиоэлея
тронного восстановления
кислорода
Откуда в клетке берется су-
пероксид? Прежде чем отве-
тить на этот вопрос, скажем,
что это один из промежуточных
продуктов последовательного
одноэлектронного восстановле-
ния молекулярного кислорода
(рис. 5.24).
Такие продукты могут об-
разовываться под действием
облучения, а также в ходе не-
которых окислительных реак-
ций. Причем среди последних
фигурирует и та, что катализи-
руется NO-синтазой! При неко-
торых условиях (например,
при недостатке кофермента Щ-
биоптерина; см. рис. 5.18) дан
ный фермент продуцирует
одновременно и NO, и супер-
оксид.
Супероксид (как и другие
промежуточные продукты,
фигурирующие на рис 5.24) —
опасный окислитель с высо-
кой реакционной способно-
стью. В частности, эти радика-
лы могут переокислять мемб-
ранные липиды, что нарушает структуру мембран.
В связи с этим в клетках присутствуют ферменты, нейтра
лизующие супероксид:
376
Глава 5
— супероксиддисмутаза превращает его в пероксид водо-
рода;
- последний же, в свою очередь, каталазой и глутатион-
пероксидазой окисляется в воду.
Но если в клетке имеются высокие концентрации NO, то
эти ферменты вряд ли успевают «сработать». Супероксид мгно-
венно реагирует с NO, образуя еще более опасный окислитель —
пероксинитрит (O=N—О—О ).
Кроме того, последний может разлагаться на гидроксильный
радикал (ОН) и диоксид азота (NO2). Первый «фигурант»
рис. 5.24, второй тоже обладает цитотоксическим действием.
Таким образом, высокоактивная иИО-синтаза в макрофа-
гах является очень мощным «оружием», образующим целую
гамму токсичных агентов NO, супероксид (при некоторых
условиях), нитриты, нитраты, нитрозосоединения, пероксини-
трит, гидроксильный радикал, NO2 (рис. 5.25).
Если это «оружие» направлено против чужеродных аген-
тов, — хорошо. Однако, как отмечалось, hNO-C может по-
являться и в ряде других клеток. Тогда все вышеперечисленное
порой приводит к гибели этих клеток.
Таков же, как мы знаем, результат избыточной активности
и нейрональной NO-C при т. н. глутаматной нейротоксичности,
с чем связан ряд нейродегенераторных заболеваний, в т. ч. бо-
лезнь Паркинсона (п. 5.3.3.6). Очевидно, при этом действуют те
же агенты, которые показаны на рис. 5.25.
Есть данные, что, по край-
ней мере, некоторые из этих
агентов (в частности, перокси-
нитрит) образуются и в сосудах,
т. е. при участии эндотелиаль-
ной NO-C.
В завершение упомянем
неожиданную деталь: оказыва-
ется, возможно не только оки-
сление NO в нитриты и нитра-
ты, но и обратное превраще-
ние восстановление нитри-
тов и нитратов в NO. Восста-
новителями при этом могут
служить гемоглобин, миогло-
бин, некоторые цитохромы.
Причем, по некоторым данным, интенсивность такого образо-
вания NO значительно выше той, что обеспечивается NO-синтазой.
NO
Нитриты,
нитраты
NO-синтаза
Супероксид
Пероксинитрит
Нитрозо-
соединения
N02 Гидроксиль-
ный радикал
Рис. 5.2,». Токсические агенты,
образующиеся при высокой ак-
тивности Н0-сйитазы
ПРРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ 377
Действительно ли это так, еще предстоит разобраться. Но
кажется очевидным, что сигнальные и регуляторные функции
fjO связаны все-таки с NO-синтазой.
5.3.4. Пути, опосредованные липидами
(ДАГ ИТФ) и ионами Са2
5.3.4 1. Введение
Еще одна неожиданность последних 10-15 лет — обнаруже
ние того факта, что вторичными мессенджерами во внутрикле-
точных регуляторных путях могут быть и определенные липиды.
Действительно, липиды (за исключением стероидных гор-
монов и простагландинов) обычно рассматривались как второ-
степенные вещества, пригодные лишь для построения мембран
да разрушения в качестве высококалорийного «топлива».
Оказалось же, что очень многие из них, начиная со свобод-
ных жирных кислот, влияют на самые разные внутриклеточные
процессы. Конечно, еще предстоит огромная работа по исключе-
нию из всех этих данных неизбежного информационного «шу-
ма» (о котором мы говорили в п. 5.1). Но уже есть и устоявшие-
ся, многократно проверенные и общепризнанные результаты.
Сюда, в первую очередь, относятся основные представления о
тех регуляторных путях, которые включают фосфолипазу С
(ФЛ С) и продукты катализируемой ею реакции.
В наиболее общем виде эти пути показаны на рис. 5.26.
5.3.4.2. Активация фосфолипазы С
Связывание сигнального вещества с мембранным рецепто-
ром приводит к активации упомянутого фермента — ФЛ-С. По-
следний, как аденилатциклаза, находится на внутренней по-
верхности плазмолеммы. Механизм же активации зависит от
изоформы ФЛ-С.
а ) Так, если это 0-изоформа (ФЛ-Ср), то
- сигнальным веществом служит гормон;
- рецептор, подобно Р2-адренорецептору (п. 5.3.1.2), —
интегральный белок, чья пептидная цепь 7раз «проши-
вает» плазмолемму;
трансмиттером является G белок стимулирующего
типа (обозначаемый Gp), который функционирует почти
так же, как Gs-6eaoK (п. 5.3.1.1), и, в частности, активи-
рует ФЛ-С с помощью диссоциирующей а-субъединицы.
378
Глава 5
Сигнальное вещество
Е'нф
Е'ф
Плазмо-
лемма
Эндон. ia зматический
ретикулум
L
О
#1
(ИТФ.^П и С*
«•птор; |ЙЙ-С - фовф^лилаза С; ПК-С — протеинкмназа С;
ФочФатидипиноэитдифо фат, ИТФ — инозитом$4>- ?*>.
£-Т — диацилг ЧМ'Фрид; PMSt*1 Е’ ивф юфорилиропаина» и фЬСф
б) Иные свойства у системы, связанной с J-изоформой ФЛ-
С (ФЛ-Су):
- здесь в качестве сигнального вещества обычно (хотя не
всегда) выступает один из факторов роста (см.
табл. 5.6);
- рецепторный белок лишь один раз «прошивает» мем-
брану; причем у его цитоплазматического домена (или у
связанных с ним белков) имеется тирозинкиназная ак-
тивность — разновидность протеинкиназной активно-
сти, при которой в белке-мишени фосфорилируются ос-
татки тирозина;
- именно фосфорилирование данным доменом у формы
ФЛ-С приводит к активации последней.
5.3.4.3. Действие фосфолипазы С
Основной субстрат активной ФЛ С — мембранный липид с
довольно сложным названием: фрсфатидилинозитдифосфат
(ФИД, рис. 5.27).
В принципе, это типичный амфифильный липид наподобие
тех, что были описаны в п. 4.1.2.1. В его основе, как и у фосфо-
липидов, — фосфатидная кислота (глицерин, связанный с
ПррРДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
379
двумя остатками жирных кислот и фосфатной группой). А все
отличие от фосфолипидов состоит лишь в том, что вместо азоти-
стого основания имеется шестиатомный спирт инозит (с двумя
фосфатными группами). Отсюда и складывается вышеприведен-
ное название вещества.
ФЛ-С гидролизует связь между глицерином и фосфатным
остатком. В результате ФИД расщепляется на два соединения:
полярное (даже заряженное благодаря ионизации фос-
фатных групп) — инозиттрифрсфат (ИТФ);
— и преимущественно неполярное — диацилглицерин
(ДАГ).
Заметим: в принципе фосфолипазами С называются фер-
менты, гидролизующие указанную связь (между глицерином
и фосфатным остатком) в любых фосфолипидах. Так, напри
мер, ФЛ-С найдена в токсине некоторых бактерий (клостри-
дий и др.).
Однако ФЛ-С, фигурирующая в рассматриваемой регуля-
торной системе, не вызывает массового разрушения мембран-
ных фосфолипидов. Это означает, что данный фермент обладает
весьма высокой субстратной специфичностью и что название
«фосфолипаза С» не полностью отражает его свойства.
380
Глава 5
Еще одна особенность данного фермента состоит в том, что
для проявления его активности необходимы ионы Са2'.
5.3.4 4. Действие ИТФ и ДАГ
Описывая рис. 5.26, мы дошли до продуктов реакции, ката-
лизируемой ФЛ-С.
а) ИТФ (инозиттрифосфат) как полярное вещество являет-
ся гидрофильным и потому свободно диффундирует во внутри-
клеточном объеме. Связываясь с Са' -каналами плазмолеммы и
эндоплазматического ретикулума, ИТФ переводит их в откры
тое состояние. В результате в цитозоле повышается концен-
трация Са2*.
Таким образом, действие ИТФ всецело опосредовано иона-
ми Са2' и включает все те эффекты, которые стимулируются
в данной клетке этими ионами.
Получается своего рода прямая положительная связь: ио-
ны Са2' необходимы для образования ИТФ, а образование ИТФ,
в свою очередь, способствует увеличению [Са2*].
Впрочем, в регуляции содержания Са2' имеются и другие
связи, например обратные отрицательные (о некоторых из них
мы скажем чуть позже). Все эти сложные влияния приводят к
тому, что в некоторых клетках возникают довольно устойчивые
колебания (осцилляции) концентрации ионов Са2'.
б) ДАГ (диацилглицерин) — второй продукт фосфолипаз-
ной реакции. Будучи неполярным, а значит, гидрофобным, это
вещество, видимо, способно лишь к латеральной диффузии в
составе плазмолеммы.
Но и этого оказывается достаточным, чтобы найти и акти-
вировать еще один мембраносвязанный регуляторный фер-
мент — протеинкиназу С (ПК-С).
Мы уже знаем две протеинкиназы со сходным буквенным
обозначением: ПК-A (зависимую от цАМФ; п. 5.3.1.1) и ПК G
(зависимую от цГМФ; п. 5.3.2.1). Теперь, следовательно, речь
идет о другой ПК — зависимой от ДАГ.
У ПК-С в разных клетках — множество белков мишеней.
Следовательно, о ДАГ можно сказать примерно так же, как вы-
ше было сказано об ИТФ, а именно: совокупность эффектов,
вызываемых ДАГ в клетке, определяется спектром действия
ПК-С в этой клетке.
Заметим, что субстратом ПК-С может быть и ФЛ-С (все изо-
формы или, по крайней мере, одна из них). Это создает в регуля-
торной цепи обратную связь, но характер ее и значение пока не
вполне ясны.
ПЕРЕДАЧА внешнего сигнала в клетку
381
Подведем итог. Если внеклеточное сигнальное вещество,
связываясь с клеткой, активирует ФЛ-С, то конечный резуль-
тат складывается из эффектов действия ПК С и ионов Саг\
Что же касается самих регуляторных липидов (ИТФ и ДАГ), то,
очевидно, они должны не только образовываться, но и исчезать
из среды. Последнее происходит с помощью достаточно обыч-
ных метаболических преобразований, на которых мы не будем
останавливаться.
5.3 4.5. Стимуляция симпатомиметиками
сокращений миоцитов
В качестве возможного примера ФЛ-С-опосредованной ре-
гуляции приведем действие норадреналина на а, адренорецеп
торы, расположенные на гладких миоцитах ряда сосудов (см.
табл. 5.7). Напомним:
р2-адренорецепторы связаны с G,-белком, который акти-
вирует аденилатциклазу (АЦ) (см. рис. 5.8 и 5.9),
а2-адренорецепторы связаны с G.-белком, ингибирую-
щим АЦ (см. рис. 5.11).
В отличие от этого, 04-адренорецепторы (04ЛР) связаны с
Ср-белком, который активирует ФЛ-Ср(рис. 5.28).
В результате при стимуляции агАР в миоците должны воз-
растать [Са2 ] и активность ПК-С.
Дальнейшее в точности неизвестно. Однако не исключено,
что происходит нечто подобное тому, что было изображено на
рис. 5.9.
Имеется в виду, что в гладких миоцитах ключевую роль
играет миозинкиназа (51 К) — специфическая ПК, которая фос-
форилирует в толстых миофиламентах головки миозина и тем
самым придает им способность взаимодействовать с тонкими
миофиламентами.
Чтобы МК стала активной, необходимы два условия:
- ее предварительное дефосфорилирование (поскольку
она сама тоже может фосфорилироваться под действием
ПК А);
и наличие нагруженного ионами Са2 кальмодулина.
Второе условие при активации ФЛ-С, очевидно, выполняет-
ся. А первое?
Для того, чтобы картина была «изящной» и законченной,
хотелось бы, чтобы «на общее дело работали» оба промежуточ-
ных результата не только повышение [Са2], но и активация
ПК-С.
382
Глава 5
Норадреналин
Ср’белок гладкий МИОЦИТ.
КМ-С а* МК™
(Активный комплекс}
<*мс. Б .28. 9 'змзж’1* » меха- ;
инам спастического ц- 4стчи« I
норадреналина
г, -АР — щ -адренорецептор,
РП-Ср — фосфолипаза С
{$-изоф«»р>ла>,
^•'Д - фосфятм^линозатдм-
? Фосфа г,
’ИТФ — инозиттриф кфа г
ДПС — эндоплазматическая сеть, «
ЛХГ - диацилглицерии,
TlK-C протеинкииаэа С,
КМ — кальмодулин,
МК — миозинкиназа
Из этого желания рожда-
ются разные предположения:
о том, что ПК-С прямым или
косвенным образом
- инактивирует ПК-Д
либо
активирует ПФ (про-
теинфосфатазу, переводящую
МК в дефосфорилированное
состояние).
Именно эти предположе-
ния и кроются за вопроситель-
ным знаком на рис. 5.28.
Однако жизнь не всегда
отвечает нашим представле-
ниям о порядке и красоте —
предлагая совершенно нео
жиданные решения. Так что
в действительности вторая
«ветвь» приведенной схемы
может быть совсем иной — и
даже не связанной с МК.
Но и одной («кальцие-
вой») ветви, возможно, доста-
точно, чтобы сдвинуть равно-
весие в сторону активной МК и
обеспечить фосфорилирование
миозиновых головок.
Как бы то ни было, при
стимуляции а, адренорецеп-
торов миоциты сокращаются
и просвет соответствующих
сосудов суживается. Тогда
как раздражение Р2-адрено-
рецепторов приводит (через
инактивацию МК путем фос-
форилирования) к рассла-
блению миоцитов и расшире-
нию сосудов (п. 5.3.1.3). Та-
ким образом, результат дей
ствия норадреналина на
миоциты зависит от того, адренорецепторы какого типа
преобладают на этих миоцитах.
рРРРДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА в КЛЕТКУ 383
5.3.4.6 а2-Адренорецепторы эндотелиоцитов и
расслабление миоцитов
Мы все чаще сталкиваемся с «интерференцией» различных
регуляторных путей, т. е. с их пересечением и взаимодействием.
Так в только что рассмотренном примере подразумевалось
«противостояние» в миоците двух регуляторных процессов:
- запускаемого Р2-адренорецепторами и опосредованного
цАМФ;
- запускаемого cq-адренорецепторами и опосредованного
липидами (ФИТ, ДАГ) и ионами Са *.
Приведем для процессов второго типа (которые более крат-
ко можно называть ФЛ-С опосредованными) еще один пример
такой связи Речь пойдет об очередном варианте адренергиче-
ской регуляции.
Известны следующие факты (рис. 5.29).
а) В эндотелии ряда сосудов имеются сс2-адренорецепторы;
причем при стимуляции последних адреналином
- на апикальной стороне клетки с помощью G.-белка тор-
мозится АЦ (аденилатциклаза; см. рис. 5.11),
• с базальной стороны начинает секретироваться ЭФР (эн-
дотелиальный фактор релаксации), содержащий NO
(п. 5.3.3.4).
б) Проникая в миоциты, NO вызывает их расслабление,
причем
- цГМФ (продукт растворимой гуанилатциклазы, рГЦ),
активируя ПК-G, одновременно ингибирует ПК-С,
- причиной расслабления является не только повышение
проницаемости К'-каналов и гиперполяризация мем-
браны, но и (как утверждалось в п. 5.3.3.4) снижение
концентрации Са1* в цитозоле.
Как видно, здесь комбинируются, по крайней мере, три ти-
па регуляторных цепей:
а) цАМФ-опосредованный,
б) NO и цГМФ опосредованный,
в) ФЛ-С-опосредованный (поскольку ПК-С — компонент
этого типа путей).
Неясными остаются только некоторые промежуточные ста-
дии (отмеченные на рисунке многоточиями). Попробуем пред-
ставить, какими они могли бы быть.
а) Связь между АЦ и эКО-С в эндотелиоцитах. Непо-
средственными результатами действия АЦ являются, как мы
знаем, увеличение концентрации цАМФ и затем активация
384
Глава 5
(ПРОСВЕТ СОСУДА) Адреналин
fa Ж %
<'г-*!с:-^'Й>|у->тторы (С:?-ДР; :ЖДОгелия
ГМ - эДВНилэтцИНла а; ЙМО С — эндотйл мал иная NQ-синтааа
jffiy1 - зндотелидеьныйфркго# эеламсацин;
НМ — Saawuwi мембрана; рГЦ - растворимая гуонила^циклээа,
Ж-Ц проч им<^^б.; с JSf№^V'!2,^S' иийда.о.и-
ПК-A. Так что ПК-А должна каким то образом (опять-таки пря-
мым или косвенным) ингибировать aNO С.
Действительно, тогда при раздражении а2-адренорецепто-
ров активности АЦ и ПК-A падают, а образование NO вслед-
ствие этого возрастает.
б) Связь между ПК С и ионами Са2 в миоцитах (в том смы-
сле, что увеличение активности ПК-С ведет к повышению [Са2']).
Как отмечалось в п. 5.3.4.4, ПК-С способна фосфорилиро-
вать и ФЛ-С. Если это ведет к активации ФЛ-С, то возрастает и
концентрация ИТФ, открывающего Са2'-каналы.
В рассматриваемой же ситуации (см. рис. 5.29) ПК-С ин-
гибируется (под влиянием цГМФ), что должно вести к дефос-
форилированию ФЛ-С, снижению уровня ИТФ и закрытию
Са2,-каналов.
Таким образом, в обоих случаях получается, что одна регу-
ляторная цепочка подавляет другую:
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ 385
- в эндотелиоцитах цАМФ зависимая цепь подавляет NO-
и цГМФ-зависимую,
в миоцитах — вторая из этих цепей подавляет ФЛ-С-за
висимую цепь.
Причем при стимуляции а2-адренорецепторов
- первая цепь (цАМФ-зависимая) угнетается,
- вторая — по этой причине активирована,
- третья — вновь угнетена.
Всем этим и определяется конечный эффект, наблюдаемый
в ряде сосудов — расслабление гладких миоцитов при связыва
нии адреналина с а2-адренорецепторами эндотелиоцитов.
Сделаем два замечания.
а) Во-первых, рассмотренный здесь механизм, видимо, не
дублирует спазмолитического действия, реализуемого через Р2-
адренорецепторы:
последнее оказывается нейромедиатором, норадрена-
лином (в окончаниях симпатических путей) непосред-
ственно на миоциты,
- сейчас же речь шла о гормоне адреналине, который по-
ступает с кровью и связывается с эндотелиоцитами.
б) Во-вторых, вовсе не всегда взаимоотношения между раз-
ными регуляторными цепочками носят реципрокный характер.
Как мы видели на рис. 5.22, цепи могут и поочередно активиро-
вать друг друга.
Да и вообще, подразделение сложных внутриклеточных ре-
гуляторных связей на отдельные цепи весьма условно и исполь-
зуется нами больше для удобства изложения.
5.3.4.7. Активация Т-хелперов
Еще одним важным и очень интересным примером ФЛ-С-опо-
средованного процесса может служить активация Т-хелпера при его
взаимодействии с антигенпредставляющей клеткой (АПК). Этот
процесс описывался нами в пп. 4.3.4.3 —4.3.4.4, и там, в частности,
было сказано, что на стадии иммуноспецифического взаимодей-
ствия клеток участвуют следующие поверхностные вещества:
- со стороны АПК — т. н. стандартный корпускулярный
антиген (СКА), т. е. фрагмент переработанного антиге-
на, связанный с антигеном ГКГ-П,
- а со стороны Т-хелпера — рецептор (TCR) и ряд «вспомо-
гательных» белков (CD4, CD3).
Причем в результате такого взаимодействия Т-хелпер начи-
нает синтезировать ИЛ-2 (интерлейкин 2) и затем вступает в
бласттрансформацию.
13-36
386
Глава 5
Так вот, эти эффекты реализуются, по всей видимости, че-
рез фосфолипазную систему (рис. 5.30). И если в примере, изо-
браженном на рис. 5.28, участвует Р-изоформа ФЛ-С, то теперь
речь идет о у-изоформе ФЛ-С. В этом же случае, согласно
п. 5.3.4.2, механизм активации ФЛ-С совсем иной — не через
Gp-белок, а путем фосфорилирования.
Итак, сигнальным веществом служит СКА. Впервые мы
сталкиваемся с ситуацией, когда такую функцию выполняет по-
верхностная молекула другой клетки (АПК).
рРРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
387
Взаимодействие СКА с рецептором (TCR) Т клетки активи-
еТ в последней тирозинкиназы (ТК), которые с цитоплазма-
тической стороны связаны с TCR либо со «вспомогательными»
белками — CD3 и CD4.
ФЛ-Сув неактивном состоянии не прикреплена к мембране,
а свободно находится в цитозоле. Поэтому в процессе своей диф
фузии молекулы ФЛ-Су могут связываться с ТК и подвергаться
фосфорилированию (по остаткам тирозина).
Непосредственные события, следующие за этим, нам знако-
мы: за счет активности ФЛ-Су образуются ИТФ и ДАТ, а благо-
даря этим веществам в Т-клетке
- повышается концентрация ионов Са2' и
- возрастает активность ПК-С (протеинкиназы С).
Дальше начинается та «специфика», которая обусловлива-
ет характер результирующего ответа. Как считают, ПК-С стиму-
лирует Ras-белок (о котором подробней мы скажем в разделе
5.3.6), а тот — каскады т. н. митогенактивируемых протеин-
киназ (МАПК). Это совокупности таких ПК, которые, активи-
руя друг друга (в цепочках Raf—>MEK—>ERK и РАК—> МЕКК —>
JNK), в конечном счете фосфорилируют ядерные транскрип-
ционные факторы (п. 2.4.2), отвечающие за активность гена
интерлейкина 2 (ИЛ-2) и генов митоза — т. н. онкогенов (с fos,
с-тус и пр.).
Это и приводит к образованию ИЛ-2 и к бласттрансформа-
ции, т. е. началу серии митотических делений. Причем ИЛ-2, в
свою очередь, тоже стимулирует деления лимфоцитов.
5.3.5. Пути, опосредованные другими
липидами (помимо ИТФ и ДАГ)
Кроме ИТФ и ДАГ, регуляторные свойства, как уже отме-
чалось, выявлены у многих других липидов. Но, в отличие от
предыдущих внутриклеточных мессенджеров, для этих липи-
дов конкретные регуляторные цепочки пока не расшифрованы.
Т. е. с достоверностью не известно:
с какими рецепторами и как связаны ферменты образова-
ния липидов-мессенджеров,
а также на какие ферментные системы непосредственно
действуют эти липиды.
Имеющиеся же сведения, в основном, ограничиваются
лишь реакциями обмена указанных веществ и перечнем их мно-
гочисленных биологических эффектов.
Таким образом, в этом разделе мы сможем только констати-
ровать, что «пути, опосредованные другими липидами», суще-
388
ствуют (особенно бесспорно это для простагландинов), но поч
ти не сумеем привести ни их общего вида, ни конкретных при
меров.
5.3.5.1. Эйкозаноиды: подразделение на классы
Раньше всего (даже прежде чем для ИТФ и ДАТ) были от-
крыты регуляторные свойства у т. н. эйкозаноидов (рис. 5.31).
Этот термин происходит от греческого слова «двадцать» и
объединяет вещества, происходящие от полиненасыщенной
арахидоновой кислоты (С20.4) и содержащие в силу этого по 20
С атомов.
Как было показано на рис. 5.22, арахидоновая кислота
(АрК) входит в состав некоторых липидов мембран, а выще-
пляется из них под действием фосфолипазы А2 (ФЛ А2). По
следняя, как и множество других ферментов, активируется
ионами Са2'.
Рис S.2i. ЗЛЙрА л исх чиДыи лредлоляга
еыыи спооеб де и г. г в
’W>-A2 - ф). - | А;ЦОГ •- ч»1К1КМ»<.игВНаха:
/ОГ яивокси иназа; АЦ - адонилатциилазл;
АрК, по некоторым данным, сама может выступать в каче-
стве внутриклеточного регулятора (о чем мы упомянем в сле-
дующих пунктах). Но более важно, что она служит источником
образования трех классов эйкозаноидов.
£Pj^A ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ 389
а) Так, с мембранами гладкой ЭПС связан фермент цикло
сигеназа (ЦОГ). Под его влиянием в середине углеводород-
ной цепи АрК замыкается 5-членное (циклопентановое) кольцо.
Образуется один из простагландинов (PG) — наиболее извест
нЫх веществ среди эйкозаноидов.
Название связано с тем обстоятельством, что, как вначале
полагали, PG синтезируются в простате и оттуда попадают в се-
менную жидкость, где они и были впервые обнаружены. Пра-
вда, затэм выяснилось, что в этих представлениях — двойная
ошибка:
- в семенную жидкость PG попадают не из простаты, а из
семенных пузырьков;
главное же, что они (PG) содержатся не только в семен-
ной жидкости, а практически во всех тканях как муж-
ского, так и женского организма.
Путем незначительной модификации исходного PG (но с
участием специальных ферментов!) образуется довольно боль-
шое количество разных PG. В связи с этим различают несколько
подклассов PG: PG-A, PG-E, PG-F, PG-I.
Обычно при этих обозначениях стоит и нижний индекс: на-
пример, PG-E2. Он указывает (как и для эйкозаноидов остальных
классов) на количество двойных связей в структуре вещества.
Некоторые PG, помимо такого обозначения, имеют и соб-
ственное название. Так, PGI> — это простациклин, пожалуй,
самый «популярный» среди PG.
Несмотря на большое сходство структуры, PG разных под-
классов могут оказывать на одну и ту же мишень совершенно
противоположные влияния. Например, одни из них суживают
сосуды, а другие — расширяют.
Другое важное обстоятельство состоит в том, что PG, подобно
оксиду азота (NO), могут диффундировать из одной клетки в со-
седние. Это мы видели, в частности, на рис. 4.27 для простацик-
лина — одного из участников воспалительной реакции. Так что
действие PG может быть и интракринным, и паракринным
б) Более значительная модификация PG приводит к синте-
зу второго класса эйкозаноидов — тромбоксанов (ТХ). При
этом пятичленный цикл PG преобразуется в шестичленный ки-
слородсодержащий цикл.
Название ТХ вновь связано с местом их первоначального
обнаружения — тромбоцитами. И опять-таки действительное
распространение ТХ в тканях, видимо, существенно шире.
в) Отдельной «ветвью» стоит образование третьего класса
эйкозаноидов — лейкотриенов (LT). Здесь АрК (арахидоновая
кислота) подвергается действию не циклооксигеназы (ЦОГ), а
390
Глава s
липоксигеназы (ЛОГ). Это значит, что в ходе окисления АрК
цикл в ее структуре не формируется.
LT впервые обнаружены в нейтрофильных лейкоцитах
откуда и происходит их название. Причем лейкоциты — в са-
мом деле, одни из главных источников LT.
LT по деталям структуры тоже делятся на подклассы. При-
чем нейтрофилы синтезируют вначале LT-А; последний же за-
тем преобразуется в LT иных подклассов:
в самих нейтрофилах или в эритроцитах — в LT-B,
- в эндотелицитах или тромбоцитах — в LT-C.
При этом LT-С содержит в своем составе остаток аминоки-
слоты цистеина.
5.3.5.2. Биологическое действие эйкозаноидов
Каков механизм действия эйкозаноидов? Ясности в этом во-
просе пока нет. Довольно много сведений о том, что PG (проста-
гландины), а возможно, и другие эйкозаноиды влияют на обмен
цАМФ в клетке-мишени, а именно на аденилатциклазу (АЦ)
либо на фосфодиэстеразу (ФДЭ). Причем это влияние может
быть как активирующим, так и тормозящим.
Так, в частности, на рис. 5.22 предполагалось, что PG-E2
стимулирует в определенных клетках гипоталамуса аденилат-
циклазу.
Каким образом это происходит — «изнутри» или «снару-
жи»? Т. е. эйкозаноид
действует непосредственно на АЦ или ФДЭ (со стороны
цитоплазмы)
или первоначально связывается с мембранным рецепто-
ром на внешней поверхности клетки?
Исходя из неполярной природы эйкозаноидов, первое пред-
положение кажется более предпочтительным. Но, с другой сто-
роны, имеются сведения о специфических мембранных рецеп-
торах для LT-С. Возможно, это обусловлено наличием гидро-
фильных цистеиновых остатков в структуре LT-C. Т. е., надо ду-
мать, мембранные рецепторы — исключительная принадлеж-
ность только данной группы эйкозаноидов.
Что же касается биологического действия эйкозаноидов,
то, как уже отмечалось, оно весьма разнообразно и для разных
представителей одного класса данных веществ может быть даже
противоположным.
Поэтому, не перечисляя всех эффектов, приведем лишь не-
которые примеры.
а) Простациклин (PG 12) — участник воспалительной ре-
391
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО сигнала в клетку
акции (см. рис. 4.27). В этом качестве он, образуясь в эндотелио-
цитах, расширяет сосуды и очень сильно ингибирует агрегацию
тромбоцитов.
Известный препарат аспирин тормозит активность ЦОГ
(циклооксигеназы). Благодаря этому, он снижает скорость син-
теза простациклина (впрочем, как и других PG, а также тром-
боксанов). С этим связывают противовоспалительный эффект
данного препарата.
б) Тромбоксан А2, напротив, стимулирует агрегацию тром
боцитов. Причем, когда тромбоциты оказываются в составе аг-
регата, он выделяется из них и, действуя на миоциты (прямо
или опосредованно), обеспечивает спазм сосудистой стенки.
Сходные эффекты вызывает PG-E2 — сужение сосудов и
усиление агрегации тромбоцитов.
в) Простагландины подкласса F стимулируют сужение
бронхов, а простагландины подкласса Е — их расширение.
Сильный бронхоспазм вызывается и лейкотриенами LT-C.
И так далее — список можно еще долго продолжать.
5.3.5.3. Сфингозин и его производные
1. Как мы видели, клеточные мембраны служат источни-
ком появления в цитоплазме уже нескольких видов регулятор-
ных липидов — ДАГ и ИТФ (см. рис. 5.26), а также эйкозаноидов
(см. рис. 5.31). Но, оказывается, этим список не исчерпывается.
Среди основных групп мембранных липидов в п. 4.1.2.1 бы-
ли названы сфинголипиды — вещества, включающие, помимо
прочего, сфингозин (двухатомный аминоспирт с длинным
углеводородным «хвостом»). Наиболее часто они представлены
сфингомиелинами (СМ), где в качестве азотистого основания
выступает холин.
Так вот, продукты последовательного разрушения СМ
(рис. 5.32) опять-таки являются вторичными мессенджерами!
Которые как регуляторы вызывают вполне определенные и
сильные эффекты.
Что это за вещества? — Прежде всего, из СФ под действием
сфингомиелиназы образуются церамиды (Цр). Это сфингозин,
связанный с тем или иным остатком жирной кислоты. Посколь-
ку сфингозин сам содержит один углеводородный «хвост», а
кроме того — еще и полярные группы, то Цр весьма напомина-
ют по строению ДАГ (диацилглицериды; рис. 5.27). В частно-
сти, они тоже являются, в целом, неполярными, а значит, и ги-
дрофобными веществами.
392
Гпава 5
I Wc .‘5Л2, Образование из сфи^г^иелиноя отооичны>
> мессенджеров
Hi*. MTOjok жирном кислоты; Ф - фосфатная группа
Затем фермент церамидаза может расщеплять Цр, приводя
к высвобождению сфингозина (Сгз). И, наконец, последний
способен переходить (под действием сфингозинкиназы) в фос-
форилированное состояние — сфингозин-1 фосфат (Сгз-1-ф).
В принципе все эти вещества (Цр, Сгз и Сгз-1-ф) могут обра-
зовываться не только из мембранных сфингомиелинов, но и в
результате синтетических (анаболических) процессов. Это, соб-
ственно, и имеет место на промежуточных стадиях синтеза мем-
бранных СМ.
Но данный синтез, как и образование многих других липи-
дов, происходит в эндоплазматической сети. Поэтому функцию
регуляторов выполняют, видимо, лишь продукты распада мем-
бранных СМ, поскольку только они могут контактировать с
объектами регуляции.
2 Конечные биологические эффекты, вызываемые цера
мидами и сфингозином, во многом совпадают или перекрыва-
ются. Эти эффекты, в основном, развиваются в делящихся
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
393
клетках и касаются принципиального выбора, периодически
возникающего перед каждой такой клеткой:
а) делиться дальше,
б) вступать в дифференцировку, прекратив делиться,
в) или, на основе анализа внутренних и внешних данных,
запустить программу самоуничтожения — апоптоза.
Как видно из рис. 5.32, церамиды и сфингозин — мессен-
джеры, «уводящие» клетку с первого пути (дальнейшего деле-
ния) на один из двух остальных путей (дифференцировку или
апоптоз).
А у сфингозин-1-фосфата — в основном, противоположное
действие: поддержание клетки в делящемся состоянии за счет
угнетения дифференцировки и апоптоза.
Кажется удивительным, что присоединение к сфингози-
ну одной фосфатной группы так сильно меняет его регулятор-
ные свойства. Но мы уже не раз сталкивались с подобными
явлениями:
- фосфорилирование белков резко изменяет их актив-
ность,
- образование фосфатной группой в молекуле АМФ вто-
рой связи с рибозой приводит к образованию цАМФ —
самого знаменитого мессенджера, и так далее.
5.3.5.4. Действие фактора некроза опухолей
Опять возникает вопрос о механизме, действия — в данном
случае сфингозина и его производных. В этом пока остается
много неясного. Но в некоторых своих частях картина начинает
прорисовываться.
Вот, например, как можно представить участие сфингозина
(и церамидов) в апоптозе опухолевых клеток (рис. 5.33). Та-
кой апоптоз инициируется фактором некроза опухолей
(ФНОа, табл. 5.5), который взаимодействует со специальным
рецептором (Rl-ФНОа), имеющимся на поверхности многих
клеток.
Цитоплазматические домены рецептора обозначаются как
«домены смерти». Когда они переходят в возбужденное состоя-
ние, с ними последовательно связываются адаптерные белки —
TRAPP, FADD, RIP (на рис. 5.33 не показаны).
Дальнейший путь сигнала разными авторами трактуется
по-разному. На рис. 5.33 приведена одна из возможных
схем — к тому же лишь в той ее части, которая иллюстрирует
роль сфингозина. (Более подробно апоптоз обсуждается в раз-
деле 6.2.)
394
Глава 5
ФНО« (фак-тор некроза опухолей)
ОПУХОЛЕВАЯ КЛЕТКА
R-ФИОл
СМ-аза
иАМФ
СМ
Транскрипционные' факторы
ЯДРО
’----,..у
I сн Гены * Гены ,
:< iNO-C(l) апоптоза (I) митоза (З-)
СФИНГОЗИН .
АТФ
ПК-А
нк-с
к МАНК
участие
, СМ - сфингомиалин. СМ-аэа - сфия
- казвиикииаза.
Итак, согласно рис. 5.33, от вышеназванных адаптерных
белков сигнал прямо или, скорее всего, опосредованно (через
специальные протеазы — каспазы) передается ферментам, ата
кующим мембранные липиды. В частности, активируются
сфингомиелиназа (СМ-аза) и фосфолипаза А2 (последняя на
рисунке не показана).
С ФЛ-А2 мы уже сталкивались ранее (см. рис. 5.22): она вы
щепляет из липидов жирные кислоты — в т. ч. арахидоновую
кислоту (АрК). Эта кислота (как продукты действия и других
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
395
фосфолипаз) тоже активирует СМ-азу. Т. е. СМ аза получает
сразу несколько стимулирующих импульсов.
Поэтому в клетке повышается концентрация церамидов и
продукта их дальнейшего разложения — сфингозина (Сгз).
а) Один из наиболее ярких непосредственных эффектов
Сгз — угнетение активности ПК-С (протеинкиназы С); в этом
отношении Сгз подобен цГМФ (п. 5.3.4.6).
Но мишенью ПК-С, как мы недавно видели (см. рис. 5.30),
может быть белок Ras, который запускает каскады митогенак-
тивируемых протеинкиназ (МАПК), необходимых для поддер-
жания в активном состоянии генов митоза.
Ингибируя же ПК-С, Сгз тормозит, следовательно, и актив-
ность названных генов. Деления клетки прекращаются.
б) Тому же, очевидно, способствует и активация протеин-
фосфатаз (ПФ), вызываемая сфингозином и церамидами.
в) Параллельно с торможением ПК С Сгз стимулирует
ряд других протеинкиназ — в т. ч. казеинкиназу (КК). Види-
мо, в результате их деятельности меняется активность еше нес-
кольких генов — тех, что отвечают за апоптоз. Не вдаваясь в де-
тали, можно сказать, что:
- включаются гены, индуцирующие апоптоз,
- выключаются гены, его тормозящие.
Это в конечном счете и приводит к запуску в клетке меха-
низма самоуничтожения.
г) Могут иметь значение и другие моменты, не отраженные
на рис. 5.33:
- непосредственное взаимодействие Сгз с определенными
участками ДНК (к чему, оказывается, способен Сгз),
- прямая либо опосредованная стимуляция сфингозином
протеаз и ядерных нуклеаз, т. е. тех ферментов, «рука-
ми» которых осуществляется апоптоз.
До сих пор речь шла о сфингозине и церамидах. Но в апо-
птогенном эффекте ФНОа, возможно, участвует также цАМФ
(см. рис. 5.33). В таком случае ФНОа активирует (путем взаимо-
действия с рецептором) не только фосфолипазы, но и аденилат-
циклазу (АЦ). Это может происходить при «посредничестве» Gs-
белка.
цАМФ, как обычно, стимулирует ПК-A (протеинкиназу А).
Последняя же путем фосфорилирования вызывает следующее:
- еще большее снижение активности МАПК (что усилива-
ет эффект сфингозина);
- активацию белка NF kB — транскрипционного факто-
ра, стимулирующего ген iNO-синтазы (п. 5.3.3.9).
396
Глава 5
В итоге в клетке начинает интенсивно образовываться NO,
который благодаря своему цитотоксическому действию тоже
способствует ее гибели.
Однако еще раз отметим, что приведенная схема во многом
гипотетична и, видимо, далеко не полна (см. раздел 6.2).
5.3.5.5. Прочие липиды с регуляторными свойствами
И еще у целого ряда липидов обнаружены регуляторные
свойства! Очень коротко эти данные суммированы в табл. 5.12.
Таблица 5.12 Липиды (помимо рассмотренных ранее) как
биорегуляторы
Вещества БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ
Гликосфинголипиды: глюкозилцерамид, галактозилцерамид. Регулируют рост, дифференцировку и взаимное распознавание клеток. Некоторые эффекты реализуются через каскад МАПК
Лизофосфатиды (т.е. ФЛ, лишённые одного остатка ЖК) Тормозят проведение сигналов в регуля- торных путях с G, белками и путях с ПК-С. В частности, ингибируют расширение сосудов при раздражении с^-адреноре- цепторов(п. 5.3.4.3). Возможный меха- низм — разобщение этих рецепторов и G.-белка
Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) — в т.ч. арахидоновая к-та (АрК) а) Влияют на каналы для ионов (Са2', К', Na ). б) Влияют на активность регуляторных белков: стимулируют G-белки, ПК-С и т.д. в) Ингибируют гены липогенеза
2-арахидоноилглицерин и арахидоноилэтаноламид (анандамид) Это эндоканнабиноиды — естественные лиганды для каннабиноидных рецепто- ров (воспринимающих препараты коно- пли; п. 5.3.1.5). Рецепторы - содержатся в мозгу, а также в пери- ферических органах (напр., на лимфо- цитах селезёнки), связаны с Gj-белком (рис. 5.11), т.е. при возбуждении угнетают аденилатци- клазу, - а их пептидная цепь (как у всех подобных рецепторов, п. 5.3.1.2) 7 раз «прошивает» плазмолемму
ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА В КЛЕТКУ
397
Какие-то из указанных в таблице веществ, возможно,
имеют самостоятельное значение в качестве вторичных мес-
сенджеров. Другие вещества выступают в роли вспомогатель-
ных модуляторов, корректирующих проведение сигналов в
регуляторных путях. Наконец, не исключено, что в таблицу
попали и такие соединения, которые вообще не обладают ка-
ким-либо специфическим действием и оказались в этом спис
ке случайно.
