Автор: Мейхи Б.
Теги: вирусология микробиология генетика молекулярная биология
ISBN: 5-03-001371-7
Год: 1988
Текст
VIROLOGY
A PRACTICAL APPROACH
Edited by B. W. J. Mahy
The Animal Virus Research Institute, Pirbright,
Woking, Surrey GU24 ONF, UK
IRL Press
Oxford • Washington DC
579714
ВИРУСОЛОГИЯ
МЕТОДЫ
Под редакцией
Б. МЕЙХИ
Перевод с английского
канд. биол. наук Е. В. КУНИНА и
Р. Б. ТРОЯНОВСКОЙ
Москва «Мир» 1988
ББК 28.4
В52
УДК 578
Авторы: Баррет Т., Берд П., Клегг Дж., Гулд Э., Халл Р.,
Инглис С., Киллингтон Р., Мак-Кри М., Майнор И., Мор-
ган-Капнер И., Паттисон Дж., Пауэлл К., Прешиос Б.,
Прингл К., Рассел В., Тюрлер X., Вуннер В.
Вирусология. Методы: Пер. с англ./Под. ред. Б. Мей-
В52 хи. — М.: Мир, 1988. — 344 с., ил.
ISBN 5-03-001371-7
В книге авторов из Великобритании, Швейцарии и США приведены конкрет-
ные методики работы с большинством вирусов человека и животных. Каждый
раздел включает подробное описание способов культивирования вирусов опреде-
ленной группы, их концентрирования, очистки, определения инфекционного тит-
ра и других методов.
Для вирусологов, генетиков, молекулярных биологов, генных инженеров.
В
2003000000—528
041(01)—88
144—88, ч. 1
ББК 28.4
Редакция литературы по биологии
' к.влиотгдла
। .;<л. Н. !;. Лсбачваок?!' |
ISBN 5-03-001371-7 (русск.)
ISBN 0-904147-78-9 (англ.)
© 1985 IRL Press Limited
© перевод на русский язык, «Мир»,
1988
ОТ ПЕРЕВОДЧИКА
Эта книга — очередное руководство из серии Practical Appro-
ach, выпускаемой уже в течение нескольких лет издательством
IRL PRESS (до этого на русском языке вышли «Транскрипция
и трансляция. Методы». М: «Мир», 1987 и «Клонирование ДНК.
Методы». М: «Мир», 1988). Как следует из самого названия
серии, эти книги отличаются четко выраженным прагматическим
подходом к рассматриваемым проблемам: многие главы пред-
ставляют собой по существу подборку конкретных методик.
«Вирусология. Методы» состоит из И глав, 10 из которых по-
строены по «монографическому» принципу: в каждой описаны
методы, применяемые в работе с какой-либо отдельной группой
вирусов; последняя глава представляет собой краткий обзор
методов клинической вирусологии. Каждая глава написана
видным и, что самое важное, имеющим большой опыт практи-
ческой работы вирусологом; во многих случаях излагаются ме-
тоды, разработанные самим автором. В руководстве представ-
лены преимущественно «классические» вирусологические подхо-
ды: размножение вирусов в клеточных культурах, их концент-
рирование, очистка, определение инфекционности, антигенных
свойств и некоторые другие. Биохимические и молекулярно-
биологические методы, электрофоретический анализ белков и
нуклеиновых кислот, гибридизация ДНК и РНК, молекулярное
клонирование описаны лишь постольку, поскольку они успели
стать неотъемлемой частью стандартной работы вирусолога.
Возможно, в «эпоху рекомбинантной ДНК» классические мето-
ды, в том числе вирусологические, невольно отошли в тень.
Однако каждый, кому приходилось вести конкретную работу
в области вирусологии, знает, что ее успех, особенно если речь
идет об идентификации новых вирусов, во многом зависит
именно от квалифицированного применения этих методов. В по-
следние годы методическая литература по вирусологии в нашей
стране почти не издавалась; настоящая книга призвана в какой-
то мере (конечно, не полностью) ликвидировать этот пробел.
Несмотря на сравнительно небольшой объем, она содержит
главы, посвященные основным методам работы с важнейшими
группами РНК- и ДНК-содержащих вирусов животных и чело-
6
От переводчика
века, исключая ретровирусы, методы исследования которых
освещены в ряде вышедших в последние годы на Западе руко-
водств. Пожалуй, приходится сожалеть лишь об отсутствии
главы по поксвирусам (вирус осповакцины и другие), значение
которых в последние годы резко возросло в связи с их примене-
нием для разработки нового типа живых вакцин. Вирусы расте-
ний представлены намного более скупо, чем вирусы животных,
хотя в гл. 1, написанной крупным исследователем Р. Халлом,
приведен ряд полезных методов их изучения. Разумеется, главы
книги не равноценны. Некоторые из них, например посвящен-
ные пневмовирусам (гл. 5, К. Прингл) и вирусам, содержащим
двунитевую РНК (гл. 7, М. Мак-Кри), представляют собой до-
статочно обширные обзоры, включающие описание разнообраз-
ных методик. В то же время в других главах, в частности по
пикорнавирусам (гл. 2, П. Майнор) и по рабдовирусам (гл. 4,
В. Вуннер), рассмотрен лишь узкий круг методов, в основном
используемых в лаборатории автора. Нельзя не отметить, что
в книге встречаются некоторые неточности теоретического плана:
в частности, приводимая классификация вирусов не всегда со-
ответствует последним данным. Тем не менее можно надеяться,
что книга в целом окажет большую помощь практическим виру-
сологам, а также будет полезна студентам, специализирующимся
в области вирусологии. Для такой надежды тем более есть
основания, что в руководство специально включены в основном
такие методы, которыми можно пользоваться, располагая до-
статочно стандартным лабораторным оборудованием. В связи
с этим хотелось бы только обратить внимание на то, что из-за
стремления к максимальной точности в книге часто фигурируют
конкретные марки лабораторного оборудования, посуды и реак-
тивов. Поэтому во многих лабораториях нашей страны приво-
димые методики, вероятно, не удастся воспроизвести буквально.
Однако в большинстве случаев их вполне можно использовать,
применяя имеющиеся аналогичные приборы и материалы. Гла-
вы 1—7 переведены Е. В. Куниным, а главы 8—11 Р. Б. Троя-
новской.
Е. В. Кунин
ПРЕДИСЛОВИЕ К АНГЛИЙСКОМУ изданию
Долгое время вирусология оставалась особой, несколько
таинственной областью микробиологии, увлекательной для тех,
кто стремился понять природу вирусов, но совершенно недоступ-
ной большинству биологов. Необходимость изучения вирусов
обусловлена тем, что они вызывают широко распространенные
тяжелые заболевания растений, животных и человека. Хотя оспа
в настоящее время ликвидирована, многие вирусные инфекции,
например грипп, ящур, простой герпес или бешенство, можно
контролировать лишь частично. Кроме того, идентификация но-
вых вирусных заболеваний, таких, как лихорадка Ласса, афри-
канская чума свиней или синдром приобретенного иммунодефи-
цита (СПИД), требует проведения вирусологических исследо-
ваний в самые сжатые сроки. В то же время в результате
вклада, внесенного в становление молекулярной и клеточной
биологии, и сама вирусология поднялась на новый уровень раз-
вития. Вирусологи постоянно применяли технические достиже-
ния других наук, в первую очередь методы исследования био-
логических макромолекул, однако лишь недавно специалисты
в области молекулярной и клеточной биологии стали использо-
вать вирусы как удобную модель для изучения структуры и
функции клетки.
По-видимому, многие считают, что наибольший вклад виру-
сологии в развитие науки и человеческой цивилизации вообще —
это открытие обратной транскриптазы, использование которой
лежит в основе современной генной инженерии. Однако следует
иметь в виду, что большинство важнейших представлений совре-
менной молекулярной и клеточной биологии (например, об ин-
тронах, сплайсинге или онкогенах) сформировалось именно в ре-
зультате изучения структуры и функций вирусов. Несомненно,
фронт вирусологических исследований будет и дальше расши-
ряться, а число ученых, применяющих специфические методы
вирусологии, будет постоянно возрастать.