5.3.6. Пути, опосредованные белком Ras
5.3.6.1. Общие замечания
С белком Ras мы уже сталкивались в пп. 5.3.4.7 и 5.3.5.4
Там было сказано, что Ras-белок:
во-первых, может активироваться протеинкиназой С
(ПК-С),
- во-вторых, сам запускает каскад т. н. митогенактиви
руемых протеинкиназ (МАПК), который, модифицируя
соответствующие транскрипционные факторы, контро-
лирует активность ряда важнейших генов — в т. ч. тех,
что отвечают за клеточное деление.
В обоих рассматривавшихся случаях в регуляторной цепи
фигурировали низкомолекулярные мессенджеры:
в первом примере (бласттрансформации лимфоцитов,
рис. 5.30) это были продукты действия фосфолипазы С,
т. е. ДАГ и ИТФ,
во втором примере (апоптозе опухолевых клеток, вызы-
ваемом фактором некроза опухолей, рис. 5.33) — сфин-
гозин и церамид.
В отличие от этого, существуют, по-видимому, и такие регу-
ляторные пути с Ras-белком, где низкомолекулярных мессен-
джеров нет вообще и все компоненты являются белками.
Поскольку же данные пути содержат Ras-белок и активиру-
емый ими каскад МАПК, то конечный результат вновь заключи
ется в изменении активности генов, отвечающих за митоз. Т. е.
эти сигнальные пути (как и те, которые включакэт ФЛ-Су и
ПК-С; раздел 5.3.4) используются ростовыми факторами.
5.3.6.2. Действие эпидермального фактора роста
В качестве примера обратимся к эпидермальному фактору
Роста (ЭФР, табл. 5.6 и рис. 5.34).
398
Глава 5
— цитоплазматические домены рецепт раз 3 ДГ, обладающие
iv,<. «ичхимазной активностью.
GftBv S 1S - белки, передающие сигнал от
рищщторз к Яав-белк»
аит^генактм' ф^ мнут оротптукудааы_____________
а) Рецептор ЭФР, располагающийся на поверхности ство-
ловых клеток эпителия, связан с тирозинкиназой (ТК). На
помним, что это характерно для рецепторов и тех ростовых фак-
торов, которые действуют через ФЛ-Су и ПК-С (п. 5.3.4 1).
Скорее всего, рецептор ЭФР, с внешней стороны плазмолем-
мы, и ТК, обращенная к цитоплазматической стороне,
просто являются доменами одного и того же интегрального
мембранного белка.
В отсутствие ЭФР рецептор находится в мономерном со-
стоянии. В процессе же связывания ЭФР молекулы (или субъе-
диницы) рецептора объединяются в димерные структуры. Это
дает возможность тирозинкиназным доменам субъединиц фос-
форилировать друг друга.
б) В таком состоянии данные домены способны связывать
комплекс из двух цитоплазматических белков:
- GRB (от англ, growth factor receptor binding protein) и
ПРРЕДАЧА ВНЕШНЕГО СИГНАЛА в КЛЕТКУ 399
- SOS (от: son of sevenless; название происходит от мута-
ции sevenless у дрозофилы).
в) После этого наступает «очередь» белка Ras. Последний,
как и G-белок (п. 5.3.1.1), способен связывать гуаниловый ну-
клеотид: в неактивном состоянии — ГДФ, а в активном — ГТФ.
Активация же осуществляется комплексом GRB-SOS, свя-
занным с тирозинкиназными доменами. Иными словами, ука-
занный комплекс катализирует замену в Ras-белке ГДФ на
ГТФ, что и делает Ras-белок активным.
Все это очень похоже на активацию G-белка, состоящего,
как мы знаем, из трех субъединиц (см. рис. 5.5). Белки GRB и
80S играют роль Р- и у-субъединиц G-белка, а Ras-белок — роль
а-субъединицы этого белка.
Сходство усиливается и следующими двумя обстоятель-
ствами. Ras-белок, как и а-субъединица,
- во-первых, диссоциирует от «материнского» комплекса,
«отправляясь на поиски» своей мишени;
- во-вторых, проявляя невысокую ГТФ-азную актив-
ность, постепенно себя инактивирует.
Но есть и отличия.
Так, Р- и у-субъединицы G-белка, видимо, постоянно нахо-
дятся в составе мембраны, рядом с тем или иным рецептором,
тогда как GRB- и SOS-белки в отсутствие внешнего сигнала
«уходят» в цитоплазму.
Главное же, разумеется, состоит в природе мишени:
- для а-субъединицы G-белка это аденилатциклаза,
а для белка Ras — первые протеинкиназы (например,
Raf) из известных нам ферментных каскадов МАПК.
Поэтому исходный сигнал (ЭФР) в конечном счете приво-
дит к активации генов митоза и усилению пролиферации эпи-
телиальных клеток'.
И весь этот регуляторный путь, действительно, обходится
без низкомолекулярных мессенджеров.
5.3,7. Пути, не содержащие вторичного
мессенджера
До сих пор мы рассматривали такие сигнальныеънутрикле-
точные пути, которые характеризовались определенными вто-
ричными мессенджерами. Но, помимо того, бывают ситуации,
когда вторичного мессенджера в сигнальном пути нет вообще!
Более детально регуляция митотического цикла будет рассмат-
риваться в разделе 6.1.
400
Глава 5
Рис S. Способ влияния м
i MR14R >е»о**л на транскрипцию dftnati
т*> фвжж „'ипционные «ЬакмвНя
8Й£. элеме>« - гены. чу ветвите «ьнып к
йн«ер • •„ лну
Пример — влия-
ние у-интерферона на
транскрипцию опре-
деленных генов; эти
гены обозначаются
как ISRE элементы
(interferon stimulated
response elements ).
Вообще говоря,
как отмечалось в
п. 3.3.2.3, интерферо-
ны, действуя на спе-
цифические клеточ-
ные рецепторы, могут
запускать сразу нес-
колько сигнальных
путей. Так, в том же
пункте были рассмот-
рены пути с выражен-
ной антивирусной на
правленностью: они
активируются в инфи-
цированных клетках
и приводят к разруше-
нию мРНК и торможе-
нию трансляции (что
ограничивает образование новых вирусных частиц).
В непораженных же клетках запускается иной сигнальный
путь — тот самый, что приводит к активации ISRE-элементов.
Он показан на рис. 5.35.
а) Как и в предыдущем пути (см. рис. 5.34), в отсутствие
сигнального вещества рецепторы находятся в мономерной фор-
ме, а при связывании этого вещества они объединяются в димер-
ные структуры.
И еще одно совпадение: такая димеризация рецепторов сти-
мулирует тирозинкиназную (ТК-) активность.
Но теперь тирозинкиназа — это не цитоплазматический до-
мен рецептора, а самостоятельный фермент, называемый Янус-
киназой (или JAK киназой от Janus kinase). Название дано
по имени двуликого бога, поскольку у данных ферментов два ак-
тивных киназных центра. (Впрочем, на подобном основании
можно было бы дать это имя и множеству других ферментов.)
Вначале Янус-киназы фосфорилируют близлежащие части
рецепторов.
пЕРЕДАЧА внешнего сигнала в клетку
401
Это способствует присоединению к комплексу рецептор-JAK
и т. н. STAT белка. После чего этот белок тоже фосфорилируется.
В таком состоянии он проникает в ядро клетки и здесь вы-
ступает как транскрипционный фактор (или необходимый
компонент такового). Это и запускает транскрипцию ISRE-эле-
ментов.
Следовательно, в данном пути передатчиком сигнала от
мембранного рецептора к эффекторному устройству (определен-
ной части хромосом) служит такое вещество (STAT белок), кото-
рое должно непосредственно входить в это устройство для
его функционирования.
Вот почему мы говорим, что здесь нет классического
внутриклеточного мессенджера. Такие мессенджеры, как
цАМФ, цГМФ, NO, ДАГ, Ras-белок и пр., лишь влияют на ак
тивность определенного регуляторного фермента, а в состав
конечного объекта регуляции не входят, оставаясь как бы «в
стороне».
С другой стороны, ИТФ, открывающий Са2 -каналы
(п. 5.4 3.1), тоже, видимо, связывается с данными каналами —
и в этом отношении подобен STAT-белку, хотя рассматривался
наряду с прочими вторичными мессенджерами.
Поэтому, возможно, подразделение внутриклеточных пере-
датчиков сигнала на «классические» мессенджеры и «некласси-
ческие» не так уж принципиально.
Как бы то ни было, путь, показанный на рис. 5.35, бесспор-
но, является самым коротким из всех рассмотренных выше.
На этом исчерпывается список типов сигнальных путей,
который был приведен в начале раздела 5.3 и которому мы неу-
коснительно следовали.
Мы убедились, что, с одной стороны, в организации этих
путей, действительно, много общего (как утверждалось еще при
описании рис. 5.1).
И что, с другой стороны, конкретные способы реализации
общих принципов весьма разнообразны. В качестве регулято-
ров «в дело» идут и такие вещества, о которых еще некоторое
время тому назад мы или вообще ничего не слышали, или дума-
ли как о весьма второстепенных компонентах клетки.
Вместе с тем многое остается пока неизвестным. Наиболее
«обидна», пожалуй, ситуация с инсулином. Этот жизненно
важный гормон инициировал огромное количество исследова-
ний. Давно установлены вызываемые им многочисленные био-
химические и физиологические эффекты (табл. 5.3,А). Выясне-
но и то, что рецепторы инсулина связаны с тирозинкиназой.
402
Глава 5
Более-менее определен механизм его влияния на поглощение
клетками глюкозы (при раздражении рецептора в плазмолемму
из цитоплазмы встраиваются белковые переносчики глюкозы).
Но при всем при этом для подавляющего большинства прочих
эффектов инсулина внутриклеточные сигнальные пути так и не
расшифрованы! Не случайно среди двух с лишним десятков пу-
тей, приведенных в этой главе, нет ни одного, запускаемого ин-
сулином.
Так что не следует думать, что все «громкие» открытия в
области регуляции уже сделаны. Скорее всего, напротив: мно-
гие открытия — еще впереди. И самое важное из них — сведение
всех регуляторных путей в той или иной клетке в единую инте-
гративную схему с ясным пониманием всех особенностей ее
функционирования.
Литература к главе 5
Алесенко А. В. Функциональная роль сфингозина в индукции про-
лиферации и гибели клеток//Биохимия, 1998, 63. С. 75-82
Алешин Б. В., Юрина Н. А., Афанасьев Ю. И. Эндокринная систе-
ма (эндокринные железы). В кн.: Гистология (под ред. Ю. И. Афанасье-
ва и Н. А. Юриной). М.: Медицина, 1999. С. 476 513.
Антипепко А. Е. Постсинаптическая трансформация сигнала. Вто-
ричные посредники. G-белки и протеинкиназы нервной ткани. В кн.:
Нейрохимия (под ред. И. П. Ашмарина и П. В. Стукалова). М.: НИ-
ИБМХ, 1996. С. 334-371.
Ашмарин И П., Каразеева Е. П Нейропептиды. Там же, 1996.
С. 296-333.
Башкатова В. Г., Раевский К. С. Оксид азота в механизмах повреж-
дения мозга, обусловленных нейротоксическим действием глутама-
та/ /Биохимия, 1998, 63. С. 1020 1028.
Безуглов В. В, Бобров М. Ю., Арчаков А. В. Биоактивные амиды
жирных кислот//Биохимия, 1998, 63. С 27 37.
Брюне Б., Сандау К., фон Кнетен А. Апоптотическая гибель клеток
и оксид азота- механизмы активации и антагонистические сигнальные
пути//Биохимия. 1998, 63. С. 966-975.
Ванин А. Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспек-
тивы исследований//Бпохилпя. 1998, 63. С. 867 869.
Винк Д. А и др. Значение химических свойств оксида азота для ле-
чения онкологических заболеваний//Биохилпя, 1998, 63. С. 948 957.
Волин М. С. и др. Механизмы передачи сигнала оксидант-оксид
азота в сосудистой ткани//Биохимия, 1998, 63. С. 958-965.
Горский А. К. Ф-, Майер Б. Универсальная и комплексная эн-
зимология синтазы оксида азота//Биохимия, 1998, 63.
С. 870 880.
Дамбинова С. А., Каменская М А. Молекулярные механизмы пе
редачи импульса в мембранах нейронов. Ионные каналы, рецепторы В
ПЕРЕДАЧА внешнего сигнала в клетку
403
кн_: Нейрохимия (под ред. И. П. Ашмарина и П. В. Стукалова). М.: НИ-
ИБМХ, 1996. С. 246 295.
Ди Марцо В. 2-Арахидоноилглицерин как «эндоканнабиноид»:
важность метаболита, ранее не получившего признания//Биохимия,
1998, 63. С. 16-26.
Дятловицкая Э. В., Безуглов В. В. Липиды как биоэффекторы. Вве-
ренке//Биохимия, 1998, 63. С. 3-5.
Каменская М. А. Синаптическая передача. Медиаторы. Вкн.: Ней
рохимия (под ред. И. П. Ашмарина и П. В. Стукалова). М.: НИИБМХ,
1996. С. 207-245.
Когтева Г. С., Безуглов В. В. Ненасыщенные жирные кислоты как
эндогенные биорегуляторы//Бцохилшя, 1998, 63. С. 6-15.
Кузнецов С. Л , Мушкамбаров Н. Н., Горячкина В. Л. Руководство-
атлас по гистологии, цитологии и эмбриологии. ММА им. И. М. Сечено-
ва, компакт-диск, 1999.
Куликов В. И., Музя Г. И. Биорегуляторная роль фактора актива-
ции тромбоцитов во внутриклеточных процессах и межклеточных взаи-
модействиях//Бцохил;ия. 1998, 63. С. 57 66.
Недоспасов А. А Биогенный NO в конкурентных отноше-
ниях// Биохимия, 1998, 63. С. 881 904.
Мартынова Е А. Влияние сфинголипидов на активацию Т-лимфо-
цитов//Биохимия, 1998, 63. С. 122-132.
Мушкамбаров Н. Н. Аналитическая биохимия. М.: Экспедитор,
1996. Т. 1-3, 1300 с.
Пальцев М. А., Иванов А. А. Межклеточные взаимодействия. М.:
Медицина, 1995, 224 с.
Проказова Н В., Звездина II. Д., Коротаева А. А. Влияние лизо-
фосфатиднлхолина на передачу трансмембранного сигнала внутрь клет-
вм// Биохимия, 1998, 63. С. 38-46.
Тэйлор Б. С., Аларсон Л. X., Биллиар Т. Р Индуцибельная синтаза
оксида азота в печени: регуляция и функции//Биохимия, 1998, 63.
С. 905 923.
Северина И. С. Растворимая гуанилатциклаза в молекулярном ме-
ханизме физиологических эффектов оксида азота//Биохимия, 1998, 63.
С. 939 947.
Реутов В. П., Сорокина Е. Г. NO-синтазная и нитритредуктазная
компоненты цикла оксида азота//Биохимия. 1998, 63. С. 1029 1040.
Сала А., Зарини С., Болла М. Лейкотриены: липидные биоэффекто-
ры воспалительных реакций//Биохимия. 1998, 63. С. 101 110.
Страйер Л. Биохимия. М.: Мир, 1985. Т. 2, 3.
Ткачук В. А. Фосфоинозитидный обмен и осцилляция ионов
Са2'//Биохимия, 1998, 63. С. 47 56.
Уайт А. и др Основы биохимии. М.: Мир, 1982. Т. 2, 3.
С. 541 1878.
Шпигель С. и др. Роль сфингозин-1-фосфата в росте, дифференци-
ровке и смерти клеток//Биохимия. 1998, 63. С. 83 88.
Эллиот В., Эллиот Д. Биохимия и молекулярная биология. М.: НИ
ИБМХ, 1999, 372 с.
Глава 6. УЗЕЛ ПРОБЛЕМ:
КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ,
АПОПТОЗ И ОНКОГЕНЕЗ
Теперь мы снова обращаемся к клеточному циклу, о кото-
ром коротко уже говорили в начале книги в связи с репликации
ей ДНК (п. 1.2.1.2) и который подразумевали потом при обсужу
дении делений клеток в культуре (п. 1.4.1.3).
Казалось бы, давно известная вещь — фазы цикла (G,. S,
G2, М), стадии митоза (профаза, метафаза, анафаза и телофа-
за), — все уже сто лет как описано и изучено.
Но что заставляет клетку «двигаться» по этому кругу? Как
удается ей обеспечить строго упорядоченную смену множества
событий, составляющих клеточный цикл? Какие механизмы за-
пускают, например, синтез ДНК в S-фазе, а затем вовремя его
останавливают, предупреждая повторное удвоение ДНК? Как и
почему происходит разрушение ядерной оболочки в поздней
профазе, а затем образование сразу двух таких оболочек в тело-
фазе? И так далее — подобные вопросы уместны в отношении
каждого процесса.
Долгое время все это было совершенно неясно. И только бла-
годаря исследованиям последних лет перед нашим взором стала
проступать, с одной стороны, чрезвычайно удивительная (по своей
сложности и «продуманности»), а с другой стороны, вполне есте-
ственная картина под названием «Регуляция клеточного цикла»
Она крайне интересна и сама по себе. Но оказалось, что это
«полотно» — лишь часть целой серии тесно связанных друг с
другом «картин». Действительно, делящиеся клетки могут не
только продолжать делиться или временно прекратить деления,
впав в «спячку» (как бывает со стволовыми клетками). Их судь-
ба, в зависимости от целого ряда обстоятельств (генетической
программы, действия гистогормонов, влияния прочих внутрен-
них и внешних факторов), может очень круто измениться. Вот
наиболее драматические варианты:
— клетка вступает в процесс дифференцировки,
в клетке запускается механизм самоуничтожения (апо
птоза),
- клетка подвергается бласттрансформации, т. е. превра-
щается в опухолевую клетку.
Все это процессы чрезвычайной биологической важности.
И то, в какой именно из них вступит делящаяся клетка, опреде-
ляется в ходе клеточного цикла. Следовательно, все эти фунда
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ..
405
ментальные проблемы: регуляция цикла, дифференцировка,
апоптоз1, онкогенез — «завязаны» в единый узел.
Дифференцировки мы в этой книге касаться не будем
(обычно каждый ее вариант — весьма протяженный процесс с
массой своей специфики). Остальные же три проблемы (в до-
статочно конспективном изложении) составят содержание
данной главы.
6.1. РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
6.1.1 Введение
6J.J.1. Периоды клеточного цикла
Прежде чем обратиться к регуляции клеточного цикла, еще
раз вспомним его фазы (которые уже перечислялись в п. 1.2.1.2)
и, кроме того, остановимся на стадиях митоза.
Итак, полный митотический цикл включает 4 периода.
S-период (синтетический): в ядре клетки происходит
удвоение ДНК (кроме центромерных участков) и хромосомных
белков; в цитоплазме — удвоение центриолей. К концу периода
клетка становится тетраплоидной по ДНК.
Как мы знаем (п. 1.2.2.2), каждая хромосома реплицирует-
ся сразу во многих точках, что значительно сокращает продол-
жительность репликации. Но ни в одной такой точке реплика-
ции процесс не инициируется более одного раза!
Gf-nepuod (постсинтетический, или премитотиче-
ский): происходит синтез других белков, необходимых для про-
хождения митоза, и в т. ч. тубулина, из которого формируются
микротрубочки веретена деления.
М — митоз: деление тетраплоидной (по ДНК) клетки на
Две диплоидные.
G, период (постсинтетический, или премитотиче-
ский): восстановление содержания цитоплазматических белков
и, соответственно, увеличение дочерних клеток до размера ма
теринской. И именно в этот период принимается «решение» о
вступлении клетки в очередной митотический цикл или о пре-
кращении делений.
Вместе с тем надо понимать, что апоптозу могут подвергаться и
неделящиеся, т. е. постмитотические, клетки.
406
Глава 6
Как отмечалось в п. 1.2.1.4, о клетках, вышедших из ци-
кла, говорят, что они вступили в Go период. Этот выход может
быть необратимым (если клетка вступает в дифференцировку
и далеко заходит на этом пути), но может быть и обратимым —
для «заснувших» стволовых клеток и некоторых дифференци-
рованных клеток (например, фибробластов и лимфоцитов). Воз-
вращаясь под действием внешних сигналов в митотический
цикл, клетки вступают в его S-nepuod.
Примерно так же и «решение» о вступлении клетки в деле-
ние может быть обратимым и необратимым. Если подготовка к
делению зашла слишком далеко, то клетка войдет в S период да-
же тогда, когда на нее перестают действовать митогены В таком
случае говорят, что клетка прошла точку рестрикции. Очевид-
но, эта точка предшествует S-периоду, т. е. для постоянно деля-
щихся клеток находится где-то в конце G,-nepuoda, а для клет-
ки, начинающей деление после перерыва, — где-то в конце Go-
периода.
В завершение приведем примерную продолжительность
стадий цикла для быстро делящихся клеток человека:
Sпериод 10 ч,
С2-период — 4,5 ч,
М (митоз) — 0,5 ч,
Gt-nepuod — 9 ч.
Итого — 24 ч. Но, разумеется, это очень приблизительные
оценки, и для каких-то клеток цикл может быть более продол-
жительным. В частности, в п. 1.2.1.2 отмечалось, что для спер-
матогонии S-период длится 15 ч. И, соответственно, в 1,5 раза
больше оказывается у них общая продолжительность цикла —
примерно 1,5 суток. Так что на 10 митотических делений спер-
матогоний (происходящих на первом этапе сперматогенеза) тре-
буется 2 недели.
6.1 1.2. Фазы митоза
Перейдем к стадиям митоза.
а) Профаза (рис. 6.1,А) — в ядре клетки конденсируются
хромосомы (как описано в п. 1.1.2.2); поэтому они начинают об-
наруживаться под световым микроскопом в виде нитчатых
структур При этом каждая хромосома содержит две прилегаю-
щие друг к другу хроматиды, что является результатом репли-
кации хромосом в S-периоде, а выявляется лишь в конце профа-
зы. Но и в профазе сестринские хроматиды еще связаны друг с
другом во многих местах с помощью белков когезинов.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ.
407
Синтез РНК на хромосомах, есте-
ственно, полностью прекращается. Из-за
инактивации рибосомных генов исчезают
ядрышки. Постепенно разрушается ядер
пая оболочка:
- ядерная ламина (связанная с внутрен-
ней ядерной мембраной; п. 1.1.1) разру-
шается путем деполимеризации соста-
вляющих ее промежуточных филаментов,
- а сами ядерные мембраны (внутренняя и
наружная) распадаются на мелкие пу-
зырьки.
Аналогичный процесс происходит в цитоплазме: эндо-
плазматическая сеть (ЭПС) и аппарат Гольджи тоже распадают-
ся на везикулы. Две диплосомы (каждая из которых — это пара
центриолей) постепенно расходятся к полюсам клетки и начи-
нают участвовать в формировании веретена деления. Синтез
белка на рибосомах значительно снижается (до 25 % от прежне-
го уровня).
б) Метафаза (рис. 6.1,Б) хромосомы достигают макси
мальной степени конденсации и выстраиваются в экваториаль-
ной плоскости клетки, образуя метафазную пластинку хромо-
сом, или материнскую звезду.
-----------.-г— . .-7 • _ I
Ямс. 6.1 .Б. Метафаза митгза: рвнняп (слева) и поздняя (справа) ;
Постепенно в хромосомах разрушаются когезиновые ком
плексы между сестринскими хроматидами К концу метафазы
Разделение хроматид завершается; они сохраняют только кажу-
щуюся связь в области центромерных перетяжек.
Путем полимеризации белка тубулина завершается форми-
рование веретена деления. В его состав входят микротрубочки
трех видов:
408
Глава 6
ется на два ядра).
I) кинетохорные — связывают каждую хроматиду (отходя
от ее кинетохоры — специального белкового комплекса в обла-|
сти центромеры) с одной из диплосом;
II) полярные — идут от одной из диплосом к центру верете-
на, где перекрываются с микротрубочками от другого полюса; I
III) астральные — направлены от диплосомы к поверхно-
сти клетки.
Заметим, что у дрожжей и других грибов ядерная оболоч-1
ка в профазе митоза не разрушается. Так что митотическое ве-
ретено формируется внутри ядра (которое позднее расщепля-
в) Анафаза (рис. 6.1,В) — это самая
короткая стадия митоза. Хроматиды,
сохраняя максимальную степень конден-
сации, теряют связь друг с другом и начи-
нают расходиться к полюсам клетки. При
этом они ориентированы центромерными
участками к соответствующему полюсу, а
теломерными — к экватору клетки.
Причем две хроматиды каждой хро-
мосомы расходятся к противоположным!
полюсам. Поэтому обе дочерние клетки
получают полные и равные наборы однохроматидных хромосом.]
Движение хромосом обеспечивается несколькими фактора-
ми. С одной стороны, видимо, имеет значение изменение длины
микротрубочек веретена деления:
- укорочение (разборка) кинетохорных микротрубочек и
- удлинение полярных микротрубочек (что ведет к расхож-
дению самих полюсов).
С другой стороны, считается, что в процессе участвуют и
белки транслокаторы:
- одни из них перемещают хромосомы вдоль кинетохорных
микротрубочек,
- другие перемещают полярные микротрубочки в стороны
друг от друга.
г) Телофаза (рис. 6.1,Г) — каждый набор расходящихся од-
нохроматидных хромосом, приблизившись к «своей» диплосо-
ме, останавливается.
С хромосомами ассоциируют пузырьки, образовавшиеся в
профазе из разрушенных ядерных мембран. В их стенки вновь
встраиваются комплексы ядерных пор (п. 1.1.1.). Через последние
в пузырьки проникают белки, формирующие промежуточные фи-
ламенты, которые, в свою очередь, образуют ядерную ламину.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
409
Рис. 4.1 ,Г. Телофаза ми«чаа: уогтир "(слева] и поздняя (справа)
Благодаря этому пузырьки сливаются. Вначале они образу-
ют двойную оболочку вокруг каждой хромосомы! Получаются
своего рода миниядра, называемые кариомерами. Каждое из
них сохраняет связь со «своей» диплосомой.
Позднее сливаются друг с другом сами кариомеры, связан-
ные с одной и той же диплосомой. Таким образом образуются
два дочерних ядра.
Хромосомы постепенно деконденсируются, и начинают
формироваться ядрышки.
В поздней телофазе происходит цитотомия (иногда назы-
ваемая цитокинезом) разделение тела клетки между ядрами.
Для этого по экватору клетки формируется актомиозиновое
кольцо, которое постепенно сжимается, стягивая за собой плаз-
молемму и образуя перетяжку все уменьшающегося диаметра.
В конце концов получаются две дочерние клетки.
После цитотомии в клетках восстанавливаются эндоплаз-
матическая сеть и аппарат Гольджи.
6.1.1.3. Методы изучения регуляции клеточного цикла
Даже вышеприведенное краткое описание клеточного ци-
кла (и митоза как его части) показывает, сколь много событий
происходит всего лишь за 24-36 часов (составляющих обычную
продолжительность цикла).
Очевидно, все это управляется на молекулярном уровне.
Т. е. за, казалось бы, чисто морфологическими явлениями стоит
некое множество молекул-регуляторов, которое воспринимает
Митогенные сигналы и затем последовательно инициирует стро-
го определенные события.
410
Глава 6
Как же расшифровывалась такая сложная молекулярная
«кухня»? Это достаточно интересно и поучительно, поэтому хотя
бы очень бегло расскажем о соответствующих экспериментах.
Их можно поделить на три типа:
а) эксперименты по слиянию клеток,
б) изучение делений бластомеров,
в) исследования мутантов (в основном, дрожжей).
а) Эксперименты по слиянию клеток. Здесь использова-
лись клетки, растущие в культуре.
Вот наиболее характерный эксперимент: специальной обра-
боткой добиваются попарного слияния клеток двух видов — од-
ни находятся в Gr, а другие — в S-периоде цикла. (Для кратко-
сти их будем обозначать соответственно Gr и S-клетки.)
Образующиеся химерные клетки содержат по два ядра,
причем на момент слияния в одном (из S-клетки) происходит
синтез ДНК, а в другом (из Gj -клетки) — нет. Так вот, через не-
большое время синтез ДНК начинается и во втором ядре.
Что отсюда следует? — То, что в S-клетке содержатся не-
кие факторы, способные диффундировать в ядра Gj-клеток и
инициировать репликацию ДНК. Очевидно, это те самые факто-
ры, которые вызывают переход клеток из G,-периода в S-период.
Но если аналогичный эксперимент произвести с G2- и S-
клетками, то результат будет отрицательным: в О2-ядре (уже со-
держащем удвоенный набор ДНК) репликация ДНК не начина-
ется. Значит, в G, ядрах имеется механизм, который блоки
рует избыточную репликацию даже при действии стимули-
рующих факторов.
Весьма показательны также эксперименты с М-клетками
(т. е. клетками, находящимися в митозе). В них нет ядерной обо-
лочки. После же слияния с ними любых интерфазных клеток
(Gr, S- или Gj-клеток) ядерная оболочка последних также раз-
рушается, а хромосомы подвергаются конденсации.
Это свидетельствует, во-первых, о том, что в митотических
клетках присутствуют регуляторные факторы, запускающие
митоз. Во-вторых, в отличие от синтеза ДНК, контроль над за
пуском митоза не столь жесткий, так что возможно прежде-
временное вхождение в митоз (не только из G2 , но также из G(-
и S-периодов). С этим обстоятельством могут быть связаны опре-
деленные нарушения клеточного цикла.
б) Изучение делений бластомеров. В данном случае
объектом исследования служили крупные яйцеклетки амфибий
и морских ежей, а также образующиеся из них зародыши самых
ранних стадий развития.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ
411
Как известно, на этих стадиях интенсивно происходят ми-
тотические деления, причем у зародышей амфибий (как и мор-
ских ежей) все клетки делятся одновременно. Кроме того, ука
занные объекты удобны тем, что могут быть получены в доста-
точно больших количествах. Все это позволяет осуществлять
биохимический анализ — фракционировать содержимое кле-
ток, находящихся на определенной стадии цикла, и произво-
дить очистку соответствующих белковых факторов.
А как проверить биологическую роль выделяемых факто-
ров? — Примерно так же, как это делалось в экспериментах
предыдущего типа. А именно: ввести либо клеточный экстракт,
либо определенную его фракцию в ооциты, покоящиеся в самом
начале мейоза. Если в изучаемом образце содержатся факторы,
запускающие деления, ооциты «просыпаются» и вступают в
мейотические деления, превращаясь в яйцеклетку.
Положительные результаты такого тестирования, между
прочим, означают, что механизмы митотических и мейотиче-
ских делений во многом близки.
Более того: оказалось, что данный тест можно использовать
для оценки экстрактов из делящихся клеток не только самих
амфибий, но и других животных, в т. ч. млекопитающих.
в) Исследования мутантов Как уже отмечалось, в этих
генетических экспериментах использовались, в основном,
дрожжи. В вегетативной фазе жизнедеятельности их клетки га-
плоидны (содержат по одной копии генов), что облегчает выяв-
ление мутаций.
Мутации можно индуцировать разными способами: облуче
нием, нагреванием, химическими агентами.
Такие исследования показали, что некоторые мутации на-
рушают клеточный цикл. При этом характерным образом меня-
ются размеры клеток.
I. При т. н. cdc-мутациях (от cell-division, cycle — цикл де-
ления клеток) блокировано деление клеток, отчего последние
только растут в длину (не почкуясь) и достигают очень больших
размеров.
И. Напротив, при т. н. wee мутациях (wee — крошечный)
Деления происходят раньше времени — до того, как клетка ус-
пела достаточно удлиниться; поэтому получаются клетки очень
малой длины.
Выяснилось, что проявляться как cdc-мутация могут пов-
реждения разных генов: то одного, то другого, то третьего и
т- д. То же относится к мутациям wee. Следовательно, все эти ге-
ны ответственны за регуляцию клеточного цикла.
412
Глава 6
А чтобы идентифицировать конкретный продукт каждого
такого гена, поступают следующим образом:
- выделяют ДНК из нормальных клеток,
- фрагментируют ее с помощью рестриктаз (раздел 1.6.2),
включают получающиеся фрагменты нормальной ДНК в
состав различных плазмид1
- и вводят плазмиды с испытуемым фрагментом в мутант-
ные клетки.
Если мутация — рецессивная, а введенный фрагмент ДНК
содержит «правильную» версию мутированного гена, то клеточ-
ный цикл нормализуется и образуется колония клеток обычно-
го размера. Так становится известным очередной ген, отвечаю-
щий за клеточный цикл.
После этого сравнительно нетрудно выяснить природу бел-
ка, который кодируется данным геном и является одним из ре-
гуляторов цикла.
До сих пор речь шла лишь о генах и белках дрожжей. Но
белки, регулирующие клеточный цикл, высококонсерватив-
ны, т. е. сравнительно мало изменились за время эволюции. По-
этому соответствующие гены даже человека, будучи введенны-
ми с плазмидами в мутантные дрожжевые клетки, часто способ-
ны восстановить у последних нормальный клеточный цикл.
Следовательно, данная модель подходит для изучения регу-
ляторных генов и высших животных.
После этих вводных сведений приступим наконец к изло-
жению молекулярных основ регуляции клеточного цикла.
6.1.2. Циклинзависимые киназы
6 12 1 Общее описание
Вышеприведенные исследования показали, что ключевую
роль в поочередной смене фаз клеточного цикла играют спе-
циальные протеинкиназы — т. н. циклинзависимые киназы
(Cdks cyclin dependent kinases). Каждая из них фосфорили
рует определенные белки, вовлеченные в соответствующую фа-
зу цикла, и таким образом активирует или ингибирует их.
Молекула любой Cdk состоит лишь из одной субъединицы,
которая сама по себе неактивна. Для активации же Cdk требует-
' Плазмиды это небольшие кольцевые молекулы ДНК. содержащиеся у
многих одноклеточных организмов помимо их основной хромосомы.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
413
цикла
Ц wwibsw Cdk чШпинаавн-.ИМЪК КИ“л«М.
WMF — митоз-с эмулирующий фа» тор.
£ оя*.няд iwMKax -т интибидуы xoMji^excos
ся связывание с ней специального белка — циклила (Ц). Имеет
ся несколько разных циклинов, и, как считают, связавшийся с
Cdk циклин не только активирует фермент, но и придает ему
субстратную специфичность в отношении тех или иных белков.
Название «циклин» не связано ни с какой-либо циклично-
стью в строении белка, ни с зависимостью его активности от не-
ких циклических молекул (например, цАМФ или цГМФ) — та-
кой зависимости как раз нет. Термин отражает лишь тот факт,
что концентрации циклинов в клетке в течение клеточного ци-
кла изменяются циклическим образом.
Итак, в активной форме рассматриваемые протеинкиназы
представляют собой гетеродимерные комплексы циклин Cdk
(Ц Cdk), где циклин служит активаторной, a Cdk — каталитиче-
ской субъединицей.
Почему данные образования не рассматривают как единые
молекулы, а называют комплексами? — По той причине, что
Могут быть разные сочетания конкретных циклинов и конкрет
414
Глава 6
ных Cdk, причем каждое такое сочетание характерно для строго
определенной фазы цикла.
Это показано на рис. 6.2.
Запускают цикл комплексы циклин D-Cdk4 и (или) ци-
клин D Cdk6 (Как видно, разные циклины обозначаются латин-
скими буквами, а разные Cdk — арабскими цифрами.) Назван-
ные комплексы функционируют на начальной стадии постмито-
тического (G,-) периода и, вызывая соответствующие внутри-
клеточные события, способствуют переходу клеткой «точки
рестрикции» (п. 6.1.1.1). Аналогично, те же комплексы приво-
дят к возврату «спящей» Go-клетки в митотический цикл.
Вторая половина Gy-периода происходит под управляющим
влиянием комплекса циклин Е Cdk2.
В следующем — синтетическом (S-) — периоде функциони-
рующая циклинзависимая киназа остается той же (Cdk2), но
она дважды меняет своих циклиновых партнеров — ими после-
довательно становятся циклин А и циклин В Соответственно,
меняются и те белковые субстраты, на которые действует Cdk2.
И, наконец, в премитотическом (G2) периоде последний из
вышеназванных циклинов (В) связывается с другой Cdk —
Cdkl. Именно комплекс циклин В Cdkl «вводит» клетку в ми-
тоз и «руководит» этим сложным процессом. Поэтому его еще
называют митоз стимулирующим фактором MPF (от mi-
tosis-promoting factor ).
Сделаем два замечания.
1) Из состава последних двух комплексов следует, что их
субстратная специфичность определяется не только циклином,
но и самой Cdk, а верней всего — одновременно тем и другим,
т. е. имеющимся сочетанием циклина с Cdk.
2) Cdkl нередко обозначается иначе — Cdc2. Дело в том, что
мутация гена Cdkl, нарушая клеточный цикл, вызывает у
дрожжей фенотип вида cdc (при котором клетки становятся
необычайно длинными; п. 6.1.1.3). И еще до идентификации
функции этого гена он был обозначен как cdc2'.
Итак, все разнообразные события клеточного цикла упра-
вляются относительно небольшим числом комплексов цикли-
нов и Cdk.
'При написании символов генов и их продуктов используют следующие
правила:
1) гены обозначают курсивом, причем для генов человека все буквы —
заглавные (например, SRC), а для генов животных — строчные (src):
2) белковые продукты генов пишут прямым шрифтом с заглавной бук-
вы (например. Src).
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
415
Возникает два естественных вопроса. —
а) На что именно воздействуют данные комплексы, т. е. ка-
ков конкретный механизм их действия?
б) И каким образом влияют на сами эти комплексы много-
численные внеклеточные митогены и антимитогены, т.е. стиму
ляторы и ингибиторы пролиферации клеток?
Ниже мы достаточно подробно остановимся на данных во-
просах, т. е., по существу, опишем сигнальные пути, идущие к
комплексам циклин-Cdk и от них.
Но предварительно задержимся на самом этом уровне, оха-
рактеризовав его несколько подробней.
6 1.2.2. Способы регуляции содержания и
активности Cdks
Ввиду исключительной функции циклинзависимых киназ
(Cdks), их содержание и особенно активность находятся под слож-
ным контролем. Вот принципиальные способы этого контроля.
1. Регуляция синтеза самих Cdks. Видимо, не все Cdks одновре-
менно присутствуют в клетке на разных стадиях ее цикла. Поэтому
очень важным моментом является активация гена той или Cdk.
Так, известно, что комплексы Gy-периода (циклин
D Cdk4,6 и циклин E-Cdk2), помимо других многочисленных
действий, запускают транскрипцию гена киназы Cdkl. Послед-
няя же необходима, как мы знаем, для образования комплекса
Сг-периода и митоза (циклин В Cdkl, или MPF). Таким обра-
зом, о синтезе компонентов данного комплекса клетка «заботит-
ся» заблаговременно, еще до репликации ДНК.
2 Регуляция активности Cdks. Способы этой регуляции до
статочно разнообразны.
а) Один из них нам уже известен: это связывание с какой-
либо Cdk активаторной субъединицы — циклина.
б) Второй способ связывание (либо только с Cdk, либо со
всем комплексом циклин-Cdk) ингибиторной субъединицы. В
Роли последней выступают специальные белки, указанные в
прямоугольных рамках на рис. 6.2. Известно, по крайней мере,
Два семейства таких белков.
Белки семейства INK4 (р15 и р16) связываются с Cdk4,6 и
тем самым препятствуют образованию комплексов (циклин D-
Cdk4,6), запускающих клеточный цикл.
Белки второго семейства, KIP1 (р21, р27, р57), связывают-
ся с уже сформированными комплексами — и зто тоже приво-
дит к ингибирующему эффекту.
416
Глава 6
в) Наконец, третий способ контроля активности Cdks — это
их фосфорилирование и дефосфорилирование. Т. е. данные
протеинкиназы (Cdks) сами способны регулироваться тем же са-
мым способом, каким они управляют активностью «подведом-
ственных» им белков.
Фосфорилирование по одним локусам Cdk обладает активи-
рующим действием; фосфорилирование других участков, на-
против, ингибирует фермент.
Например, фосфорилирование Cdk2 по треонину в сотни
раз повышает ее сродство к белкам-мишеням (при условии, ко-!
нечно, ее связи с определенным циклином — например, с Ц-А).
Однако фосфорилирование той же Cdk2 по некоторым ос-
таткам тирозина резко снижает активность.
Но последняя восстанавливается под действием специфиче
ской фосфатазы, кодируемой геном cdc25a. Из обозначения сле-
дует, что это еще один ген, мутация которого у дрожжей приводи^
к нарушению клеточного цикла и фенотипу cdc (п. 6.1.1.3).
Выявлены также две тирозинкиназы (ТК), ингибирующие
другую Cdk Cdkl; одна из этих ТК, видимо, действует на сво-
бодную Cdkl, а другая — на весь комплекс циклин B-C'dkl.
3. Регуляция синтеза и распада активаторов и ингибиторов
Cdks. Содержание в клетке активаторов (циклинов) и ингибито-
ров Cdks также контролируется. Причем это осуществляется пу-
тем регуляции не только синтеза данных веществ, но и процес-
са их распада.
В качестве примера обратимся вначале к циклинам.
а) Многие митогенные факторы, «побуждая» клетку к деле-
нию, запускают такие регуляторные цепи, которые в конце кон-
цов активируют ген циклина D (помимо многих других дей-
ствий). На следующих стадиях клеточного цикла стимулирует-
ся синтез очередных циклинов. И так далее.
б) Крайне интересным является также управление распа
дом циклинов. Оно осуществляется с помощью убиквитинзави
симого механизма, каковой используется для короткоживу-
щих белков (раздел 3.7).
Наиболее четко роль этого механизма показана для цикли
на В, участвующего в образовании комплекса циклин В—Cdk2
митоз стимулирующего фактора (MPF, он же комплекс циклин
В Cdkl).
Фосфорилируя определенные белки, MPF стимулирует
вхождение клетки в митоз. Но для завершения митоза необхо
димы во многом прямо противоположные события. Т. е. содер-
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ... 417
жание MPF должно снижаться. Это-то и достигается с помощью
быстрого протеолиза циклина В.
Примерная последовательность событий такова.
Максимальной активности комплекс MPF достигает в ме
тафазу митоза. В это время он фосфорилирует, помимо других
белков, т. н. фактор АРС (anaphase-promoting complex), т. е.
фактор, обеспечивающий анафазу.
А данный фактор является ничем иным, как убиквитин-
пигазой (раздел 3.7), специфичной в отношении MPF Поэтому
он начинает последовательно присоединять (одну за другой) мо-
лекулы убиквитина к циклинуВ.
Меченный таким образом циклин В быстро разрушается в
протеосомах. В итоге содержание комплекса циклин В—Cdkl
значительно снижается, и в клетке благополучно совершаются
события анафазы, а затем и телофазы.
Затем (в С,-периоде) фактор АРС инактивируется, отчего
скорость распада циклина В снижается и данный циклин вновь
начинает накапливаться в клетке.
в) Теперь несколько слов о контроле за синтезом веществ,
ингибирующих Cdks (либо комплексы циклин-Cdk). Выше мы
упоминали о двух семействах таких ингибиторов.
Так вот, регуляция синтеза последних часто используется
внеклеточными эффекторами для влияния на клеточный
цикл — стимуляции или торможения пролиферации.
Один из примеров: в некоторых регуляторных внутрикле-
точных цепочках фигурируют белки семейства Smad. Эти белки,
образуя соответствующие транскрипционные факторы, стимули-
руют синтез ингибиторов р15, р21 и др. В итоге активность ком-
плексов G,-пер ио да тормозится и клетка прекращает деления.
6.1.3. Сигнальные пути, идущие к
циклинзависимым киназам
Итак, способы непосредственного воздействия на содержа
ине и активность циклинзависимых киназ (Cdks) мы выяснили.
Теперь рассмотрим, как используются эти способы внекле-
точными регуляторами пролиферации. Т. е. речь сейчас пойдет
0 сигнальных путях, связывающих такие регуляторы с Cdks.
При этом надо понимать, что подобных путей — достаточно
Много, расшифрованы они далеко не полностью, но и при том
мы сможем конспективно осветить лишь малую часть имею-
щейся информации.
418
Глава 6
6.1.3.1. Действие митогенов
Практически все сигнальные пути, регулирующие проли-
ферацию клеток, «нацелены» на комплексы С,-периода
(см. рис. 6.2) — в основном, циклин D-Cdk4,6 и, в меньшей сте-
пени, циклин Е Cdk2 Это и понятно: как уже отмечалоси
(п. 6.1.2.1), именно данные комплексы «запускают» очередной
клеточный цикл
В главе 5 мы уже сталкивались с двумя митогенными сиг-
нальными путями.
Один из них относится к стволовым клеткам эпителия и на-
чинается со связывания ЭФР эпидермального фактора роста
(см. табл. 5.6 ирис. 5.34).
Второй путь активируется в Т-хелперах после их взаимо!
действия с АПК — антигенпредставляющими клетками (см.
рис. 5.30).
Теперь на этих же двух примерах покажем «выход» подоб-
ных путей на комплексы циклин Cdk. На рис. 6.3 оба назван-
ных пути для демонстрации сходства между ними «помещены»
в одну клетку; но в реальности, как уже сказано, они функцио-
нируют в разных клетках.
Что же мы видим?
а) В обоих случаях внешний сигнал приводит к активации
тирозинкиназы, ассоциированной с рецептором.
б) Это ведет (через те или иные посредники) к запуску ка-
скадов митогенактивируемых протеинкиназ (МАПК,
п. 5.3.4.4).
в) Конечные ферменты данного каскада, фосфорилируя ряд
транскрипционных факторов (Elk, Ets, ATF2, Tcf и др.), активи-
руют их, а через них — и т. н. гены раннего ответа (FOS,
JUN). В культуре клеток уже через 30 мин после начала дей-
ствия митогена активность этих генов достигает максимального
уровня.
г) Продукты семейств генов FOS и JUN — это опять таки
транскрипционные факторы, но специфичные уже в отноше-
нии других генов — т. н. генов замедленного ответа.
д) Поэтому через некоторое время начинается экспрессия
этих генов.
Среди последних-то и находятся наши «знакомые» — гене
циклима D, Cdk4 и Cdk6, т. е. компонентов комплексов циклин-
Cdk, специфичных для первой половины бгпериода цикла.
Кроме того, активируются еще некоторые гены и среди
них — ген белка Мус.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ... 419
-ев-1-
• ЭФР
GRB
/\п гмreiinредс I авлян>цгая клетка (/\ П К)
Рецепторы
>ФР
TCR
(anil
SOS
ДАГ
ФИД
МАПК <
ЯДРО
Т ранскрипционнь*
факторы генов
раннего ответа
Гены замедленного
ответа
Гены FOS и JUN
Ген Ген Ген Геи Ген
Ц I) Cdk4 Мус Cdc25a р27
TZZE
Транскрипционные 1 /
факторы генов >
кщедлецногд ответа J
Фосфа-
таза
Cdk-4
неакт.
II I)
<Л4
Активный комплекс
420
Глава 6
е) После своего синтеза белок Мус, в свою очередь, влияет щ
активность ряда генов. Так, он тормозит экспрессию гена белю
р27 — ингибитора целого ряда комплексов циклин Cdk. И одно
временно белок Мус активирует ген Cdc25a, который, как отме
чалосьвп. 6.1.2.2, кодирует специфическую фосфата у Послед,
няя дефосфорилирует Cdk4 и Cdk2, что приводит к их активации
В результате мы получаем следующие эффекты:
I) увеличение содержания в клетке циклииа D и реагирую
щих с ним киназ — Cdk4, Cdk6;
II ) снижение содержания ряда ингибиторов Cdks;
II I) повышение активности (в результате дефосфорилирова
ния) тех же циклинзависимых киназ (Cdk4, Cdk6), а также Cdk2.
Все это и обеспечивает формирование в клетке достаточно
го количества активных комплексов циклин D Cdk4,6, начц
нающих подготавливать клетку к делению.
Заметим: чтобы рассмотренные сигнальные пути «сработа
ли», необходимо одно условие: клетка должна быть фиксирова-
на на каком-либо внеклеточном матриксе. Но об этом подробней
мы скажем чуть позже — в п. 6.1.3.3.
6.1.3.2. Действие антимитогенов
Здесь тоже приведем два примера.
1. Один нам уже знаком — это действие ФНО (фактора не-
кроза опухолей) на опухолевые клетки (см. табл. 5.5 и
рис. 5.33). ФНО «запускает» в клетках сразу несколько сиг-
нальных путей, и среди них один содержит ферментативный ка-
скад МАПК
Только теперь возбуждение соответствующего рецептора
через ряд посредников (среди которых — сфингозин и ПК С)
приводит к торможению МАПК (см. рис. 5.33).
Дальше — все как в предыдущих путях, но с противопо-
ложным знаком. Следовательно, в итоге в клетке будет резко!
снижаться количество активных комплексов циклин D Cdk4,6,
в результате чего деления прекратятся. (Действие же ФНО че-1
рез другие сигнальные пути, как сказано в п. 5.3.5.4, будет ини-
циировать апоптоз.)
2. Второй пример (рис. 6.4): речь идет о ТФРр — трансфор-
мирующем факторе роста. В табл. 5.6 уже отмечалось, что он!
угнетает про иферацию многих клеток.
Рецепторы ТФРр, видимо, сходны по структуре с рецепте
рами ЭФР (эпидермального фактора роста; п. 5.3.6.2). Это зна-)
чит. что
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
421
Рис. >•. 4. М^х-'-яИзМ iHTWMMtyi
г“нн -го „уйстт ин ТФГ (ц аи-
сф/рми.-унщг ir-? фжктсфэ рзют)
ТХ мчиы jt< -ц дата с тиро^
4hhkmh-»*h'4S **тиаи' -стью. ктл<'
2,3,4 — циттлдзматическил бчл-
«и, ф'-рми; укпцие трхнск. Ил-
ЦЯОМИН? КОМПЛЕКС.
Г15 и pZ1 - иигм#мтчрм С'Чю и
* 'мя«н-ксо« циклмн-С-‘к
- при связывании своего
лиганда рецепторные субъеди-
ницы объединяются в димер-
ные структуры,
— цитоплазматические до-
мены каждой субъединицы
обладают тирозинкиназной ак-
тивностью,
- в активированном со-
стоянии эти домены фосфори-
лируют друг друга.
Отличие состоит лишь в
том, что в данном случае модифи-
цированные домены рецептора
связывают иной комплекс цито-
плазматических белков: теперь
это комплекс Smad2+Smad3. Он
тоже фосфорилируется рецептор-
ной тирозинкиназой, после чего
приобретает способность связы-
вать третий белок — Smad4.
Затем, как упоминалось в
п. 6.1.2.2, весь этот тройной ком-
плекс диффундирует в ядро и вы-
полняет роль транскрипционно-
го фактора для генов, кодирую-
щих ингибиторы Cdks Имеются
в виду такие белки, как р15 и
р21 (п. 6.1.2.2).
Накопление в клетке этих
ингибиторов и приводит к тор
можению пролиферации.
* * *
Теперь рассмотрим такие сигнальные пути, которые начина-
ются от адгезивных мембранных белков. Одни из этих путей сти
мулируют пролиферацию клеток; другие, наоборот, тормозят.
6 1.3.3 Прикрепление клетки к внеклеточному
матриксу
Многие клетки способны делиться, только будучи прикре-
пленными к внеклеточной структуре базальной мембране
(эпителиоциты), коллагеновым волокнам (фибробласты), по-
верхности флакона (при культивировании in vitro) и т. д.
422
Гпава 6
Информация же о связи клетки с такой структурой посту-1
пает от интегринов (п. 4.3.1.2). Как мы знаем, это адгезивные
белки с двумя неравными субъединицами (см. рис. 4.23).
При связывании с внеклеточным матриксом меньшая (р-)
субъединица интегрина активирует одну из тирозинкиназ —
FAK (Focal Adhesion Kinase), а та, в свою очередь, еще одну ти-
розинкиназу Src (рис. 6.5). Последняя относится к классу не-
рецепторных тирозинкиназ, поскольку не входит в состав ре-
цепторного комплекса и даже не взаимодействует напрямую с
рецепторами.
Непосредственным субстратом Src является белок SHC, ко-
торый связывает данный сигнальный путь (идущий от интегри-
нов) с сигнальными путями от рецепторов митогенов.
Общей же частью последних путей являются многократно
упоминавшиеся выше каскады МАПК (митогенактивируемых
протеинкиназ). Следовательно, адаптерный белок SHC должен
стимулировать прохождение сигнала по данным каскадам.
Опорная поверхность
У.у/. "К.".. 1 ".
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ ..
423
Однако не вполне ясно, какой именно член каскадов акти-
вируется белком SHC. Есть предположение, что это тот же ком-
плекс белков (GRB, SOS, Ras, Raf), что и в случае действия ЭФР
(эпидермального фактора роста; см. рис. 6.3).
Но, с нашей точки зрения, надо учесть следующее обстоя-
тельство. Для того, чтобы клетка млекопитающих стала делить-
ся, необходимо одновременное выполнение двух условий:
а) прикрепление клетки к какой-либо поверхности и
б) действие на нее ростового фактора.
Причем в неприкрепленной клетке прохождение сигнала
от ростового фактора блокируется на одной из МАПК, а кон-
кретно — на киназе МЕК (МЕК1).
Отсюда следует, что:
а) сигнал от интегринов идет именно к этому звену
МАПК — киназе МЕК;
б) а данная киназа активируется только при действии
на нее сразу двух белков:
- предыдущей киназы из семейства МАПК и
— белка SHC (после действия на него Src).
Тогда и получается, что сигналы от ростового фактора и ин
тегринов взаимно дополняют друг друга, а каждый из них в от-
дельности не способен индуцировать деление клетки.
Эффект прикрепления клетки к опоре включает еше одно
важное событие. Оно касается «знаменитого» транскрипцион-
ного фактора — белка рбЗ.
Последний, согласно п. 2.4.2.3, активирует гены, остана-
вливающие деления (в частности, ген белка р21 — ингибитора
комплексов циклин-Cdk), а также гены апоптоза. Поэтому не-
удивительно, что идущий от интегринов сигнал приводит к сни-
жению содержания в клетке такого «вредного» белка.
В случае белка р53 обычно регулируется не синтез, а рас-
пад. Поэтому под действием сигнала от интегринов, видимо, тем
или иным способом ускоряется протеолиз этого белка. По не
которым данным, это может быть связано со снижением содер
жания другого белка (ARF), ингибирующего распад белка рбЗ.
6 1.3.4. Контактное торможение пролиферации
Если же клетка устанавливает контакт не с внеклеточным
Матриксом, а с другими клетками, то наблюдается эффект,
прямо противоположный предыдущему, — прекращение деле-
ний. Это обозначается как контактное торможение.
Напомним: оба данных эффекта упоминались в п. 1 4.1.3
пРи описании экспериментов с клеточными культурами. —
424
Глава 6
а) После очередного пересева клеток в плоский стеклянный
сосуд («матрас») они вначале — в течение нескольких часов —
прикрепляются ко дну сосуда и лишь после этого входят в кле- *
точный цикл (стимуляция делений).
б) Когда же на дне сосуда не остается свободного места и
клетки вступают в контакт друге другом, деления прекращают-
ся (контактное, торможение).
Сигнал о межклеточном контакте, видимо, идет от кадге-
ринов — адгезивных белков, участвующих в образовании та-
ких контактов (п. 4.3.1.5). Вероятно, у кадгеринов меняется!
при этом конфигурация; поэтому их цитоплазматические до-
мены приобретают способность связывать белок Р-катенин
(рис. 6.6).
Предполагают, что данный белок — транскрипционный
фактор. Когда он свободен от связи с кадгерином (т. е. когда
клетка еще не контактирует с другими клетками), он образует
активный комплекс с еще одним транскрипционным факто-
ром — белком Tcf4. Комплекс мигрирует в ядро и здесь прямым
или (скорее всего) опосредованным способом стимулирует тран-
скрипцию генов циклина D и белка Мус.
Это вновь те самые гены, которые активируются в ранее
рассмотренных сигнальных путях — идущих от ростовых фак-1
торов и от интегринов. Те пути сходятся и взаимно дополняют!
друг друга на каскадах митогенактивируемых киназ (МАПК)
Но путь, содержащий Р-катенин, тоже является необходи-
мым для деления! При улавливании Р-катенина кадгерином де-
ления прекращаются!
Следовательно, этот путь также необходимо дополняет
предыдущие.
С нашей точки зрения, все объясняется и встает на свои ме-
ста при следующих предположениях:
а) в начале любого клеточного цикла должен образоваться
некий (всегда один и тот же) промитотический комплекс тран-
скрипционных факторов (ПМКТФ) специфичный в отношении
генов раннего ответа (п. 6.1.3.1);
б) в состав этого комплекса входят Р-катенин и белок Tcf4
что возможно лишь тогда, когда р-катенин не связан кадгери
ном (нет межклеточных контактов),
в) кроме того, комплекс содержит факторы, активируемые
каскадом МАПК; причем этот каскад сам, по предыдущему на-
шему предположению, требует двойного сигнала от интегри-
нов (клетка прикреплена к внеклеточной структуре) и от росто-
вого фактора.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ
425
( I Ь . I
I №> ]
1 «Д "У
RB
МАПК
4
(
Активным
жкс
НЕ
Cdk-4
Неактивные
транскрипционные
фак юры
Ядро
СоседняяГъ]
к.1С<ка
Рецепторы___________Кадтерцны,
)ФР
Интегрины
Активный транскрипционный
комплекс генов ответа
Опорная поверхность
_______________________Z______________________________________- . ......................................
аминокислоты
6.S, Механизм контактного торможения
>тезы of уии- орсальцсм лромитотическом
се транскрипционных. фактор*
ж фактор роста, ft-Кзт fl-катонан.
426
Глава 6
В итоге число условий, необходимых для деления клетки (в
принципе способной к делению), возрастает уже до трех:
- это не только прикрепление к поверхности и действие рос-
тового фактора;
- но и отсутствие контактов с другими клетками.
Лишь при выполнении этих условий активируются гены
раннего ответа и запускается механизм клеточного цикла (в
частности, образуется «вторая очередь» транскрипционных
факторов, а затем и продукты стимулируемых ими генов — ци-
клин D, Cdk4,6 и т. д.; см. п. 6.1.3.1).
Но этим перипетии внутриклеточных регуляторных путей,
связанные с Р-катенином, не исчерпываются. Установлено еще,
по крайней мере, два интересных факта.
а) Деградация Р-катенина производится с помощью уби-
квитинзависимого механизма (см. раздел 3.7). Причем в каче-
стве убиквитинлигазы- (фермента, переносящего убиквитин на
Р катенин) выступает уже знакомый нам фактор АРС (рбеспе
чивающий анафазу; п. 6.1.2.2).
Последний выполняет такую же функцию в отношении ци-
клинов, необходимых для вхождения клетки в цикл (п. 6.1.2.2).
Поэтому нет ничего удивительного, что одновременно с данными
циклинами разрушается и транскрипционный фактор, требую-
щийся для их синтеза. Происходит же это в метафазе и анафазе
митоза, когда АРС активируется путем фосфорилирования.
По некоторым данным, перед взаимодействием с АРС Р-ка-
тенин тоже должен подвергнуться фосфорилированию — кина-
зой-Зр-гликогенсинтетазы (GSK-3P) (которая, в свою очередь,
находится под контролем ряда белков).
Такое «повышенное внимание» со стороны клетки к Р-кате-
нину — косвенное свидетельство его ключевой роли в запуске
деления. Это вполне согласуется с предположением, что Р кате-
нин — необходимый компонент универсального транскрип-
ционного комплекса, начинающего клеточный цикл при любом
митогенном стимуле.
б) Второй факт состоит в том, что при контактном торможе-
нии в клетке увеличивается содержание белка рбЗ.
Это тоже выглядит вполне естественно, если считать, что
все тот же комплекс транскрипционных факторов, помимо про-
чего, ускоряет распад белка р53 (например, в соответствии со
сказанным в конце п. 6.1.3.3, выключая ген белка ARF инги-
битора протеолиза белка р53).
При контактном торможении указанный транскрипцион-
ный комплекс образоваться не в состоянии (из-за дефицита сво-
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
427
бодного Р-катенина), поэтому в клетке накапливается белок
ARF а значит — и белок р53.
6.1.4. Механизм действия комплексов
циклин-Cdk
Итак, мы выяснили, что митогенные и антимитогенные
факторы влияют, в первую очередь, на содержание и активность
начальных комплексов G,-периода — циклин D-Cdk4,6.
Это запускает механизм клеточного цикла — с последова-
тельной сменой комплексов циклип-Cdk и со всеми многочислен-
ными событиями, характерными для каждой стадии цикла.
В нашем изложении пришла, наконец, пора разобраться в
работе этого механизма. Главный вопрос состоит в том, каким
образом комплексы циклин-Cdk, обладая «всего лишь» проте-
инкиназной активностью, «продвигают» клетку «вперед» — от
стадии к стадии, от одних событий к другим?
Конечно, известно здесь еще далеко не все. Но о принципе
работы и некоторых деталях этого замечательного механизма
уже можно сказать.
Что касается принципа работы, то он достаточно прост и
очевиден. Комплекс циклин-Cdk очередной стадии цикла, как
правило, должен обеспечить три вещи:
а) «выведение из игры» комплекса предыдущей стадии,
б) стимуляцию событий «своей» стадии,
в) образование (или активацию) комплекса следующей
стадии.
Получается своего рода «цепной» механизм, после вклю-
чения которого каждая стадия процесса подготавливает усло-
вия для перехода к следующей стадии. Несомненно, таков же
принцип многих других сложных биологических процессов
таких, как эмбриональное развитие, дифференцировка, реге
Нерация.
Посмотрим теперь, как конкретно реализуется этот прин-
цип в случае клеточного цикла.
6 14 1 Действие комплексов G, периода
Активные протеинкиназные комплексы циклин D Cdk4 и
Циклин D Cdk6 действуют сразу на несколько субстратов.
1. Основным среди последних является белок pRb (и подоб-
ные ему белки р!05 и р!ЗО; рис. 6.7).
428
Глава 6
Рис. КТ' екты, лэдСыва^мые комплексами п»
i D. Ц-Б, Ц-А — циклимы О. Е и А;
inc анофл-ч^ инваюи1ии<ря«<тор
i2F-l5P комплекс гранмрипционаых ф&<’ороь
iftt) уу ИНгИ^МХ>р______________________________
Обозначение данного белка происходит от термина «ре-
тинобластома»: такая опухоль развивается при мутациях ге-
на pRb.
А функция этого белка состоит в ингибировании комплекса
очередных транскрипционных факторов: E2F и DP. Каждый|
из этих факторов имеет несколько разновидностей (E2F-1,.--
E2F-5; DP 1....DP 3).
В неделящихся клетках белок pRb находится в нефосфори
лированном (или недофосфорилированном) состоянии; поэтому
имеет высокое сродство к комплексу E2F-DP и блокирует его. (
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
429
Положение меняется под действием других комплек-
сов — циклин D-Cdk4,6: они, как уже было сказано, фосфо-
рилируют pRb.
В результате pRb теряет сродство к E2F-DP, и последний
становится способным выполнять функции транскрипционного
фактора. В этом качестве комплекс E2F-DP активирует целый
ряд генов:
а) гены циклинов Е, А и киназ Cdk2, Cdkl т. е. компонен-
тов комплексов циклин-Cdk последующих стадий цикла;
б) гены самих факторов E2F;
в) гены ключевых ферментов синтеза дезоксирибону
клеотидов и репликации ДНК , а именно:
- дигидрофолатредуктазы (участвует в превращении рибо-
нуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды),
- тимидинкиназы (присоединяет фосфатные группы к ти-
мидину),
- ДНК-полимеразы а (основной фермент репликации ДНК;
п. 1.2.3.2),
белка PCNA (своего рода «прищепка», которая крепит
комплекс полимераз к реплицируемой цепи ДНК; см.
рис. 1.13) и некоторых других;
г) предположительно, также гены новых транскрипцион-
ных факторов, стимулирующих в конце G,-периода экспрессию
гена циклина В
Весьма существенное обстоятельство: в этих регуляторных
взаимоотношениях имеются две положительные обратные
связи.
Первая из них касается комплекса второй половины Grne-
риода — циклииа Е Cdk2
- с одной стороны, он образуется под влиянием транскрип
ционного комплекса E2F-DP,
с другой стороны, после своего образования он начинает
(помимо других действий) фосфорилировать белок pRb,
поддерживая таким образом высокую активность того же
комплекса E2F-DP
Вторая связь еще проще: последний комплекс стимулирует
ген своего ключевого компонента — белка E2F.
Благодаря этим связям, со временем прохождение клеткой
клеточного цикла перестает зависеть от того, действуют на нее
митогены или нет. Действительно, теперь независимо от митоге-
нов в клетке поддерживается высокое содержание активного
транскрипционного комплекса E2F DP, который обеспечивает
экспрессию всех вышеперечисленных генов.
430
Глава 6
Это означает, что клетка прошла точку рестрикции
(п. 6.1.1.1.): «решение» о ее вхождении в клеточный цикл стало
необратимым.
Что же касается ферментов и белков, необходимых для син-
теза дезоксирибонуклеотидов и репликации ДНК, то, очевидно,
экспрессия их генов в Сгпериоде — не что иное, как подготовка
к следующему (синтетическому) периоду клеточного цикла.
И все это, как мы видели, обеспечивается единственным
действием исходных комплексов циклин D—Cdk4,6 — фосфори-
лированием ингибиторного белка pRb.
2. Но кроме этого белка у комплексов С(-периода есть и дру-1
гие объекты «внимания». Среди них — фактор АПС и некото
рые ингибиторы.
а) АРС (анафазу обеспечивающий фактор) - это, как мы зна-
ем (пп. 6.1.2.2 и 6.1.3.4), убиквитинлигаза, которая присоединя-
ет молекулы сигнального белка убиквитина к катенину циклину В
и тем самым стимулирует их быстрый распад в протеосомах.
Фосфорилирование же АРС комплексами циклин
D Cdk4,6 инактивирует его (АРС). Поэтому синтезируемый
циклин В практически не разрушается и его концентрация
неуклонно нарастает до метафазы митоза.
Заметим: как отмечалось в п. 6.1.2.2, в метафазе комплекс
циклин В Cdkl (достигнув достаточно высокой концентрации)
тоже фосфорилирует АРС — и это оказывает противоположное
действие: не ингибирование, а активацию АРС. Очевидно, фос-
форилирование в этих двух случаях происходит по разным ами-i
нокислотным остаткам. И, кроме того, должны присутствовать
фосфатазы, устраняющие в АРС последствия «работы» ком-
плекса циклин D—Cdk4,6.
б) Не менее важно влияние комплексов Gj-периода на инги-
биторы комплексов S-фазы.
Дело в том, что вначале образующиеся комплексы циклин
A-Cdk2 и циклин B-Cdk2 сразу связываются с ингибиторами из
семейства KIP1 (п. 6.1.2.2); это предохраняет клетку от прежде-
временного начала репликации ДНК.
В конце же Gj-периода ингибиторы фосфорилируются (ве-
роятно, комплексами циклин E-Cdk2), что лишает их сродства к
своим лигандам. Поэтому соответствующие комплексы активи-
руются и вводят клетку в S-nepuod.
С другой стороны, активность комплекса циклин A Cdk2
может быть увеличена в сотни раз путем фосфорилирования од-
ного из его компонентов — Cdk2 (п. 6.1.2.2). Так что, возможна
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ... 431
вхождение клетки в S-фазу осуществляется с помощью и этого
или преимущественно этого механизма.
Итак, комплексы Gj-фазы обеспечивают:
- образование, компонентов комплексов последующих ста-
дий цикла, сохранение, их на протяжении определенного
времени и активацию в нужный момент;
образование субстратов и ферментов, необходимых для
репликации ДНК.
6 1 4.2. Действие комплексов S и G2-nepuodoe
Для S-периода характерны комплексы циклин A Cdk2 ци-
клин В Cdk2 а для О2-периода — комплекс циклин В Cdkl
(см. рис. 6 2) f
Спектр решаемых ими задач представляется гораздо уже,
чем для комплексов Gj периода.
Основная из этих задач — обеспечить такое проведение ре-
пликации ДНК, чтобы каждый участок любой молекулы ДНК
был реплицирован только один раз.
Как мы знаем (п. 1.2.2 2), на хромосоме имеется много то-
чек начала репликации (ТНР): в сперматогониях — в среднем
по 40 точек на хромосому, в прелептотенных сперматоцитах —
по 5-6 точек. В каждой ТНР, согласно существующим предста-
влениям, начинают работать два репликативных комплекса:
один перемещается по молекуле ДНК в одну сторону, второй —
в противоположную.
Так вот, сформулированная выше задача означает, что с
любой ТНР за весь клеточный цикл должна связаться лишь од
на пара репликативных комплексов.
Каким же образом это достигается?
Вспомним: в состав репликативного комплекса (РК) входит
До 15-20 белков (раздел 1.2.3). Под влиянием комплексов Gj-ne-
Риода образуются только некоторые из этих белков (ДНК-полиме-
раза, PCNA и ряд других); обозначим белки этой группы РК 2
Остальные же компоненты (обозначим их РК-1), похоже,
синтезируются независимо от циклинзависимых киназ. Но за
то могут регулироваться путем фосфорилирования и дефосфо
Рилирования.
В связи с этим картина представляется таковой.
а) Еще в раннем G, периоде фосфатазы дефосфорилируют
какие-то белки из группы РК 1 Это сообщает белкам данной
гРУппы способность связываться с ТНР, образуя т. н. пререпли-
кативные комплексыТЧто тогда же — в раннем Сгпериоде — и
происходит.
432
Гпава 6
б) В позднем Gt-nepuode к этим комплексам, видимо, при-
соединяются вновь синтезированные белки группы РК-2. Но ре-
пликация не начинается, поскольку белки РК-1 в дефосфорили
роеанном состоянии:
- могут связываться с ДНК,
- но не могут участвовать в ее репликации.
в) В самом конце G, периода, как уже отмечалось
(п. 6.1.4.1), путем освобождения от ингибиторов активируются
комплексы S-фазы — в т. ч. комплекс циклин A Cdk2.
Последний фосфорилирует соответствующие белки из груп-
пы РК-1. Изменение их конформации приводит к тому, что ре-
пликативный комплекс, уже давно связанный с ТНР,
- приобретает, наконец, способность реплицировать ДНК,
- но теряет способность вновь связываться с той же или лю-
бой другой ТНР.
Этот-то «хитроумный» механизм и предупреждает повтор-
ную репликацию каких-либо участков ДНК.
Такое положение сохраняется до начала G,-периода сле-
дующего клеточного цикла, когда в «дело» вновь вступают
РК-1-специфичные фосфатазы.
Что еще в регуляторном плане должно иметь место в тече-
ние S- и С2-периодов?
а) Во-первых, образование компонентов MPF, т. е. митоз-
стимупирующего фактора, представляющего собой комплекс
циклин B-Cdkl (п. 6.1.2.1).
б) А во-вторых, торможение активности этого комплекса —
во избежание преждевременного начала митоза. Это осущест-
вляется, вероятно, путем ингибиторного фосфорилирования
специальной протеинкиназой.
6 1.4.3. Профаза и метафаза митоза: действие
митотического комплекса (MPF)
Митоз — безусловно, наиболее драматичный период кле-
точного цикла. В это время происходит масса радикальных пре-
образований (п. 6 1 1.2), различимых даже на светооптическом
уровне.
Как же все это управляется только что упомянутым ком-
плексом циклин В Cdkl (который мы будем называть более ко-
ротко — MPF)?
Оказывается (и об этом уже упоминалось в п. 6 1.2.2), на
первых двух стадиях митоза — в профазе и метафазе — ключе-
вую роль играет высокая активность MPF: она инициирует со-
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
433
ответствующие процессы (конденсацию хромосом, распад ядер-
ной оболочки и т. д.).
А на последней стадии митоза — в телофазе — такое же ре-
шающее значение имеет низкое содержание вышеназванного
комплекса: благодаря ему происходят процессы, обратные началь-
ным (сборка ядерной оболочки, деконденсация хромосом и пр.).
Рассмотрим все это подробнее. Обратимся вначале к собы-
тиям первых фаз митоза.
1. Конденсация хромосом. Известно, что MPF способен
фосфорилировать гистон Н1. Данное обстоятельство даже ис-
пользуют как тест на активность MPF. Молекулы же гистона Н1
связаны с межнуклеосомными участками ДНК и участвуют в
укладке нуклеосомной нити (п. 1.1.2.2), причем, возможно,
лишь в фосфорилированном состоянии.
Но, видимо, одного гистона Н1 недостаточно. У разных ор-
ганизмов обнаружено семейство специальных белков, уча-
ствующих в поддержании структуры конденсированных хромо-
сом. Это т. н. белки SMS (от англ, structural maintenance of chro
nwsomes).
Но и их недостаточно! Необходимы еще несколько бел-
ков, и только после их фосфорилирования фактором MPF
они объединяются с белками SMS в комплекс, называемый
конденсином
Вот этот-то комплекс, видимо, и приводит к тому, что в хро-
мосомах нуклеосомные нити начинают складываться в структу-
ры более высокого порядка (см. п. 1.1.2.2): образуют спираль
типа соленоида, затем — суперспираль и т. д. — вплоть до пре-
вращения в компактные метафазные хромосомы.
Оказалось также, что за эту упаковку надо «платить»: про-
цесс идет с затратой АТФ. Вообще говоря, само фосфорилиро-
вание белковых компонентов конденсина (как и любая протеин-
киназная реакция) происходит с участием АТФ, которая явля-
ется донором фосфатной группы (п. 5.2.1.4). Но здесь, кроме то-
го, АТФ расходуется и в ходе взаимодействия уже фосфорилиро-
ванного конденсина с нуклеосомной цепью.
В принципе это понятно: данная цепь переходит из относи-
тельно неупорядоченного состояния в строго упорядоченное;
следовательно, ее энтропия (степень разупорядоченности)
Уменьшается. А такие процессы, как известно из термодинами-
ки, самопроизвольными не бывают и требуют энергетического
обеспечения.
Пусковым же толчком к запуску конденсации хромосом яв
ляется, как мы видели, фосфорилирующее действие MPF.
434
Глава 6
2. Распад ядерной оболочки. Целостность ядерной оболоч-
ки во многом поддерживается ядерной ламиной. Напомним
(п. 1.1.1): это тонкая сетевидная пластинка, которая образована
из промежуточных филаментов и прилежит к внутренней сторо-
не внутренней ядерной мембраны, выполняя функцию опорной
структуры.
При этом белки ламины (подразделяющиеся на типы А, В и
С) имеют гантелеобразную форму: два глобулярных домена, свя-
занные палочкообразной частью. Полимеризация происходит
путем взаимодействия глобулярных доменов.
Данное взаимодействие и регулируется путем фосфорили-1
рования-дефосфорилирования. Фактор MPF катализирует
фосфорилирование определенных остатков серина в области
палочковидных частей филаментов. А это сказывается на кон-
формации связывающих доменов — так, что вся конструкция
«рассыпается». Белки ламины А и С переходят в растворенное
состояние, тогда как белок В остается связанным с ядерной
мембраной.
Мембрана же, лишенная объединяющего ее «скелета», рас-
падается на фрагменты, замыкающиеся в микропузырьки. Так
фактор MPF приводит ко второму важному результату распа-
ду ядерной оболочки.
3. Распад других мембранных структур. В ходе профазы
митоза разрушаются, кроме ядерной оболочки, также мембра-
ны эндоплазмати ческой сети и аппарата Гольджи. Биологи-
ческий смысл этого понятен: сохранившаяся единая система ци-
стерн и вакуолей,
- во-первых, мешала бы расхождению хромосом,
- во-вторых, могла бы оказаться в будущих ядрах и,
- в-третьих, препятствовала бы разделению цитоплазмы. 1
Как и ядерные мембраны, эти мембраны не «растворяются»
(что было бы, конечно, невозможно), а тоже распадаются на
мелкие везикулы.
И, как полагают, аналогичными являются механизм рас-
пада и запускающее его событие: фосфорилирование факто-
ром MPF неких структурообразующих белков, связанных с
мембранами.
4. Формирование веретена деления. Если фосфорилирова-
ние белков промежуточных филаментов приводит к явлению де-
полимеризации, то фосфорилирование тубулина, видимо, ведет
к противоположному процессу — полимеризации тубулина с
образованием микротрубочек.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ. ..
435
Катализатором же фосфорилирования является опять MPF.
5. Предупреждение преждевременной цитотомии. Как от-
мечалось в п. 6.1.1.2, цитотомия (разделение цитоплазмы) в те-
лофазе происходит путем образования актомиозинового кольца,
которое постепенно сужается за счет взаимодействия актино-
вых и миозиновых филаментов.
Но всему должно быть свое время! Поэтому все тот же фак-
тор MPF еще в ранней профазе фосфорилирует легкие цепи мио-
зина, и это лишает миозин способности реагировать с актином.
Тем самым предупреждается преждевременная цитотомия — до
того, как хромосомы разойдутся по двум полюсам клетки.
Помимо вышеперечисленных субстратов, MPF, как счита-
ют, фосфорилирует и много других — еще неидентифицирован-
ных — белков.
Но и сказанного вполне достаточно, чтобы согласиться с
мнением, что вся эта сложная совокупность событий может ини-
циироваться всего лишь одной ключевой протеинкиназой, а
именно — фактором MPF
6.1.4 4 Анафаза и телофаза митоза: действие
АРС и протеинфосфатаз
Среди белков, фосфорилируемых в метафазе фактором
MPF, есть и его собственный «могильщик» - фактор, обеспе-
чивающий анафазу, или АРС. Об этом мы уже говорили в
п. 6.1.2.2, равно как и об «истинной сущности» АРС. Послед-
ний — это убиквитинлигаза (раздел 3.7), специфичная в отно-
шении ряда белков, в том числе MPF. Присоединяя к ним моле
кулы небольшого белка убиквитина, АРС тем самым метит свои
«жертвы». Благодаря этому они быстро захватываются про-
теосомами и разрушаются их протеолитическими ферментами.
И вот именно такой белок (имеется в виду АРС) фосфорили-
руется и тем самым активируется фактором MPF!
Но, впрочем, АРС оказывает свое разрушительное влияние
Не только на MPF. Поэтому перечислим все по порядку.
1. Расхождение сестринских хроматид и ингибиторы ана-
фазы. В метафазе каждая сестринская хроматида каждой хро
Мосомы с помощью своего кинетохора (п. 1.1.2.3) прикреплена
к микротрубочкам веретена деления. Другим концом микротру
бочки связаны с одним из полюсов веретена. За счет определен-
ных процессов (п. 6.1.1.2) создается напряжение, тянущее се
СтРинские хроматиды к противоположным полюсам.
Но этому напряжению препятствует связь между хромати
Дами, осуществляемая мультибелковыми комплексами т. н.
436
Глава 6
когезинами В данные комплексы входят и некоторые белки,
ответственные за конденсацию хромосом (в частности, белки се-
мейства SMS, п. 6.1 4.3).
Но, кроме того, ключевую роль в поддержании целостности
когезиновых комплексов играют некие белки, обозначаемые
как ингибиторы анафазы (ИнА)
Эти-то белки и метятся убиквитином с помощью АРС, после
чего подвергаются быстрому разрушению в протеосомах.