Настоящая книга охватывает оба аспекта вирусологии. В ней
приведены конкретные методики и практические рекомендации
для работы с большинством вирусов животных, которые в на-
стоящее время представляют интерес как возбудители инфек-
8
Предисловие к английскому изданию
ционных заболеваний или как модель для изучения функций
клетки. В пределах предоставленного нам объема не было воз-
можности подробно рассмотреть все группы вирусов, и на мне
лежит ответственность за подбор тем. В книге отсутствует глава
о ретровирусах, поскольку данная группа подробнейшим обра-
зом обсуждена в прекрасной двухтомной монографии, выпущен-
ной недавно в Колд-Спринг-Харборе.
Большинство глав книги посвящено не отдельному методу
(титрованию, радиоизотопному анализу или очистке), а тому
или иному семейству вирусов. При изучении определенной
группы вирусов часто применяются специфические методы, и,
хотя существуют, конечно, некоторые общие принципы, иссле-
дователю, работающему с конкретным вирусом (например, по-
лиомиелита), удобнее прочитать о стандартных методах в одной
главе. В случае необходимости невирусологу будут полезны
«А Dictionary of Virology» К. Е. К. Rowson, Т. A. L. Ress и
В. W. J. Mahy, вводящий в курс вирусологической номенклатуры
и принятого в этой области жаргона, и руководство по работе
с клетками животных и культурами тканей, выпущенное в дан-
ной серии0.
Мне доставляет удовольствие поблагодарить всех авторов
настоящей книги за упорную работу и постоянную готовность
к сотрудничеству, а также редакторов данной серии и персонал
издательства IRL, быстро выполнявший все мои просьбы и сде-
лавший редактирование этой книги приятным делом. Я глубоко
признателен Крис Смейл за советы по оформлению и моим сек-
ретарям, Мери Райт в Кембридже и Хейзел Уэст в Пирбрайте,
за долготерпение.
Б. В. Дж. Мейхи
ч См. Культура животных клеток. Методы: Пер. с англ./Под ред.
Р. Фрешни. —М.: Мир, 1989.
СПИСОК АВТОРОВ
Barrett Т. Division of Virology, Department of Pathology, University of
Cambridge, Laboratories Block, Addenbrooke’s Hospital, UK
Beard P. Institute of Experimental Cancer Research, Chemin des Boveresses,
Switzerland
Clegg J .C. S. Centre for Applied Microbiological Research, Salisbury, UK
Gould E. A. Arbovirus Unit, London School of Hygiene and Tropical Medi-
cine, Winches Farm Field Station, UK
Hull R. John Innes Institute, Colney Lane, UK
Inglis S. C. Division of Virology, Department of Pathology, University of
Cambridge, Laboratories Block, Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK
Killington R. A. Department of Microbiology, University of Leeds, UK
McCrae M. Department of Biological Sciences, University of Warwick,
Coventry
Minor P. D. National Institute of Biological Standards and Control, London
Morgan-Capner P. Department of Medical Microbiology, King’s College
Hospital Medical School, London
Pattison J. R. The Joint Department of Medical Microbiology and The
Middlesex Hospital Medical School, Facilty of Clinical Sciences, University
College London, London
Powell K. L. Department of Microbiology, University of Leeds, UK
Precious B. National Institute for Medical Research, London
Pringle C. R. Department of Biological Sciences, University of Warwick,
Coventry
Russell IF. C. National Institute for Medical Research, London
Tiirler H. Department of Molecular Biology, University of Geneva, Switzer-
land
Wunner W. H. The Wistar Institute of Anatomy and Biology, Philadelphia
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
БОЕ —бляшкообразующая единица
БСА — бычий сывороточный альбумин
ВВС — вирус везикулярного стоматита
ВПГ — вирус простого герпеса
ВПМ'—вирус пневмонии мышей
ГА — гемагглютинин
ГАЕ —гемагглютинирующая единица
ГЛ — гемолизин
ДДС-Na—додецилсульфат натрия
ДИЧ — дефектные интерферирующие частицы
ДМЕМ — минимальная среда Игла, модифицированная Дюль-
бекко
ДМСО — диметилсульфоксид
ДЭАЭ — диэтил аминоэтил
ДЭП —диэтилпирокарбонат
ЕИЭ51) —доза вируса, инфекционная для 50% куриных эмб-
рионов (от единица инфекционности для куриных
эмбрионов)
ИНС — индекс нейтрализации сыворотки
КМЦ — карбоксиметилцеллюлоза
ЛД5а— доза вируса, вызывающая гибель 50% зараженных
животных (от летальная доза)
МЕМ — минимальная среда Игла
мРНК — матричная РНК
,НА — нейраминидаза
НОЧ — неинфекционные оболочечные частицы
НП — нуклеопротеин
ОСК — оптимальная сенсибилизирующая концентрация
ПЭГ — полиэтиленгликоль
РСВ — респираторно-синцитиальный вирус
РСК — реакция связывания комплемента
РТГ — реакция торможения гемолиза
РТГА — реакция торможения гемагглютининации
СНТ — сыворотка новорожденных телят
ТД-буфер — буфер трис-Дюльбекко
трис — трис- (гидроксиметил) аминометан
ТС—-телячья сыворотка
ТФБ — триптозофосфатный бульон
уд — уранилацетат
ФИТЦ — флуоресцеинизотиоцианат
ФЭК — фибробласты эмбрионов кур
Список сокращений
11
ЦПД — цитопатическое действие
ЭГТА —этиленгликольбис(р-аминоэтил) тетраацетат
ЭДТА — этилендиаминтетраацетат
ЭТС — эмбриональная телячья сыворотка
BBS — боратный буферный раствор (от англ, borate buffe-
red saline)
BMV — вирус мамиллита крупного рогатого скота (от
англ, bovine mammilitis virus)
CCV — вирус кошачьего сомика (от англ, channel catfish
virus)
CMV — цитомегаловирус
DGV — глюкозо-желатиновый буфер с вероналом (от англ,
dextrose-gelatin veronal buffer)
EHV-1 — вирус герпеса лошадей типа 1
ELISA — твердофазный иммуноферментный анализ (от англ,
enzyme-linked immunosorbent assay)
Fetr — вирус ринотрахеита кошек
GNTE — буфер, содержащий 200 мМ глицин, 50 мМ трис-
НС1, 10 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА
НВЕ — буфер, содержащий 10 мМ HEPES, 5 мМ КС1,
1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотреитол
HEPES — М-2-гидроксиэтилпиперазин-М'-2-этансульфоновая
кислота (от англ. N-2-hydroxyethylpiperazine-Nz-2-
ethanesulfonic acid)
HVS — герпесвирус саймири
NP-40 — нонидет Р-40
NJE — буфер, содержащий 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-НС1,
pH 7,5, 1 мМ ЭДТА
PBS — фосфатный буферный раствор (от англ, phosphate
buffered saline)
PBSA — фосфатный буферный раствор Дюльбекко А
PMSF — фенилметилсульфонилфторид (от англ, phenylme-
thylsulphonyl fluoride)
PRV — вирус псевдобешенства
RIA — радиоиммунологический анализ (от англ, radioim-
munoassay)
RIP — радиоиммунопреципитация (от англ, radioimmuno-
precipitation)
SSC — стандартный солевой раствор (0,15 М. NaCl, 0,015 М
цитрат натрия, pH 7,0)
TCID50 — доза вируса, инфекционная для 50% клеток (от
англ, tissue culture infectious dose)
ТЕ — буфер, содержащий 10 мМ трис-НС1, pH 7,4, 0,1 мМ
ЭДТА
VBS —буферный раствор с вероналом (от англ, veronal
buffered saline)
ГЛАВА 1
ОЧИСТКА, БИОФИЗИЧЕСКАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ
(ПРЕИМУЩЕСТВЕННО ВИРУСОВ РАСТЕНИИ]
Р. Халл
1. Введение
Для характеристики вирусов в первую очередь важны их
биохимические и биофизические свойства. Чтобы исследовать
эти свойства, вирусы необходимо очистить. Разные вирусы тре-
буют специфических методов очистки, и привести их все в дан-
ной главе не представляется возможным. Описание методов
очистки вирусов животных читатель найдет в других главах
книги. Здесь же я рассматриваю принципы, на которых осно-
вана разработка методов очистки вирусов растений, и привожу
отдельные примеры. После очистки методология исследования
биофизических и биохимических свойств одинакова для боль-
шинства, если не для всех, вирусов животных, растений и бак-
терий. В этой главе рассмотрены методы изучения только про-
стейших вирусов, состоящих из белковой оболочки и геномной
нуклеиновой кислоты.
2. Очистка вирусов растений
Методики очистки многих вирусов приведены в «Описаниях
вирусов растений», выпускаемых CMI/AAB [1], и в книге [2].
Хотя универсального метода и не существует, изложение основ-
ных принципов и фактов может оказаться полезным при разра-
ботке способов очистки вирусов.
2.1. Растения-хозяева
В идеале для наращивания вируса следует использовать рас-
тение, в котором вирус дает системную инфекцию (системный
хозяин), а для определения инфекционности на разных стадиях
очистки — растение, на котором образуются локальные пораже-
ния. При выборе системного хозяина необходимо принимать во
внимание выход вируса, легкость его экстракции (в частности,
является ли растение «мягким» в агротехническом понимании,
не содержит ли оно веществ, затрудняющих выделение вируса,
например больших количеств полифенолоксидазы), легкость
культивирования растения и возможность контаминации дру-
гими вирусами. Растение, на котором образуются локальные
Характеристика вирусов
13
поражения, следует использовать для определения периода мак-
симального накопления вируса в основном хозяине и для конт-
роля количества вируса на разных стадиях очистки.
В большинстве случаев, однако, невозможно выполнить мно-
гие из этих требований. Часто не удается найти подходящее
растение, на котором образуются локальные поражения. В этих
случаях для контроля количества вируса можно использовать
метод дот-блот гибридизации (см. разд. 3.8).
2.2. Экстракция вирусов из растений
Чтобы экстрагировать вирусные частицы из растения, необ-
ходимо разрушить клеточные стенки и высвободить содержимое
клеток. Обычно экстракцию проводят в буферном растворе (для
поддержания постоянного значения pH) и в присутствии соеди-
нений, предотвращающих повреждение вирусных частиц высво-
бождающимися ферментами. Кроме того, действие ферментов
замедляется, если экстракцию проводят на холоду. Если отсут-
ствуют специальные указания, все стадии очистки следует про-
водить при 0—5 °C.
Наиболее распространенное приспособление для разрушения
растительных клеток —это гомогенизатор с вращающимися но-
жами, которые приводятся в движение сверху или снизу. В про-
даже имеются различные типы гомогенизаторов, и выбор кон-
кретной модели должен определяться эффективностью разру-
шения растительных тканей, которая зависит от скорости
вращения ножей, размера лезвий, угла между ними и формы
сосуда. Эффективность разрушения растительных клеток можно
повысить путем их предварительного замораживания, хотя в не-
которых случаях это приводит к снижению выхода вируса.
Использование гомогенизаторов неудобно, если ткани расте-
ния-хозяина очень богаты волокнами (эту особенность следует
учитывать и при выборе системного хозяина) или частицы вы-
деляемого вируса длинные и гибкие; в последнем случае при
гомогенизации они (например, частицы клостеровирусов) могут
разрушаться {3]. Этих трудностей легко избежать, используя
соковыжималку или ступку с пестиком. При очистке вирусов,
размножающихся только в сосудистых тканях, например лютео-
вирусов, обнаруживаемых во флоэме, ткань листьев необходимо
сначала разрушить целлюлазами и пектиназами [4].
Выбор экстрагирующего буферного раствора может оказать
решающее влияние на эффективность очистки вируса. Вирусы
с удлиненными частицами (например, потивирусы), склонные
к агрегации или к адсорбции на клеточном дебрисе, лучше всего
экстрагировать щелочными буферами (pH 8—9) с умеренной
ионной силой (например, 0,1 М); однако частицы некоторых
14 Глава 1
палочковидных вирусов [например, вируса табачной мозаики
(ВТМ)] в щелочной среде повреждаются. Для экстракции мно-
гих изометрических вирусов удобны кислые буферные растворы
с pH около 5 (например, 0,1 М ацетат натрия, доведенный до
pH 4,8 уксусной кислотой); дополнительное преимущество по-
добных растворов — осаждение многих клеточных белков при
кислой реакции среды. Некоторые изометрические вирусы, на-
пример вирус мозаики огурцов и вирус кольцевой пятнистости
табака, при pH около 5 выпадают в осадок, и поэтому для их
выделения следует использовать растворы с pH, близким к ней-
тральному. С другой стороны, некоторые вирусы, например
бромовирусы, при pH 7 набухают, и РНК становится доступной
для нуклеаз; в этом случае лучше использовать кислые растворы.
Наиболее распространенные дополнительные компоненты ис-
пользуемых растворов — это восстановители, препятствующие
действию полифенолоксидаз, «задубляющих» вирусный капсид-
ный белок. Обычно в качестве восстановителей используют
10 мМ аскорбиновую кислоту (в этом случае повторно доводят
pH раствора), 20 мМ аскорбат натрия, 0,5%-ный 2-меркапто-
этанол, 20—40 мМ сульфит натрия, 10 мМ тиогликолат натрия
или 10—20 мМ диэтилдитиокарбамат натрия; для растений с
высокой «дубильной» активностью можно использовать коже-
венную пудру [5]. Для подавления активности ферментов и дис-
социации рибосом используют также хелатирующие агенты,
чаще всего натриевую соль этилеидиаминтетрауксусной кислоты
(ЭДТА) в концентрации 5—50 мМ. Следует, однако, принимать
во внимание возможность стабилизации вирусных частиц (на-
пример, собемовирусов) двухвалентными катионами. Частицы
некоторых вирусов (например, каулимовирусов) содержатся
в белковых включениях, откуда их выделяют путем обработки
2,5—5%-ным тритоном Х-100 в присутствии 1—2 М мочевины
в течение ночи.
2.3. Осветление экстрактов
Для очистки вирусных частиц их следует отделить от других
компонентов цитоплазмы. В число последних входят органеллы,
мембраны, рибосомы и белки, в первую очередь рибулозобис-
фосфаткарбоксилаза (РБФК) и фитоферритин. В табл. 1.1 при-
ведены способы обработки, позволяющие эффективно удалять
различные контаминанты. При разработке новой методики очи-
стки какого-либо вируса анализируется возможность применения
каждого способа грубой очистки путем определения вируса ме-
тодом локальных поражений или дот-блот гибридизации (см.
разд. 3.8). Для удаления выпавших в осадок контаминантов
Характеристика вирусов
15
Таблица 1.1. Удаление основных контаминантов
при очистке вирусов растений
Контаминант Способ обработки1)
Рибосомы РБФК Фитоферритин Мембраны и органеллы 10 мМ Na2 ЭДТА, 0,5М NaCl, 8%-ный бутанол, хлороформ, нагревание, бентонит 8%-ный бутанол, бутанол/хлороформ, pH 4,9, на- гревание, бентонит 10 мМ Na2 ЭДТА, pH 4,9, 8%-иый бутанол, бу- танол/хлороформ, нагревание, бентонит Органические растворители, неионные детергенты
1) Эти способы обработки являются взаимоисключающими. ЭДТА или NaCl добав-
ляют к экстрактам для разрушения рибосом или фитоферритина, чтобы последние не
соосаждались с вирусом.
8%-ный бутанол добавляют к экстрактам по каплям при постоянном перемешивании
я денатурированные компоненты удаляют низкоскоростным центрифугированием.