Может возникнуть вопрос: как ИнА, даже помеченные уби-
квитином, оказываются в протеосомах — они ведь находятся в
составе когезиновых комплексов?
Но надо понимать, что в клетке любые, даже самые ста-1
бильные, комплексы пребывают в состоянии динамического
равновесия. Это значит, что существует и некое количество не-
связавшихся друг с другом лигандов И если в среде быстро раз-
рушаются свободные лиганды, то из-за снижения их концентра-
ции равновесие в комплексах будет смещаться в сторону диссо-
циации.
Отсюда и следует, что разрушение свободных ИнА приведет
к распаду когезиновых комплексов.
Это даст возможность сестринским хромосомам расходить-
ся. И с этого момента начинается, как известно, анафаза.
2. Разрушение MPF. В отношении MPF убиквитинлигаза
(АРС) некоторое время — до поздней анафазы — проявляет]
«терпимость». Смысл этого вполне ясен: пока не завершится]
расхождение хромосом, «устранение» MPF нежелательно. Дей-
ствительно, именно благодаря MPF, как мы видели, поддержи-
вается конденсированное состояние хромосом, ядерная оболоч-
ка находится в раздробленном виде и т. д.
Но вот каков конкретный механизм проявляемой «терпимо-'
сти», пока не известно. Не исключено, что в дело вмешиваются еще
некие факторы, до поры до времени защищающие MPF от АРС.
Как бы то ни было, в конце анафазы АРС, наконец, метит1
MPF (точнее, циклин В в комплексе циклин В Cdkl) убиквити-
ном, после чего MPF быстро «уходит со сцены». Остается лишь
его каталитическая субъединица (Cdkl), которая сама по себе
малоактивна. Это знаменует наступление телофазы.
3 Эффекты «отмены» MPF В делящейся клетке, видимо,
постоянно присутствуют протеинфосфатазы (ПФ). После рез-1
кого снижения содержания MPF их активность начинает преоб-
ладать. Поэтому те белки, которые в профазе и метафазе фосфори- ’
лировались, теперь подвергаются дефосфорилированию. Это при-
водит к эффектам, противоположным событиям профазы.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
437
а) Восстановление ядерных оболочек. Дефосфорилиро-
ванные белки ламины склонны к полимеризации с образовани-
ем промежуточных филаментов.
Как мы помним, белок ламины В сохранял связь с мембра-
ной и в составе мелких мембранных пузырьков (появляющихся
при разрушении ядерной оболочки). Теперь же через отверстия
пор внутрь пузырьков начинают проникать также белки типа А
и С, используя белки В как центры полимеризации.
Мембранные пузырьки - тоже динамичные структуры:
они постоянно сливаются друг с другом и вновь разбиваются
(под влиянием взаимных толчков) на более мелкие пузырьки.
Так что, в итоге их средний диаметр такой, какой является наи-
более термодинамически вероятным при имеющихся условиях.
Формирующиеся филаменты, достигнув в длину диаметра
пузырька и не исчерпав потенциал своего роста, начинают «да-
вить» на стенки пузырьков. Поэтому термодинамически наибо-
лее вероятный диаметр последних начинает возрастать. Проще
говоря, процесс слияния теперь преобладает над процессом раз
биения.
Центром объединения служат пузырьки, связанные с кине-
тохорами хромосом. (Неизвестно, сохраняется ли такая связь в
течение метафазы и анафазы или она появляется только в тело-
фазе.) Поэтому последовательно образуются
вначале кариомеры (п. 6.1.1.2) — относительно крупные
пузырьки, содержащие по одной хромосоме,
а затем и дочерние ядра, каждое из которых включает все
хромосомы, собравшиеся у соответствующего полюса.
И, как мы видели, стимулом к этому служит стремление де-
фос<1>орилированных белков ламины к полимеризации.
Вероятно, сходным образом происходит восстановление эн-
доплазматической сети и аппарата Гольджи.
б) Деконденсация хромосом. Здесь ключевым моментом,
очевидно, является дефосфорилирование определенных белков
в конденсине (п. 6.1.4.3) — белковом комплексе, обеспечиваю-
щем плотную упаковку нуклеосомной нити.
Изменение структуры белков в результате дефосфорилиро
вания приводит к тому, что конденсиновые комплексы «рассы-
паются», отчего хромосомы «разворачиваются».
в) Цитотомия (цитокинез). Дефосфорилируются так
же легкие нити миозина. Поэтому миозиновые филаменты
получают возможность взаимодействовать с актиновыми.
Вместе они образуют актомиозиновое кольцо, расположенное
По экватору клетки.
438
Глава 6
В результате указанного взаимодействия кольцо постепен-
но сжимается, образуя перетяжку, которая постепенно делит
одну клетку на две. Митоз заканчивается, а с ним — и клеточ-
ный цикл.
6.1.4.5. Некоторые замечания
Итак, мы проследили все этапы регуляции клеточного цикла:
- от действия митогенных факторов на рецепторы плазмо-
леммы до активации протеинкиназных комплексов ци-
клин D-Cdk4,6
- и от вызванного этой активацией вхождения клетки в Gr
период до окончания митоза.
Пожалуй, самое удивительное в вышеизложенном — это
огромная роль во всех этих событиях, казалось бы, простейшей мо-
дификации белков фосфорилирования-дефосфорилирования. |
Есть еще одно обстоятельство, на которое хотелось бы обра-
тить внимание. Мы уже не раз упоминали, что по сложности и
по взаимной «переплетенности» регуляторные пути напомина-
ют метаболические. Но имеется и отличие, затрудняющее их
анализ.
Оно состоит в том, что «физиономия» всех субъектов рас-
шифрованных путей метаболизма известна: она выражается от-
носительно простой структурной формулой. И вполне ясно поэ-
тому, что именно происходит при превращении одного метабо-
лита в другой.
В отличие от этого, многочисленные белковые компоненты
регуляторных путей остаются фактически «безликими». Дей-
ствительно, их разнообразные буквенные обозначения отража-
ют отчасти лишь функциональную роль белка, а отчасти — безу-
держную фантазию первооткрывателей. Поэтому за словами
«фактор X активируется и затем активирует очередной фактор
Y» никакого зрительного образа, который был бы адекватен ре-
альности, не стоит.
Между тем в этих взаимных активациях и торможениях, в
этих беспрестанных и очень тонких изменениях конформации
белков-регуляторов и заключается весь смысл их деятельности.
Все это говорится к тому, что не следует думать, будто вся
истина уже известна. Предстоит еще огромная исследователь-
ская и аналитическая работа по выявлению структурного
«облика» всевозможных регуляторных белков в различных их
состояниях. И эта работа уже интенсивно ведется во многих ла-
бораториях мира
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
439
На этом можно было бы завершить рассмотрение проблемы
«регуляция клеточного цикла».
Однако у нее есть еще один чрезвычайно интересный «пово-
рот»- Который затем естественным образом выведет нас на вто-
рую крупную проблему данной главы — апоптоз.
6.1.5. Контроль клетки за прохождением
клеточного цикла
6.1.5.1. Объекты, контроля и сверенные точки
1. Оказывается, в ходе цикла клетка не просто «бездумно»
следует по раз и навсегда заданному маршруту. Нет, одновре-
менно происходит и самоконтроль собственного состояния
Точнее, этот контроль приурочен к определенным стадиям ци-
кла. Как говорят, в цикле существует несколько «сверочных
точек» — по одной на каждый из четырех периодов цикла (G, ,
S-, 02-периоды и митоз).
Главное, что подвергается контролю, — это состояние на
следственного материала, хромосом. И, в зависимости от ре-
зультатов «проверки», выбирается один из трех вариантов даль-
нейшего « поведения »:
а) безостановочный переход к следующей стадии цикла,
б) более или менее длительная задержка на текущей ста-
дии — для исправления обнаруженных дефектов, если таковое
возможно;
в) запуск механизма апоптоза, если выявленные наруше-
ния неисправимы.
Отметим: последний вариант выбирается не только тогда,
когда хромосомные дефекты просто «несовместимы с
жизнью», но и тогда, когда они в принципе не препятствуют
прохождению последующих стадий цикла. Так что здесь име-
ет место «забота» о том, чтобы в организме не появлялись
клетки с «неправильным» геномом, даже если эти клетки и
были бы жизнеспособными.
2. В табл. 6.1 указано, что конкретно может быть призна-
но «неудовлетворительным» в каждой из сверочных точек.
Иначе говоря, какие причины могут задержать клетку на дан
ной стадии цикла или даже индуцировать ее «самоубийство»,
т- е. апоптоз.
440
Глава 6
Таблица 6.1. Характеристика сверочиых точек
Возможные причины остановки цикла в данной точке
Сверочная точка Gj-периода 1. Двухцепочечные разрывы в молекулах ДНК (под дей- ствием УФ и у-облучения, алкилирующих агентов и т. д.)_ 2. Неправильная сегрегация хромосом во время предыду) щего деления (в т. ч. проявляющаяся образованием ми- кроядер). 3. Разрушение системы микротрубочек.
Сверочная точка S-периода Недостаток нуклеотидов в клетке.
Сверочная точка G2 периода 1. Незавершенность репликации каких-либо участков! хромосом. 2. Крупные повреждения ДНК (сохранившиеся с предыду- щих периодов или полученные вновь)
Сверочная точка метафазы митоза Неправильная сборка веретена деления. Например, неприкрепление кинетохоры какой-либо хроматиды к микротрубочкам веретена деления. В частности, это может быть следствием неправилы кого функционирования белков (из семейств BUB или MAD), ассоциированных с кинетохорами
Видно, что все эти причины действительно так или иначе
связаны с состоянием хромосом. Даже тогда, когда речь идет о
микротрубочках и образующемся из них веретене деления. Ведь
от функционирования этого веретена непосредственно зависит
сегрегация хромосом (расхождение их к разным полюсам ана-
фазной клетки).
Обратим внимание на такой интересный момент — непра-
вильная сегрегация хромосом может привести не только к ано-
малиям их числа, но и к образованию стабильных микроядер.
Это наблюдается тогда, когда у каких-либо хромосом нарушает-
ся связь с диплосомой. Такие хромосомы в анафазе перемеща-
ются (если перемещаются вообще) к одному из полюсов с види-1
мым отставанием. В телофазе же они, как обычно, служат цен-
трами формирования микроядер. Но из-за отсутствия связи с
единым центром эти микроядра так и не сливаются с «основ-
ным» ядром. Видимо, образование единой ядерной ламины (за-
ставляющее микроядра объединяться друг с другом) происхо-
дит при формообразующем участии микротрубочек клеточного,
центра.
3. Сделаем еще три замечания.
а) В процессе репликации ДНК могут происходить те или
иные ошибки (например, включение «неправильного» нуклео-
тида). Такие ошибки детектируются и исправляются специаль-1
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
441
вой системой репарации (п. 1.6.3); поэтому они, как правило, не
приводят к остановке цикла и тем более к апоптозу.
б) Кроме того, в ДНК на всех стадиях цикла могут по-
являться и другие «точечные» повреждения (раздел 1.7.1). Они
тоже — предмет «заботы» соответствующих систем репарации
ДНК (раздел 1.7.2), но не тех систем, которые отвечают за про-
хождение цикла. Если, конечно, эти повреждения не настолько
множественные, что серьезно нарушают структуру хромосом.
Таким образом, контроль за состоянием хромосом, о кото-
ром идет речь в настоящем разделе, касается лишь достаточно
крупных нарушений их структуры — начиная с двухцепочеч-
ных разрывов и кончая изменением числа хромосом (в результа-
те ошибок сегрегации).
в) Наконец, следует сказать, что, как и в случае систем ре-
парации ДНК, эффективность контроля и элиминации (в т. ч.
и путем апоптоза) крупных хромосомных нарушений — все же
не стопроцентна.
Об этом свидетельствует и табл. 6.1, из которой видно, что
эти нарушения могут «переходить» из одного периода цикла в
другой. И о том же говорит сам факт существования таких из-
вестных хромосомных аномалий, как синдромы Дауна. Шере-
шевского-Тернера и другие.
6.1.5.2. Механизм остановки цикла или перехода к
апоптозу
Какие конкретно структуры являются сенсором или детек-
тором нарушений хромосомной структуры? В большинстве слу-
чаев это остается пока неизвестным.
Но в отношении двухцепочечных разрывов ДНК некоторая
определенность есть. Считают, что их узнает специальная ДНК
протеинкиназа.
Само исправление таких разрывов осуществляется, вероят
но, путем гомологичной рекомбинации поврежденной хромо-
сомы (или хроматиды) с интактной (рис. 6.8; ср. с рис. 1.18).
Имеется в виду, что между этими хромосомами происходит об-
мен таким фрагментом одной из цепей ДНК, в котором и заклю-
чен разрыв. В результате обмена в каждой хромосоме оказыва-
ется молекула ДНК с одноцепочечным разрывом. А такие раз-
рывы устраняются ДНК-лигазой (п. 1.2.3.3).
Но все это требует времени. Для чего и происходит останов-
ка клеточного цикла. Каким же образом она осуществляется?
В большинстве, если не во всех, случаях хромосомных
повреждений центральную роль в остановке цикла играет
442
Глава 6
ь__________________________________
1б..................*..............
26
I
2а ..................................
26 I
♦ (из цепи 2а)
+ (из цепи 1а)
2а -...........। j ..........
26 ................♦.................
la -------------------<....
16
26
Рис. 6 8. Возможная схема '
репараций д» ухцелрмеЧнь)х
... разрывов ди^ .
белок р53. В соответствии с
п. 2.4.2.3, он синтезируется в клет-
ке постоянно, но в обычных усло-
виях очень быстро разрушается,
так что его концентрация в клетке
оказывается весьма низкой.
При наличии же в клетке хро-
мосомных повреждений «включе-
ние» белка р53 происходит сле-
дующими способами:
- путем уменьшения скоростй
его распада и
- путем повышения активно-
сти его молекул.
На активность р влияет, в
частности, его специфический ин-
гибитор — белок Mdm2. В то же
время связывание этого ингибито-
ра зависит от того, фосфорилиро-
ван ли соответствующий локус
белка р53.
Так, если речь идет о двухцепочечных разрывах ДНК, то об-
наруживающая их ДНК-протеинкиназа (упомянутая выше)
фосфорилирует р 3 и тем самым освобождает его от ингибирую-
щего влияния белка Mdm2 (рис. 6.9).
При других повреждениях ДНК могут работать иные меха-
низмы. Например, после УФ-облучения в действие вступает ка-
зеинкиназа II (см. рис. 5.33): она тоже способна фосфорилиро!
вать и тем самым активировать белок р53.
И так далее - способов регуляции активности этого белка
очень много, о чем говорилось в п. 2.4.2.3.
Что делает активный белок р53? Мы уже знаем (п. 2.4.2.3),
что это транскрипционный фактор. И одно из первых его действий
в таком качестве — активация гена белка р21 (п. 6.2.3.4 и
рис. 6.6). Белок же р21 — ингибитор всех комплексов циклин-Cdk
(п. 6.1.2.1 и рис. 6.2). По этой причине и наступает остановка
клеточного цикла, в каком бы его периоде ни находилась клетка.
Если повреждения хромосом достаточно велики и их испра-
вление затягивается, то длительно сохраняющий высокую ак-
тивность белок р53 начинает стимулировать (как транскрип-
ционный фактор) серию других генов (ВАХ, KILLER/DR5, PIG
и др.; п. 2.4.2.3) — запускающих апоптоз. Одновременно ин-
гибируются антиапоптозные гены (BCL2, RELA).
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ 443
В итоге в такой клетке начинает выполняться сложная про-
грамма самоуничтожения.
К рассмотрению этой программы (а также прочих вопросов,
касающихся апоптоза) мы теперь и переходим.
6.2. АПОПТОЗ’
6.2.1 Общие представления
6.2.1.1. Введение
Это чрезвычайно интересный феномен — и сам апоптоз, и
необыкновенная емкость данного термина: не так давно возник-
нув, последний вдруг объединил широчайший круг явлений.
Авторы выражают благодарность А. Архипенко за помощь в сборе ли
пературы по данной проблеме и предоставление ряда иллюстраций.
444
Глава 6
Оказалось, что природа снабдила клетки не только много-
численными механизмами защиты и репарации, но и целым на-
бором «суицидальных» инструментов.
Образно говоря, в каждой клетке есть своя собственная «ги-
льотина», нож которой держится на не очень прочной «нитке» И
когда случается что-то экстраординарное — в самой клетке или во-
круг нее, нитка перерезается и гильотина падает, «аккуратно»
лишая клетку жизни. В этой «аккуратности» — тоже своя целесо-1
образность: соседние клетки пострадать не должны.
Вообще говоря, гибель отдельных клеток в организме из-
вестна достаточно давно. Но вначале она воспринималась как
сугубо дегенеративное явление, т. е. как процесс постепенного
отмирания клеток в результате терминальной дифференциров-]
ки (пример — эритроциты и кератиноциты; п. 1.2.1.4) или ста-
рения (нейроны).
И первый переворот во взглядах был сделан тогда, когда
стало ясно, что погибать могут и, казалось бы, вполне жизне-
способные клетки, т. е. клетки, которые еще не успели исчер-
пать свои жизненные ресурсы. Действительно, как иначе ха-
рактеризовать те многочисленные клетки, которые гибнут в эм-
бриогенезе — например, клетки предпочки (пронефроса) или
клетки межпальцевых перегородок? Как иначе объяснить эли-
минацию аутореактивных клонов лимфоцитов? И так далее.
Но обычно явно или неявно считалось, что во всех этих слу-
чаях клетки погибают, так сказать, естественным путем — из-за
того, что микроокружение перестает обеспечивать их жизнедея-
тельность. Например, прекращается поступление кислорода и
питательных веществ, создается резкое закисление среды и т. п.
И потребовался второй переворот во взглядах, чтобы прид-
ти к заключению: часто активную роль в своей гибели играет
сама клетка — с помощью содержащихся в ней механизмов.
Которые лишь запускаются теми или иными факторами внекле-
точной или внутриклеточной среды.
Именно в результате этого переворота и возникло представле-
ние об апоптозе, или программированной клеточной гибели (ПКГ).
Надо сказать, вначале эти понятия пытались разграничи-
вать: к ПКГ относили гибель клеток в эмбриогенезе, а к апопто-
зу — прочие случаи клеточного «суицида». Но к настоящему
времени стало ясно: никакой целесообразности в таком разгра-
ничении нет. И эти два понятия превратились в синонимы.
Поэтому кратко апоптоз определяют как программиро-
ванную клеточную смерть Понимая под этим такую гибель
клетки, в развитии которой активную роль играют специалы
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ..
445
нь1е и генетически запрограммированные внутриклеточные
механизмы.
Исходный же смысл слова «апоптоз» — весьма поэтиче-
ский: по-гречески это означает опадание листьев.
* * *
Когда и при каких обстоятельствах в клетке включается
программа апоптоза? Как мы уже говорили, круг этих «обстоя-
тельств» весьма широк. Но их можно разбить на две группы:
а) «неудовлетворительное» состояние самой клетки (что
вызывает, условно говоря, «апоптоз изнутри») и
б) «негативная» сигнализация снаружи, передающаяся че-
рез специальные рецепторы клетки («апоптоз по команде»).
Дадим вначале общую характеристику этих двух типов
апоптоза.
6 2.1.2. «Апоптоз изнутри»: пусковые факторы и
биологическая роль
Итак, в данном случае поводом для апоптоза служит «неу-
довлетворительное» состояние самой клетки.
Что именно может свидетельствовать о таком состоянии?
а) В первую очередь, чрезмерные (нерепарируемые или пло-
хо репарируемые) повреждения хромосом: многочисленные
разрывы ДНК, нарушения ее конформации, сшивки между це-
пями, неправильная сегрегация хромосом и т. д.
б) Кроме того, возможно, пусковым моментом иногда являют-
ся серьезные повреждения внутриклеточных мембран (особенно
митохондрий) в результате перекисного окисления их липидов.
А чем вызываются эти повреждения? — Хорошо известными
внешними факторами; среди них — разные виды облучений, изме-
нения температуры, определенные химические соединения. К по-
следним, в частности, относятся вещества (цисплатин и др.),
встраивающиеся в структуру ДНК, а также ингибиторы топоизо-
мераз (п. 1.2.3.1): те и другие нарушают конформацию ДНК.
Опасными могут быть и эндогенно образующиеся соедине-
ния оксид азота, супероксидный радикал и др. (п. 5.3.3.6).
Ускорять же их образование способны разнообразные стрессо-
вые ситуации.
Наконец, разнообразные повреждения могут возникать в
клетке и при нарушениях ее питания.
Пример апоптоза данного типа — прогрессивное уменьше-
ние с возрастом количества нейронов в головном мозгу. Если же
впоптоз особенно интенсивно происходит в тех или иных отде-
446
Глава 6
лах мозга, развивается соответствующее заболевание. Так, апо-
птотической дегенерации черной субстанции и полосатых ядер
соответствует болезнь Паркинсона (п. 5.3.3.5).
Нейроны — клетки неделящиеся. В делящихся же клетках
к вышеперечисленным факторам риска добавляется, пожалуй,
еще более опасный — сам процесс деления. Действительно,
здесь аномалии структуры хромосом могут появляться просто в
ходе сложнейших преобразований — репликации хромосом,
конденсации, сегрегации и т. д.
Следовательно, деления повышают вероятность апопто-
за Она возрастает, видимо, и потому, что в делящихся клет-
ках — более «строгий» контроль: как мы видели (п. 6.1.5.1), в
митотическом цикле имеются 4 сверочные точки.
В результате, как известно, на облучение особенно остро ре-
агируют ткани с интенсивно делящимися клетками крове
творные и эпителиальные.
Отметим также линии половых клеток — мужских и жен-
ских. В этих линиях на целом ряде этапов (как в эмбриональном
и перинатальном периодах, так и после полового созревания)
наблюдается массовая гибель клеток.
Вообще говоря, пока еще не ясно, как следует трактовать
эту гибель. Но не исключено, что ее цель — элиминация клеток
с «некачественным» геномом. В таком случае апоптоз — важ-
нейший инструмент решения той фундаментальной проблемы,
о которой говорилось в п. 1.4.3.4. Имеется в виду образование,
несмотря на естественные процессы старения, таких зрелых по-
ловых клеток, которые не несли бы в себе «груз» лет, прожитых
родительским организмом.
Итак, видимо, во всех названных случаях апоптоз выполня-
ет одну и ту же функцию уничтожение дефектных клеток.
Имеется и еще один общий момент: и для делящихся, и для
неделящихся клеток апоптоз, обусловленный их «неудовлетво-
рительным» состоянием, реализуется через белок р53 (что для
делящихся клеток нам уже известно; п. 6.1.5.2).
Но данный белок — транскрипционный фактор: он активи-
рует гены будущих участников апоптозного процесса. Следова-
тельно, для развития апоптоза должны пройти процессы тран-
скрипции и трансляции.
Отсюда вытекает важный вывод: повреждение клеточных
структур, ведущее к апоптозу, хотя и должно быть достаточ-
но сильным, не может быть чрезмерно сильным. Иначе гово-
ря, у клетки должны сохраняться энергетические и материаль-
ные ресурсы для экспрессии генов апоптоза.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
447
Если же повреждения клетки чрезмерны, процесс ее гибели
становится неуправляемым и представляет собой уже некроз.
Таким образом, в зависимости от интенсивности и характера
повреждающих воздействий, гибель клетки может пойти либо
по апоптотическому («цивилизованному»), либо по некротиче-
скому («анархическому») пути.
6.2.1.3. л Апоптоз по команде»: биологическая роль
Данный тип апоптоза вызывается, как мы уже говорили,
внешней «негативной» сигнализацией, которая передается че-
рез мембранные или (реже) внутриклеточные рецепторы.
Здесь, следовательно, клетка — вполне жизнеспособна, но, с
позиций целостного организма, она является ненужной или даже
вредной. Поэтому ей посылается «черная метка», «повелеваю-
щая» умереть. Что неукоснительно принимается к исполнению.
1. Многие примеры такого апоптоза закономерно связаны с
той или иной стадией онтогенеза:
- гибель клеток куколки в ходе метаморфоза насекомых,
- уже упоминавшаяся редукция пронефроса и ряда других
зачатков (хорды, части мезонефрального или парамезо-
нефрального канала и т. д.) в эмбриогенезе,
- исчезновение межпальцевых «перепонок» в ходе эмбрио-
нального морфогенеза.
Так, считают, что при образовании конечностей у эмбриона
не только появляются миллионы новых клеток, но и погибают
миллионы прежних клеток.
Видимо, к тому же ряду примеров следует отнести и бы-
струю инволюцию органов у горбуш после нереста, которая за-
канчивается смертью животного (п. 1.6.1.2).
Вместе с тем сделаем и такое замечание. Казалось бы, ги
бель клеток в эмбриогенезе — это всегда проявление «апоптоза
по команде». Но, по крайней мере, две ситуации вызывают
определенные сомнения.
а) Первая из них уже упоминалась: это гибель многих гоно-
Цитов и других предшественников половых клеток. В данном
случае не происходит замена одних («отслуживших свое») кле-
ток на другие. А просто в большой популяции однотипных кле-
ток часть клеток погибает, тогда как остальные продолжают
Развитие.
Мы уже говорили: не исключено, что здесь апоптоз совер-
шается не столько «по команде», сколько «изнутри» — на осно-
вании анализа состояния генома. Т. е. речь идет об удалении из
448
Глава 6
популяции таких клеток, чьи хромосомы получили поврежде-
ния в период активного размножения.
б) Вторая «сомнительная» ситуация непрямой остеоге-
нез, когда вначале формируется хрящевой аналог кости, а затем
хрящевая ткань замещается костной.
Как известно, решающее значение в разрушении хрящевой
ткани имеет нарушение ее питания — из-за образования ко-
стной манжетки вокруг зачатка. Соответственно, на определен-
ной стадии дистрофии хондроциты становятся пузыреобразны-
ми («зона пузырчатого хряща»). Все это свидетельствует скорее
о некрозе (завершающем дистрофию), нежели об апоптозе.
2. Другая группа примеров «апоптоза по команде» касается!
формирования и функционирования иммунной системы
- уничтожение аутореактивных клонов Т - и В лимфоци-
тов (что происходит в несколько этапов, которые мы рас-
смотрим позднее),
- гибель стимулированных антигеном лимфоцитов при
длительном отсутствии антигена,
— гибель лимфоцитов под действием избытка гликокорти-
коидов и т. д.
Физиологический смысл первых двух процессов ясен и без
комментариев.
Что же касается действия гликокортикоидов, то надо иметь
в виду, что их «стратегическая» задача это материальное и
энергетическое обеспечение хронического стресса. На эту зада-
чу «работают» практически все многочисленные эффекты гли-
кокортикоидов, в т. ч.
а) усиление катаболизма белков таких «второстепенных»
(на фоне хронического стресса) тканей, как лимфоидные и сое-
динительные,
б) и направление высвобождающихся при этом аминокис-
лот на гликонеогенез (новообразование глюкозы) в печени —
для снабжения жизненно важных органов (мозга и сердца).
Таким образом, давно известный феномен (стимулируемая
гликокортикоидами инволюция лимфоидной ткани), — оказы-
вается, не что иное, как очередное проявление «апоптоза по ко-
манде» с достаточно «прозрачным» физиологическим смыслом.
Только из-за гидрофобности гликокортикоидов рецепторы
к ним находятся не на плазмолемме, а в цитоплазме (п. 5.2.1-5).
Многие элементы апоптоза присутствуют также в цитоли
тическом действии Т киллеров на клетки мишени.
Действительно, как отмечалось в п. 4.3.4.2, на поверхности
этих мишеней имеется рецепторный белок Fas, а на поверхно-
у<;ЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ..449
сти Т-киллеров — Fas-лиганд (Fas-L). И их взаимодействие за-
пускает в клетке-мишени процесс апоптоза.
Тому же способствует и белок перфорин, который выделя-
ется Т-киллером и образует каналы в плазмолемме клетки-ми-
шени: через эти каналы в клетку проникают протеолитические
ферменты гранзимы. Протеолиз же (наряду с распадом нуклеи-
новых кислот) — важнейшая составная часть апоптоза.
Но взаимодействие Fas—Fas-L может проходить и так, что
жертвами апоптоза окажутся сами лимфоциты! Такая ситуация
складывается в областях, изолированных от иммунной систе-
мы, — внутренних слоях семенных канальцев и внутренних
средах глаз. В данном случае имеет место гибель Т лимфоцитов
при проникновении в эти внутренние слои и среды (т. н. имму
непривилегированные зоны).
Возьмем, например, семенные канальцы. Как мы отмечали
в п. 1.4.3.4, различают 4 вида созревающих сперматогенных
клеток:
а) сперматогонии (совершают митотические деления),
б) сперматоциты (проходят мейотические деления),
в) сперматиды (не делятся и подвергаются сложным морфо-
логическим преобразованиям, в ходе чего значительно меняется
белковый состав клеток) и
г) собственно сперматозоиды (оказываются в просвете ка-
нальцев и еще 1-2 недели дозревают в придатке семенника).
У новорожденных мальчиков, да и затем — до периода
полового созревания, в семенных канальцах имеются
лишь начальные клетки этого ряда — сперматогонии и, воз-
можно, самые ранние сперматоциты. Но как раз в это время в
тимусе и ряде других лимфоидных органов происходит отбор
аутореактивных клонов лимфоцитов. Поэтому белки (точнее,
антигенные детерминанты) еще не образовавшихся поздних
сперматоцитов, сперматид и сперматозоидов «не запечатле-
ваются» иммунной системой как «свои». Это означает, что
среди сохраняющихся клонов лимфоцитов имеются и такие,
которые могли бы атаковать указанные виды сперматоген-
ных клеток.
Как же избежать такой атаки после полового созревания,
когда в семенных канальцах появляются все виды сперматоген-
ных клеток?
Природой выработано два механизма. Один — весьма на-
дежный гематотестикулярный барьер. Наиболее важная его
часть образована отростками поддерживающих клеток (т. н.
Клеток Сертоли). Эти отростки соединяются друг с другом, раз-
'5-36
450
Глава 6
деляя два отсека. В наружном отсеке находятся сперматогонии
и ранние сперматоциты, во внутреннем же отсеке (т. е. за барь.
ером) — все остальные сперматогенные клетки.
Перемещение созревающих клеток из наружного отсека во
внутренний происходит по принципу шлюзования: вначале с
наружной их стороны тоже смыкаются отростки клеток Серто-:
ли, а затем размыкаются отростки, преграждавшие доступ во
внутренний отсек.
Но нет ничего абсолютно прочного и надежного. Поэтому
«для подстраховки» создан еще один механизм. Т-лимфоциты
на своей поверхности имеют Fas-рецептор (следовательно, у Т-
киллеров эти рецепторы соседствуют с Fas-лигандами), а раз-
личные клетки семенников (эндотелиоциты сосудов, клетки
Сертоли) — Fas-лиганд.
И когда потенциально опасный Т-лимфоцит оказывается в
пределах досягаемости этих клеток, уже знакомое нам взаимо-
действие Fas-Fas-L, как ему и «положено», запускав i апоптоз в
клетке с Fas-рецептором; но теперь это, как уже было сказано,
Т-лимфоцит.
3. Третья группа примеров «апоптоза по команде» относит-
ся к кроветворным клеткам всех рядов (как лимфоидных, так
и миелоидных). Для развития клеток каждого ряда необходимы
определенные цитокины — например, колониестимулирующие
факторы, или КСФ (п. 5.2.2.1).
В отсутствие же соответствующих факторов клетки, всту-
пившие было в определенный путь развития, погибают. Т. е в
них запускается механизм апоптоза. Таким образом, очевидно,1
осуществляется регуляция гемопоэза.
4. Очередную серию ярких примеров апоптоза можно найти
в женской репродуктивной системе:
— гибель клеток (ооцита и фолликулярных клеток) атрези-
рующих фолликулов,
- гибель клеток редуцирующегося желтого тела,
- гибель клеток функционального слоя эндометрия накану-
не менструации,
- гибель лактоцитов молочной железы после прекращения
лактации (и т. д.).
Правда, в ряде из этих случаев можно усомниться: «тот» ли
это вид апоптоза, да и апоптоз ли вообще?
Вот, например, выбор того, какие из фолликулов, вступив-1
ших в созревание, будут подвергаться атрезии. Не исключено,
что этот выбор базируется на состоянии генома; тогда перед на-
ми, казалось бы, «апоптоз изнутри». Но, с другой стороны, и3'
вестно, что развивающиеся фолликулы выделяют белковый
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ... 451
фактор (гонадокринин), который тормозит развитие других
фолликулов, т. е. фактически способствует «апоптозу по коман-
де» составляющих их клеток.
Так что в данном случае однозначно определить природу
апоптоза пока вряд ли возможно. Можно представить даже, что
ддесь — некий сочетанный вид апоптоза, который стимулирует-
ся совокупностью внешних и внутренних сигналов.
Непрост вопрос и относительно отторжения функционально-
го слоя эндометрия при менструации. Здесь тоже действуют, по
крайней мере, два фактора — спад гормонов и нарушение пита-
ния из-за спазма сосудов. Если гормональный фактор может ин-
дуцировать апоптоз, то нарушение кровоснабжения (в зависимо-
сти от выраженности) способно вызвать и апоптоз, и некроз. Воз-
можно, что и тут мы не имеем «в чистом виде» чего-либо одного.
5. Не менее разнообразны примеры апоптоза в патологиче-
ских условиях. Правда, большая их часть относится к предыду-
щему типу апоптоза («апоптозу изнутри»). Но есть и примеры
классического «апоптоза по команде».
С одним из них мы уже сталкивались. Фактор некроза
опухолей (ФН0о) вызывает апоптоз в клетках, содержащих на
поверхности рецептор К1-ФН0а (п. 5.3.5.4). Этот феномен
один из способов противоопухолевой защиты.
И так далее: примеров можно приводить еще немало.
Заканчивая обзор биологической роли «апоптоза по коман
де», хотелось бы обратить внимание на два обстоятельства.
а) Во первых, эта самая роль кажется гораздо более разно
образной, чем роль «апоптоза изнутри». Что, в общем-то, по-
нятно: если последний лишь призван «убирать» поврежденные
клетки, то «апоптоз по команде» — это инструмент, с помо
Щъю которого решаются многочисленные проблемы надкле-
почного уровня. Какие это проблемы, мы уже видели: морфоге-
нез, адекватная иммунная защита и многие, многие другие.
б) Во-вторых, за очень редким исключением (типа инволю-
ции органов у горбуш после нереста), практически все примеры
♦апоптоза по команде» касаются делящихся, или недавно де
пившихся, или еще способных к делению клеток. Т. е. это до-
статочно динамичные клеточные популяции, для которых апо-
птоз один из эффективных способов регуляции численности
к леток.
6.2.1 4 «Апоптоз по команде»: пусковые факторы
Говоря о биологической роли «апоптоза по команде», мы
гРУппировали примеры по тканевому или органному признаку.
452
Глава 6
Но интересно также обратить внимание на природу «нега-
тивной» сигнализации, запускающей апоптоз. По этому при-
знаку можно различить два варианта:
1) действие собственно негативного сигнала и
2) прекращение действия подкрепляющего, т.е. позитивно-
го, сигнала (это прекращение тоже можно рассматривать как
негативную сигнализацию).
1. Первый вариант — очевиден. В качестве негативных сип
налов мы видели, например, гликокортикоиды (в отношении
лимфоцитов), а также мембраносвязанный Fas-лиганд (в отно-
шении клеток с Fas-рецепторами).
К такому же типу относится и сигнал от кадгеринов, возни-
кающий при т. н. контактном торможении. Как отмечалось в
п. 6.1.3.4, в этой ситуации в клетках возрастает содержание
апоптогенного белка р53. Поэтому, когда делящиеся клетки на-
чинают располагаться слишком плотно, они не только рекра-
щают деления, но и могут подвергаться апоптозу.
Заметим: это наиболее наглядный пример такой недавно
упомянутой функции апоптоза, как регуляция численности
клеток в популяции.
2. Второй вариант «негативной» сигнализации прекра-
щение действия положительного сигнала кажется не-
сколько необычным. Тем не менее, и с такой ситуацией мы уже
неоднократно встречались. Достаточно назвать
гибель начальных клеток кроветворных рядов в отсут-1
ствие колониеобразующих факторов и
гибель клеток функционального слоя эндометрия из-за|
спада половых гормонов.
Можно привести и такой пример. В п. 6.1.3.3 мы говорили:
чтобы клетка начала делиться, она должна быть прикреплена к
опоре. Это вызывает сигналы от мембранных интегринов,
необходимые для запуска деления Причем среди вызываемых
сигналом эффектов — и снижение содержания белка р53.
Соответственно, если нормальная клетка теряет связь с
опорой, то перестают поступать положительные (подкре
пляющие) сигналы от интегринов Поэтому содержание бел-
ка р53 возрастает и клетка не только прекращает делиться, но и
вступает в апоптоз.
В обоих указанных вариантах природа сигнала (начинаю-
щего или прекращающего действовать на клетку) весьма разно-
образна. Это, как мы видели, может быть:
- обычный гормон,
- тканевой гормон (цитокин или фактор роста),
— антиген.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ.. 453
- адгезивный белок, участвующий в определенном взаимо-
действии.
Несколько слов — об участии белка р53 в «апоптозе по ко-
манде»- В двух приведенных выше примерах (апоптозе при кон-
тактном торможении и при потере связи клетки с опорой) этот
белок — ключевое звено в развитии апоптоза.
В то же время в литературе подчас приводятся и такие схе-
мы «апоптоза по команде», которые не содержат белка р53. На-
пример, это касается механизма действия ФНО фактора не-
кроза опухолей. (Хотя та схема, которая приведена на рис. 5.33,
вполне допускает участие белка р53.)
В итоге пока не вполне ясно, все ли случаи «апоптоза по ко-
манде» реализуются непременно через белок р53.
6.2.1.5. Морфология апоптоза и некроза
Познакомившись с пусковыми факторами апоптоза, мы те-
перь «забежим вперед» и обратимся к его финальным стадиям,
т. е. к тем стадиям, которые уже проявляются на морфологиче-
ском уровне.
В чем необходимость такого «забегания»? Дело в том, что про-
межуточные биохимические процессы (связывающие пусковые
сигналы с финальными морфологическими явлениями), во-пер-
вых, весьма разнообразны, а во-вторых, далеко не полностью про-
яснены. Морфология же апоптоза хорошо описана и довольно
стандартна: почти не зависит от характера пусковых факторов.
Поэтому мы вначале познакомимся с ней, а уж затем вер-
немся к сложным и дискутабельным промежуточным стадиям.
1. Морфологическая картина апоптоза имеет свою динами-
ку; в связи с этим можно различить следующие этапы ее разви
тия (рис. 6.10; переходы 1-»2, 2->3 и 3—>4).
а) Конденсация хроматина и некоторое сжатие клетки
(из-за конденсации цитоплазмы) (переход 1—>2).
Хроматин приобретает вид плотных и резко очерченных го-
могенных масс, расположенных по периферии ядра.
Цитоплазма также несколько уменьшается в объеме, отче-
го клетка изменяет свою форму. Полагают, что причиной явля-
ется образование перекрестных связей между цитоплазматиче-
скими белками, — так что под плазмолеммой образуется что-то
вроде дополнительной уплотненной оболочки.
б) Фрагментация ядра и цитоплазмы с образованием
апоптозных телец (переход 2 >3). На данной стадии ядро рас
падается на отдельные фрагменты, окруженные ядерной обо-
лочкой и содержащие очень плотные массы хроматина.
454
Глава 6
Рис. Й.«р М\'ф' norm. йпсйт..за (чтр*в <) и некроз»/«лева
| ~ исх.днзи клетка. 2-3 — кл- тка ни ризмъо гладиях МЮЛ^ЭЛ:
% соседи.:я клеткл. ^г6цйтнр-АЛе.ша?!: апоптозные зелЬЦх
— к.поткл на рлзимх ст ;.иях и»-1ф -з-:
Изменение же формы клетки в целом приводит к образованию!
в ее контуре глубоких впячиваний. Разделяемые ими участки ци-
топлазмы приобретают вид лопастей с постепенно сужающимиав
ножками.
В конце концов эти клеточные фрагменты отшнуровывают-
ся, после чего называются апоптозными тельцами. В некоторых
из телец оказываются ядерные фрагменты, в других — только
цитоплазматическое содержимое.