Органические растворители2), хлороформ, смесь хлороформ/бутаиол (1:1), ацетон
эфир или фреон; тот или иной растворитель смешивают в равных объемах с экстрактом,
центрифугируют и отбирают водную фазу.
Неионные детергенты. К экстракту добавляют нонидет Р-40 или тритон Х-100 до
концентрации 1—5%.
Нагревание. Экстракты прогревают 10 мин при 50—60 °C и удаляют денатурирован-
ные белки низкоскоростным центрифугированием.
Бентонит. Используют магниевую соль бентонита, как описано в работе [61.
2) Замечание по технике безопасности: эти растворители очень летучи и воспламеня-
ются при относительно низкой температуре, кроме того, могут обладать канцерогенным
действием.
или разделения фаз при экстракции органическими растворите-
лями обычно применяют низкоскоростное центрифугирование
при 10 000 g в течение 10 мин.
2.4. Концентрирование вирусов
Концентрирование обычно осуществляют с помощью поли-
этиленгликоля (ПЭГ) или путем высокоскоростного центрифу-
гирования. Типичные условия осаждения ПЭГ следующие: для
палочковидных вирусов используют 2,5% (вес на объем) ПЭГ
и 0,1 М NaCl, а для изометрических вирусов— 10% (вес на объ-
ем) ПЭГ в присутствии 0,1 М NaCl; для эффективного осажде-
ния необходимо поддерживать достаточно высокую концентра-
цию соли. Обычно ПЭГ и соль добавляют к раствору, содер-
жащему вирус, растворяют их в течение часа при постоянном
перемешивании и затем собирают осадок вируса центрифугиро-
ванием при 10 000 g в течение 10 мин. Высокоскоростное цент-
рифугирование большинства типичных изометрических вирусов
(80—130 S) проводят при 70000 g в течение 3 ч, а большин-
ства палочковидных вирусов (130—180 S)—при 50000 g в те-
чение 2 ч.
16
Глава 1
2.5. Дальнейшая очистка
Осветленный и концентрированный вирус еще недостаточно
чист для большинства биохимических и биофизических исследо-
ваний. Дополнительной очистки достигают зональным (скорост-
ным) или равновесным (изопикническим) центрифугированием.
Теоретические и практические аспекты центрифугирования де-
тально изложены в другом руководстве [7]. Для вирусов расте-
ний можно использовать следующие методы дополнительной
очистки.
2.5.1. Зональное (скоростное) центрифугирование
Обычно применяют градиенты концентрации сахарозы, рас-
творенной в буфере, который использовался для очистки вируса.
Не следует использовать для приготовления сахарозных гради-
ентов боратные буферы. При очистке большинства простых
(т. е. состоящих только из белковой оболочки и нуклеиновой
кислоты) вирусов применяют 10—40%-ные сахарозные градиен-
ты. Их можно приготовить одним из следующих способов:
1. С помощью устройства для приготовления градиентов,
в котором соответствующим образом смешиваются исходные
10%-ный и 40%-ный растворы сахарозы.
2. Путем наслаивания друг на друга 10, 20, 30 и 40%-ного
растворов сахарозы в количествах, приведенных в табл. 1.2,
с последующей диффузией при 4 °C в течение ночи.
3. Путем замораживания 25%-ного раствора сахарозы в цент-
рифужных пробирках и медленного оттаивания. Раствор, содер-
жащий вирус, осторожно наслаивают на поверхность градиента.
В большие пробирки (например, от ротора SW27 фирмы Beck-
man) не следует вносить больше 5 мг вируса, а в маленькие
пробирки (например, от ротора SW50) — больше 1 мг. Центри-
фугирование проводят в роторах со свободно подвешенными
стаканами (бакет-роторах); рекомендуемые режимы центрифу-
гирования (время и скорость вращения) указаны в табл. 1.2.
Зоны вируса можно увидеть при освещении сверху и отобрать
через верх пробирки шприцем с иглой, изогнутой под прямым
углом недалеко от конца, прокалывая пробирку сбоку (вытека-
ние раствора предотвращают с помощью вазелина или клейкой
ленты) или фракционированием через дно пробирки. В послед-
нем случае для контроля скорости вытекания раствора рекомен-
дуется простое приспособление, показанное на рис. 1.1. Возмож-
но использование и более сложных приспособлений, например
прибора для фракционирования градиентов фирмы Isco, в ко-
тором раствор вытесняется снизу вверх и проходит через спект-
рофотометрическую кювету для регистрации оптической плот-
Характеристика вирусов
17
Таблица 1.2. Зональное центрифугирование
в градиентах концентрации сахарозы
А. Для получения близких к линейным градиентов методом диффузии при-
веденные объемы растворов сахарозы наслаивают один на другой и оставля-
ют на ночь при 4 °C для диффузии.
Размер пробирки, дюймы Ротор Объем раствора сахарозы1), мл
40% 30% 20% ю%
3X1 SW25 7 7 7 4
3,5X1 SW27 8 8 8 6
3,5x9/16 SW41 3 3 3 2
2X0,5 SW50.1 1 1 1 1
Б. Примерное время центрифугирования разных вирусов в градиентах кон-
центрации сахарозы2>
Ротор Скорость враще- ния, об/мин Время центрифугирования разных вирусов3), ч
вмк ВЮМБ ВТМ
SW27 24 000 4,0 3,0 2,5
SW41 36 000 2,5 2,0 1,5
SW50.1 45 000 1,5 1,25 1,0
’) Вес на объем.
2) Приведены данные для 10—40%-ных градиентов концентрации сахарозы, приго-
товленных иа 0,1 М солевом буфере, центрифугирование проводят прн 4 °C.
3) ВМК —вирус мозаики костра, S20w=87; ВЮМБ — вирус южной мозаики бобов,
S20W=115; ВТМ-вирус табачной мозаики. S20W=194.
ности. Простейшее правило, которым следует пользоваться при
извлечении зоны вируса из градиента, состоит в том, что вирус
не должен проходить через те участки пробирки, в которых
концентрируются примеси, т. е. если, например, РБФК находится
выше зоны вируса, не следует вытеснять градиент снизу вверх
или отбирать зону вируса шприцем через верх пробирки. Саха-
розу можно удалить диализом против подходящего буферного
раствора или осаждением вируса ПЭГ.
2.5.2. Изопикническое центрифугирование
Изопикническое центрифугирование для очистки вирусов рас-
тений проводят обычно в растворах хлористого или сернокислого
цезия (CsCl или CS2SO4). Частицы некоторых вирусов, например
мозаики огурцов или мозаики люцерны, разрушаются CsCl, но
стабильны в растворах CS2SO4. Частицы других вирусов, напри-
мер бромовирусов, нестабильны в растворах CsCl при pH вы-
S 7 4 7 1 L
НАУЧИЛИ
2—369
18
Глава 1
ше 7; поэтому их следует центрифугировать при pH 5. По воз-
можности лучше использовать CsCl, так как ион С1~ обладает
хаотропными свойствами и способствует удалению клеточных
белков и других контаминантов.
Рекомендуемые исходные плотности растворов CsCl и CS2SO4
для центрифугирования типичных вирусов в плотностных гра-
диентах приведены в табл. 1.3. Вирус суспендируют в подходя-
щем буферном растворе, а затем добавляют CsCl или CS2SO4
в количестве, необходимом для получения нужной исходной
плотности; концентрация вируса не должна превышать 1 мг/мл.
Центрифужные пробирки с алюминиевыми крышками заполня-
Рис. 1.1. Простое приспособление для фракционирования градиентов. Приспо-
собление собирают, как показано на схеме; при этом следует убедиться в гер-
метичности всех соединений. Пробку, закрывающую пробирку с градиентом,
необходимо слегка смазать вазелиновым маслом. Дно пробирки перед прока-
лыванием также смазывают очень тонким слоем вазелинового масла, чтобы
обеспечить постоянный размер капель. Скорость поступления воздуха в про-
бирку определяется скоростью вращения перистальтического насоса; фрак-
ционирование градиента можно остановить, выключив насос
ют раствором CsCl или CS2SO4 только на три четверти, надевают
крышки на сухие верхние части пробирок и доливают пробирки
маслом. Алюминиевые крышки корродируют под влиянием солей
цезия, что может в конце концов привести к аварии при цент-
рифугировании. Изопикнические градиенты получают центрифу-
гированием в роторе SW40 (Beckman) при 36 000 об/мин или
SW50 при 40 000 об/мин в течение 18 ч. Лучший результат до-
стигается при центрифугировании в угловых роторах, а не в
бакет-роторах по причинам, изложенным в руководстве [7].
Зоны вируса обнаруживают при освещении пробирки сверху
и извлекают шприцем, проколов пробирку сбоку. Соли цезия
затем удаляют диализом.
Характеристика вирусов
19
Таблица 1.3. Изопикническое центрифугирование
в градиентах плотности
Примерные плавучие плотности,
г/см3
CsCl Cs2SO4
Белок
Вирусы, содержащие 5% РНК
Вирусы, содержащие 20% РНК
Вирусы, содержащие 35% РНК
Вирусы, содержащие 40% РНК
РНК
ДНК
1,28 (29% Д) 1,24 (24,5%).
1,32 (32%) 1,27 (27%)
1,36 (35,5%) 1,30 (29,5%).
1,42 (39,5%) 1,33 (32%)
1,50 (44,5%) 1,38 (35,5%).
1,90 1,63 (49,5%).
1,70 (55,5%) 1,42 (38%)
’) Примерная концентрация раствора с данной плотностью (вес на объем). Плот-
ность растворов определяют, измеряя рефрактометром коэффициент преломления и
пользуясь следующими соотношениями между коэффициентом преломления и плотностью.
Диапазоны плот-
ности, г/см3
CsCl 625о=10,8601 Ло2»0—13,4974 1,25—1,90
Cs2SO4 625о = 12,1200 ло25° —15,1662 1,15—1,40
= 13,6986 ло25 — 17,3233 1,4°—1 > 70
2.6. Что такое «чистота»?
Необходимая степень очистки вируса определяется тем, ка-
кие биофизические или биохимические методы будут применены
для его исследования в дальнейшем. Очевидно, что препараты,
используемые для анализа вирусных нуклеиновых кислот или
капсидных белков, должны быть очищены от клеточных приме-
сей более тщательно, чем препараты, предназначенные для
электронной микроскопии или седиментационного анализа.
2.7. Хранение вирусных препаратов
Очищенные препараты некоторых вирусов хранят в заморо-
женном виде при —20°C, однако следует отметить, что замора-
живание влияет на структуру и стабильность некоторых виру-
сов. Полезной защитной добавкой может оказаться хлорбутанол
(1,1,1-трихлор-2-метилпропанол), не влияющий ни на биологи-
ческие свойства (в случае вирусов, не имеющих оболочки), ни
на спектр поглощения в ультрафиолетовой области. Для предот-
вращения бактериального роста добавляют один-два кристалла
азида натрия; при работе с этим веществом следует соблюдать,
осторожность.
2*
20
Глава 1
2.8. Конкретные методики очистки
Ниже приведены четыре методики очистки вирусов, в кото-
рых используют рассмотренные выше приемы. Прежде чем на-
чать работу с любым из вирусов, следует ознакомиться с дей-
ствующими правилами защиты растений.
2.8.1. Вирус мозаики костра
Эту методику можно использовать при очистке изометриче-
ских вирусов, не выпадающих в осадок при pH 5.
1. Вирус наращивают на ячмене 10—12 дней. Собирают
листья. Все дальнейшие процедуры проводят при 4 °C.
2. Гомогенизируют листья в 2 мл 0,1 М. ацетата натрия
(pH 4,8) на 1 г листьев.
3. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10 000 g. Собира-
ют супернатант.
4. К супернатанту добавляют ПЭГ 6000 до концентрации
10% и NaCl до 0,1 М и перемешивают в течение 1 ч.
5. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10 000 g и ресу-
спендируют осадок в 1/10 исходного объема в 0,1 М ацетате
натрия (pH 5,0).
6. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10 000 g и соби-
рают супернатант.
7. Добавляют CsCl до плотности 1,36 г/см3 (см. табл. 1.3) и
центрифугируют 18 ч при 36 000 об/мин в роторе R40 (Beckman).
8. Из градиента извлекают вирусную зону и диализуют по
меньшей мере против 100 объемов 0,1 М ацетата натрия (pH 5,0)
3—4 ч для удаления CsCl.
9. Повторяют стадии 4 и 5. Вирус ресуспендируют в 1 мл
•0,1 М ацетата натрия на 100 г исходной листовой массы.
2.8.2. Вирус мозаики люцерны
Эту методику можно использовать для очистки вирусов, вы-
падающих в осадок при кислых pH и чувствительных к высоким
концентрациям солей.
1. Вирус наращивают на табаке (сорт Ксанти NN) 10—
12 дней. Собирают листья. Все дальнейшие процедуры проводят
при 4 °C.
2. 100 г листьев гомогенизируют в 100 мл 10 мМ раствора
К2Н/КН2РО4, pH 7, Г, к которому предварительно добавляют 1 г
аскорбиновой кислоты и 3,5 мл 50%-ного К2НРО4.
3. Добавляют равный объем смеси хлороформ/бутанол (1:1)
и повторяют гомогенизацию (эту стадию проводят в вытяжном
шкафу).
Характеристика вирусов
21
4. Смесь центрифугируют 5 мин при 5000 g. Собирают вод-
ную (верхнюю) фазу.
5. Центрифугируют водную фазу 3 ч при 27 000 об/мин в ро-
торе R30 (Beckman).
6. Осадок ресуспендируют в 1/10 исходного объема в ГО мМ
фосфатном буфере (pH 7,1).
7. Добавляют CS2SO4 до плотности 1,30 г/см3 (см. табл. 1.3)
и центрифугируют 18 ч при 36 000 об/мин в роторе R40 (Beck-
man).
8. Зону вируса извлекают из градиента и диализуют по мень-
шей мере против 100 объемов 10 мМ фосфатного буфера
(pH 7,1).
9. Повторяют стадии 5 и 6, ресуспендируя осадок вируса
в 10 мМ фосфатном буфере (pH 7,1), из расчета 1 мл на 100 г
исходной листовой массы.
2.8.3. Вирус табачной мозаики
Настоящая методика применима только к вирусам с очень
стабильными частицами. Она не требует использования ультра-
центрифуги.
1. Вирус наращивают на табаке (сорт Берли белый) 2—
3 нед. (данный вирус чрезвычайно контагиозен и может пере-
даваться от растения к растению путем простого контакта или
через инструменты и руки экспериментатора).
2. Листья гомогенизируют в 1 мл 10 мМ трис-НС1 (pH 7,4)
на 1 г листовой массы. Сок фильтруют через марлю.
3. Сок прогревают 10 мин при 55 °C.
4. Сок центрифугируют 10 мин при 10 000 g и собирают су-
пернатант.
5. Добавляют ПЭГ до конечной концентрации 2,5% и NaCl
до 0,1 М, перемешивают 1 ч и центрифугируют 10 мин при
10 000 g.
6. Осадок ресуспендируют в 10 мМ трис-НС1 (pH 7,4), цент-
рифугируют 10 мин при 10 000 g и собирают супернатант.
7. Стадии 5 и 6 повторяют 2—3 раза. Последний осадок ре-
суспендируют в 10 мМ трис-HCl (из расчета 1 мл на 10 г ис-
ходной листовой массы).
Метод позволяет получить препарат средней степени чистоты.
Дальнейшую очистку можно провести зональным или изопикни-
ческим центрифугированием, что требует использования ультра-
центрифуги.
2.8.4. Х-вирус картофеля
1. Вирус наращивают на табаке 2—3 нед.