Но и те и другие окружены плазмолеммой с несколько из-
мененным составом.
в) Фагоцитоз апоптозных телец окружающими клетка
ми (переход 3—>4). Считают, что соседние клетки распознают
апоптозные тельца по тем особенностям, которые приобретает!
наружная поверхность их плазмолеммы.
Причем к фагоцитозу апоптозных телец способны не только
«профессиональные» фагоциты (макрофаги и нейтрофилы), но
и прочие окружающие клетки. Фагоцитированные ими тельца
быстро разрушаются в фаголизосомах.
В однослойном эпителии некоторые апоптозные тельца мо-
гут также слущиваться в просвет соответствующего органа.
Место, освободившееся в результате исчезновения клетки,!
занимается сближающимися соседними клетками, что обеспе-
чивает либо сохранение прежней структуры ткани, либо форми-
рование новой структуры (если замещающие клетки отличают-
ся от погибших).
Все перечисленные черты и придают апоптозной гибели I
клетки ту «аккуратность», о которой было сказано в п. 6.2.Не-
действительно, благодаря сохранению плазмолеммы у апоптоз-
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...455
нЫХ телец и их быстрому фагоцитозу, содержимое погибшей
клетки в межклеточную среду не попадает и реакции воспале-
ния не вызывает.
Да и вообще, все вышеперечисленные морфологические ста-
дии апоптоза совершаются довольно быстро (за несколько часов).
Поэтому при микроскопическом исследовании выявить клетки,
находящиеся в процессе апоптоза, весьма проблематично.
2. Во многом иная картина — при некрозе. Напомним: не-
кроз развивается при очень сильном повреждении клетки или
столь же сильном изменении условий ее существования (како-
вым, например, является прекращение кровотока в близлежа-
щих сосудах). Т. е. это такие повреждения или условия, при ко-
торых механизмы апоптоза сработать не могут:
либо они повреждены сами,
- либо клетка не имеет энергетических и пластических ре-
сурсов для их функционирования (п. 6.2.1.2).
Этими обстоятельствами и определяются морфологические
черты некроза (см. рис. 6.10).
а) Уже на ранних его стадиях повреждаются плазмолемме
и другие мембраны. Их проницаемость для воды и, видимо,
также для ионов повышается.
б) Это вызывает набухание клетки в целом, ядра и других
мембранных структур. Таким образом, объем клетки при некро-
зе возрастает (тогда как при апоптозе уменьшается).
в) Из-за повреждения лизосомальных мембран происходит
хаотичное самопереваривание клетки ферментами лизосом.
(При апоптозе, как мы вскоре увидим, тоже активируются про-
теазы. Но это не лизосомные ферменты, не обладающие суб-
стратной специфичностью, а «высокоточные инструменты»,
действующие лишь на определенные белки.)
г) Хроматин вовлекается в морфологически различимые со-
бытия не сразу, а к середине или к концу процесса. Вначале он
тоже конденсируется у ядерной мембраны. Но его массы значи-
тельно менее гомогенны и не так четко очерчены по краям, как
при апоптозе.
Затем в результате кариолизиса хроматин исчезает
(тогда как при апоптозе фрагменты хроматина оказываются в
апоптозных тельцах).
д) Заканчивается некроз разрывом плазмолеммы и высво-
бождением продуктов клеточного распада в межклеточную сре-
ДУ- Это вызывает:
~ во-первых, повреждение соседних клеток (где тоже начи-
наются процессы апоптоза или некроза),
456
Глава 6
а во-вторых, начало воспалительного процесса (расши-
рение сосудов, миграцию лейкоцитов и т. д.).
Весь процесс некроза клетки может завершиться очень бы
стро — лишь за 1 ч. Но его последствия столь значительны, что
при микроскопическом исследовании случаи некроза наблюда-
ют гораздо чаще, чем случаи апоптоза.
6.2.2. Непосредственные «орудия» апоптоза
Итак, апоптоз
это, хотя и «цивилизованная», но все же
гибель клетки. Каким же конкретно «орудием» осуществляет
клетка самоубийство? Оказывается, оно (орудие) — не одно: и<
пользуется целый арсенал.
К знакомству с этим арсеналом мы сейчас и приступим.
6.2.2.1. Цитоплазматические протеазы — каспазы
Рис. 6.11. Тетрамерная j
структура каспазы
|и4 тяжелые цепи,
2ИЗ легкие цепи
1 Структура каспаз. Одним из
важнейших инструментов апоптоз,
является специальное семейство ци
топлазматических протеаз — т. н.
каспаз. Последние относятся к се
риновым (у некоторых организ-
мов — цистеиновым) протеазам —
по наличию в активном центре ос
татка соответствующей аминоки-
слоты.
В своих же белковых мишенях
каспазы разрывают те пептидные
связи, которые образованы с участи-
ем остатка аспарагиновой кислоты.
Видимо, каспазы находятся в
цитоплазме практически всех кле-
ток. Точнее, в клетках, еще не «по-
мышляющих» об апоптозе, содер-
жатся неактивные предшественники каспаз — прокаспазы.
При активации (о причинах которой мы скажем ниже)
прокаспазы теряют N-концевой домен и расщепляются на две
субъединицы — большую и малую. Затем субъединицы со-
бираются в тетрамерную структуру (рис. 6 11) с двумя актив-
ными центрами.
Всего в семействе каспаз — 10 ферментов. Прежде их обоз-
начали различными буквами (ICE, Ich, Meh и т. д.); теперь пере-
ходят на цифровые обозначения: например, каспаза 3 и т. п.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
457
(Сигнал от рецептора)
11овреждённая
мил окон хрия
ZZEEZZZ2Z3
р N
lAPs
ЯДРО
> ipnit
Укгин
2. Каспазный каскад. Каспазы способны в определенной по-
следовательности активировать друг друга, образуя своего рода
каскад, причем — разветвленный. Правда, положение всех ка-
спаз в этом каскаде пока до конца не выяснено. Поэтому приво
1)Структурные белки (гистон 111 и ламин В)
2) Ферменты репликации и репарации (ДНК-НК
и др.)
3) Регуляторные белки (pRb и др.)
4) Инг конторы эндонуклеаз
Рие. в '*2. Крсп«5>«ыи каскад и гоми
- мембранный (нщаптор; К xac.«*w;
Димая на рис. 6.12 схема включает не все каспазы.
Согласно этой схеме, под действием сигнала, идущего от
плазмолеммы, с помощью тех или иных посредников (не пока-
занных на схеме) первой активируется каспаза 8.
Но к активации каспаз могут приводить и факторы, высво-
бождающиеся из митохондрий (при повышении проницаемо-
сти их мембран). Это протеаза AIF (Apoptosis Inducing Factor) и
Цитохром с.
Протеаза AIF, видимо, непосредственно активирует (путем
частичного протеолиза) каспазу 9. А цитохром с, оказавшись в
Цитозоле, стимулирует взаимодействие с прокаспазой 9 белка
458
Глава 6
Apaf 1. Это облегчает связывание молекул данной прокаспазы
друг с другом и их обоюдную активацию.
Таким образом, оба митохондриальных фактора запускают
каспазный каскад с каспазы 9.
Но откуда бы ни запускался каскад, его узловым звеном яв-
ляется каспаза 3. Она активируется и каспазой 8, и каспазой 9
Среди мишеней каспазы 3, видимо, присутствуют как другие
компоненты каспазного каскада (каспазы 6, 7 и т. д.), так и не-
которые некаспазные белки.
Завершающие члены каскада иногда обозначаются как ICE
(interleukin converting enzymes). Главная их функция - ограни-
ченный протеолиз определенных белковых мишеней.
3 Ингибиторы каспаз. Но чтобы активность каспаз достиг-
ла значимого уровня, необходимо, видимо, еще одно условие:
отсутствие в клетке их ингибиторов.
Таковыми являются белки семейства IAP (Inhibitors of
Apoptosis). Их синтез стимулируется транскрипционным фак-
тором NF-kB после его фосфорилирования протеинкиназой
PKB/Akt
Зато протеинфосфатаза PTEN препятствует образованию
ингибиторов каспаз. Отсюда следует, что апоптоз может разви-
ваться лишь при достаточном содержании этого белка
4. Мишени каскада. Полный список мишеней каспаз тоже по-
ка не известен Однако ясно, что в него входят и цитоплазмати
ческие, и ядерные белки. Из последнего обстоятельства следует,
что активированные каспазы могут перемещаться из цитоплазмы
в ядро. И именно ядерные белки составляют подавляющее боль-
шинство среди ныне идентифицированных мишеней каспаз
а) Что касается цитоплазматических мишеней, то счита-
ется, что их очень много, но конкретно называют обычно лишь
- некоторые белки цитоскелета: фодрин и актин, а также
некоторые регуляторные ферменты: фосфолипазу А2,
протеинкиназу С и т. д.
При этом с протеолизом фодрина связывают изменение по-
верхности клетки появление на ней впячиваний и выступов
(«гофрирование» плазмолеммы).
Основную же роль в развитии апоптоза приписывают про-
теолизу ядерных белков.
б) К последним, в частности, относят гистон Н1 и белок
ламин В Интересно что это те самые белки, фосфорилирова-
ние которых в профазе митоза приводит к конденсации хро-
матина и распаду ядерной оболочки на микропузырьки
(п. 6.1 4.3).
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ АПОПТОЗ..
459
В ходе же апоптоза наблюдаются сходные явления (хотя и
со своей спецификой) — конденсация хроматина и фрагмен-
тация ядра. Поэтому можно думать, что и в данном случае на
блюдаемые явления обусловлены модификацией тех же белков.
Только теперь способом модификации является не фосфо-
рилирование, а частичный протеолиз. Чем объясняются опреде-
ленные (и, конечно, существенные) отличия: например, то, что
ядерная оболочка распадается не на микропузырьки, а на обо-
лочки нескольких ядерных фрагментов.
Кроме того, не исключено, что объектом каспазного протео-
лиза являются и прочие белки, участвующие в обеспечении про-
фазы, — в частности, белковый комплекс, который называется
конденсином и в еще большей степени, чем гистон Н1, участву-
ет в конденсации хромосом (п. 6.1.4.3).
в) Коротко перечислим остальные ядерные мишени каспаз:
— ферменты репликации и репарации: топоизомеразы
(п. 1.2.3.1), ДНК-протеинкиназы (ДНК-ПК; п. 6.1.5.2),
поли-АДФ-рибозилполимераза (ПАРП; видимо, участву-
ет в «сшивании» разрывов в цепях) и пр.;
- регуляторные белки — например, белок pRb, контроли-
рующий клеточный цикл (п. 6.1 4.1);
- ингибиторы эндонуклеаз.
В ряде из этих случаев частичный протеолиз (так же, как и
фосфорилирование) ведет к активации белка, а в других слу-
чаях — к его ингибированию.
Например, ДНК протеинкиназы в результате действия
каспаз активируются. После чего они, как мы знаем (см.
рис. 6.9), способны фосфорилировать белок р53, что приводит к
активации и этого белка. Таким образом, каспазный каскад, да-
же если он «запущен» без участия белка р53 (а такое возможно
при «апоптозе по команде»), все равно способен вовлекать этот
белок в процесс.
А к чему приводит частичный протеолиз белка pRb ! — Ви
димо, к тому же, что и фосфорилирование (п. 6.4 1 4) — к инги-
бированию. Что активирует транскрипционный комплекс E2F
DP и, таким образом, провоцирует вступление клетки в кле
тонный цикл (см. рис. 6.7). События же этого цикла — силь-
ный апоптогенный фактор (п. 6.2 1.2). Поэтому, если процесс
начинался, например, как «апоптоз по команде», то далее он мо-
жет продолжиться как сочетанный апоптоз — и «по команде», и
♦изнутри».
Наконец, об ингибиторах эндонуклеаз. Здесь — то же са-
мое, что в случае белка pRb: протеолиз, видимо, «выключает»
460
Глава 6
ингибитор, отчего активируются соответствующие структу-
ры: в данном случае — эндонуклеазы. А эндонуклеазы — вто-
рое «орудие» апоптоза.
6.2.2.2. Эндонуклеазы
В неизмененных клетках присутствует целый набор нукле-
аз, различающихся и по механизму действия, и по функции.
Например, в цитоплазме содержатся ДНКазы I и II.
Можно было бы думать, что именно они осуществляют деграда-
цию ДНК в разрушающейся клетке. Видимо, при некрозе так и
есть: действительно, некроз сопровождается, во-первых, повы-
шением проницаемости мембран, а во-вторых, практически
полным лизисом хроматина (п. 6.2.1.5).
При апоптозе же «работают» ядерные эндонуклеазы, дей-
ствующие более «тонко»: они разрушают ДНК не до нуклеоти-
дов, а лишь до более или менее крупных фрагментов
С некоторыми из ядерных нуклеаз мы уже знакомы: это ре
парационные эндо и экзонуклеазы (раздел 1.7.2). (Напомним:
эндонуклеазы разрывают срединную межнуклеотидную связь,
а экзонуклеазы — крайнюю с 5’- или З’-конца.) Но это опять «не
те» нуклеазы: в апоптозе участвуют иные ферменты.
Довольно интересна история обнаружения и дальнейшего
изучения этих «иных» ферментов. Так, в 60-х-70-х годах XX
века, вскоре после открытия феномена рестрикции и модифика-
ции ДНК у бактерий (раздел 1.6.2), были сделаны многочислен-
ные попытки выявить аналогичные ферменты у животных. И
если ДНК метилаза была-таки обнаружена (раздел 1.6.1) — пра-
вда, с иной специфичностью и, видимо, иной функцией, — то
ничего похожего на рестриктазы так и не было найдено.
Тем не менее исследования ядерных эндонуклеаз у эука-
риот продолжались. Всех заинтересовал любопытный феномен:
если изолированные клеточные ядра инкубировать в буферной
среде при температуре тела, то через некоторое время можно на-
блюдать (при электрофорезе выделенной ДНК), что ДНК распа-
лась на фрагменты различной длины (рис. 6.13). Причем длина
фрагментов кратна длине самых коротких фрагментов, соста-
вляющей примерно 200 нуклеотидных пар. Получалась своего
рода электрофоретическая «лесенка».
Очень скоро эту «лесенку» стали воспроизводить во многих
лабораториях мира.
К ним, в частности, относилась и лаборатория, в которой
работал один из авторов этой книги (Н. Н. Мушкамбаров). И хо-
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ. .
461
npwj ше
сгвуюшей ицху<*Ц>и йл^еиреваи-
[и«« клеи иных **>; :
а - О мгн : — 40 Мин, с — 2 в
тя темы его работы были совер-
шенно иными, избежать всеоб-
щего увлечения и не «зара-
зиться» не удалось. — Вначале
это проявилось в попытке вы-
яснить, получается ли такая
же «картинка» в случае спер-
матозоидов (при формирова-
нии которых происходит заме-
на чуть ли не всех основных
белков хроматина). Затем — в
построении математических
моделей распада хроматина на
фрагменты.
Такой интерес к описанно-
му феномену объяснялся про-
сто: из него вытекало, по мень-
шей мере, два важных след-
ствия.
а) Во-первых, он свиде-
тельствовал о периодичности
укладки ДНК в хроматине, что
привело к представлению о нуклеосомах (п. 1.1.2.2).
б) Во-вторых, становилось ясно, что в интактных ядрах су
ществует фермент (вскоре названный Caz*,Mg^ -зависимой эндо-
нуклеазой), который в норме не активен, но при определенных
условиях разрушает хроматин до нуклеосом.
Данные выводы и определили два основных направления
изучения феномена:
- в первом случае с его помощью исследовали структуру
хроматина;
во втором случае речь шла об изучении эндонуклеазы.
а) Надо сказать, первое направление казалось гораздо более
интересным и перспективным. Так, анализируя кинетику нако-
пления разных фрагментов ДНК (моносомных, дисомных и
т. д.), исследователи пытались ответить на вопрос: все ли лин
керные (межнуклеосомные) участки ДНК доступны для вну
триядерной эндонуклеазы?
Одновременно, как уже было сказано, составлялись ма-
тематические модели процесса. Вот один из простейших ре
зультатов этого моделирования; если все линкерные участ
ки одинаково доступны для эндонуклеазы, то при разрыве
95 % таких участков доли моносом, дисом и трисом среди
462
Глава 6
продуктов аутолиза составляют соответственно 90,25; 9,0 и
0,75 % . Далее требовалось сравнение с экспериментальными
данными, чтобы подтвердить или опровергнуть исходное
предположение.
б) Что касается изучения Ca2 ,Mg2* зависимой эндонуклеа-
зы, то долгое время оно касалось, в основном, лишь ее энзимоло-
гических свойств.
Относительно же функции ясности не было: лишь предпо-
лагалось, что этот фермент осуществляет аутолиз ДНК в клет-
ках после смерти целого организма.
И только относительно недавно — после того, как широкое
распространение получило представление об апоптозе, — на
Са2 ,Mg2 зависимую эндонуклеазу стали смотреть как на
центральный фермент апоптоза.
Действительно, в отличие от ДНКаз, данный фермент рас-
щепляет ДНК хромосом не в случайных местах, а только в лин-
керных участках. Поэтому хроматин не подвергается полному
лизису, а лишь фрагментируется, что, как мы знаем, составляет
отличительную черту апоптоза.
Мол. масса этой Са^Мё^'-зависимой эндонуклеазы —
18 000 Да. В интактных клетках она входит в состав высокомо-
лекулярного комплекса с массой 100 000 Да, где ее активность
подавлена. Под действием же индукторов апоптоза фермент вы-
свобождается из этого комплекса и становится активным.
Казалось бы, все ясно. Но имеются и поводы для сомнений.
1) Так, не очень понятно, что именно выполняет роль ин-
дуктора. В конце предыдущего пункта в предположительной
форме было сказано, что это каспазы.
Однако активные каспазы поступают в ядро из цитоплаз-
мы. А, как мы теперь знаем, Саг“, Mg’ -зависимая эндонуклеаза
активируется и в изолированных клеточных ядрах, т. е. в отсут-
ствие цитоплазмы и содержащихся в ней каспаз.
Поэтому, не отрицая возможного участия каспаз в актива-
ции данного фермента, мы должны заключить, что, очевидно,
имеются и иные способы его активации.
2) Кроме того, недавно обнаружена другая Ca2‘,Mg -зависи-
мая эндонуклеаза — с мол. массой 45 000 49 000 Да. Она по мно-
гим своим свойствам (в т. ч. зависимости от активаторов и инги-
биторов апоптоза) также подходит на обсуждаемую роль.
3) И, наконец, считают, что начальные стадии распада хро-
матина (на очень крупные фрагменты) катализируются совсем
иными нуклеазами, в качестве которых называют сразу нес-
колько «кандидатур». Здесь и ядерная I-подобная ДНКаза (т. е.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
463
она подобна цитоплазматической ДНКазе I), и топоизомеразы, и
некоторые другие ферменты.
Но, несмотря на эти сомнения, считается общепринятым,
что фрагментирование хромосомной ДНК — важнейшая состав-
ная часть апоптоза.
6.2.2.3. Прочие «орудия» апоптоза
Конечно, каспазы и эндонуклеазы — наиболее сильные и
впечатляющие средства, используемые клеткой для самоубий-
ства. Но можно назвать еще, как минимум, два механизма, ко-
торые способствуют разрушению клеточных структур и погло-
щению образующихся фрагментов окружающими клетками.
а) Во-первых, это совокупность сильных окислителей.
Мы не имеем в виду те ситуации, когда такие окислители слу-
жат первичным повреждающим фактором и вызывают ♦апоптоз
изнутри». Нет, речь о том, что даже при ♦апоптозе по команде»
окислители, видимо, могут специально накапливаться в клетке
для быстрейшего завершения процесса.
Как всегда, есть два способа их накопления — усиление
продукции и торможение распада.
О первом варианте мы уже говорили: на рис. 5.33 было по-
казано, что при действии на клетку ФНО в ней, кроме всего про-
чего, активируется ген iNO-синтазы. А это, как было показано
еше раньше (см. рис. 5.25), ведет к избыточному накоплению не
только самого оксида азота (NO), но и целого ряда других реак-
ционноактивных веществ — супероксидного и гидроксидного
радикалов, пероксинитрита, нитритов, нитратов и т. д.
Все это создает в клетке, как говорят, «окислительный
стресс». Особенно чувствительны к нему мембраны митохон
дрий и ядер. Повышение же их проницаемости, как мы зна-
ем, важный элемент апоптоза. Действительно, через повреж-
денные мембраны митохондрий выходят факторы (протеаза AIF
и цитохром с), которые активируют каспазный каскад
(п. 6.2.2.1). А через поврежденную ядерную оболочку каспазы
легче проникают в ядро и активируют здесь эндонуклеазы (пу-
тем воздействия на их ингибиторы).
Заметим: в нормальной клетке существуют и механизмы
защиты от радикалов и окислителей. Это, в частности, фермен-
ты т. н. антиоксидантной системы: супероксиддисмутаза
(превращает супероксид в пероксид водорода), каталаза и пе
Роксидаза (в свою очередь, элиминируют из среды пероксид во-
дорода) и т. д. Не было бы ничего удивительного, если бы оказа-
лось, что при апоптозе гены этих ферментов инактивируются.
464
Глава 6
Но даже и без этого антиоксидантная система не в состоя-
нии справиться с резко возрастающей продукцией окислителей.
б) Наконец, еще одним прямым «орудием» апоптоза сле-
дует признать белки, ответственные за изменение струк
туры плазмолеммы. Опять-таки, речь не о вторичных из-
менениях под действием повреждающих факторов (например,
тех же окислителей и радикалов), а, видимо, о специально соз-
данном механизме.
Суть в том, что с мембраной связан ряд ферментов, которые
способны при своей активации менять ее структуру. Так, тран-
слоказа фос фатидилсерина активируясь при апоптозе, выво-
дит соответствующие липиды в наружный слой липидного би-
слоя. На внешней поверхности плазмолеммы оказываются и не-
которые другие вещества, обычно здесь не присутствующие. А у
мембранных гликолипидов исчезают остатки сиаловой кислоты.
В результате эта поверхность приобретает такие специфи-
ческие «черты», которые для соседних клеток служат сигналом
к фагоцитозу.
(Заметим, что примерно так же обстоит дело с эритроцита-
ми. Они прекращают свое существование и захватываются мак-
рофагами селезенки тогда, когда вследствие потери остатков си-
аловой кислоты отрицательный заряд их поверхности снижает-
ся до критического уровня.)
Таким образом, целенаправленная реорганизация плазмо-
леммы при апоптозе призвана обеспечить его последнюю ста-
дию — поглощение апоптозных телец окружающими клетками.
6.2.3. Дополнительный «инструментарий»
апоптоза
Кроме непосредственных «орудий», рассмотренных выше,
в клетке имеются и дополнительные факторы, вся функция ко-
торых состоит в управлении этими «орудиями». Очевидно, дан-
ные факторы тоже имеют исключительно важное значение. По
этому обратимся теперь к ним.
6.2.3 1 Митохондриальные факторы
Мы уже знаем, что в мембранах митохондрии находятся
два белка — протеаза AIF и цитохром с, которые активируют
каспазу 9, а через нее — весь каспазный каскад (рис. 6.12). При-
чем высвобождение этих белков происходит при повышении
проницаемости мембран.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ
465
ЭДс. €.14. Г-еяки сьмьйстг "₽с12.'Ках '
•Й-2. ₽сЬх. Л1/ВН1: эяХ!'1 »• т (агната t мй» м «Г4 **Л» «ой
Юх, f *; < ткян- лв'.............
1. Каналы митохондриальных мембран. Оказывается, про-
ницаемость мембран для указанных факторов обусловлена нали-
чием в них (мембранах) специальных каналов. Состояние же по-
следних находится под сложным контролем целой группы бел-
ков т. н. семейства Вс12/Вах, включающего более двух десят-
ков членов. Вот его наиболее важные представители (рис. 6.14).
а) Белки Вс1-2 (мол. масса — 26 кДа), Bcl-x, Al/Bfll и др.: в
нормальных клетках находятся в составе митохондриальных
мембран и закрывают вышеуказанные каналы. В этом-то и за-
ключается их исключительно важное значение: ведь получает-
ся, что они «грудью» защищают клетку от ничем не спрово-
цированного (т. е. спонтанного) апоптоза
Заметим: хотя эти белки и встроены в митохондриальные
мембраны, гены их (как 95 % прочих белков митохондрий) ло-
кализуются не в митохондриальной, а в ядерной ДНК.
б) Белки Вах, Bad, Bak, Bid и др.: относятся к тому же се
мейству, что и предыдущие протеины, но выполняют прямо
противоположную функцию — стимуляцию апоптоза.
При нормальном состоянии клетки они находятся в цито-
плазме. А при апоптогенных сигналах перемещаются к мито-
хондриальным мембранам, где способствуют открытию каналов
ДИя протеазы AIF и цитохрома с.
Как это происходит? Возможно, белок Вах (как и его ана-
логи) образует комплексы с белками Вс1-2 и Вс1-х, в результате
Него и происходит деблокирование каналов. По другим данным.
Ключевую роль играет взаимодействие белка Вах с еще одним
®елком мембраны митохондрий — VDAC
466
Глава
В любом случае митохондриальная «ветвь» апоптоза запу.
скается с помощью белка Вах и (или) его аналогов.
2 Трансмембранный потенциал митохондрий. Происходя
щее при апоптозе повышение проницаемости мембран митохон-
дрий, кроме выхода протеазы AIF и цитохрома с, имеет еще од-
но следствие падение трансмембранного потенциала.
Как известно (см. рис. 4.11), в митохондриях перенос элек-
тронов по дыхательной цепи сопряжен с откачкой протонщ
(ионов Н4) из матрикса митохондрий в межмембранное простран-
ство (между внутренней и наружной мембранами). Таким обра-
зом, создается градиент концентрации водородных ионов: в утри
митохондрий концентрация протонов значительно ниже, чем
снаружи. Соответственно, внутри оказывается избыток отрица-
тельных зарядов, а снаружи — положительных, что и означает
наличие трансмембранного потенциала.
Значение этого феномена тоже хорошо известно: энергия
протонного градиента используется для синтеза АТФ.
Поэтому, когда под действием апоптогенных сигналов бе-
лок Вах и его аналоги открывают в митохондриальной мембра
не каналы, протонный градиент (а с ним и трансмембранный по-
тенциал) исчезает — и прекращается синтез АТФ в митохон-
дриях Хотя цепь переноса электронов какое-то время может,
продолжать функционировать (пока содержание цитохрома с,
покидающего митохондрии, не станет критически низким).
Данное событие падение трансмембранного потенциала
митохондрий — обычно рассматривают как одно из ведущих
проявлений апоптоза. И это вполне справедливо. Но парадокс
состоит в том, что падение потенциала — это вовсе не проапо-
птозный, а аншнапоптозный фактор!
Действительно, оно никоим образом не стимулирует хотя
бы какое «орудие» апоптоза — каспазы, эндонуклеазы, реакции
образования опасных окислителей и свободных радикалов. Зато
лишает клетку главного источника энергии. Между тем, как
всегда подчеркивается, апоптоз — это энергозависимый про-
цесс. Энергия требуется, в частности, для синтеза транскрип-
ционных факторов и прочих регуляторных веществ, участвую-
щих в развитии механизма апоптоза.
Недостаток же энергии может нарушить «правильный» ход
вещей и свести процесс к «некрасивому», «неупорядоченному*
некрозу.
Таким образом, вовлечение в апоптоз митохондрий,
- с одной стороны, способствует его развитию (за счет выхо-
да протеазы AIF и цитохрома с),
уЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
467
RafuPKB МЛ-дротеинкиназы. РТ?Л -
NF kS и р.а - т^искригциони^^ ««‘•оры.
AIFinpo eaas,») ицил>хи<х»« ллтиь»тор»1 касоаэно-'о и.^'-кала; ;
1АР—<^иЗД1оры Каспаз; , "
А1Ш1, Sei 2,8«-х - вегой, замрамци»^лмалы амдожид и.гжиой
мембране; ..
-1’ хеах -^w. <>7awrrillfr*,1irffni> -_____________а______
-ас другой стороны, создает опасность перерождения апо-
птоза в некроз.
3 Регуляция митохондриальной «ветви» апоптоза. Вернем-
ся к белкам семейства Вс12/Вах, от которых столь многое зависит
(а именно проницаемость митохондриальных мембран).
Очевидно, что их продукция и функциональное состояние
тоже находятся под многосторонним контролем Но все ас-
пекты этого контроля еще не известны. Имеются лишь отдель-
ные и достаточно разрозненные сведения (рис. 6.15).
а) Так, по крайней мере, две протеинкиназы (ПК) способны
Фосфорилировать апоптогенный белок Bad (который относится к
белкам, открывающим каналы) и тем самым его ингибировать:
- одна из этих ПК — Raf компонент каскада МАПК (мито-
генактивируемых протеинкиназ, п. 6.1.3.1);
- вторая — т. н. протеинкиназа РКВ Akt.
Таким образом, эти две ПК образуют еще один «заслон» (по-
СЛе белков типа Bel 2, закрывающих каналы) на пути «несанк-
ционированного» апоптоза.
468
Глава в
В случае первой из ПК (Raf) такое действие коррелирует со
стимуляцией митоза, вызываемой каскадом МАПК.
А что касается второй из ПК (PKB/Akt), то она запускает
также ряд других механизмов антиапоптозного действия. В
частности, эта ПК активирует транскрипционный фактор из се-
мейства NF-kB, стимулирующий ген белка Al/Bfll одного из
белков, закрывающих каналы.
Кроме того, как отмечалось в п. 6.2.2.1, фактор NF-kB (после
фосфорилирования протеинкиназой PKB/Akt) стимулирует син-
тез ингибиторов каспаз (IAPs), что тоже сдерживает апоптоз.
б) Но на каждое «действие» во всякой регуляторной систе-
ме клетки есть свое «противодействие».
Так, антагонистом протеинкиназы PKB/Akt является, как
мы уже знаем из того же п. 6.2.2.1, протеинфосфатаза PTEN.
Следовательно, для нее можно перечислить три механизма про-
апоптозного влияния:
- дефосфорилирование и тем самым активирование белка
Bad, открывающего митохондриальные каналы;
- дефосфорилирование и тем самым инактивирование
транскрипционного фактора NF-kB, приводящее к сни-
жению синтеза
белка Al/Bfll, закрывающего каналы, и
- ингибиторов каспаз (IAP).
Еще более известным проапоптозным фактором, действую!
щим на уровне митохондриальной «ветви» апоптоза, является
белок р53. Как мы уже неоднократно отмечали, это (как и белки
семейства NF-kB) — тоже транскрипционный фактор, влия-
ющий на активность генов апоптоза.
Так вот, важнейшие среди этих генов — пожалуй, те, ко-
торые кодируют белки, закрывающие и открывающие кана-
лы митохондрий. А именно, белок р53
инактивирует гены белков (Bcl-2, Вс1-х), закрывающих
каналы, и
- активирует гены белков (Вах и др.), открывающих каналЫ-
На этом и базируется основная часть проапоптозного дей-
ствия белка р53.
Но есть в этом его действии и другие механизмы. Поэтому!
а также в силу особо важной функции данного белка рассмо-l
трим его отдельно и достаточно подробно.
Напомним, что белку р53 уже был посвящен п. 2.4.2.3-
Сейчас мы, с одной стороны, будем опираться на изложенные
там сведения, а с другой стороны, существенно их расширим.
у^ЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ.
469
6.2.3.2. Белок р53: саморегуляция содержания и
активности
Мы уже не раз отмечали, что содержание белка р53 регули-
руется, главным образом, не на уровне синтеза, а на уровне рас-
пада- Причем распад является убиквитинзависимым и происхо-
дит в протеосомах.
Что касается активности этого белка, то способы ее регу-
ляции достаточно разнообразны: это фосфорилирование и аце-
тилирование по целому ряду локусов.
Данная система является саморегулирующейся; благодаря
этому, в обычных условиях содержание и активность белка р53
поддерживаются на низком уровне. И вот как это осуществляет-
ся (рис. 6.16).
а) Главный сдерживающий агент для фактора р53 — белок
Mdm2. Он, во-первых, является ингибитором фактора рбЗ, т. е.
снижает его активность. А во-вторых, в комплексе с Mdm2 фак-
тор р53 гораздо интенсивней выходит из ядра в цитоплазму, где у
Mdm2 проявляется к тому же убиквитинлигазная активность в
отношении р53. Таким образом, ускоряется и распад белка рбЗ.
Белок же р53, как транскрипционный фактор, активирует
ген белка Mdm2.
В результате формируется прямая положительная связь:
при избыточном накоплении белок р53 стимулирует (с помо-
щью белка Mdm2) снижение своей активности и ускорение свое-
го распада.
Рич. регуляция содержания и фактор а р!
в логоящацгь. шмгш •
470
Глава 6
б) Известен еще один регуляторный фактор — белок ARF(
или р19ЛКЕ (упоминавшийся в пп. 6.1.3.3 и 6.1.3.4). Связываясь ’
с р53, он, напротив, тормозит его распад.
И здесь имеется прямая положительная связь со тороны
белка р53. Только теперь он выступает в качестве транскрип
ционного репрессора угнетает активность гена белка ARF.
Поэтому при высоком содержании фактора р53 количество
белка ARF снижается, отчего ускоряется распад р53.
Кстати говоря, ген белка ARF весьма интересен. Это тот
очень редкий для животных случай, когда ген имеет две «рам
ки считывания»: в одном случае начинает транскрибироваться
с одного, а в другом случае •— с соседнего нуклеотида. Поэтому
смысл последующих кодонов мРНК в обоих случаях оказывает-
ся совершенно разным, и, соответственно, на рибосомах образу- I
ются два разных белка.
В данном случае вторым белком является белок р16 из се-
мейства INK4 — ингибитор комплексов циклин D-Cdk4(6) (см.
рис. 6.2).
в) Наконец, третий пример. Белок с довольно экзотическим
обозначением 14-З-ЗЬ служит активатором фактора р53.
В «ответ» фактор р53 ингибирует ген этого белка. Следова
тельно, при чрезмерно высокой активности фактора р53 снижа-
ется содержание его активатора (белка 14 З-ЗЬ), и активность
р53 возвращается к нормальному низкому уровню.
Напомним: так обстоит дело в обычных условиях И, закан-
чивая их рассмотрение, заметим, что из трех перечисленных ре-
гуляторов (белков Mdm2, ARF i 14-З-ЗЬ) первый действи ельно ;
яв яется наиболее эффективным. Тогда как ARF влияет
только на распад белка р53, а белок 14 З-ЗЬ лишь на актив-
ность, фактор Mdm2 контролирует одновременно и то, и другое.
6.2.3.3. Белок р53 как «диспетчер» апоптоза факторы,
изменяющие его содержание и активность
Теперь обратимся к ситуациям, когда содержание и актив-
ность белка р53 закономерно отклоняются от обычного уровня.
Это, как мы уже знаем, предапоптозные или премитотиче
ские состояния. В каждом случае на активность или содержание J
белка р53 влияют вполне конкретные факторы (рис. 6.17)
1. «Апоптоз изнутри» повреждения ДНК При на-
коплении в ДНК повреждений сигналы к р53 передаются, по
крайней мере, тремя протеинкиназами (две из них упоминались
в п. 6.1.5.2).
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ.
471
Рме»7/Факторы. и-хменАкшНс и
наивность белка рЗ®
ДЮР - мнсулииоп /м <мЫй фккгор роста,
flMKlKt Промитотичесмки комплекс гртюкриг «ионных факторов,
ДНУ Ап ДНК протшя««йн»М> КХ - казеинкццаза / ._
а) ДНК протеинкиназа (ДНК ПК) регистрирует двухцепо-
чечные разрывы, которые особенно интенсивно образуются при
ионизирующих облучениях. После этого ДНК ПК фосфорили-
рует, видимо, как сам белок р53 (активируя его), так и его инги-
битор — белок Mdm2 (снижая его сродство к р53).
б) Вторая протеинкиназа — белок ATM. Она тоже стимули-
руется после ионизирующего облучения и опять-таки, как счи-
тают, действует несколькими способами:
- непосредственно фосфорилирует определенный локус р53
(что ведет к активации р53),
— способствует связыванию с р53 его активатора — белка
14-З-ЗЬ (путем дефосфорилирования другого локуса р53),
активирует (путем фосфорилирования) тирозинкиназу
с АЫ, которая, в свою очередь, фосфорилирует еще один ло-
кус р53 и тем самым тоже повышает активность этого белка.
в) Третья протеинкиназа - казеинкиназа (КК) Она реагиру
ет на повреждения ДНК, вызванные ультрафиолетовым светом.
Далее — обычно: активация рбЗ путем фосфорилирования.
Кроме этих ПК, имеется еще ряд факторов, участвующих в
Узнавании повреждений ДНК, возможно в их репарации, а
472
Глава 6
при безуспешности в активации р53. Это, в частности, белки
BRCA1 и BRCA2.
2. Митогенные факторы и «апоптоз по команде». В
п. 6.1.3.4 мы сформулировали три условия, необходимые для
вступления клетки (способной к делению) в очередной митоти-
ческий цикл:
- действие ростового фактора,
- прикрепление клетки к внеклеточной опоре,
- отсутствие контакта с соседними клетками.
При выполнении этих условий содержание фактора р53 в
клетке уменьшается. Там же было предположено, что это мо-1
жет происходить путем угнетения гена белка ARF, тормозящегя
распад р53. Другая возможность стимуляция гена белка]
Mdm2, который, напротив, ускоряет распад р53.
В обоих случаях изменение активности соответствующего
гена происходит после запуска каскадов МАПК (митогенакти-
вируемых протеинкиназ) и, возможно, образования т. н. проми-
тотического комплекса транскрипционных факторов
(ПМКТФ).
Напротив, когда хотя бы одно из перечисленных условий не
выполняется, т. е.
- нет ростового фактора,
- потеряна связь с опорным субстратом или
- клетки контактируют друг с другом, —
содержание белка р53 возрастает и после достижения не-
коего критического уровня начинается «апоптоз по команде».
Отдельно остановимся на действии ИПФР инсулином
добного фактора роста (см. табл. 5.6). Если в предыдущим
случаях можно было лишь предполагать механизм влияния на
белок р53, то здесь имеются более определенные сведения. А
именно: ИПРФ индуцирует синтез белка Mdm2 и, таким обра-<
зом, снижает активность и содержание белка р53.
Еще более интересны следующие факты:
- в клетках может образовываться ингибитор данного рос-|
тового фактора (белок ИПФР-ВРЗ),
- и белок р53 активирует ген этого ингибитора.
Такие отношения делают два процесса (клеточный цикл и
апоптоз) взаимоисключающими:
ИПРФ (стимулирующий деления) — сильный антиапо-
птозный фактор,
- а белок р53 (накапливающийся в ходе апоптоза) блокиру-1
ет митогенное действие ИПРФ.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
473
В то же время такая альтернативность имеется не во всем:
как отмечалось в п. 6.2.2.1, протеолиз каспазами белка pRb про-
воцирует вступление клетки в клеточный цикл (что, правда,
только усугубляет ее состояние).
6.2.3 4 Белок р53 как «диспетчер» апоптоза:
вызываемые им эффекты
Итак, в ходе многих, если не всех, видов апоптоза в клетке
возрастают содержание и активность белка р53.
К каким непосредственным результатам это приводит? От-
веты на данный вопрос суммированы на рис. 6.18; причем прак-
тически все они, кроме первого, нам уже знакомы.
1. Первый же ответ состоит в том, что белок р53 стимули-
рует гены ряда «киллерных» рецепторов, т. е. рецепторов,
воспринимающих команду об апоптозе. Среди них — белок Fas
(Fas-рецептор) и рецептор KILLER/DR5
Таким образом повышается чувствительность клетки к со-
ответствующим сигналам.
Правда, аналогичных сведений о рецепторах ФИО и ряда
других сходных факторов нет.
Остальные приведенные на рис. 6.18 эффекты перечисля-
лись еще в п. 2.4 2.3; только теперь мы глубже понимаем суще-
ство данных эффектов.