2. Каждый грамм листьев гомогенизируют в 1 мл 0,02 М
бората натрия (pH 8,2), содержащем 0,01 М аскорбата натрия.
22
Глава 1
3. Суспензию фильтруют через марлю и добавляют к соку
тритон Х-100 до конечной концентрации 0,5%; перемешива-
ют 1 ч.
4. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10 000 g и собира-
ют супернатант.
5. Экстракт наслаивают на 5-мл столбик 30%-ной сахарозы
в 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (pH 8,0) в пробирке от ротора
R30 (Beckman); центрифугируют 3 ч при 27 000 об/мин.
6. Осадок ресуспендируют в 1/10 объема 10 мМ трис-HCl и
1 мМ ЭДТА в течение ночи.
7. Экстракт центрифугируют 10 мин при 10 000 об/мин, со-
бирают супернатант и центрифугируют 1,5 ч при 45000 об/мин
в роторе R50 (Beckman).
8. Осадок ресуспендируют в 1 мл 10 мМ трис-HCl и 1 мМ
ЭДТА на 50 г исходной листовой массы.
При необходимости дальнейшую очистку проводят изопик-
ническим центрифугированием.
3. Биофизическая характеристика
3.1. Необходимость биофизической характеристики
Биофизические свойства вирусов изучаются для того, чтобы
получить информацию о размере, форме, молекулярной массе
и структуре вирусных частиц. Во многих случаях с вирусными
частицами можно работать как с простыми макромолекулами,
у которых периодически повторяются элементы поверхностной
структуры. Для исследования вирусов в настоящее время при-
меняют высокочувствительные методы (в частности, рентгено-
структурный анализ), но я остановлюсь только на тех методах,
которыми можно воспользоваться в стандартных лабораторных
условиях.
3.2. Ультрафиолетовые спектры
Подавляющее большинство простых вирусов состоит в ос-
новном из белка и нуклеиновой кислоты; каждый из этих ком-
понентов имеет характерный спектр поглощения в ультрафиоле-
те (рис. 1.2). Спектр поглощения целых вирусных частиц таким
образом представляет собой комбинацию спектров белка и нук-
леиновой кислоты. Поскольку для нуклеиновых кислот в области
максимума ( — 260 нм) удельное поглощение (для РНК^%М =25,
для ДНК°б0ны =20) намного выше, чем для белка (Е^0/»м =0,5),
спектр вирусных частиц в основном определяется спектром нук-
леиновой кислоты. Удельное поглощение нуклеиновых кислот
мало зависит от нуклеотидного состава (табл. 1.4), однако для
Характеристика вирусов
23
Рис. 1.2. Сравнение спектров поглощения РНК, вируса, содержащего 20%
РНК, и типичного белка. Концентрация растворов РНК и вируса — 1 мг/мл,
раствора белка—10 мг/мл. Обратите внимание на плечо в спектре поглоще-
ния белка в области 290 нм, обусловленное поглощением триптофана
белков оно определяется содержанием ароматических амино-
кислот. Поэтому спектральные характеристики вируса нельзя
использовать для определения процентного содержания нуклеи-
новой кислоты.
Спектр поглощения можно использовать для определения
концентрации вируса. Чтобы определить коэффициент экстинк-
ции неизученного вируса, можно воспользоваться следующим
методом:
1. Препарат вируса диализуют против большого объема под-
ходящего буферного раствора, например 10 мМ. ацетата натрия
(pH 5,0) или 10 мМ фосфатного буфера (pH 7,1). Диализный
раствор сохраняют.
2. Отбирают часть препарата, разводят в необходимое число
раз и определяют спектр поглощения при 220—360 нм. Если
требуется, уточняют значение для 260 нм, вводя поправку на
светорассеяние (см. ниже).
3. В предварительно высушенные сосуды известной массы
переносят равные объемы образцов препарата и диализного
буфера. Растворы упаривают досуха либо путем лиофилиза-
24
Глава 1
Таблица 1.4. Удельное поглощение нуклеотидов
и вирусных РНК1’
Нуклеотид Е»* 1 io-3 4 Содержание нуклеотида, %
вмк ВМЛ ВТМ ХВК
Аденозин 14,2 27 26,5 29,8 32
Цитидин 6,8 21 21,8 18,5 24
Гуанозин 11,8 28 24,4 25,3 22
Уридин 9,8 24 27,3 26,3 22
Е^’-Ю-2 35,59 35,04 35,59 35,41
') ВМК —вирус мозаики костра; ВМЛ —-вирус мозаики люцерны; ВТМ —вирус та-
бачной мозаики; ХВК — Х-вирус картофеля.
2) Молярное поглощение нуклеотидов при 260 нм в кислом растворе (pH 2).
3) Поглощение раствора с концентрацией 1 мг/мл при 260 нм в кислой среде (pH 2).
ции, либо поместив их сначала в термостат на 50 °C, а затем
в вакуумный испаритель.
4. Сосуды периодически взвешивают до достижения посто-
янного веса.
5. Коэффициент экстинкции рассчитывают, разделив зна-
чение Егео на разность сухих весов препарата вируса и диализ-
ного буфера.
Поправку на светорассеяние определяют следующим об-
разом:
1. Измеряют поглощение при нескольких длинах волн между
300 и 360 нм.
2. Строят график зависимости log (100X поглощение) от
log (длина волны/100) и экстраполируют к 260 нм.
3. Взяв антилогарифм экстраполированного значения для
260 нм и разделив на 100, подсчитывают величину светорас-
сеяния.
4. Путем вычитания величины светорассеяния при 260 нм
из Агеонм для вирусного препарата получают исправленную
величину поглощения.
3.3. Седиментационные свойства
Седиментационные характеристики частиц, содержащихся
в вирусных препаратах, можно исследовать либо методом зо-
нального центрифугирования в градиентах концентрации саха-
розы, либо методом аналитического ультрацентрифугирования.
Детальное описание обоих методов имеется в руководстве
[7]. Дополнительные данные об использовании аналитической
ультрацентрифуги и простые графические приемы определения
коэффициента седиментации можно найти в работе [8]. По-
Характеристика вирусов
25
скольку данная тема подробно отражена в этих двух работах,
я приведу здесь лишь простой метод расчета коэффициента
седиментации.
10—40%-ные градиенты концентрации сахарозы готовят, как
описано в разд. 2.5.1. При этом лучше всего использовать
специальное приспособление (см. руководство [7] или рис. 1.3).
Маркерные вирусы (табл. 1.2) подбирают с таким расчетом,
чтобы коэффициент седиментации исследуемого вируса лежал
между коэффициентами седиментации маркеров, а содержание
нуклеиновой кислоты в исследуемом вирусе и в маркерах было
Рис. 1.3. Простое приспособление для приготовления линейного градиента.
Трехканальный перистальтический насос подключается, как показано на схеме.
Шланг из тяжелого раствора сахарозы вводят в центрифужную пробирку
лосле того, как заполняется шланг, ведущий из легкого раствора в тяжелый.
Модифицируя эту схему, можно приготовить градиенты разных типов. Так,
используя только 2 канала насоса, можно получить экспоненциальный гра-
диент
по возможности одинаковым. Последняя предосторожность
позволяет избежать искажения коэффициента седиментации
из-за увеличения плотности раствора сахарозы. Достаточные
для обнаружения зон количества исследуемого вируса и мар-
керов центрифугируют в параллельных градиентах. Коэффици-
ент седиментации исследуемого вируса можно определить путем
сравнения расстояния, пройденного им в градиенте, с расстоя-
нием, пройденным маркерами. В этом случае зоны локализуют
визуально, освещая пробирки сверху и измеряя расстояние от
мениска (однако данный способ не отличается большой точ-
ностью). Можно также пропустить градиент через проточную
26
Глава 1
спектрофотометрическую кювету или фракционировать его и
измерить А2бо в каждой фракции, что позволяет более точно
определить миграцию исследуемого вируса и маркеров в гра-
диенте. При использовании небольших количеств вируса фрак-
ции, содержащие исследуемый вирус и маркеры, можно иден-
тифицировать методом дот-блот гибридизации (см. разд. 3.8).
3.4. Коэффициенты диффузии
Хотя коэффициент диффузии вирусной частицы обратно про-
порционален ее стоксовскому радиусу, его нельзя определить,
измеряя частицы под электронным микроскопом. Это связано
с тем, что частицы, исследуемые с помощью электронного мик-
роскопа, не гидратированы; в растворе же частицы гидрати-
руются, и это влияет на их истинный радиус.
Единственный реальный способ измерения коэффициента
диффузии вируса состоит в том, чтобы создать четкую границу
между раствором вируса и растворителем и затем измерить
скорость ее смещения. Это делается в аналитической ультра-
центрифуге; соответствующие методы подробно описаны в ра-
боте [8].
3.5. Определение молекулярной массы
Известны два стандартных метода определения молекуляр-
ной массы вирусных частиц: на основе гидродинамических дан-
ных и по содержанию капсидного белка и нуклеиновой кислоты.
Расчет с использованием гидродинамических данных осно-
ван на уравнении Сведберга
D(l— vd)
где М—молекулярная масса вируса; R — универсальная газо-
вая постоянная [8,314 Дж/(моль-К)]; s — коэффициент седи-
ментации _(S2ow в сведбергах); D — коэффициент диффузии
(см2/с); v — парциальный удельный объем (см. ниже); 6 —
плотность растворителя (см. ниже); Т—абсолютная темпера-
тура (К). Парциальный удельный объем можно непосредствен-
но определить с помощью пикнометра или рассчитать непря-
мым способом, исходя из удельного содержания нуклеиновой
кислоты и белка в составе вирусных частиц. Так, если процент-
ное содержание нуклеиновой кислоты известно, парциальный
удальный объем можно вычислить, используя для РНК значе-
ние v = 0,55 см3/г и для белка v = 0,74 см3/г (если известен
аминокислотный состав капсидного белка, можно определить
v белка точнее как взвешенную сумму значений v индивиду-
альных аминокислот).
Характеристика вирусов
27
Поскольку коэффициент диффузии и коэффициент седимен-
тации обычно определяют при 20 °C и вводят поправку на кон-
центрацию солей, можно принять 6 = 0,9982 и Т = 293,3 К.
Второй метод расчета молекулярной массы включает опре-
деление процентного содержания нуклеиновой кислоты (см.
разд. 4.3), ее молекулярной массы и числа молекул в вирусной
частице. Вместо этих данных (или дополнительно) можно ис-
пользовать сведения о процентном содержании капсидного бел-
ка, числе субъединиц и их молекулярной массе. Если в расчетах
используются данные о нуклеиновой кислоте, а молекулярная
масса капсидного белка известна, можно рассчитать число
субъединиц в составе одной вирусной частицы. Расчеты могут
быть полезны при интерпретации структуры, наблюдаемой на
электронных микрофотографиях.
Основное различие между двумя методами состоит в том,
что при гидродинамическом подходе определяется молекуляр-
ная масса гидратированной частицы, в то время как другой
подход никак не учитывает гидратацию. Поэтому для некото-
рых целей гидродинамический подход незаменим. Однако, если
значение молекулярной массы вирусной частицы нужно иссле-
дователю для определения, например, числа субъединиц кап-
сидного белка или молекул нуклеиновой кислоты в составе
частицы, оптимальным является второй подход.
3.6. Плавучая плотность
Факторы, которые следует принимать во внимание при изо-
пикническом центрифугировании вирусов в растворах CsCl или
CS2SO4 (наиболее часто используемые соли), рассмотрены
в разд. 2.5.2. Детальное описание других сред, используемых
для приготовления плотностных градиентов, можно найти в ру-
ководстве [7]. Как и коэффициент седиментации, плавучую
плотность можно определить в аналитической или препаратив-
ной ультрацентрифуге. Использование аналитической ультра-
центрифуги описано в работе [8]. Чтобы определить плавучую
плотность в препаративной ультрацентрифуге, вирусные части-
цы центрифугируют до равновесия в угловом роторе, градиенты
фракционируют, определяют плотности фракций и идентифици-
руют фракции, содержащие вирусные частицы. Фракциониро-
вать градиент можно с помощью устройства, показанного на
рис. 1.1, или ему подобного. Другие методы фракционирования
градиентов описаны в разд. 5.4 гл. 2. Плотности фракций можно
измерить, используя рефрактометр и таблицу перехода от по-
казателя преломления к плотности (табл. 1.3, [7]) или взвеши-
вая образцы с известным объемом. Фракции, содержащие вирус,
можно идентифицировать путем измерения Агео или методом
28
Глава 1
дот-блот гибридизации (см. разд. 3.8). Последний метод поле-
зен, если для центрифугирования применяется среда, интенсив-
но поглощающая в ультрафиолете (например, метризамид).
Использование значения плавучей плотности для определе-
ния относительного содержания нуклеиновой кислоты и белка
в составе вирусных частиц может привести к ошибочным ре-
зультатам за счет различий в связывании или проникновении
ионов Cs+ в вирусные частицы, а также влияния используемой
для центрифугирования среды на их гидратацию.
3.7. Электронная микроскопия
В настоящей главе не представляется возможным подробно
описать методы приготовления образцов для электронной мик-
роскопии и работу с электронным микроскопом. Но, поскольку
электронная микроскопия является одним из самых важных и
полезных методов исследования формы и структуры вирусных
частиц, я все же привожу здесь некоторые соображения.
3.7.1. Негативное контрастирование
Негативное контрастирование — основной метод визуального
исследования вирусных частиц. Для многих вирусов в каче-
стве негативного контрастирующего вещества подходит ФВК
(2%-ный раствор фосфорновольфрамовой кислоты, pH которо-
го доведен до 6,5—7,0 с помощью NaOH или КОН), но неко-
торые вирусные частицы (как правило, чувствительные к вы-
сокой концентрации солей) повреждаются или разрушаются
в присутствии этого вещества. Альтернативным контрастирую-
щим веществом может быть УА (2%-ный незабуференный вод-
ный раствор уранилацетата, pH 4,2), но и оно повреждает неко-
торые вирусы. Существуют и другие, более мягкие контрасти-
рующие вещества, в том числе молибдат аммония (pH 6,5),
вольфрамат натрия, доведенный до pH 6,5 муравьиной кисло-
той, и незабуференный метиламинвольфрамат (pH 6,4). Про-
верив несколько контрастирующих веществ, можно подобрать
то, которое наилучшим образом выявляет структуру капсида
данного вируса.
3.7.2. Контроль увеличения
Увеличение на электронных микрофотографиях должно быть
тщательно откалибровано, лучше всего с использованием внут-
реннего маркера, помещенного на ту же сеточку, что и иссле-
дуемый материал. Увеличение, установленное на электронном
микроскопе, не всегда отражает реальность; могут даже на-
Характеристика вирусов 29
блюдаться вариации увеличения на разных участках одной и
той же сеточки. Одним из лучших внутренних маркеров могут
служить кристаллы каталазы (период 17,2 нм) [9]; можно ис-
пользовать и частицы ВТМ, имеющие среднюю длину 300 нм1
и шаг спирали 2,3 нм.
3.8. Обнаружение вирусов методом дот-блот гибридизации
Данный метод включает иммобилизацию вирусной нуклеи-
новой кислоты на нитроцеллюлозе и гибридизацию ее с комп-
лементарной нуклеиновой кислотой в качестве зонда. Экстраги-
ровать нуклеиновую кислоту из вирусных частиц перед нанесе-
нием на нитроцеллюлозу нет необходимости. Фракции сахароз-
ных или цезиевых градиентов можно наносить непосредственно,,
не удаляя среды, используемой для центрифугирования.