Рис. бла Q'f-'i' кты. вызываемые беям мрбЗ
__• ' '• -Ж.______ТГ. -- - - ——
474
Глава 6
2 Остановка клеточного цикла. Это происходит благода-
ря активации гена Р21, продукт которого (белок р21) ингибиру.
ет комплексы циклин-Cdk (пп. 6.1.2.1, 6.1.3.3, 6.1.5.2).
Тому же способствует и активация гена GADD45. Белок
Gadd45 тоже ингибирует, по крайней мере, один из комплексов
циклин-Cdks. Кроме того, он (как и фактор р21) связывается с
белком PCNA (п. 1.2.3.2), необходимым для репликации ДНК.
3 . Активизация митохондриальной «ветви» апоптоза
а) Об этом мы говорили совсем недавно (в п. 6.2.3.1) Фак-
тор р53
- ингибирует гены тех белков (bcl-2, bcl-x), которые закры-
вают каналы в митохондриальных мембранах, и
- активирует гены белка (Ьах), открывающего каналы.
Через каналы выходят протеаза AIF и цитохром с, стимули-
рующие каспазный каскад.
б) Активируется и группа генов P1G. Их продукты каким-
то образом способствуют накоплению в клетке активных ради-
калов и окислителей. Поэтому повреждаются мембраны мито-
хондрий, что тоже облегчает выход в цитоплазму протеазы AIF
и цитохрома с (п. 6.2.2.3).
4 Воздействие на окружающие клетки Белок р53 акти-
вирует и такие гены, продукты которых выделяются из гибну-
щей клетки и воздействуют на ее окружение. При этом могут на-
блюдаться, по крайней мере, следующие два эффекта.
а) Торможение ангиогенеза. Данный эффект реализуется
через гены TSP, BAS и др. — клетки с начавшимся апоптозом
секретируют белки (тромбоспондин — Tspl — и т. д.), пода-
вляющие новообразование сосудов в соседней ткани. Это лежит
в русле такой важной функции апоптоза, как ограничение опу-
холевого роста (п. 2.4.2.3).
б) Торможение пролиферации соседних клеток. Фактор
р53 способствует также синтезу и секреции ряда ингибиторов
пролиферации клеток р-ингибина и даже ФНОц (фактора не-
кроза опухолей), который не только останавливает деления
окружающих клеток, но и запускает в них апоптоз.
И этот эффект, очевидно, тоже один из ограничителей опу-
холевого роста.
Таковы основные из известных на данное время проапо-
птозных эффектов белка р53. Иллюстрируя их, мы привели на
рис. 6.18 около десятка генов-мишеней данного белка. На самом
деле число генов мишеней, видимо, существенно больше.
Но и перечисленное вполне оправдывает сложившееся
представление о белке р53. Это, действительно, ключевой «дис-
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ
475
петчер» апоптоза, на котором сходятся многие (если не все) апо-
птогенные сигналы и от которого исходят многочисленные «ко-
манды» по «рядовым исполнителям».
6.2.4. Некоторые схемы апоптоза
Итак, мы уже знаем о механизме апоптоза практически все
самое важное:
а) типы («апоптоз изнутри» и «апоптоз по команде») и при
чины, их вызывающие;
б) конкретные «орудия» самоубийства клетки (каспазы, эндо-
нуклеазы, активные окислители; белки, которые, образно говоря,
«навешивают» на клетку «метку» — «подлежит фагоцитозу»);
в) важнейшие факторы (митохондриальные и «околомито
хондрильные» белки, а также белок рбЗ), связывающие пуско-
вые причины с «орудиями» апоптоза.
Осталась самая «малость»: свести все воедино, указав точ-
ные причинно-следственные связи.
Но это не так просто.
Действительно, во-первых, схемы развития апоптоза зависят
от исходной причины. А поскольку, как мы видели в разде-
ле 6.2.1, причин весьма много, то много и различных способов осу
ществления апоптоза. Во всяком случае, они различаются началь-
ными стадиями — до включения в «дело» каспаз и эндонуклеаз.
Во вторых, еще далеко не все ясно. Например, даже если
мы уже дошли в своей схеме до каспаз, то, как отмечалось в
п. 6.2.2.2, остается еще большой вопрос а как же активируются
эндонуклеазы? И подобных вопросов возникает немало.
Поэтому читатель должен иметь в виду, что приводимые
ниже схемы имеют во многом гипотетический характер.
6.2.4 1. Примерная схема «апоптоза изнутри»
В развитии данного вида апоптоза с некоторой долей условно-
сти можно выделить 7 стадий (рис. 6.19). Вот их краткий перечень.
1) Повреждение (под действием самых разнообразных
факторов) внутриклеточных структур — особенно хромосом и
мембран.
2) Передача сигналов (с помощью специальных протеин
киназ и других модифицирующих ферментов) на транскрип
Ционный фактор р53. Напомним, что модифицироваться мо-
’Кет как сам белок р53, так и его ингибитор — белок Mdm2. В
любом случае достигается следующий результат — повышение
содержания (за счет замедления распада) и (или) активности
Фактора р53.
476
Глава 6
ПОВРЕЖДАЮЩИЕ ФАКТОРЫ
(излучения. УФ-свет, скачки температуры, активные окислители,
другие токсические соединения)
___________t________
Повреждения хромосом
(мерез протеи икни а з ы:
ДНК-ПК. А ГМ. КК)
Повреждения
мембран
Увеличение содержания н
активности белка р53
(через изменение
активности leiion
семейства BCL)
Открытие каналов я
мембранах мнтохоцзрий
Повышение
проницаемости
митохондриальных
мембран
Активация митохондриальными факторами
(протеазой A1F и ингохромом с)
каспазы 9 и зятем - всего каспазного каскада
Частичный
протеолиз
ферментов
репликации
и репарации
ДНК
в т.ч.
ДИК-ПК
Частичный
протеолиз
реп ля гор-
ных белков
IRb
Част мчнып
ирогеолнз
ст руктур-
ных ядерных
белков
Hie юна Н1
и ламинов
Частичный
протеолиз
ингибиторов
эндонуклеаз
Частичный
протеолиз
мембранных
и цнгонлаз-
магических-
белков
Активация
эндануклеаз
X
Провокации t ♦
вступления Коидсиса- Фрасмеи-
клезки в ция тацня
мигоз хроматина хроматина
Фрагментация
ядер
Фрагмент ания
цитоплазмы
_____2л__—£______
Образование
аполгозиых ге.тец
Измене-
ние
шиш ;
шло
состава
нлазмо-
леммы
Фаюшноз азмлпозных it леисоседними клетками
PvH.. 6. t Я. Схомя р|*ЗВ»:1ИЯ шлпппа Ил*УТ0И >
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...477
3) Повышение проницаемости митохондриальных мем-
бран — благодаря влиянию р53 на гены семейства BCL-2, а так
же из за непосредственного повреждения мембран.
4) Включение (факторами, покидающими митохондрии)
каспазного каскада. Частичный протеолиз каспазами много
численных белков мишеней.
5) Различные последствия частичного протеолиза, в т. ч.:
а) конденсация хроматина (результат протеолиза струк-
турных белков — гистона Н1 и ламинов),
б) активация ядерных эндонуклеаз (из-за протеолиза их
ингибиторов)и
в) изменение липидного состава плазмолеммы (по причи-
не изменения активности ряда мембраносвязанных ферментов).
Кроме того, протеолиз может иметь и такие последствия,
которые придают апоптозу черты автокаталитического про-
цесса — путем усиления или повторного запуска некоторых его
предыдущих стадий.
г) Так, частичный протеолиз ДНК-протеинкиназы тоже
(как и исходные повреждения ДНК) активирует этот фермент,
отчего последний с новой силой влияет на содержание и актив-
ность фактора р53.
д) А протеолиз белка pRb подавляет его ингибиторную ак-
тивность в отношении транскрипционного фактора E2F-DP По
следний же, высвобождаясь из-под влияния pRb, запускает кле
точный цикл, в т. ч. — репликацию ДНК. Что, на фоне уже
имеющихся многочисленных повреждений хромосом, приводит
к новым нарушениям их структуры — и к повторной ини-
циации «апоптоза изнутри».
Продолжим перечисление его стадий. Последние стадии та
ковы.
6) Действие эндонуклеаз — постепенная фрагментация
хроматина.
7) Завершающие морфологические преобразования:
а) фрагментация ядер и цитоплазмы с образованием апо-
птозных телец и
б) фагоцитоз этих телец окружающими клетками.
Как видно, составленная цепочка событий
- во-первых, охватывает и объединяет все из того вышеска-
занного, что могло относиться к «апоптозу изнутри»,
- а во вторых, являет собой законченную картину — от ис-
ходных пусковых причин до последних морфологически
различимых стадий.
Однако повторим, что в целом ряде своих узлов данная схе
ма является пока лишь гипотетической.
478
Глава 6
6.2.4.2 Примерные схемы некоторых видов
«апоптоза по команде»
В этом пункте мы рассмотрим две схемы апоптоза.
I. Апоптоз при недостатке митогенных или при поступле-
нии антимитогенных сигналов (рис. 6.20). Здесь апоптозу под-
вергается митотическая клетка, т. е. клетка, до того активно
участвовавшая в клеточных делениях. А исходной причиной
апоптоза является одно из трех событий, перечисленных в
п. 6.2.3.3:
(включение гена белка ARF или
выключение гена белка М dm 2)
Уыли яие содержания и (или) актквкостм белка р :
(Далее, как на схеме 6.10
открытие каналов в мембранах митохондрий
М Т.п1
; Рис. С. гС Нач.-вьмыс тадии чапоп o ia но команде
> (ори недостатке митогенны* или при nocrynco^v.
днтимитогенных сигналов)^
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ. ..
479
а) к клетке перестал поступать ростовой фактор,
б) клетка потеряла связь с опорным субстратом,
в) клетка вступила в контакт с другой аналогичной клеткой.
1) Соответственно, первая стадия апоптоза заключается в
том, что изменяется состояние расположенных в плазмолемме
а) рецепторов ростового фактора,
б) интегринов или
в) кадгеринов.
А это, в свою очередь, сказывается на состоянии адаптер-
ных белков (взаимодействующих с цитоплазматическими доме-
нами вышеназванных белков).
2) Все последующие события, показанные на рис. 6.20, бу-
дем рассматривать как вторую стадию процесса передачу сиг-
нала на белок р53.
По названию это совпадает со второй стадией «апоптоза из-
нутри» (п. 6.2 4 1). Механизм же передачи сигнала совершенно
иной, а именно
а) из-за отсутствия сигнала от рецептора или от интегринов
инактивируются каскады МАПК (митогенактивируемых про-
теинкиназ);
б) по этой причине либо из-за связывания кадгеринами р-
катенина не может собраться т. н. премитотический комплекс
транскрипционных факторов гипотеза о существовании ко-
торого была выдвинута нами в п. 6.1.3 4;
в) среди многочисленных последствий нефункционирова-
ния этого комплекса — изменение активности гена одного из
белков (ARF или Mdm-2), контролирующих активность и (или)
распад белка р53. В результате активность и (или) содержа-
ние данного белка возрастают.
3-7) После этого ход апоптоза, вероятно, уже не отличается
принципиально от предыдущей схемы (см. рис. 6.19).
II. Апоптоз, вызываемый фактором некроза опухоли
(ФИО.,). Заметим: в этом словосочетании — явное противоречие,
поскольку апоптоз и некроз — разные процессы (п. 6.2.1.5).
Очевидно, свое название данный фактор получил до того, как
возникло учение об апоптозе.
Что же касается механизма действия ФНОа, то многие
его аспекты мы рассматривали в п. 5.3.5.4 Нынешняя наша
задача — соединить содержащиеся там сведения с тем общим
представлением об апоптозе, которое было изложено в этой
главе.
Результат такого соединения — рис. 6.21. На нем суммиро-
вано несколько точек зрения о механизме действия ФНОа. При
480
Глава 6
чем не исключено, что все они в той или иной мере верны, т. е.
что ФНОа действует сразу несколькими способами.
А Итак, согласно одной версии, связывание ФНОа со своим
рецептором приводит к тому, что с цитоплазматическими «до-
менами смерти» последнего поочередно взаимодействуют адап-
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ- КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ
481
териые белки: TRADD, FADD и RIP. И это непосредственно (на-
пример, через белок RIP) ведет к активации каспазы 8, а с ней
и всего каспазного каскада.
Таким образом, в данном варианте апоптоза не участвует
белок р53 и клетка очень быстро переходит к стадии 4 того про-
цесса, который был описан в п. 6.2.4.1.
Б. Но одновременно, видимо, включается и второй, более
длинный, путь.
1) Он начинается с активации мембранных ферментов
(сфингомиелиназы и церамидазы), которые разрушают сфин-
гомиелин мембраны до свободного сфингозина.
2) У сфингозина много эффектов (см. рис. 5.33):
- активация казеинкиназы, в свою очередь, активирующей
белок р53;
- активация протеинфосфатаз, дефосфорилирующих и тем
самым инактивирующих ферменты МАПК;
инактивация протеинкиназы С, способной запускать ка-
скады МАПК.
Но выключение этих каскадов, согласно рис. 6.20, ведет
через ряд промежуточных эффектов к накоплению и (или)
активации белка р53, что еще более усиливает действие казе-
инкиназы.
Следовательно, в этом пути вторая стадия, хотя иницииру-
ется своим особенным интермедиатом сфингозином, имеет
точно такой же результат (включение в процесс белка р53), как
одноименные стадии двух предыдущих схем апоптоза (приве-
денных на рис. 6.19 и 6.20).
Поэтому вновь можно заключить, что со стадии 3 апоптоз
идет так же, как изложено в п. 6.2 4.1
В Вместе с тем, на рис. 6.21 имеется и третья ветвь, благо
даря которой реакция клетки на ФНОа оказывается не столь од-
нозначной.
Так, как отмечалось в п. 5.3.5.2, наряду с вышеизложен-
ным в клетке повышается концентрация цАМФ, а следователь-
но, и активность протеинкиназы А (ПК А).
ПК-А, в отличие от ПК-С, инактивирует каскады МАПК
и это вполне лежит в русле апоптозных событий.
Но одновременно ПК А может активировать и транскрип
Ционный фактор NF-kB с широким спектром действия
а) С одной стороны, в этом спектре стимуляция гена ин-
ДУцибельной NO-синтазы И, с позиций апоптозного процесса
это «хорошо»: накапливающийся оксид азота усиливает по
вРеждения мембран.
116~36
482
Глава 6
б) С другой же стороны, фактор NF-kB, согласно п. 6.2.3.1,
оказывает и противоапоптозное действие: активирует
- гены ингибиторов каспаз (AIP) и
- ген белка Al/Bfll, закрывающего митохондриальные ка-
налы.
Поскольку апоптозный процесс все равно идет и «успешно»
завершается, ясно, что указанные антиапоптозные влияния
преодолеваются многочисленными проапотозными эффектами.
В итоге, на основании рассмотренных примеров можно сде-
лать, по крайней мере, два следующих вывода.
а) Во первых, действительно, разные схемы апоптоза раз-
личаются, главным образом, своими начальными стадиями.
б) Во-вторых же (как следует из последнего примера), в ре-
гуляторном обеспечении апоптоза (а возможно, и других про-
цессов) не все так уж однозначно «подогнано» под требуемый ре-
зультат: имеются и определенные «несовершенства». Если, ко-
нечно, этими несовершенствами не отличаются наши нынешние
знания о данных процессах.
6. 2.5. Роль апоптоза в созревании и
функционировании иммунной системы
6.2.5.1. Подверженность клеток апоптозу
Завершая посвященный апоптозу раздел, несколько де-
тальней, чем это было сделано в п. 6.2.1.3, рассмотрим в соот-
ветствующем аспекте иммунную систему. Тому имеются две
причины:
- хотя апоптоз клеток, как мы видели, часто встречается в
очень многих органах и тканях, все же его роль в созрева-
нии и функционировании иммунной системы, пожалуй,
особенно велика;
- во-вторых, эта роль апоптоза и лучше всего изучена.
Но прежде чем обратиться к конкретным проявлениям апо-
птоза в указанной системе, отметим одно небесспорное предста-
вление.
Согласно ему, в длительном процессе созревания Т- и В-
лимфоцитов подверженность клеток апоптозу неоднократ
но меняется то значительно повышается, то вновь снижает
ся. Тем самым утверждается, что одни и те же пусковые факто-
ры, например, «апоптоза по команде» или «апоптоза изнутри»
могут вызывать, а могут и не вызывать апоптоз в зависимости
от чувствительности клеток.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
483
В отношении «апоптоза по команде» это было бы совершен-
но очевидно, если имелось бы в виду наличие или отсутствие у
клеток соответствующих мембранных рецепторов. Действи-
тельно, чтобы подвергнуться апоптозу, индуцированному, на-
пример, фактором некроза опухолей, клетка должна нести на
поверхности рецептор В1-ФН0а.
Однако в упомянутом представлении имеются в виду вовсе
не рецепторы, а митохондриальные белки Вс1-2 и Вс1-х. Послед-
ние рассматриваются как эндогенные ингибиторы апоптоза.
И именно варьирование их содержания (вследствие усиления
или ослабления экспрессии их генов) меняет подверженность
клеток апоптозу:
- при увеличении содержания данных белков устойчивость
клеток к апоптогенным факторам возрастает,
при снижении содержания устойчивость убывает.
Оценивая эту концепцию, вспомним (п. 6.2.3.1): белки Вс1-
2 и Bel х закрывают каналы в митохондриальных мембранах,
препятствуя активации каспаз; а в ходе апоптоза обычно «из-
влекаются» оттуда другими белками того же семейства — Вах
Bad, Bak, Bid и пр.
Может ли изменение экспрессии генов BCL 2 и BCL X ска-
зываться на подверженности клеток апоптозу? Теоретически,
да — если представить, что при увеличении активности этих ге-
нов в цитозоле создается избыток белков Вс1-2 и Bcl-х (сверх то-
го количества, которое требуется для закрытия каналов). И этот
избыток «оттягивает» на себя вышеперечисленные апоптоген-
ные белки (Вах, Bad и др.).
Кроме того, как мы видели, состояние митохондриальных
каналов — это, действительно, решающий фактор во многих
случаях апоптоза; причем именно оно (данное состояние) регу-
лируется белком р53, а также целым рядом других факторов
(см. рис. 6.15).
Все это — с одной стороны. А с другой стороны, из того же
самого следует, что подверженность клеток апоптозу могла бы
зависеть от экспрессии отнюдь не только генов BCL 2 и BCL X,
но и многих других генов.
Таким образом, принимая основную идею концепции (о
варьировании чувствительности созревающих клеток к апопто-
зу), мы полагаем, что способы ее реализации, видимо, гораздо
более многообразны, нежели только изменение активности ге
нов BCL 2 и BCL X. Причем среди этих способов и такой есте
ственный, как появление или исчезновение соответствующего
рецептора плазмолеммы.
484
Глава 6
Очевидно, это относится к созреванию не только иммуно-
компетентных клеток.
6.2.5.2. Вводные сведения о дифференцировке
лимфоцитов
Сделаем еще одно необходимое отступление Прежде чем
рассматривать роль апоптоза в созревании лимфоцитов, сооб-
щим очень краткие сведения о самом этом созревании.
Как известно, все кроветворные клетки по степени зрелости
подразделяются на 6 классов:
I) стволовые кроветворные клетки,
И) полустволовые клетки,
III) унипотентные клетки,
IV) бласты,
V) созревающие клетки,
VI) зрелые клетки.
Это относится и к лимфоцитам (рис. 6.22).
Но для них, помимо того, созревание разбивается на 2 этапа.
а) Антигеннезависимый этап включает первичное образо-
вание из стволовых клеток крови покоящихся клеток VI клас-
са В- и Т-лимфоцитов. Он происходит в центральных органах
кроветворения — красном костном мозгу и (в случае Т-клеток)
тимусе.
Таким образом, клетки Т-лимфопоэтического ряда на од
ной из ранних стадий развития перемещаются из красного ко-
стного мозга в тимус, где завершают свою дифференцировку. Но
к какому конкретно классу относятся мигрирующие в тимус
клетки, пока в точности неясно. Предположительно, это унипо-
тентные предшественники Т-клеток (клетки III класса).
б) Второй этап (антигензависимый) начинается после имму-
носпецифического взаимодействия лимфоцитов с соответствую-
щим антигеном (антигенной детерминантой), т. е. входит как со-
ставная часть в клеточную (см. рис. 4.28) или гуморальную (см.
рис. 4.29) иммунную реакцию. Место его осуществления — пе-
риферические лимфоидные органы: лимфоидная система слизи-
стых оболочек, лимфоузлы, белая пульпа селезенки.
При этом стимулированные клетки из VI класса как бы
вновь возвращаются в IV класс бластов (интенсивно делящихся
клеток), а затем подвергаются дополнительному созреванию. В
результате образуются:
из стимулированных В лимфоцитов — В-клетки памя-
ти и плазмоциты, интенсивно синтезирующие иммуно-
глобулины;
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ’ КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ
485
АНТИГЕННЕЗАВИСИМОЕ СОЗРЕВАНИЕ I. Стволовые клетки Стволовые клетки крови (в красном костном мозгу)
II. Полуство- ловые клетки Предшеств лимфоп еиники Предшественники оэза миелопоэза^
III. У импотентные клетки В-лимфо- поэтин Предшест В-лим^ \ Т-лимфо- • • • Г ^поэтик венники Предшественники оцитов Т-лимфоцитов
IV. Бласты т т В-лимфобласты Т-лимфобласты (в красном костном мозгу) (в тимусе)
V. Созреваю- щие клетки В-пролимфоциты Т-пролимфоциты (пре-В-клетки) (пре-Т-клетки)
VI Зрелые клетки t ' В лимйоииты Т ламе ouumw
(CD4 —Т-хелперы, CD8‘ — Т-киллеры)
1 АНТИГЕНЗАВИСИМОЕ СОЗРЕВАНИЕ IVa. Бласты АГ — В-иммунобл АГ“*'1 асты T-hmmj нобласты
Va. Созреваю- щие клетки Про В- и Т плазмоциты клетки памяти
Via. Зрелые клетки f Плазмоциты. Активы (плазматические клетки) Тлил рованныв 1фоциты
Htc. лим*| г*п**з**$>
инти! ан (млиритмге-ии^ дуг<рм4лн.нтз)
- а из стимулированных Т-клеток — Т-клетки памяти и ак-
тивированные Т-хелперы или Т киллеры.
После этих вводных замечаний рассмотрим некоторые клю
чевые события лимфопоэза в контексте их связи с апоптозом
созревающих клеток.
В случае антигеннезависимого этапа дифференцировки
имеющиеся сведения более определенны в отношении Т клеток,
а в случае антигензависимого этапа в отношении В-клеток.
Что и будет нами учтено при последующем изложении.
486
Глава 6
6.2.5.3. Антигеннезависимая дифференцировка.
ранние стадии (табл. 6.2)
1,а-б) На ранних стадиях созревания выживание и дальней-
шее деление Т лимфопоэтических клеток (как, впрочем, и всех
прочих кроветворных клеток) зависит от присутствия специфи-
ческих индукторов.
Вначале (еще в красном костном мозгу) в качестве такового,
видимо, служит Т-лимфопоэтин.
Несколько позднее становится абсолютно необходимым
присутствие во внеклеточной среде интерлейкина 7 (ИЛ-7). Он
же требуется для развития и В-клеток.
Следовательно, на поверхности развивающихся клеток
имеются рецепторы к данным индукторам. Причем, если эти ре-
цепторы свободны от связи с индуктором, инициируются собы-
тия, показанные на рис. 6.20, т. е. развивается «апоптоз по ко-
манде».
Связывание же индуктора не только предупреждает апо-
птоз, но и через неизвестные еще регуляторные цепочки стиму-
лирует определенные изменения клеточной биохимии и морфо-
логии — такие, которые продвигают клетку по пути дифферен-
цировки.
Поэтому клетки стоят перед жесткой альтернативой:
— или развиваться в направлении, указанном индукто-
ром,
- или погибнуть в ходе апоптоза
Однажды вступив в дифференцировку, остановиться на
полпути, «заснуть», «законсервироваться» они уже «не имеют
права» — даже по «объективным» обстоятельствам (к каковым
можно было бы причислить отсутствие индуктора).
Похоже, это общий закон для всех видов дифференци
ровки Во всяком случае, в сперматогенезе действует тот же
принцип.
Биологический же смысл этого принципа, очевидно, состо-
ит в том, что благодаря ему в организме не сохраняются (как по-
тенциально опасные) «беспризорные» и бесполезные клетки,
т. е. клетки с неопределенной «жизненной программой». Такая
«привилегия» предоставляется лишь стволовым клеткам.
2) При нормальном лимфопоэзе на одной из стадий в клет-
ках происходит уникальное событие - перестройка той обла-
сти генома, которая кодирует полипептидные фрагменты имму-
ноглобулинов (в случае В клеток) или Т-клеточных рецепторов
(TCR, в случае Т-клеток).
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
487
Таблица 6.2. Антигеннезависимое созревание Т-клеток
Место действия СОБЫТИЯ Особенности клеток Отношение к АПОПТОЗУ
Красный костный мозг 1а) Начальные ста- дии созревания: клетки классов П-Ш(?) Имеется зависи- мость от Т лимфопоэтина При недостатке указанных индук- торов во внекле- точной среде — «апоптоз по ко- манде»
Кора ти- муса: под- капсуляр ная зона 16) Последующая стадия созревания: клетки класса IV — Т-лимфобласты Имеется зависи- мость от интер- лейкина 7 (ИЛ-7) и ряда других факторов
Кора тимуса ? 2а) Пре-Т-клетки (V класс) (?): пере- стройка геномной области, кодирую- щей фрагменты TCR Происходит пере- нос фрагментов ДНК из одной области хромосо мы в другую Из-за многочи- сленных разрывов и соединений цепей ДНК возможны повреждения ДНК с развитием «апо- птоза изнутри»
26) В результате образуются Т-клетки CD4',CD8 с рецепторным комплексом TCR-CD3
Кора ти- муса: глубокие слои За) Положительная селекция Т клеток, распознающих ан- тигены ГКГ (I и II классов) на ретику- лоэпителиоцитах На поверхности клеток, помимо белков TCR CD3 и CD4 CD8*, имеет- ся Fas-рецептор Тимоциты, чьи TCR не узнают ГКГ (I или II классов) на рети кулоэп ите- лиальных клетках, подвергаются «апо- птозу по команде»
36) Дифференцировка выживших Т-клеток на 2 субпопуля ции CD4’,CD8 (Т-хелперы) и CD4 CD8 (Т-киллеры)
Зв) Положительная селекция A) CD4’ Т-клеток, распознающих на ре- тикулоэпителиоци- тах I KI II, B)CD8‘ Т клеток, распознающих ГКГ-1 Во взаимодействии с ГКГ-I и ГКГ-П со стороны Т-клеток участвуют не толь- ко TCR-CD3, но и, соответственно, CD4 (табл. 4.3.А) или CD8 Подвергаются «апо- птозу по команде» A) CD4‘Т-клетки, распознающие ГКГ -I, Б) CD8 -Т-клетки, распознающие ГКГ-П
Тимус: граница между ко рой и моз- говым ве- ществом 4а) Стимуляция синтеза рецепторов TCR-CD3 увеличе- ние их концентрации на поверхности клеток
46) Отрицательная селекция тех Т-кле ток, которые распознают в антигенах ГКГ на дендритных клетках антиген- ные детерминанты Указанные Т-клет- ки подвергаются «апоптозу по ко- манде»
Тимус: мозговое вещество 5) Завершение соз- ревания тимоцитов: образование покоя- щихся клеток VI класса — Т-хелпе- ров и Т киллеров а) Исчезают Fas- рецепторы б) Высокоактив- ны гены ВСЕ 2 и BCL X Клетки устойчивы к апоптогенным факторам
488
Глава 6
Сама необходимость подобной перестройки вызывается сле-
дующим обстоятельством. Как известно, зрелые лимфоциты
подразделяются на множество клонов (порядка 10 ), различаю-
щихся по антигенной специфичности своих Ig-подобных рецеп-
торов (со структурой, показанной на рис. 4 25,А и 4 25,Б).
Если представить, что каждый такой рецептор изначально
кодируется двумя отдельными генами (для тяжелой и для лег-
кой цепей), то общий объем всех этих генов (выраженный в ну-
клеотидных парах ДНК) в 10 раз превысил бы действительный
объем всего генома человека. Не говоря уже о том, что в геноме
должны присутствовать и прочие гены, а также протяженные
структурные и регуляторные участки.
Иными словами, идея «каждому Ig-подобному белку в лю-
бой клетке — свои гены» при имеющемся размере генома про-
сто не могла быть реализована.
Как же решается проблема кодирования иммуноглобули-
нов? — Весьма просто и изящно. По наследству передаются все-
го несколько сотен генов, отвечающих за структуру Ig. Но они
кодируют не целиком ту или иную цепь Ig, а, как уже было ска-
зано, лишь ее определенный фрагмент.
В частности, по имеющимся оценкам, существует
350 генов вариабельных доменов (V'L) легких цепей Ig,
- 250 генов вариабельных доменов (V'H) тяжелых цепей,
- 5 генов соединительных участков (J,) легких цепей,
- 5 генов соединительных участков (JH) тяжелых цепей,
- 2 гена (С,/ и С,/) константного участка легких цепей и
5 генов (Сп", Сн’, Сн°, Сц6, CHF) константного участка тяже-
лых цепей.
Причем эти гены расположены тандемами (кластерами),
т. е. друг за другом.
- отдельно тандем генов V'L,
- отдельно кластер генов JL, сразу за которым следует пара
генов С,’ и CL*, — и т. д.
В процессе же вышеупомянутой перестройки генома в со-
зревающих иммунокомпетентных клетках происходит перенос
(транспозиция) некоторых из вышеперечисленных генов. Он
приводит к тому, что:
- в Т клетках образуется один полный ген вида
S—V Hi- JuСн",
кодирующий TCR (Т-клеточный рецептор, рис. 4.25Б),
а в В клетках — два полных гена, для тяжелой и для лей
кой цепей Ig подобного рецептора:
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
489
S-VLJi-JL.n-CH\
Здесь S — часть полного гена, кодирующая сигнальную по-
следовательность (СП, п. 3.6.1.2), которая необходима для про-
никновения синтезируемой цепи в цистерны эндоплазматиче-
ской цепи. Остальные же части полного гена представляют со-
бой случайным образом выбранные гены соответствующих
фрагментов Ig.
При этом соединение генов и Jh<l),j происходит вплот-
ную, без оставления спейсера между ними. Но место стыковки
может варьировать в пределах трех нуклеотидов, что влияет на
рамку считывания J-гена
Поэтому каждый из 5 J генов способен давать после транс-
позиции по 3 разных J-участка в будущих Ig. Всего же, очевид-
но, могут получаться (при всех вариантах транспозиции) 15 раз-
личных J-участков тяжелой и столько же участков легкой цепи.
В каждой клетке образуется, как уже сказано, только один
или два полных гена. Но из-за случайности выбора их компо-
нентов разные клетки, как правило, отличаются своими заново
созданными генами. Это будет относиться и к потомкам данных
клеток. Поэтому важнейший результат транспозиции генов —
образование большого числа клонов лимфоцитов с различной
иммуноспецифичностью (которая определяется их рецептор
ными Ig-подобными белками).
Вот простой расчет количества различных клонов В-клеток.
В нем следует учитывать лишь V- и J-участки Ig, поскольку
только они влияют на конформацию антигенсвязывающих цен-
тров (АСЦ). Итак,
350 V'Lk х 15 J,..n = 5250 VL.k-JL.n,
250 V'Hi x 15 JH ) = 3750 Vhj-Jhj»
5250 VLk-JUn x 3750 V = 2 • 10? АСЦ.
Здесь
- первая строчка — количество разных вариантов вариа-
бельной (V J) части легких цепей Ig,
- вторая строчка то же для тяжелых цепей Ig,
- третья строчка искомое количество разных видов АСЦ
и оно же общее число клонов В-клеток (поскольку у каж
дого клона лишь по одному виду АСЦ).
Таким образом, итоговый результат определяется множе
ством случайных комбинаций различных фрагментов Ig
490
Глава 6
Эти-то комбинации, следовательно, и создаются в ходе транспо-
зиции генов.
А что мы имеем для Т-клеток? — Их рецепторы (TCR)
включают цепь лишь одного вида (см. рис. 4.25,Б). Следова-
тельно, для Т-клеток из вышеприведенного расчета остается
только вторая строчка, а значит результат составляет всего нес-
колько тысяч клонов.
Именно поэтому в пп. 4.3.4.2 и 4.3.4.3 мы сомневались в
том, что рецепторы Т-клеток (TCR) способны узнавать (в со-
ставе антигенов ГКГ-1 или ГКГ-П) конкретные антигенные
детерминанты. Для охвата множества всевозможных детер-
минант требовалось бы слишком большое количество разных
TCR — примерно такое, какое мы получили для рецепторов
В-клеток.
Итак, транспозиция генов-«полуфабрикатов» приводит к
подразделению В- и Т-лимфопоэтических клеток на клоны с раз-
ной иммуноспецифичностью. Правда, так четко и не определе-
на стадия лимфопоэза, на которой все это происходит Рав-
но как ее положение в онтогенезе и конкретное место осущест-
вления.
Тем не менее, в том или ином виде указанная транспозиция
все-таки совершается. Для чего требуются двухцепочечные раз-
рывы в одних участках ДНК и сшивки в других.
Сопоставимо ли число этих разрывов с тем, которое способ-
но инициировать «апоптоз изнутри»? Вероятно, нет. Поэтому, с
нашей точки зрения, для клеток нет необходимости как-то спе-
циально повышать на этот период свою устойчивость к апопто-
зу. (Хотя в литературе имеется и противоположная точка зре-
ния на этот счет.)
Более того, в каких-то клетках сложные процессы пере-
стройки генома могут привести к тем или иным нарушениям
структуры ДНК. И, как это имеет место в митотическом цикле
(раздел 6.1.5), должны, видимо, существовать специальные ме-
ханизмы контроля за результатом транспозиции. Следователь-
но, эти две причины:
а) повышение вероятности повреждений структуры ДНК и
б) усиление контроля, —
будут увеличивать частоту «апоптоза изнутри» на данном
критическом этапе лимфопоэза.
В конце его на поверхности будущих Т-клеток появляют
ся рецепторный комплекс TCR-CD3, а также маркерные белки
CD4 и CD8.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...491
6.2.5.4 Антигеннезависимая дифференцировка:
селекция Т-клеток ( табл. 6.2)
Продолжаем описание событий, кратко суммированных в
табл. 6.2.
Если на вышерассмотренном этапе апоптоз служил для от-
браковки «плохих», «испорченных» клеток (не сумевших пра-
вильно перестроить геном), то затем начинается тщательная се-
лекция клеток по природе их поверхностных (и только что на-
званных) белков. При этом вновь значительно возрастает роль
«апоптоза по команде» — для элиминации отбракованных
клеток.
Селекция проходит в несколько стадий
3 . Положительная селекция. Как мы знаем (пп. 4.3.4.2 и
4.3.4.3) и недавно вспоминали, в основе функций зрелых Т-кле-
ток лежит способность реагировать со специальными поверх-
ностными белками других клеток:
- антигенами ГКГ I, имеющимися практически у всех
клеток,
- и антигенами ГКГ-П, содержащимися лишь у т. н. анти
генпредставляющих клеток — В-лимфоцитов, макрофа-
гов (включая их многие разновидности) и некоторых спе-
циализированных эпителиоцитов.
а) Поэтому первый этап селекции — устранение тех пре-
Т-клеток, рецепторы которых (TCR) не способны взаимо
действовать с существующими в организме ГКГ того или
иного класса.
Процесс проходит в глубоких слоях коры тимуса. И в каче-
стве «экзаменаторов» выступают ретикулоэпителиальные
клетки, образующие строму лимфоидной ткани тимуса. Они од-
новременно содержат на своей поверхности:
и весь набор антигенов ГКГ-1 (как и прочие клетки орга-
низма),
- и, видимо, весь набор антигенов ГКГ II (на правах специа-
лизированных эпителиальных клеток).
Принцип селекции отражается следующей простой схемой:
Пре-Т-клетка Ретикулоэпнтелиоцит
TCR (+CD3, CD8) — ГКГ I
или
TCR (+CD3, CD4 ) ГКГ II
или
Fas-рецептор
Fas лиганд
492
Глава 6
Она означает, что, если TCR пре Т-клетки (при участии
других поверхностных белков) не взаимодействует с каким ли-
бо антигеном ГКГ ретикулоэпителиоцита, то начинают взаимо-
действовать Fas-рецептор (появляющийся к моменту селекции
на Т-клетке) и Fas-лиганд (видимо, существующий на ретикуло-
эпителиоците или какой-то иной клетке окружения).
А возбуждение Fas-рецептора на поверхности клетки ведет,
как отмечалось в пп 4.3.4.2 и 6.2.1.3, к запуску в этой клетке
«апоптоза по команде».
Таким образом, на данном этапе отбраковывается и погиба-
ет весьма большое количество пре-Т-клеток, чьи TCR могли бы
узнать какие то другие белки, но не белки ГКГ-I или ГКГ-П
Сохраняются же пре-Т-клетки, способные к «контрольно-
му» узнаванию. Поэтому данный отбор обозначается как поло
жительная селекция.
б) В конце предыдущего пункта (6.2.5.3) отмечалось, что вна-
чале у всех пре-Т-клеток на поверхности появляются оба белка,
по которым различают Т-киллеров и Т-хелперов, — и CD4, и CD8.
Позднее же (после вышеописанного этапа положительной
селекции или одновременно с ним)
- у одних клеток (будущих Т-киллеров) остается только бе-
лок CD8,
— у других (будущих Т хелперов) — только CD4
в) Такая дифференциация приводит к выбраковке и гибели
еще примерно половины оставшихся клеток.
Действительно, теперь должны быть удалены из популя-
ции клетки с «неправильным» взаимодействием:
Т-киллеры (СП8’-клетки), чьи TCR узнают какой-либо ан
тиген ГКГ из класса II,
- Т хелперы (СП4‘-клетки), реагирующие на антиген ГКГ-1.
Но никаких дополнительных механизмов для такой выбра-
ковки не требуется. Как было показано на вышеприведенной
схеме, для того, чтобы взаимодействие TCR с антигеном ГКГ бы-
ло достаточно сильным, в нем должен участвовать белок CD4
(при контакте с антигеном ГКГ II) или белок CD8 (при контакте
с антигеном ГКГ-1).
Поэтому, если необходимый для взаимодействия белок CD
исчезает с поверхности клетки, взаимодействие «считается» не-
состоявшимся (просто из-за своей слабости) и клетка направля-
ется на путь апоптоза (опять-таки с помощью «роковой» пары
Fas-R Fas-L).
На этом положительная селекция заканчивается. Уце-
левшие клетки перемещаются на границу коркового и мозго-
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ
493
вого вещества тимуса или даже непосредственно в мозговое
вещество.
4. Отрицательная селекция После вышеописанных собы
тий в клетках активизируются синтетические процессы, в ре
зультате чего на поверхности возрастает количество молекул
TCR и связанных с ними молекул белков CD.
Затем, как полагают, наступает очередь т. н. отрицатель-
ной селекции. Теперь элиминации подвергаются Т-клетки, спо-
собные к специфическому узнаванию антигенных детерминант
в составе белков ГКГ. А в роли «экзаменаторов» выступают ден-
дритные клетки — одна из разновидностей макрофагов.
Таким образом,
- если при положительной селекции, из-за невысокого со-
держания TCR, распознавался лишь некий общий образ
белков ГКГ и способные к такому распознаванию клетки
сохранялись,
то при отрицательной селекции (когда плотность располо-
жения TCR значительно увеличена) речь идет о детекции
конкретных антигенных детерминант в ГКГ, и клетки,
узнающие эти детерминанты, уничтожаются
Смысл процесса очевиден удаление аутореактивных
клонов Т клеток. Но, несмотря на кажущуюся очевидность
возникают некоторые сомнения.
А. Первое из них касается Т-киллеров (реагирующих, как
мы знаем, на ГКГ-1). В п. 4.3 4 2 была выдвинута гипотеза о том,
что Т киллеры узнают
не всевозможные чужеродные антигены ГКГ I
- а собственные белки ГКГ I.
И активируются тогда, когда не могут найти на «обследуе-
мой» клетке «свой» неизмененный белок ГКГ I.
Если это действительно так, то для популяции Т-киллеров
отрицательная селекция не требуется И весь необходимый от-
бор ограничен лишь положительной селекцией клеток, узнаю
щих собственные антигены ГКГ-1.
Б. Тогда, если исходить из того, что отрицательная селек
Ция лимфоцитов действительно существует (чему имеются экс-
периментальные доказательства), то ее приходится отнести из
Т-клеток лишь к Т хелперам.
Однако и в этом случае непонятно, откуда берутся на по
верхности дендритных клеток (в связанном состоянии с белка-
ми ГКГ-П) антигенные детерминанты всевозможных собствен-
ных белков организма. Т. е. белков, находящихся в норме в со
ставе самых различных клеток.
494
Глава 6
Ведь, согласно представлениям об отрицательной селек-
ции, должны отбраковаться те пре-Т-хелперы, чьи TCR узнают
именно такие антигенные детерминанты — представляющие все
множество белков организма.
Впрочем, допускается, что отрицательная селекция Т-клеток
может продолжаться и после того, как они покинут тимус. Но тог-
да в чем состоит «эксклюзивная» роль дендритных клеток?
Что касается В-лимфоцитов, то у них положительная се-
лекция, видимо, не проходит совсем (т. к. им не требуется узна-
вать какие то собственные белки — типа антигенов ГКГ). И все
дело ограничивается отрицательной селекцией (удалением ау
тореактивных клонов), которая в данном случае безусловно
необходима.
Но определенных представлений об этой селекции пока
нет включая и то, где именно она происходит: в каком-либо
одном органе или сразу во многих областях расселения.
Таким образом, в отношении антигеннезависимого созрева-
ния иммунокомпетентных клеток, несмотря на весьма давнюю
историю изучения этой проблемы, остается еще очень и очень
много неясного.
Кроме вдруг ярко осознанного факта: это самое созревание
все время идет «рука об руку» с апоптозом.
5- По окончании же процессов селекции «рецептор смерти»
(Fas-R) исчезает с поверхности лимфоцитов. Кроме того, по не-
которым данным, усиливается экспрессия генов BCL-2 и BCL X.
В результате устойчивость к апоптозу повышается, и клет-
ки переходят в покоящееся состояние.
6.2.5.5. Антигензависимая дифференцировка
В лимфоцитов (табл. 6.3 )
Что касается антигензависимой дифференцировки, то
здесь, как уже отмечалось, лучше изучены В-клетки. О них и бу-
дет идти речь в данном пункте.
В общих чертах гуморальную иммунную реакцию (в кото-
рой участвуют В-клетки) мы уже рассматривали в п. 4.3.4 3.
Сейчас же она нас интересует опять таки в контексте связи с
апоптозом.
1. Поэтому первичное взаимодействие В-клетки с чужерод-
ным антигеном и последующую ее активацию Т-хелпером опу-
стим: здесь об апоптозе говорить не приходится.
2. Зато далее начинаются события, в которых апоптоз явля-
ется важной «сюжетной линией».
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
495
Речь идет о процессах, протекающих в лимфатических
узелках периферической лимфоидной системы после антиген-
ной стимуляции одного или нескольких клонов В-клеток.
Таблица 6.3. Антигензависимая
дифференцировка В-клеток
Место действия СОБЫТИЯ Отношение к АПОПТОЗУ
Чаще всего — поверхностные слои слизистых оболочек и кожи 1) Взаимодействие В-клеток (с помощью Ig-подобных ре- цепторов) с АД (антигенны- ми детерминантами) и последующая активация таких В-клеток Т-хелпера- ми (см. рис. 4.29) —
Реактивный центр лимфатических фолликулов — темная зона 2а) Мутагенез клеток (цен- тробластов) — появление клонов с более высоким срод- ством к антигену (или АД) Вероятно, часть клеток вследствие повреждения генома при мутагенезе подвергается «апоптозу изнутри»
Реактивный центр лимфатических фолликулов — светлая база ль иая зона 26) Положительная селек- ция клеток (центроцитов) с высоким сродством к АД, находящимся на поверхно- сти дендритных клеток Клетки, слабо взаимо- действующие с АД, вступают в «апоптоз по команде»
Реактивный центр лимфати- ческих фоллику- лов — светлая апикальная зона За) Размножение выжив- ших клеток (В-иммунобла- стов) Устойчивость к апопто- зу повышена: особенно долго она сохраняется в В-клетках памяти
Корона(мантия) лимфатических фолликулов 36) Дифференцировка В- клеток в плазмоциты и В клетки памяти
Мозговые тяжи лимфоузлов и рыхлая соедини- тельная ткань 4а) Функционирование плаз- моцитов (секреция Ig М) 46) Сн-переключение (в сох- ранившихся бластах или плазмоцитах): перестройка генома и переход к продук- ции IgG, IgA, IgE или IgD Вследствие поврежде- ний хромосом в ходе перестройки генов возможен «апоптоз изнутри»
Там же 5) Постепенное повышение подверженности апоптозу: в плазмоцитах — быстрее, в В клетках памяти — медленней. Без подкрепляющей стимуляции антигеном (на по- верхности дендритных клеток) — постепенная ги бель В-клеток соответствующего клона
496
Глава 6
Причем, появившиеся недавно представления весьма суще-
ственно корректируют устоявшиеся взгляды и b самих этих про-
цессах, и (что не менее интересно) о клеточной организации
лимфатических фолликулов.
Действительно, обычно в фолликулах различают следую-
щие две области:
- светлый реактивный (или герминативный) центр с деля-
щимися В-иммунобластами и
окружающую этот центр темную корону (мантию) с В-
клетками памяти и проплазмоцитами.
Современная трактовка (рис. 6.23) сохраняет это деле
ние, но
I) «забирает» у короны часть темной области, относя ее к ре-
активному центру;
II) различает в этом центре несколько зон и, главное,
III) указывает два принципиально новых процесса, проис-
ходящих в соответствующих зонах.
а) Итак, согласно новым представлениям, после стимуля-
ции антигеном и Т-хелпером В-клетки мигрируют в т. н. тем
ную зону реактивного центра, где в них резко интенсифициру-
ется мутагенез. Клетки на этой стадии называются центра
бластами
Механизм мутагенеза не конкретизирован. С нашей точки
зрения, он мог бы развиваться по двум направлениям:
РЕАК-
ТИВНЫЙ
ЦЕНТР
б) Светлая
базальная зона
(селекция
центроцитов)
а) Тёмная зона
(мутагенез
центробластов)
в) Светлая
апикальная зона
(деления
В-иммунобластов
КОРОНА или МАНТИЯ (дифференцировка проплазмоциты
и клетки памяти)
Рмс. 6.23. Лимфатический <*к ллциуг' зоны, их клеточным состав
и^уищим А А Ярплмну)
________:____________>__S______&______________
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ
497
- усиления продукции клеткой мутагенных факторов (на-
пример, того же оксида азота) и
- ослабления деятельности определенных защитных си-
стем (системы репарации ДНК, антиоксидантной систе-
мы и т. д.).
Биологический же смысл мутагенеза в В-клетках — образо-
вание, наряду с прочими «мутантами», и таких клеток (а зна-
чит, и клонов), чьи Ig-подобные рецепторы имели бы большее
сродство к попавшему в организм антигену.
Отсюда следует, между прочим, что описанная в п. 6.2.5.3
перестройка генома (на ранних стадиях лимфопоэза) обеспечи-
вает не абсолютное сродство множества появляющихся рецепто-
ров ко всевозможным антигенам, а лишь «приблизительное»,
первичное узнавание.
А уж «подгонка» структуры рецепторов под антиген проис
ходит путем мутагенеза.
Но, конечно, при этом могут быть и «издержки производ-
ства»: в каких-то клетках мутагенез приводит к значительным
повреждениям ДНК, влекущим «апоптоз по команде».
6) Кроме того, необходимо провести селекцию мутировав-
ших клеток по сродству их рецепторов к антигену. Это осущест-
вляется в светлой базальной зоне реактивного центра, а под-
вергаемые селекции В-клетки называются центроцитами.
Процесс проходит по принципу положительной селек-
ции примерно так же, как в тимусе при антигеннезависимой
дифференцировке Т-клеток (п. 6.2.5.4). Вновь можно составить
несложную схему:
Центроцит Дендритная клетка
Ig-nod. рецептор 1 ( АД-ГКГII
CD40 f \CD154 (CD40L)
или
Fas рецептор — Fas-лиганд
Она означает, что антигенные детерминанты (АД) попавше-
го в организм антигена фиксированы на поверхности дендрит-
ных клеток вышеуказанной зоны фолликулов — и, скорее все
го, как обычно, связаны с белками ГКГ-П.
«Удачное» взаимодействие между инспектируемым Ig-pe-
цептором и АД скрепляется неспецифическим взаимодействием
двух белков из группы CD.
498
Глава 6
Но на поверхности контактирующих клеток наготове нахо-
дится и пара Fas-рецептор (у В клетки) — Fas-лиганд (у ден-
дритной клетки). И если исследуемое сродство невысоко, то
взаимодействие этой пары запускает «апоптоз по команде» в
центроците (В-клетке).
За) По окончании селекции отобранные клетки перемеща-
ются в самую светлую зону реактивного центра — т. н. апикаль-
ную светлую и только теперь становятся классическими В-
иммунобластами. Они интенсивно делятся.
Fas-рецепторы с поверхности исчезают: необходимости в
них более нет. Так что команды на апоптоз уже не поступают и
не воспринимаются.
С другой стороны, как мы знаем, интенсивные митотиче-
ские деления повышают вероятность «апоптоза изнутри».
б) Наконец, клетки выходят из клеточного цикла и в коро
не узелка дифференцируются либо в В-клетки памяти, либо в
проплазмоциты.
Если дело происходит в лимфоузлах, плазматические клет-
ки накапливаются в мозговых тяжах. И затем в течение некото-
рого времени активно продуцируют IgM
Наши расчеты показывают: чтобы был достигнут требуе-
мый уровень IgM в крови, необходимо, чтобы в каждой клетке-
продуценте содержалось по несколько тысяч, копий генов соот-
ветствующего IgM.
Это означает, что в ходе антигензависимой дифференциров-
ки В-клеток происходит, помимо мутагенеза, еще один затраги-
вающий геном процесс - амплификация (многократное увели-
чение числа копий) генов IgM.
О времени ее осуществления (если она действительно имеет
место) можно лишь строить предположения. Наиболее «разум-
но» было бы, чтобы амплификация совершалась после селекции
В-клеток и перед их пролиферацией.
6.2.5.6 Сн-переключение (табл. 6.3)
4. Но и вышеизложенным процессы перестройки генов не
исчерпываются. Давно известен еще один феномен — т. н. Сн пе-
реключение.
Чтобы понять его суть, необходимо кратко сказать о клас-
сах иммуноглобулинов (рис. 6.24).
Ранее (на рис. 4.25,А) была приведена структура типичного
Ig, которую можно представить так: L2H2 (две легкие и две тя-
желые цепи). В свою очередь, цепи подразделяются на домены:
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
499
Впачал* иыстуг-аит в качктв*
мембранных рецепторов
Затем продуцируют» в кровь иа-
ранних стадиях мимуного «вт.
IgM
[L2(H*)2]sJ
igE
L2(H»)2 [L2(H")2)2JS
Это
ОСНОВНОЙ
класс Ig
й
крови
Эго ОСНОВНОЙ КЛАСС
I g в различных
секретах — молок*,
слипе, сл-еадх
кишечном соке зя
L2(H^2
Стимулирует
секреции гиста-
мина. базофилами
и тучными
клетками
L2(H*)2
Главным
образом,
содержатся на
мембране В
клеток в
Рис. в. 24, Имм-^н^-гл- ^удпниГихжлхесы,'<>у*^4р<нйайЙД
структу; ифунхцяи
- легкая цепь — на VL (вариабельный) и CL (константный);
- тяжелая цепь — на VH, Сн1, СН2 и Снз.
Как мы знаем, у Ig с разной антигенной специфичностью
отличаются вариабельные домены (включающие и соединитель-
ные участки JL или JH).
Константные же участки (из одного или трех доменов) на
иммунную специфичность не влияют. Но, тем не менее, и они
могут различаться. Как было указано в п. 6.2.5.3, существуют
- 2 разных гена (CL* и CLZ) для CL (константной области лег-
ких цепей)и
- 5 разных генов (С,/, CHV, Сн“, Снс, Сн5) для Сн (константной
области тяжелых цепей).
Так вот, классы Ig различаются по виду константной
части тяжелых цепей. И соответственно пяти видам этой ча-
сти существуют 5 классов Ig:
IgM IgG IgA IgE IgD
(с Си) (с Си1) (с CH“) (C CH‘) (c CH6)
Кроме того, как видно из рис. 6.24, у IgM и IgA — несколь-
ко более сложная и субъединичная структура Так, IgM являет-
ся пентамером: (L2H2)6 и, кроме того, содержит соединительную
цепь J (которую не следует путать с соединительным участком,
входящим в состав каждой вариабельной области).
Кроме того, Ig разных классов отличаются и по своей
Функции.
500
Глава 6
Так что же такое Сн-переключение“! На ранних стадиях
гуморального иммунного ответа образующиеся плазмоциты
продуцируют, как уже отмечалось, IgM. — Потому, что для фор-
мирования гена тяжелой цепи в ходе антигеннезависимой диф-
ференцировки (п. 6.2.5.3) всегда используется ген С,,1'.
Через некоторое же время после начала синтеза и продук-
ции Ig их класс меняется: с IgM на один из остальных четырех
классов. Этот феномен и обозначается как Сн-переключение —
переход от образования Ig с одной Сн-областью к синтезу Ig
с другой одноименной областью.
Механизм данного перехода опять состоит в транспозиции
генов (рис. 6.25). А именно:
- в полном гене Н-цепи вырезается участок Снм,
- оставшаяся часть этого гена (S—VH-JH) сшивается с од-
ним из остальных Сн-генов — CHY, Сн", Снс или Сн8.
Рис. 6.25 Ме*анизм Си-|’*?рехпю«емий
Там же, где происходит реорганизация генетического мате-
риала, всегда возможны ошибки и повреждения. Т. е. часть кле-
ток будет подвергаться «апоптозу изнутри».
Правда, не вполне ясно, в каких именно клетках идет дан-
ная реорганизация — то ли в сохранившихся В-иммунобластах,
то ли в уже функционирующих плазмоцитах.
5. После Сп-переключения на некоторое время наступает
стабилизация клеток-плазмоцитов и В клеток памяти.
Но со временем медленно нарастает подверженность клеток
апоптозу (вероятно, опять «апоптозу изнутри»). И без новой сти-
муляции клона В клеток тем же антигеном численность его
(клона) значительно сокращается.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
501
Итак, мы рассмотрели большой комплекс иммунных про-
цессов в плане их отношения к апоптозу.
Ранее (в п. 6.2.1.3) были описаны другие примеры важной
роли апоптоза в иммунных реакциях:
- при цитолитическом действии Т-киллеров и
- при проникновении иммунокомпетентных клеток через
гематотестикулярный барьер.
Поэтому завершим обсуждение данной проблемы — ас ней
и разговор об апоптозе.
6.3. ОНКОГЕНЕЗ
И вот в завершающем разделе книги мы подошли к пробле-
ме, которую отнюдь нельзя назвать новой для биологической
науки. И сто лет назад, и пятьдесят, и тем более двадцать — все
время ученые и общество надеялись: еще чуть-чуть, еще немно-
го — и онкологические заболевания станут столь же излечимы-
ми, как многие инфекционные болезни после появления анти-
биотиков.
Нельзя сказать, чтобы не было никакого прогресса. Про-
гресс был, но такой медленный, такой постепенный, что вовсе не
соответствовал надеждам на яркий, революционный прорыв.
Быть может, прорыв еще случится. А может быть, нет. Но в
любом случае сегодня мы знаем о канцерогенезе (или онкогене-
зе: это почти идентичные термины) существенно больше, чем,
например, тридцать лет назад. Хотя по-прежнему, видимо, не
знаем чего-то еще очень важного, что могло бы объединить все
имеющиеся сведения в единую и законченную картину.
Но область этого «чего-то», круг, ее ограничивающий, неу-
клонно сужаются. И когда-нибудь станет уже не важно, каким
образом была достигнута решающая победа — путем блестяще
го штурма или в ходе долгой изнурительной осады.
6.3.1. Генетическая природа онкогенеза
6 3.1.1. Вводные утверждения
1 Один из важнейших результатов предыдущих десятиле-
тий состоит в том, что достигнуто четкое понимание:
- опухолевые клетки имеют «неправильный» геном, т. е.
у них модифицированы некоторые из ключевых генов.
Это утверждение не столь уж тривиально. Так, в начале се-
мидесятых годов XX века была широко распространена точка
502
Глава 6
зрения, по которой рак — результат дерепрессии генома, а спо-
собом дерепрессии считалось снижение содержания в хромосо-
мах гистонов.
Примерно тогда же один из авторов этой книги (Н Н. Муш-
камбаров) выдвинул гипотезу: «Онкогенез — это побочный эф-
фект борьбы клеток с процессом старения». Имелось в виду,
что со временем в клетках,
- с одной стороны, наступает все более обширная репрессия
генов гистонами,
- а с другой стороны, этому пытаются противодействовать
некие компенсаторные механизмы.
И при перенапряжении последних может наступить срыв,
ведущий к нерегулируемой дерепрессии генов, т. е. к опухолево-
му перерождению клетки.
Иллюстрацией этой гипотезы могла бы служить бласттран-
сформация в культуре делящихся клеток (раздел 1.5). Подав-
ляющее число клеток после определенного числа делений старе-
ет и погибает, но единичные клетки после некоторого «кризиса»
приобретают способность к неограниченному делению. И, как
теперь известно, во многом эта способность связана с дерепрес-
сией гена теломеразы. Казалось бы, просто прекрасное по своей
силе и эффектности доказательство!
Тем не менее, оценивая утверждение о «борьбе со старени-
ем» с позиций нынешнего дня, надо сказать: оно не имеет даже
права на существование, если не включит в свою интерпретацию
не просто гены, а модифицированные измененные гены. Од-
ним нарушением регуляции нормальных генов онкогенез, как
теперь представляется, ограничиваться не может.
Иными словами, стойкое (передающееся дочерним клет-
кам) изменение активности определенных генов, видимо, может
иметь место лишь в том случае, если изменена структура либо
этих генов, либо каких-то других, отвечающих за активность
первых.
Так, в частности, должно обстоять дело и с появлением те-
ломеразы при спонтанной бласттрансформации клеток: ему,
очевидно, предшествует определенное изменение генома. А уж
дальше можно дискутировать, чем оно обусловлено:
- напряжением неких механизмов, направленных на вы-
живание клетки (т. е. той самой «борьбой со старением»)»
- или простой случайностью, каковой являются, например,
мутации генов.
2. Второе общее утверждение по существу, следствие пер-
вого. Его суть в том, что
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ АПОПТОЗ...
503
- наследственные опухоли (возникающие в определенных
тканях или органах у близких родственников) обусловле-
ны первичной мутацией определенного гена в половой
клетке какого то предка,
- а т. н. спорадические (не связанные с наследованием) опу-
холи вызываются изменением структуры генов какой то
соматической клетки самого пациента.
3. И, наконец, третье утверждение: как правило, опухо-
ли — это следствие поражения не единичного гена, а целой
совокупности генов.
И потому процесс опухолевого перерождения — не одно-
моментная мутация, а достаточно длительное накопление ге-
нетических дефектов. И лишь когда их сумма превышает кри-
тический предел, клетка превращается в опухолевую.
Подтверждением служат недавно упоминавшиеся наслед-
ственные опухоли. Казалось бы, они свидетельствуют как раз об
обратном: ведь обычно в каждом из этих случаев установлен на-
следуемый дефект определенного гена!
Но давайте вдумаемся: ведь если данный дефект — един-
ственное условие развития опухоли, то просто непонятно, поче
му не становится опухолевой клеткой сама зигота! Но этого не
происходит; напротив, совершаются сложнейшие процессы эм-
бриогенеза, образуется множество дифференцированных кле-
ток (каждая из которых содержит дефектный ген). И только че-
рез достаточно большое время (несколько лет или несколько де-
сятилетий) в определенной ткани некоторые (и опять-таки не
все) клетки превращаются в опухолевые.
Чем это можно объяснить? — Очевидно, тем, что в данных
клетках, в дополнение к уже имеющемуся дефекту, появилось
со временем еще некое количество опухолеродных повреждений
генома. Причем само их появление или проявление каким то об-
разом связано с функцией клетки — почему наследственные
опухоли обычно появляются в одних и тех же тканях.
6. 3.1.2. Типы генов, отвечающих за онкогенез
Всего в наших клетках — примерно по 30 000 генов
(п. 2.2.1 1) К онкогенезу же, во всех его возможных проявле-
ниях, имеют отношение, по нынешним данным, не более
120 150 генов человека. Плюс некоторое количество вирус-
ных генов.
Все гены, которые могут отвечать за онкогенез, делят на
несколько типов (рис. 6.26).
504
Глава 6
МугАгсммые
факторы
А|
Неконтро-
лируемая
экспрессия
или
изменение
функции
| 1) Мумтоумые геях
I Снижение
активности
За) Прото-
онко-
гень
2а) Некото-
рые
вирус И ь 5
Встраивание
ж геном
клетки
4а)
Олухолев* в
супрессоры
____Му агеккыс
факторы
Инахти
вация
Эб Омкогемь
клеточной
ирфодь
2б) Онкоген ь
вирусной
природы
46) МойЧАщне
гены
ОПУХОЛЕВОЕ ПЕРЕРОЖДЕНИЕ КЛЕТКИ
Pwc. f .26. Гены, огЯ'чаищие за- hkj г- nej
1 Во-первых, это т. н. мутаторные гены При снижении
их активности резко возрастает скорость накопления мутаций и
других изменений генома. Очевидно, к данному типу относятся
гены систем контроля за состоянием ДНК и репарации ее пов-
реждений.
2 Вторая группа некоторые гены вирусного происхожде-
ния, т. е вирусные онкогены.
Уже четко доказано, что целый ряд вирусов может вызы-
вать (хотя, конечно, далеко не всегда вызывает) опухолевое пе-
рерождение зараженной клетки (табл. 6 4).
Причем имеется одна общая для всех этих вирусов особен-
ность: опухолевому перерождению клетки предшествует
встраивание (интеграция) вирусных генов (в т.ч. и онкоге-
нов) в одну из ее хромосом.
Таблица 6.4 Некоторые представители опухолеродных вирусов
Геном вируса Семейство вирусов Во м >жные опу холи
ДНК — линейная (двухцепочечная) Вирусы герпеса Инфекционный мононуклеоз
Вирусы оспы Контагиозный моллюск <
ДНК — кольцевая Панова-вирусы Папил омы (бородавки)
РНК — одноцепочеч пая, (+)-цепь Ретровирусы Лейкемии (у человека), саркома Рауса (у птиц)
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
505
Так что и при вирусной природе онкогенеза тезис об измене-
нии генома клетки сохраняет справедливость.
Остается верным и другой тезис о множественности гене-
тических нарушений. Действительно, интеграция вирусных он-
когенов в клеточную хромосому вовсе не означает, что клетка
немедленно превратится в опухолевую. Нередко вначале прохо-
дит довольно продолжительный (до нескольких лет) латентный
период. Более того, подчас перерождению подвергается даже не
та клетка, которая была инфицирована, а одна из клеток сле-
дующих поколений.
Все это и говорит о том, что одного лишь внедрения вирусных
онкогенов в хромосомы хозяина недостаточно для трансформа-
ции клетки. Требуется еще серия каких-то (видимо, случайных,
но достаточно определенных) изменений клеточного генома.
3 . Третья группа генов, которые могут иметь отношение к
онкогенезу, — протоонкогены Так называются вполне нор-
мальные гены клетки (мало того, необходимые ей для обеспече-
ния ряда ключевых процессов), которые, однако, становятся
крайне опасными при неконтролируемой экспрессии или мо-
дификации функций.
Таким образом, изменение структуры самих этих генов или
каких-то других генов, контролирующих их активность, пре-
вращает протоонкогены в настоящие клеточные онкогены.
Иногда этому превращению могут способствовать и вирусные
онкогены.
4 . Наконец, четвертая группа генов, показанных на
рис. 6.26, — т.н. опухолевые супрессоры. Здесь ситуация об
ратная: потенциально опасно (в плане онкогенеза) не бескон-
трольное усиление функции такого гена, а наоборот — выклю-
чение функции. Что опять-таки происходит вследствие той или
иной генетической перестройки либо мутации.
Заметим: мутаторные гены (т. е. гены систем контроля за
состоянием ДНК и репарации ее повреждений) формально под
падают под определение опухолевых супрессоров. При их вы-
ключении риск трансформации клетки резко возрастает.
И все таки целесообразно выделять мутаторные гены среди
опухолевых супрессоров в силу их особой функциональной ро-
ли. Хотя, повторяем, это выделение подчас является достаточно
Условным.
Всего известно около 100 протоонкогенов и порядка 20 опу-
холевых супрессоров. Конкретные примеры тех и других будут
приведены несколько позже (в разделе 6.3.2). Но уже заранее
можно сказать, что практически все они — наши «старые знако-
506
Глава 6
мые». А именно, это гены белков, участвующих (в качестве
«приводных ремней» или сдерживающих факторов) в таких
процессах, как
репарация ДНК,
- клеточный цикл,
- апоптоз и
- дифференцировка клеток.
Потому-то, как мы отмечали во введении к данной главе (не
упоминая, правда, о репарации), все эти процессы завязаны с
онкогенезом в единый узел.
6.3.1.3. Способы изменения генома клетки
Итак, причиной онкогенеза являются такие изменения ге-
нома, которые затрагивают вышеперечисленные группы генов.
Какими же конкретно могут быть эти изменения? О вирус-
ных онкогенах мы уже говорили: для них, пожалуй, решающим
событием (на пути приобретения онкогенности) является
встраивание в клеточную хромосому.
Для клеточных же генов возможные способы трансформа-
ции суммированы на рис. 6.27.
а) Во первых, это точечные мутации, которые, как из-
вестно, могут представлять собой замену, делецию (выпадение)
или вставку одного нуклеотида.
Точечны
€
мутации
Амплифи
кация
ф агмеит
од дак
Тр ансп «шц
ии и
рвсомбинац
ии
фрагментов
Вирусные
онкогены
или их
продукты
Изменение
СМЫСЛА
Увеличение
ЧИСЛА
Хромосом
Hblfc
зралслока
Х04И
Образование
химерных
ЭлиминА- Изменений
ЦИЯ . СОСТОЯНИЯ
кодирумыих участков генов «ли
регуляторных отделов (энхансеров, и Т-Д)
Гис . 6.27. Пдодоссм. которые м гут • ости к.
активности герое и hmgыпоть .«ясогенез
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ .
507
В некоторых случаях достаточно единичной мутации; в
других — для принципиального изменения свойств гена необхо-
димы мутации в нескольких строго определенных его локусах.
Так, если говорить о превращении протоонкогена в онко
ген, то к нему может привести, например, такая мутация (или
серия мутаций), которая в белке-продукте затрагивает центр
связывания ингибитора (контролирующего функцию белка).
Тогда данный белок окажется «без тормозов» и будет постоянно
иметь высокую активность, бесконтрольно стимулируя соответ-
ствующий процесс.
А для выключения супрессорного гена бывает достаточно
практически любой мутации со сдвигом рамки считывания (т. е.
делеции или вставки) или даже простой замены, если она ведет
к образованию в середине гена бессмысленного триплета (мис-
сенс-мутация).
б) Другой способ трансформации — амплификация, или
умножение числа копий, определенных фрагментов ДНК. Ока-
залось, это достаточно распространенный способ образования
клеточных онкогенов.
Правда, не вполне ясно, какими конкретно ферментными
системами и как именно осуществляется амплификация.
Возможно, вначале какой-либо участок ДНК случайным
образом полностью вырезается из хромосомы, становясь, таким
образом, как бы вирусной ДНК. А затем начинает «жить по за-
конам» вирусных ДНК:
приобретает циклическую форму,
- многократно реплицируется независимо от прочего гено-
ма и, наконец,
- всеми своими копиями вновь встраивается в ту же или
иную хромосому.
К чему приводит амплификация гена? — Чаще всего, к значи
тельному увеличению его экспрессии (при условии достаточного со
держания в среде соответствующих транскрипционных факторов).
в-г) К еще более радикальным перестройкам генома отно-
сятся следующие два процесса, упомянутые на рис. 6.27:
внутрихромсомные транслокации фрагментов ДНК,
т. е. перемещение их в пределах одной хромосомы из ка-
кого-то участка в другой;
- межхромосомные транслокации, т. е. перенос фрагмен
тов ДНК (хромосом) из одной хромосомы в другую.
Сходные по характеру процессы происходят при созрева-
нии иммунных клеток — в ходе образования полных генов Ig
(п. 6,2.5.3) и при Сн-переключении (п. 6.2.5.6).
508
Глава 6
Поэтому неудивительно, что «незаконные» транслокации
относительно часто происходят именно в кроветворных клет-
ках. Причем почти столь же часто перенесенные таким образом
«посторонние» (в т. ч онкогенные) гены попадают под контроль
тех регуляторных элементов (например, энхансеров), которые
управляют генами иммуноглобулинов.
Очевидно, это просто
- ошибка «законной» транслокации — при формировании пол-
ных генов Ig (если речь идет о клетках лимфоидного ряда)
- или «незаконное» включение того же механизма трансло-
кации, да еще с допущением «ошибки» (если это клетки
миелоидного ряда).
«Ошибка» же, видимо, в обоих случаях состоит в том, что
вместе с генами фрагментов Ig захватываются и какие-то близ-
лежащие гены, которые затем оказываются рядом с формируе-
мыми полными генами Ig или даже в их составе.
Что получается в результате? — Вот некоторые варианты:
I) перенесенный ген сохраняет свою индивидуальность, но
утрачивает нормальные механизмы контроля — с широким
спектром последствий: от постоянной гиперэкспрессии до пол
него выключения;
II) образуется некий химерный ген с модифицированными
функциями.
д) Наконец, на рис. 6.27 предусмотрен и тот случай, при ко-
тором к изменению активности (или даже функций) клеточных
генов могут вести вирусные онкогены
- либо из-за встраивания в хромосому клетки с послед-
ствиями, аналогичными только что перечисленным;
- либо за счет действия своих продуктов (например, белков
с регуляторными свойствами).
Таковы в общих чертах механизмы модификации генома.
Естественно, они могут относиться к любым из 30 000 генов че-
ловека, но в плане онкогенеза, как мы уже знаем, важны изме-
нения лишь относительно небольшого числа генов.
Что же это за гены?
6 3.2. Конкретные гены, имеющие отношение к
онкогенезу
6 3.2.1 Примеры вирусного онкогенеза
Биология размножения вирусов, а с нею и потенциальная
онкогенность, во многом зависит от того, чем представлен их ге-
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
509
нбм. В связи с этим рассмотрим два примера — для ДНК-содер-
жащих и для РНК-содержащих вирусов.
1. Панова вирусы. Согласно табл. 6.4, в этих вирусах -
двухцепочечная кольцевая молекула ДНК.
Обычно папова-вирусы функционируют без интеграции
своей ДНК в хромосомы зараженной клетки. Поэтому в пода-
вляющем большинстве случаев имеет место продуктивная ин
фекция, т. е. просто образование новых вирусных частиц и раз-
рушение клетки. Клетки, подверженные такой инфекции, на-
зываются пермиссивными.
Но в очень редких случаях (примерно в 1 клетке из 10’) ге-
ному вируса либо только его онкогенам удается внедриться в од-
ну из хромосом клетки-хозяина (рис. 6.28).
Такими онкогенами в ДНК папова вируса являются t- и Т-
гены, которые при «обычной» (продуктивной) инфекции запу-
скают репликацию вирусной ДНК. После же интеграции этих
генов в клеточный геном их продукты, видимо, приобретают
способность бесконтролько стимулировать репликацию и кле-
точной ДНК.
Правда, эта способность зачастую проявляется не сразу, а,
как уже отмечалось в п. 6.3.1.2, после того или иного латентно-
го периода.
Рис, > . 2’. Онкогенное
действие
2. Ретровирусы. У этих же виру-
сов в качестве генома содержится (+)-
цепь РНК. И их жизненный цикл обя
зательно включает интеграцию виру-
сных генов в хромосому хозяина.
Здесь последовательно происхо-
дят следующие события (рис. 6.29):
I) обратная транскрипция (п.
2.8.1.1) — синтез (-)-цепи ДНК на ви-
русной (+)-РНК как на матрице;
II) разрушение вирусной РНК в со-
ставе образовавшегося гибрида РНК-
ДНК;
III) синтез (+) цепи ДНК на (-)-цепи с
образованием двухцепочечной кольце-
вой ДНК, которая проникает в ядро
клетки;
IV) встраивание этой ДНК в ту или
иную хромосому клетки;
V) транскрипция вирусных генов; при
этом среди образующихся (+)-цепей РНК
510
Глава 6
ОфАЖАЛЛ ЯуМР<|С>9>йМ |ЙА
4 ЦЙМРИОАТА»/)
(•) ДНК«ф
I Хромосома хозяина
Химерная хромосома
F=FF=f
Вирусные гемы
I ПД*Л4А* \
! м/влхзу нци* '
(’жнк^
(♦Д-НК.,,
М/МАСЛАЦЙЛ
Стимуляция
каскаде*
МАПК
вируса
Еир ; но* - -ЧХСГУШЛ
Обрх»ь2иие
комплекса _
Ц-D СЛ4
КАЦЙА
(Деление клетки)
Рис .6.26. Онкогенное
^еисгвие рНр-иирусов
- одни (после созревания) служат
как мРНК, т. е. обеспечивают син-
тез вирусных белков на рибосомах,
другие вместе с этими белками
формируют новые вирусные ча-
стицы.
Одновременно некоторые из
вирусных белков могут оказывать
онкогенное действие.
Так, в геноме вируса саркомы
Рауса имеется всего 4 гена, и среди
них — ген v src, почти идентичный
гену SRC человека. Продуктом то-
го и другого гена является нерецеп-
торная тирозинкиназа (белок Src),
участвующая в передаче сигнала от
мембранных интегринов клетки (о
связи с опорой) на каскады МАПК
(п. 6.1.3.3).
Однако вирусный белок, из-за,
казалось бы, незначительного от-
личия первичной структуры, не-
чувствителен к регуляторным воз-
действиям и все время находится в
активном состоянии. Отсюда — и
постоянная стимуляция каскадов
МАПК со всеми вытекающими от-
сюда последствиями.
Впрочем, и в этом случае для
опухолевого перерождения клет-
ки, очевидно, требуются также ка-
кие-то изменения ее собственных
генов.
Тем не менее, вероятность такого перерождения существен-
но выше, чем при инфицировании ДНК-содержащими вируса-
ми — поскольку гораздо чаще происходит интеграция вирусных
генов в клеточные хромосомы.
Сделаем важное замечание Давно уже известная анало-
гия между вирусным онкогеном vsrc и геном млекопитающих
SRC (или, по прежнему обозначению, с src) наводит на часто вы
сказываемую мысль о том, что вирусные онкогены. — это моди-
фицированные гены высших организмов когда то попавшие
в вирусный геном
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ. КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
511
Есть и другие подтверждения этой мысли — например, па-
ра генов v fos и c-fos (FOS). Здесь, как отмечалось в п. 2.9.2.2,
вирусный онкоген v-fos отличается от нормального гена с fos
лишь тем, что лишен в определенном участке последовательно-
сти АТ. Благодаря чему считываемая с него мРНК оказывается
гораздо более стабильной.
В то же время, с нашей точки зрения, указанную гипотезу
еще нельзя абсолютизировать и распространить на все вирусные
онкогены. Например, для генов Т- и t-белков папова-вирусов
(см. рис. 6.28) клеточный аналог пока не установлен. И вроде бы
нет каких-то очень убедительных оснований для того, чтобы не-
пременно предполагать существование таких аналогов.
6.3.2.2. Система регуляции, клеточного цикла как «по
ставщик > протоонкогенов и опухолевых супрессоров
Теперь обратимся к клеточным генам, с которыми может
быть связан онкогенез. В п. 6.3.1.2 мы обещали, что среди них
окажется много «старых знакомых» — в частности, генов, обеспе-
чивающих клеточный цикл, апоптоз, а также репарацию ДНК.
Соответственно этим трем процессам и рассмотрим приме-
ры онкогенов и опухолевых супрессоров.
Первая группа таких генов представлена в табл. 6.5,А-Б
Таблица 6.5. Некоторые протоонкогены и опухолевые супрессоры,
участвующие в регуляции клеточного цикла (по Б. П. Копнину)
А. Протоонкогеиы
Прото- онкоген Функция кодируемого им белка Изменения гена, ведущие к онкогенезу Ново- образования
ЭФРЯ (EGF Я ERBBI) Белок ЭФР-R — ре- цептор ЭФР (эпидер- мального фактора рос- та); обладает тирозин- киназной активно- стью (табл. 5.6; рис. 5.34; рис. 6 3,А). Амплификация и гиперэкспрессия гена Нейрогенные опухоли: глиобластома и др.
RAS (разли- чают гены К-, N-иН- RAS) Ras — адаптерный бе- лок, передающий сиг- нал от ростовых факте ров или от ПК С на ка- скады МАПК. В актив- ном состоянии связы- вает ГТФ, а разрушая его, инактивируется (раздел 5.3.6) Мутации в трёх ко- донах геиа. X Мутантная форма белка постоянно на ходится в активном состоянии (видимо, из-за утраты ГТФаз- ной активности) Указанные му- тации наблюда- ются а) в 70 % рака поджелудочной железы, б) а также в ряде других опухолей
512
Глава 6
Таблица 6.5,А. (Продолжение)
Прото- онкоген Функция кодируемого им белка Изменения геиа, ведущие к онкогенезу Ново- образования
SRC Белок SRC — нерецепторная ти рози нки наза; передаёт сигнал от ин тегринов (при прикре- плении клетки к опо- ре) на каскады МАПК (п. 6.1.3.3). Мутации в кодоне 531. Мутантная форма белка постоянно на- ходится в активном состоянии Некоторые опухоли толстого кишечника на поздиих стадиях
образовался аналогичный ген (v-src) вируса саркомы Рауса Саркома Рауса культивируется (путем пере- вивок) у животных
c-ABL Белок с-АЫ — тиро- зинкиназа с двойной функцией: оиа акти вирует а) не только белок р53 (в ходе апоптоза; рис. 6.17), б) но и компоненты МАЛК, стимулируя деления клетки Перемещение гена из хромосомы 9 в хромосому 22. Образуется т. н. фи ладельфи йская хромосома и в ней — химерный ген BCR-ABL, кото- рый постоянно сти мулирует пролифе- рацию клеток а) Все хронические миелолеикозы. б) Часть острых лимфолейкозов
Ген р- катени на (CTNNB) Р-Катенин — тран- скрипционный фак- тор, который при от- сутствии сигнала от кадгеринов (о межкле- точном контакте) уча ствует в активации ге- нов митоза (п. 6.1.3.4) Мутации, снижаю- щие сродство р-катенииа к к ад геринам. X Отсутствие контактного торможения. Наследственный аденоматозный полипоз толстой кишки, многие формы других опухолей
Гены се- мейств FOS (хромо- сома 2) и JUN Это т. н. гены раннего ответа при митоген- ной стимуляции,чьи продукты — тран- скрипционные факто- ры для генов позднего ответа (п. 6.1.3.1) Из-за делеции в гене FOS его мРНК оказывается очень стабильной (рис. 2.36) Связь с различными опухолями — на стадии изучения (Е.А. Коган)
Ген циклииа D1 (PRAD) Комплекс Циклин D Cdk4(6) инициирует события ©[-фазы ци- кла (путём инактива- ции ингибитора pRb) (рис. 6.2: рис. 6.7) Амплификация и (или) гиперэкспрессия гена Рак молочных и слюнных желёз
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ- КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ 513
Б Опухолевые супрессоры
Супрессор- ный ген Функция кодируемого им белка Новообразования
TbR II Белок ТФРр-R (TGFp-R) — рецептор трансформирующего фактора роста, который ингибирует деления многих клеток (рис. 6.4) Инактивация гена при раках толстой кишки (наследственных и спорадических)
SMAD2, SMAD3 Белки SMAD2 и SMAD3 (рис. 6.4): при действии ТФРр (ингибирующего деления) передают сигнал от мембранного рецептора на SMAD4 Раки толстой кишки, легкого, поджелудочной железы
SMAD4 Белок SMAD4 стимулирует синтез белков р15 и р21 — ингибиторов Cdks и их комплексов Юношеский полипоз желудка и кишечника; другие опухоли
АРС Белок АРС (анафазу обеспечивающий комплекс) — убиквитинлигаза, ускоряющая распад стимуляторов митоза — циклина В (п. 6.1.2.2, п. 6.1.4.3) и ^-катенина (рис. 6.6). Опухоли толстой кишки: наследственный аденоматоз и др.
INK4(pl6)/ ARP Благодаря варьированию рамки считывания, ген кодирует 2 белка: а) р16 - ингибитор комплекса Циклин D Cdk4 (6) (рис. 6.2) и б) ARF ингибитор распада белка р53 (рис. 6.16) Наследственные меланомы и многие спорадические (ненаследуемые) опухоли
Rb (в хромосоме 13) Белок pRb (рис. 6.7) — ингибитор транскрипционных факторов E2F и DP, запускающих Gj-фазу цикла При делеции в гене — наследственная ретинобластома (Rb) и многие спорадические Опухоли
NP1 Белок NF1 (нейрофибромин) член семейства GAP; переводит белок Ras (раздел 5.3.6) из активной формы в неактивную Нейрофиброма тоз (первого типа)
VHL Белок VHL подавляет экспрессию генов эндотелинов (табл 5.6), или факторов роста эндотелия которые (гены) активируются при гипоксии При инактивации гена VHL — множествен- ные наследственные гемангиомы, а также спорадические опухо ли почек (светлокле- точные карциномы)
Г/-36
514
Глава 6
А. Просмотрим вначале часть А табл. 6.5. Какие протоон-
когены. в данном списке? — Вот что они кодируют:
а) мембранные рецепторы к факторам роста — ЭФР-R,
б) адаптерные белки, передающие митогенный сигнал от
этих либо аналогичных рецепторов на каскады МАПК (мито-
генактивируемых протеинкиназ) - Ras, Src, c-Abl;
в) транскрипционные факторы, которые, влияя на актив-
ность соответствующих генов, увеличивают содержание либо ак-
тивность комплексов Циклин-Cdk, — Р катенин, Fos, Jun, Мус;
г) сам циклин D, образующий комплексы Огпериода, кото-
рые запускают множество событий этого периода (см. рис. 6.7),
а через них — и клеточный цикл в целом.
Как видно, это все такие компоненты регуляторных путей,
включающихся при действии митогенов, которые действуют е
положительном направлении, т. е. в сторону проведения сиг-
нала. Гены именно таких белков являются протоонкогенами. В
самом деле, неуправляемая гиперэкспрессия данных генов в
клетке способствует вовлечению последней в бесконечную се-
рию делений.
Установив общую функцию протоонкогенов данной груп-
пы, нетрудно увеличить их список. Для чего достаточно было бы
просмотреть табл. 5.6, а также схемы раздела 6.1, и выбрать в
них соответствующие вещества. Вот лишь некоторые примеры
подобного поиска: это гены, кодирующие
а) рецепторы других ростовых факторов тромбоцитарно-
го (ТцФР), инсулиноподобного (ИПФР, см. также рис. 6.17),
фактора роста фибробластов (ФРФ) и т. д.;
б) другие адаптерные белки, передающие сигнал от этих ре-
цепторов, — GRB, SOS, FAK, SHC (рис. 6.5), а также компонен-
ты каскадов МАПК — Raf РАК МЕК, МЕКК ERK, JNK (там же);
в) другие транскрипционные факторы, вовлеченные в рас-
сматриваемые пути, — Elk, Ets, ATF2, Tcf (п. 6.1.3.1), E2F DP
(см. рис. 6.7) и пр.;
г) другие белковые продукты замедленного ответа (помимо
циклина D) — Cdk4 и Cdc25a (см. рис. 6.3).
Вероятно, гены всех этих белков потенциальные клеточ-
ные онкогены.
И еще раз просмотрим табл. 6.5,А. Теперь обратим внима
ние на то, каким образом протоонкогены превращаются в онко-
гены. Нетрудно видеть, что это те самые способы, которые были
суммированы на рис. 6.27: мутации амплификация и тран
слокации генов Причем транслокации происходят лишь в кро-
ветворных клетках, приводя к лейкозу.
515
Глава 6
Заметим: в некоторых случаях причиной превращения про-
тоонкогена в онкоген указана гиперэкспрессия гена (порой даже
без предшествующей амплификации). Очевидно, это означает,
что изменился какой-то другой ген (еще один протоонкоген)
отвечающий за активность данного гена.
Наконец, сделаем замечание по поводу последней ко-
лонки табл. 6.5,А. Параллель между тем или иным онкоге-
ном и определенным типом опухоли вовсе не означает, что
появление данного онкогена — единственная причина этой
опухоли.
Как мы уже не раз подчеркивали, практически всегда из-
менены и какие-то другие гены. Так что указанное изменение
одного гена вовсе не является полным генетическим «пор
третом» соответствующей опухоли. Хотя не исключено,
что в каких-то случаях выявленный онкоген играет решаю-
щую роль в том, что перерождение клетки пошло именно по
данному, а не иному пути.
Б. Теперь кратко обсудим часть Б табл. 6.5. Ее просмотр
приводит к очевидному заключению: опухолевыми супрессора
ми являются такие гены, чьи белковые продукты противо-
действуют митогенным сигналам. Действительно, супрес-
сорные гены данной группы кодируют
а) рецепторы антимитогенных факторов — ТФРр-R.
б) адаптерные белки, передающие сигнал от этих факто-
ров, SMAD2 и SMAD3;
в) эффекторы соответствующих генов:
— активатор антимитогенных генов SMAD4,
- ингибитор митогенного гена VHL;
г) ингибиторы компонентов митогенных путей:
адаптерного белка Ras — NF1,
комплекса Циклин D Cdk4 — р16 (один из двух продук-
тов гена INK4/ARF),
— транскрипционных факторов — белок pRb;
д) стимулятор распада компонентов митогенных пу
тей АРС.
Абсолютно во всех этих случаях четко просматривается ан
тимитогенная направленность действия указанных веществ.
И вновь, используя раздел 6.1, можно увеличить список
опухолевых супрессоров — включая в него гены и других белков
с аналогичным действием. Но на сей раз предоставим это еде
лать самому читателю.
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ АПОПТОЗ...
516
6.3.2.3. Апоптоз: связанные с ним протоонкогены и
опухолевые супрессоры
Перейдем к очередной группе генов, имеющих отношение к он-
когенезу. Эго гены, связанные с апоптозом (табл. 6.6,А Б).
Здесь закономерность тоже очень простая:
— гены, препятствующие развитию апоптоза, являют-
ся протоонкогенами,
— гены, способствующие апоптозу, — опухолевыми су
прессорами.
Как видно, по сравнению с генами, регулирующими кле-
точный цикл, ситуация прямо противоположная (там гены,
«продвигающие» цикл и деление, оказываются супрессорами, а
препятствующие этому — протоонкогенами). Но, впрочем, это
отличие вполне естественно.
Таблица 6 6. Некоторые протоонкогены и опухолевые супрессоры,
участвующие в апоптозе (по Б П Копнину)
А. Протоонкогены
Прото- онкоген Функция кодируемого им белка Изменения гена, ведущие к онкогенезу Новообразо- вания
BCL2 Белок Вс12: закрывая каналы митохонд- рий, препятствует развитию апоптоза (п. 6.2.3.1) Перемещение гена BCL2 из одной хромосому в другую — под контроль регуляторных элемен- тов иммуноглобулинов Фолликуляр- ная лимфома (ср. с протоон- когеном МУС; табл. 6.5,А)
MDM2 Белок Mdm2: выклю- чает фактор р53 («диспетчер» апопто- за) — снижает его ак- тивность и ускоряет распад (рис. 6.16) Амплификация и (или) гиперэкспрессия гена Некоторые ос- теосаркомы и саркомы мяг ких тканей
Б. Опухолевые супрессоры (в указанных опухолях — неактивны)
Ген супр. Функция кодируемого им белка Новообразования
Е Кадгерин С помощью кадгеринов устанавли- ваются межклеточные контакты (п. 4.3.1.5). В тканях, где таких контактов быть не должно, сигнал от кадгерина останавливает деле- ния (п. 6.1.3.4) и инициирует апоптоз (п. 6.2.3.3) Наследственные раки желудка; многие спорадические опухоли
р53 Белок р53 — транскрипционный фактор, участвующий в развитии многих видов апоптоза (пп. 2.4 2.3, 6.2.3.3) а) Большинство спора- дических опухолей б) Наследственный синдром Ли Фраумени
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ...
517
Таблица 6.6, Б. Опухолевые супрессоры (Продолжение)
Ген супр. Функция кодируемого им белка Новообразования
WT1 (в хромо- соме 11) >к WTI — траг ный фактор: связывается с бел- ком р53 и усиливает его эффекты При делении в гене — опухоль Вильмса (наслед- ственная нефробластома)
ВИСА (1.2) Продукты данных генов участву- ют в узнавании и (или) репара- ции повреждений ДНК, а при не- устранимости повреждений ак- тивируют белок р53 (п. 6.2.3.3) Наследственные опухоли молочной железы и яич- ников б) Ряд спорадических опухолей
PTEN / ММАС1 Белок PTEN — протеинфосфата- за с проапоптозным влиянием (п.6.2.3.1) а) Многие опухоли б) Наследственная бо- лезнь Коудена
PML (в хромо- соме 15) Белок PML а) участвует в индукции апоптоза (активируя ряд каспаз и белок Вах), б) тормозит клеточный цикл, в) стимулирует дифференциров- ку кроветворных клеток При транслокации в хро- мосому 17 образуется хи мерный ген PML RARa‘, продукт которого ингиби рует нормальный белок PML. Это наблюдается при некоторых гемобластозах
Действительно, почему проапоптотические гены являются
опухолевыми супрессорами? — Потому, что обеспечивают раз-
витие апоптоза («апоптоза изнутри») в потенциально опухоле-
вых клетках, а именно в клетках с поврежденными (измененны-
ми) генами. И, соответственно, при выключении функции этих
генов (опять-таки в результате мутаций или генетической пере-
стройки) вероятность опухолевой трансформации клетки резко
возрастает. Например, в том случае, если протоонкоген первой
группы (относящийся к генам, контролирующим деления) пре-
вратится в онкоген.
Если же гены препятствуют развитию апоптоза, то при их
неконтролируемой гиперфункции клетки с измененным геномом
не будут элиминироваться. Опять получится тот же результат, что
и выше (повышение вероятности опухолевой трансформации), но
теперь не при выключении, а, как сказано, при гиперфункции ге-
нов. Следовательно исходные гены являются протоонкогенами.
А. Итак, какие антиапоптозные гены мы видим среди про
тоонкогенов в табл. 6.6А? Здесь список невелик: продукты
данных генов.
либо закрывают митохондриальные каналы, через кото-
рые могли бы выйти проапоптозные факторы (протеаза
AIF и цитохром с), — это белок Вс1-2;
либо снижают активность и содержание фактора р53
белок Mdm2.
' Белок RAR а — рецептор ретиноевой кислоты.
518
Глава 6
Но данный список можно было бы увеличить. Вероятно, в
него должны входить гены и других ингибиторов апоптоза:
- прочих (помимо Bel 2) белков, закрывающих митохондри-
альные каналы, — Bcl-x, Al/Bfll и т. д. (см. рис. 6.14);
- ингибиторов каспаз - IAPs (п. 6.2.2.1);
- протеинкиназы PKB/Akt и транскрипционного фактора
NF кВ (см. рис. 6.15).
А каким образом указанные в табл. 6.6,А протоонкогены
превращаются в «полноценные» онкогены? — Опять мы видим
знакомые способы.
В первом случае — это межхромосомная транслокация ге-
на (BCL 2). Причем в новом месте он попадает под общий кон-
троль с генами 1g, а по существу, выходит из-под нормального
контроля. И естественно, что это происходит среди гемопоэтиче-
ских клеток и ведет к очередной форме лейкоза.
Во втором случае имеет место амплификация гена (MDM2).
Б. Список опухолевых супрессоров, а «по совместитель-
ству» — лроапоптозных генов, — заметно больше (табл. 6.6,Б).
Среди них гены, кодирующие следующие белки:
- мембранные рецепторы апоптогенных сигналов, иници-
ирующие «апоптоз по команде», — Е кадгерины;
белки, распознающие повреждения ДНК и при их не-
устранимости инициирующие «апоптоз изнутри», —
BRCA;
транскрипционные факторы генов апоптоза — белки р53
и WTI;
- белки, способствующие открытию митохондриальных
каналов и повышению активности каспаз, PTEN,
PML
И вновь по каждой из перечисленных позиций можно было
бы добавить, используя раздел 6.2, еще несколько «претенден-
тов» в опухолевые супрессоры.
Что касается способов «выключения» супрессорных генов,
то там, где эти способы известны, мы видим то же, что и преж-
де, — мутации (гена WTI) и транслокации (гена PML). Причем
транслокации происходят опять в кроветворных клетках.
6.3.2 4 Система репарации ДНК как источник
мутаторных генов
Наконец, последняя из рассматриваемых здесь групп ге-
нов — относительно небольшая. Это гены ферментов репарации
ДНК (табл. 6.7).
УЗЕЛ ПРОБЛЕМ-КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ, АПОПТОЗ
519
Таблица 6.7. Некоторые мутаторные гены (они же опухолевые су-
прессоры), участвующие в репарации ДНК (по Б П Копнину)
Гены- супрессоры Функция кодируемых ими белков Новообразования
Гены фер ментов эк сцизион ной репа- рации ДНК Удаление нз цепей ДНК тими- новых димеров (образуемых под действием УФ) — путём вырезания части цепи ДНК и восстановления её по интакт- ной цепи (п. 1.7.2.1) При наследственном дефек- те генов — пигментная ксе- родерма и высокая вероят- ность развития опухолей ко- жи в местах, подвергающих- ся солнечному облучению
MSH MLH, PMS (1.2) Продукты этих генов отвечают за исправление таких ошибок репликации, когда в ДНК обра- зуются неспа репные основания (раздел 1.6.3) При выключении генов — а) наследственные неполи- позные раки толстой киш- ки и (или) яичников; б) ряд других опухолей
Гены белков (типа BRCA), которые не только участвуют в репарации, но и (при ее безуспешности) активируют рбЗ, запуская апоптоз (табл. 6.6,Б)
Как отмечалось выше (в п. 6.3.1.2), данные гены являются
мутаторными. В том смысле, что при их «выключении» резко
увеличивается скорость накопления в геноме мутаций и других
изменений.
И там же было сказано, что мутаторные гены можно отне-
сти и к опухолевым супрессорам.
Наиболее известной патологией, связанной с этими гена-
ми, является дефект системы, удаляющей тиминовые диме-
ры. Он может проявляться в виде т. н. пигментной ксеродер-
мы (п. 1.7.2.1) — наследственной болезни, при котором кожа
больного чрезвычайно чувствительна к свету. Причиной этой
чувствительности, видимо, является беззащитность генома
кератиноцитов перед УФ-лучами. Что, помимо прочих по-
следствий, резко увеличивает вероятность опухолевого пере-
рождения данных клеток.
Кроме того, как мы знаем, в клетке имеются и другие систе-
мы репарации ДНК. И, соответственно, существуют также про
чие мутаторные гены — вместе с опасностью трансформации
клетки при ослаблении их функции.
Итак, мы назвали несколько десятков конкретных генов, с
изменением структуры которых может быть связано образе ва
ние всевозможных опухолей.
Это достаточно убедительно подтверждает тезисы о гене
тической природе онкогенеза, сформулированные в
п. 6.3.1.1.
520
Глава 6
Мало того, опухоли весьма многообразны. И мы видели так
же, что тип развивающейся опухоли во многом зависит от
природы пораженного гена. А еще точнее - от всей совокупно-
сти пораженных генов, ибо обычно онкогенез - следствие мно-
жественных генетических дефектов.
Выяснение этих фактов является, как мы уже говорили,
достижением последних двух-трех десятилетий. Много это
или мало? Близки ли мы к полному пониманию механизма
онкогенеза или все еще находимся на дальних подступах к
нему?
Не беремся ответить на эти вопросы. На них о ветить пока,
кажется, невозможно...
Тем не менее накоплены огромные знания о морфологии,
особенностях роста и клинической картины, а также о способах
лечения самых разнообразных опухолей. Но изложение этих во-
просов — прерогатива патоморфологов и клиницистов-онколо-
гов, которым, заканчивая данную книгу, мы уступаем место на
письменном столе у читателя.
Литература к главе 6
Андреева Л И., Иванова Л. И., Титова М. В. Петрова В. С. Биохи-
мические механизмы апоптоза. В кн.: Программированная клеточная
гибель. СПб.: Наука, 1996. С. 51 71.
Коган Е А. Межклеточные взаимодействия при опухолевом росте. В
кн.: Межклеточные взаимодействия. М : Медицина, 1995. С. 127-190.
Копнин Б. П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессо-
ров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза//Биохи
лил, 65, 2000. С. 5-33.
Кузнецов С. Л , Мушкамбаров Н. Н., Горячкина В Л. Руководство-
атлас по гистологии, цитологии и эмбриологии. М.: ММА им. И. М. Се-
ченова, компакт-диск, 1999.
Мушкамбаров Н. Н. Аналитическая биохимия. М.: Экспедитор,
1996. Т. 3. С. 801-1300.
Новиков В. С., Булавни Д В , Цыган В. Н Молекулярные механиз-
мы инициации клеточной гибели. В ки.: Программированная клеточ
ная гибель. СПб.: Наука, 1996. С. 30-50.
Новиков В. С., Ястребов Д. В., Бахтин М Ю Генная регуляция апо-
птоза. В кн.: Программированная клеточная гибель. СПб.: Наука, 1996.
С. 72-78.
Новожилова А П., Плужников Н Н. Новиков В С. Механизмы
клеточной смерти: проблемы и перспективы. В кн.: Программирован
ная клеточная гибель. СПб.: Наука, 1996, С. 9-29.
Чумаков П М. Функция гена р53: выбор между жизнью и
смертью//Биохимия, 2000, 65 С. 34 47.
Глава 6
Ярилии А. А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном
организме. Патологическая физиология и экспериментальная тера
пия. 1998, 2. С. 38 48.
Ladich Н., Baltimore D., Berg A et al. Molecular Cell Biology. Scien-
tific American Books, 1995.
СОДЕРЖАНИЕ
ПРЕДИСЛОВИЕ 3
Глава 1. ЯДРО: СИНТЕЗ ДНК И ТЕЛОМЕРАЗА 5
1.1 . Компоненты ядра
1.1.1. Ядерная оболочка и ядерный матрикс 5
1.1.2. Хромосомы 6
1.1.2.1. ДНК хромосом 6
1.1.2.2. Гистоны и организация ДНК в хромосомах 8
1.1.2.3. Метафазные хромосомы 10
1.1.2.4. Негистоновые белки хромосом 11
1.1.3. Ядрышко 11
1.2 Репликация основной части ДНК
1.2.1. Место репликации ДНК в клеточном цикле 13
1.2.1.1. Схемы митоза и мейоза 13
1.2.1.2. Митотический цикл 14
1.2.1.3. Типы клеток по способности к делению 15
1.2.1.4. Выход клеток из митотического цикла 16
1.2.2. Общая характеристика репликации ДНК 17
1.2.2.1. Основные принципы 17
1.2.2.2. Особенности механизма 18
1.2 3. Компоненты ферментного комплекса 21
1.2.3.1. Белки, подготавливающие родительскую
ДНК к репликации 21
1.2.3.2. Ферменты полимеризации 23
1.2.З.З. Ферменты, завершающие репликацию ДНК 27
1.3 . Репликация теломерных отделов ДНК
1.3.1. Основные представления 27
1.3.1.1. Суть проблемы концевой недорепликации 27
1.3.1.2. Буферные теломерные последовательности 29
1.3.1.3. Удлинение теломер с помощью теломеразы 30
1.3.1.4. Механизм ALT 31
1.3.2. Теломеры и теломераза 32
1.3.2.1. Структура теломер 32
1.3.2.2. Функции теломер
1.З.2.З. Механизм действия теломеразы 35
524
Содержание
1 3.2.4. О методах определения активности
теломеразы 36
1.З.2.5. Распространение теломеразы 38
1.4. Теломераза и старение 41
14 1. Эксперименты Карреля и Хейфлика 41
1.4.1.1. Исходные идеи Вейсмана 41
1.4.1.2. Опровержение, первого постулата
Вейсмана Каррелем 42
1.4.1.3. Опровержение Карреля Хейфликом 43
1 4 1.4. Дополнительные аргументы Хейфлика 45
1 4.2. Теломерная теория старения 47
1.4.2.1. Основные положения теории 47
1.4.2.2. Факты, подтверждающие теорию 48
1.4.2.З. Дополнительные предположения 50
1.4.2.4. Некоторые итоги 51
1 4.3. Критика теломерной теории старения 51
1.4.З.1. Тезис о том, что лимит Хейфлика
обусловлен укорочением теломер 52
1.4.3.2 Тезис о том, что старение in vivo
обусловлено эффектом Хеифлика 52
1.4.З.З. Тезис о том, что ведущая причина
старения in vivo — укорочение теломер 55
1.4.3.4. Тезис о том, что в линии половых клеток
старение отсутствует 57
1.5. Теломераза и онкогенез 60
15 1. Получение линий опухолевых клеток 61
1.5.1.1. Общие сведения 61
15.1.2. Иммортализация in vitro 61
1 5 2 Теломеры и теломераза в трансформированных
клетках 62
1.5.2 1. Исходные предположения 62
1.5.2.2. Клеточные линии: экспериментальные
факты 63
1.5.2.3. Первичные опухоли: экспериментальные
факты 65
1.6 Метилирование ДНК 65
1.6 1. Метилирование цитозина в ДНК эукариот 65
1.6.1.1. Общие сведения 65
Содержание $25
1.6.1.2. Динамика содержания 5-МЦ
параллель с теломерами 67
1.6.1.3. Возможные функции метилирования ДНК 68
1 6.2. Система рестрикции и модификации
у бактерий 72
1.6.2.1. Введение Т2.
1.6.2.2. Принцип функционирования системы 73
1.6.2.3. Действие ДНК метилаз и рестриктаз 74
1.6.3. Метилирование ДНК, связанное с репарацией
ошибок репликации 76
1 7. Репарация повреждений ДНК 78
1.7.1 Возможные повреждения ДНК 78
1.7.1.1. Повреждения оснований 79
1.7.1.2. Повреждения цепей ДНК 79
1.7.2. Некоторые примеры репарации ДНК 80
1.7.2.1. Удаление тиминовых димеров:
репарация с эксцизией участка цепи 80
1.7.2.2. Удаление остатков урацила и репарация
участков лишенных основания 82
Литература к главе 1 83
Глава 2. ЯДРО: ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ И
ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ 85
2.1. Введение 85
2.2. Организация генетического материала:
общие принципы
2 2 1 Функциональные отделы генома
2.2.1.1 Гены и их структура 87
2.2.1.2 Прочие отделы ДНК 88
2.2 2. Способ записи генетической информации 91
2.2.2.1. Функциональная роль цепей ДНК 91
2.2.2.2. Основные свойства генетического кода 92
2.2.2.3. Генетический код 93
2.3. Оперонная организация генетического
материала у бактерии 95
2.3.1. Регулируемые и конститутивные гены 95
2 3.1.1 Общая схема оперона 95
2.3.1.2. Конститутивные, гены и белки 9;
2.3.2. Примеры оперонов 98
526
Содержание
2.З.2.1. Лактозный оперон — пример
индуцибельных оперонов 98
2.3.2.2. Триптофановый оперон — пример
репрессибелъных оперонов 101
2.4. Организация генетического материала
у эукариот 103
2 4.1 Гены ряда белков и РНК 103
2.4.1.1. Гены гистонов 103
2.4.1.2. Гены рибосомных РНК 104
2.4.1.3. Гены гемоглобина 105
2 4.2. Транскрипционные факторы и репрессоры 107
2.4.2.1. Подразделение ДНК связывающих белков
по их структуре 108
2.4.2.2. Общие факторы транскрипции 112
2.4.2.3. Белок р53 как транскрипционный фактор 113
2 5 Структура РНК 117
2.5.1. Общий план строения РНК 117
2.5.2. Особенности строения мРНК 119
2 5.3. Особенности строения тРНК 121
2.5.З.1. Первичная, вторичная и третичная
структуры 121
2.5.3.2 Взаимодействия тРНК с лигандами 123
2.5.4. Рибосомальные рРНК и рибосомы 124
2 6. Синтез РНК (транскрипция ДНК) 125
2 6.1. Общая характеристика транскрипции 125
2.6.2. Механизм транскрипции 126
2.6.2.1. Инициация транскрипции 126
2.6.2.2. Элонгация транскрипции 128
2.6.2.3. Терминация транскрипции 128
2.6.2 .4. Конвейерный характер процесса 129
2.6.2.5. Ингибиторы транскрипции 130
2 6.3. Продукты транскрипции 130
2.7. Созревание (процессинг) РНК 132
2 7.1 Удаление «лишних» последовательностей 132
2 7.1 1 Общее описание 132
2.7.1.2. Механизм сплайсинга 133
2.7.2 Присоединение и модификация нуклеотидов 135
2 8. Прочие системы синтеза РНК 136
Содержание
527
2.8.1 Вирусы: РНК-синтетазная система 136
2.81.1. Способы репликации генома РНК
содержащих вирусов 136
2.8.1.2. (+) РНК содержащие вирусы, использующие
РНК-синтетазу 137
2.8.1.3. (-) РНК содержащие вирусы 139
2.8 .1.4. (±)-РНК содержащие вирусы 140
2.8.2. Полинуклеотидфосфорилаза 140
2.9 Распад мРНК 141
2 9.1 Разрушение мРНК бактерий с 5'-конца
эффект положения 141
2.9.2. Разрушение мРНК эукариот с З'-конца 143
2.9.2.1. Роль поли(А)-фрагмента 143
2.9.2.2. Роль АУ элементов 144
2.9.2.3. Влияние продуктов трансляции
на распад мРНК 145
2.9.2.4. Влияние лиганда белка на распад мРНК 147
Литература к главе 2 148
Глава 3. ЦИТОПЛАЗМА: ОБРАЗОВАНИЕ БЕЛКОВ -
ТРАНСЛЯЦИЯ, ФОЛДИНГ, МОДИФИКАЦИЯ 149
3.1 Введение 149
3.2. Трансляция мРНК 150
3 2 1. Подготовительные стадии. Центры рибосом 150
3.2.1.1. Связывание аминокислот с тРНК 150
3.2.1.2. Функциональные центры рибосом 151
3.2.1.3. Инициация трансляции 154
3.2.2. Элонгация и терминация трансляции 155
3.2.2.1. Стадии элонгации 156
3.2.2.2. Терминация трансляции 158
3.2.3. Полисомы 159
3.2,4. Особенности трансляции у прокариот и в
митохондриях 161
3.2.4.1. Прокариоты 161
3.2.4.2. Митохондрии 163
3 3. Ингибиторы трансляции 164
3.3.1. Ингибирование трансляции у бактерий 164
528
Содержание
3.3.2. Ингибирование трансляции у эукариот 165
3.3.2.1. Антибиотики 165
3.3.2.2. Дифтерийный токсин 166
3.3.2.3. Интерфероны 167
3.4. Фолдинг белков: общие представления 169
3 4 1. Строение белков 169
3.4.1.1. Первичная структура 169
3.4.1.2. Вторичная структура 170
3.4.1.3. Третичная структура 173
З.4.1.4. Четвертичная структура 176
3 4.2 Факторы, определяющие пространственную
структуру белка 176
3.4.2.1. Роль первичной структуры 176
3.4.2.2. Роль лигандов 179
3 4.3. Модели сворачивания белков 180
3.4.3.1. Модель промежуточных состояний 180
3.4.3.2. Сворачивание по принципу «все или ничего» 182
3.4.3.3. Феномен кооперативности 183
3.4.3.4. Отношение фолдинга к трансляции 185
3.5. Факторы фолдинга 185
3.5.1. Открытие факторов фолдинга 185
3.5.2. Ферменты фолдинга 187
3.5.2.1. Протеиндисульфидизомераза 187
3.5.2.2. Пептидилпролилизомераза 189
3.5.3. Шапероны 190
3.5.3.1. Функции шаперонов 190
3.5.3.2. Система DnaK/ DnaJ у бактерий 193
3.5.3.3. Система GroEL/GroES у бактерий 194
3.5.3.4. Роль шаперонов в формировании
бактериофагов 197
3.5 4 Прионы как антишапероны 199
3.6. Сортировка и модификация белков 201
3 6.1 Процессы в гранулярной ЭПС 201
3.6.1.1 Структура гранулярной ЭПС 201
3.6.1.2. Особенности трансляции 203
3.6.1.3. Модификация белков в ЭПС 205
3 6.2. Процессы в комплексе Гольджи 208
3.6.2.1 Структура и функции комплекса Гольджи 208
Содержание 529
3.6.2.2. Сортировка белков 209
3.6.3. Сортировка и транспорт белков митохондрий и ядер
212
3.6.4. Образование коротких пептидов 213
3.7. Распад белков 214
Литература к главе 3 216
Глава 4. БИОМЕМБРАНЫ; СТРУКТУРА И УЧАСТИЕ
В МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ 218
4.1. Структура биомембран 218
4.1.1. Общие представления 218
4.1.1.1. Принцип строения 218
4.1.1.2. Количественные характеристики 220
4.1.1.3. Основные свойства мембран 221
4.1.2. Мембранные липиды 222
4.1.2.1. Классы мембранных липидов 222
4.1.2.2. Влияние липидного состава на
свойства мембран 225
4.1.2.3. Различные способы «упаковки»
амфифильных липидов 227
4 1.3. Белки мембран 229
4.1.3.1. Функциональные виды мембранных белков 229
4.1.3.2. Некоторые белки плазмолеммы
эритроцитов 232
4.2. Перенос веществ через мембраны
4.2.1. Низкомолекулярные соединения:
три способа переноса 235
4.2.1.1. Простая диффузия 236
4.2.1.2. Облегченная диффузия 236
4.2.1.3. Активный транспорт 238
4.2.2. Конкретные системы переноса низкомолеку-
лярных веществ 241
4.2.2.1. Na ,К* насос 241
4.2.2.2. К -каналы 244
4.2.2.3. Na'-каналы 244
4.2.2.4. Катионные каналы и н холинорецепторы 247
530
Содержание
4.2.2.5. Системы транспорта ионов Са2' в поперечно-
полосатой мышечной ткани 250
4.2.2.6. Антибиотики как переносчики ионов 252
4 2.2.7. Транспорт глюкозы в почках 254
4.2.3. Перенос через мембраны частиц и высоко-
молекулярных соединений 255
4.2.3.1. Способы переноса 255
4.2.3.2. Экзоцитоз ацетилхолина 258
4 3 Адгезивная функция мембран 260
4.3 1 Семейства адгезивных мембранных белков 260
4.3 1.1. Введение 260
4.3.1.2. Интегрины 262
4.3.1.3. Селектины 263
4.3.1.4. Адгезивные иммуноглобулины 265
4 3.1.5. Кадгерины и «внесистемные»
адгезивные белки 267
4.3.2 Хоминг Т-лимфоцитов 268
4.3.2.1. Специфичность хоминга 268
4.3.2.2. Механизм миграции Т-клеток 268
4,3.3. Воспаление 271
4.3.3.1. Медиаторы воспаления 271
4.3.3.2. Что делают медиаторы воспаления 274
4 3.3.3. Миграция лейкоцитов: адгезивные
взаимодействия 276
4.3.4. Иммунные реакции 279
4.3.4.1. Антигены 279
4.3.4.2. Антигены ГКГ-I и клеточная
иммунная реакция 280
4.3 4.3. Антигены ГКГ-II и гуморальная иммунная
реакция 283
4.3.4.4. Адгезивные взаимодействия в гуморальной
иммунной реакции 287
4.3.4.5. Адгезивные взаимодействия в клеточной
иммунной реакции (идущей с участием
NK клеток) 291
4 3.5. Межклеточные контакты 292
4.З.5.1. Введение 292
4.3.5.2. Контакты простого, сцепляющего и
запирающего типов 294
Содержание
531
4.3.5.3. Контакты коммуникационного типа 298
Литература к главе 4 300
Глава 5. ПЕРЕДАЧА ВНЕШНЕГО
СИГНАЛА В КЛЕТКУ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ
МЕДИАТОРЫ 301
5.1 Введение 301
5 2. Межклеточные сигнальные вещества
5 2.1 Гормоны 303
5.2.1.1. Место образования и биологическое
действие 303
5.2.1.2. О принципе «одна клетка — один гормон» 314
5.2.1.3. О химической природе гормонов 315
5.2.1.4. Общая схема действия гидрофильных
гормонов 316
5.2.1.5. Общая схема действия гидрофобных
гормонов 318
5.2.2. Гистогормоны 320
5.2.2.1. Определение и классификация 320
5.2.2.2. Резюме 323
5.2.2.3. Некоторые интерлейкины и
факторы роста 323
5.2.3.1. Исходные сведения 327
5.2.3.2. Краткая сводка нейромедиаторов 328
5.2.3.3. Нейромодуляторы 334
5.2.4. Резюме: механизмы действия
сигнальных веществ 339
5.3. Внутриклеточные сигнальные пути
начинающиеся от мембранного рецептора 340
5.3.1. цАМФ-опосредованные пути 340
5.3.1.1. Компоненты подобных путей 340
5.3.1.2. Стимуляция адреналином распада
углеводов и жиров 344
5.3.1.3. Спазмолитическое действие
симпатомиметиков 347
5.3.1.4. Аденилатциклазная система
эпителия кишечника 349
532
Содержание
5.3.1.5. Рецепторы, связанные с G^-белками 351
5.3.2. цГМФ-опосредованные пути
(не зависимые от NO) 353
5.З.2.1. Общее описание 353
5.3.2.2. Примеры регуляторных путей 355
5.3.2.3. Гуанилатциклазная система в
фоторецепторных клетках сетчатки глаза 356
5.3.3. цГМФ- и NO-опосредованные пути 360
5.3.3.1. Введение 360
5.3.3.2. Образование NO и NO-синтаза 361
5.3.3.3. Изоформы NO-синтазы 363
5.3.3.4. Сосудорасширяющее действие NO 365
5.3.3.5. NO в нервной системе: введение 367
5.3.3.6. NO как внутриклеточный
мессенджер в мозгу 368
5.3.3.7. NO как нейромедиатор 369
5.3.3.8. NO в периферической нервной системе 373
5.3.3.9. Цитотоксическое действие NO 373
5.3.4. Пути, опосредованные липидами
(ДАГ, ИТФ) и ионами Са2' 377
5.З.4.1. Введение 377
5.3.4.2. Активация фосфолипазы С 378
5.3.4.3. Действие фосфолипазы С 378
5.3.4.4. Действие ИТФ и ДАГ 380
5.3.4.5. Стимуляция симпатомиметиками
сокращений миоцитов 381
5.3.4.6. а2 Адренорецепторы эндотелиоцитов и
расслабление миоцитов 383
5.3.4.7. Активация Т-хелперов 385
5.3.5. Пути, опосредованные другими липидами
(помимо ИТФ и ДАГ) 387
5.3.5.1. Эйкозаноиды: подразделение на классы 388
5.3.5.2. Биологическое действие эйкозаноидов 390
5.3.5.3. Сфингозин и его производные 391
5.3.5.4. Действие фактора некроза опухолей 393
5.3.5.5. Прочие липиды с регуляторными
свойствами 396
5.3.6. Пути, опосредованные белком Ras 397
5.3.6.1. Общие замечания 397
5.3.6.2. Действие эпидермального фактора роста 397
Содержание
533
5.3.7. Пути, не содержащие вторичного мессенджера 399
Литература к главе 5 402
Глава 6. УЗЕЛ ПРОБЛЕМ: КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ,
АПОПТОЗ И ОНКОГЕНЕЗ 404
6.1 Регуляция клеточного цикла 405
6.1 1. Введение 405
6.1.1.1. Периоды клеточного цикла 405
6.1.1.2. Фазы митоза 406
6.1.1.3. Методы изучения регуляции
клеточного цикла 409
6.1.2. Циклинзависимые киназы 412
6.1.2.1. Общее описание 412
6.1.2.2. Способы регуляции содержания и
активности Cdks 415
6.1.3. Сигнальные пути, идущие к циклинзависимым
киназам 417
6.1.3.1. Действие митогенов 418
6.1.3.2. Действие антимитогенов 420
6.1.З.З. Прикрепление клетки к внеклеточному
матриксу 421
6.1.3.4. Контактное торможение пролиферации 423
6.1.4. Механизм действия комплексов циклин-Cdk 427
6.1 4.1. Действие комплексов Gt периода Д27
6.1.4.2. Действие, комплексов S иС2-периодов 431
6.1.4.3. Профаза и метафаза митоза: действие
митотического комплекса (MPF) 432
6.1.4.4. Анафаза и телофаза митоза: действие
АРС и протеинфосфатаз 435
6.1.4.5. Некоторые замечания 438
6.1.5. Контроль клетки за прохождением
клеточного цикла 439
6.1.5.1. Объекты контроля и сверочные точки 439
6.1.5.2. Механизм остановки цикла или перехода к
апоптозу 441
6.2. Апоптоз 443
6.2.1. Общие представления 443
6.2.1.1. Введение 443
6.2.1 2. «Апоптоз изнутри»: пусковые факторы и
биологическая роль 445
534
Содержание
6.2.1.3. «Апоптоз по команде»: биологическая роль 447
6.2.1.4. «Апоптоз по команде»: пусковые факторы 451
6.2.1.5. Морфология апоптоза и некроза 453
6.2.2. Непосредственные «орудия» апоптоза 456
6.2.2.1. Цитоплазматические протеазы - каспазы 456
6.2.2.2. Эндонуклеазы 460
6.2.2.3. Прочие «орудия» апоптоза 463
6.2.3. Дополнительный «инструментарий» апоптоза 464
6.2.3.1. Митохондриальные факторы 464
6.2.3.2. Белок р53: саморегуляция содержания и
активности 469
6.2.3.3. Белок р53 как «диспетчер» апоптоза:
факторы,
изменяющие его содержание и активность 470
6.2.3.4. Белок р53 как «диспетчер» апоптоза:
вызываемые
им эффекты 473
6.2.4. Некоторые схемы апоптоза 475
6.2.4.1. Примерная схема «апоптоза изнутри» 475
6.2.4.2. Примерные схемы некоторых видов
«апоптоза по команде» 478
6.2.5. Роль апоптоза в созревании и
функционировании иммунной системы 482
6.2.5.1. Подверженность клеток апоптозу 482
6.2.5.2. Вводные сведения о дифференцировке
лимфоцитов 484
6.2.5.3. Антигеннезависимая дифференцировка:
ранние стадии 486
6.2.5.4. Антигеннезависимая дифференцировка:
селекция Т-клеток 491
6.2.5.5. Антигензависимая дифференцировка
В-лимфоцитов 494
6.2.5.6. С ^-переключение 498
6.3. Онкогенез 501
6.3.1. Генетическая природа онкогенеза 501
6.3.1.1. Вводные утверждения 501
6.3.1.2. Типы генов, отвечающих за онкогенез 503
6.3.1.3. Способы изменения генома клетки 506
6.3.2. Конкретные гены, имеющие отношение к
онкогенезу 508
Содержание
6.3.2.1. Примеры вирусного онкогенеза 508
6.3.2.2. Система регуляции клеточного цикла как
«поставщик» протоонкогенов и опухолевых
супрессоров 511
6.3.2.3. Апоптоз: связанные с ним протоонкогены и
опухолевые супрессоры 516
6.3.2.4. Система репарации ДНК как источник
мутаторных генов 518
Литература к главе 6 520