3.8.1. Иммобилизация однонитевых вирусных РНК и ДНК
1. Лист нитроцеллюлозы (Schleicher and Schull ВА85) раз-
мечают мягким карандашом для того, чтобы пятна после на-
несения можно было обнаружить. Работать с нитроцеллюлозой
следует в резиновых перчатках.
2. Нитроцеллюлозу смачивают в дистиллированной воде,,
а затем вымачивают в растворе 20XSSC (1XSSC = O,1 М. NaCl,
0,015 М цитрат натрия) 5—10 мин.
3. Избыток SSC, оставшийся на нитроцеллюлозе, удаляют
фильтровальной бумагой.
4. В случае необходимости готовят соответствующие разве-
дения препарата вируса или фракций градиента в 50 мМ нат-
рий-фосфатном буфере (Na2H/NaH2PO4, pH 7,0).
5. В отмеченные точки на листе нитроцеллюлозы наносят
по 5 мкл препарата вируса или фракций градиента. Дают рас-
твору впитаться.
6. Нитроцеллюлозу накрывают листом бумаги Whatman
ЗММ и прогревают при 80 °C в вакууме по крайней мере 2 ч.
При отсутствии вакуумной печи нитроцеллюлозу сушат сначала
на воздухе, затем — под лампой, после чего прогревают 2 ч
при 80 °C.
3.8.2. Иммобилизация двунитевых вирусных РНК и ДНК
1. Нитроцеллюлозу подготавливают, как указано выше (ста-
дии 1—3).
2. Отбирают аликвоты препарата вируса или фракций гра-
диента объемом 8 мкл и добавляют к каждой 2 мкл 0,5 М
NaOH. Раствор инкубируют при комнатной температуре 10 мин
в случае ДНК или 5 мин в случае РНК.
30
Глава 1
3. Добавляют по 2 мкл 3 М ацетата натрия (pH 5,5); в слу-
чае необходимости готовят соответствующие разведения на бу-
фере 1XSSC.
4. Образцы объемом 5 мкл наносят на нитроцеллюлозу и
прогревают, как описано выше (стадии 5 и 6).
Если ДНК суперспирализована, ее следует депуринизиро-
вать, приливая к аликвотам объемом 5 мкл по 5 мкл 0,5 М
НС1 перед добавлением NaOH (в этом случае следует добавить
2 мкл 3 М NaOH).
3.8.3. Приготовление зондов
Зонды обычно представляют собой двунитевую ДНК (на-
пример, клон ДНК) или однонитевую комплементарную ДНК
(кДНК), полученную путем обратной транскрипции РНК. Су-
ществует много методов получения зондов (см. руководство
[10]). Ниже приведены два широко распространенных метода.
Ник-трансляция двунитевой ДНК
1. Исходные растворы:
буфер 10XNT:
50 мМ трис-НС1 (pH 7,8)
5 мМ MgCl2
10 мМ 2-меркаптоэтанол
Концентрированные растворы дезоксирибонуклеотидов (dNTP):
0,1 мМ dATP, dTTP, dCTP и dGTP. Растворы хранят заморо-
женными до использования. Размораживают как можно быстрее.
2. ДНКаза: следует пользоваться ДНКазой, не содержащей
РНКазы, например DN-EP фирмы Sigma. Раствор с концент-
рацией 2 мг/мл хранят в замороженном виде в 10 мМ трис-НС1
(pH 7,8) и 1 мМ MgCl2. Перед использованием раствор разво-
дят в 1000 раз.
Смешивают 1 мкг ДНК, 2,5 мкл буфера 10XNT, доводят
водой до общего объема 24 мкл и добавляют 1 мкл разведен-
ного раствора ДНКазы. Смесь инкубируют 15 мин при 37 °C,
после чего прогревают 10 мин при 70 °C для инактивации
ДНКазы.
3. Высушивают 20 мкКи [a-32P]-dATP или [a-32P]-dCTP
в вакуумном испарителе.
4. К высушенному меченому dNTP добавляют раствор ДНК
(стадия 2) и по 0,5 мкл каждого из трех оставшихся концент-
рированных растворов dNTP. Добавляют 2 единицы ДНК-по-
лимеразы-I Escherichia coli и инкубируют смесь 60 мин при
15 °C или при комнатной температуре. Реакцию останавливают
прогреванием смеси при 70 °C в течение 10 мин.
5. Не включившиеся в ДНК dNTP удаляют хроматографией
на колонке. Для этого суспендируют сефадекс G-100 в буфере
Характеристика вирусов
31
G-100 (5 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, pH 7,9). Колонку делают
из пластмассовой пипетки объемом 1 мл, из нее удаляют боль-
шую часть ватной пробки, а остальную вату помещают в кон-
чик пипетки. Пипетку заполняют буфером G-100 и удаляют
пузыри воздуха. По мере вытекания раствора добавляют сус-
пензию сефадекса G-100 до тех пор, пока колонка не будет
набита. Колонку промывают буфером G-100 примерно 30 мин.
К раствору ДНК после ник-трансляции добавляют 2 мкл 0,06%
раствора красителя оранжевого G в 10%-ном фиколле и 0,5%
додецилсульфат натрия (ДДС-Na) и наносят полученную смесь
на колонку. Прохождение радиоактивной метки по колонке
можно контролировать с помощью стандартного мини-счетчика
Гейгера или собирая фракции. ДНК, меченная ник-трансляцией,
должна элюироваться в свободном объеме, а не включившиеся
dNTP вместе с оранжевым G — в полном объеме.
Обратная транскрипция РНК- При использовании для об-
ратной транскрипции статистической затравки получают попу-
ляцию кДНК, в которой представлены копии всех участков
РНК.
1. Исходные растворы:
буфер 10XRT:
0,5 М трис-НС1 (pH 8,0)
0,1 М MgCl2,
1 ,4 М КС1.
10ХМЕ:
0,3 М 2-меркаптоэтанол.
Концентрированные растворы dNTP:
10 мкл 10 мМ раствора каждого из немеченых dNTP и
10 мкл 0,1 мМ раствора тех же меченых dNTP.
Затравка.
ДНК тимуса теленка или спермы лосося суспендируют в
концентрации 5 мг/мл в 10 мМ. трис-НС1 (pH 7,4) и 10 мМ.
MgCl2. Добавляют ДНКазу I до конечной концентрации
70 мкг/мл и инкубируют раствор 2 ч при 37°C, после чего
автоклавируют 10 мин при 121 °C.
2. Смешивают 1 мкг РНК, 20 мкл ДНК-затравки и воду до
конечного объема 30 мкл. Раствор прогревают 1 мин при 100 °C
и охлаждают при комнатной температуре.
3. Высушивают в вакуумном испарителе 20 мкКи [а-32Р]-
dATP или [a-32P]-dCTP.
4. К высушенной радиоактивной метке добавляют раствор
РНК (стадия 2), после чего добавляют:
5 мкл Юхбуфера,
5 мкл 10ХМЕ,
10 мкл каждого из dNTP,
32
Глава 1
Характеристика вирусов
33
10—12 единиц обратной транскриптазы вируса птичьего
миелобластоза.
Инкубируют смесь 1,5 ч при 37 °C.
5. Добавляют 11 мкл 3 М NaOH, 10 мМ ЭДТА и прогре-
вают смесь 3 ч при 70 °C или в течение ночи при 37 °C.
6. Добавляют 11 мкл 3 М НС1.
7. Добавляют 5 мкл раствора оранжевого G и пропускают
смесь через колонку с сефадексом G-50 (стадия 5 в разд. 3.8.3).
3.8.4. Гибридизация на нитроцеллюлозе
Сначала проводят предгибридизацию нитроцеллюлозы, что-
бы блокировать участки неспецифического связывания, а затем
инкубируют с зондом в условиях, способствующих гибридиза-
ции. Гибридизацию можно проводить двумя путями: при 65 °C
в 3XSSC или при 42°С в 3XSSC в присутствии 50% формами-
да. В первом случае гибридизация идет быстрее, но иногда
возможно повреждение иммобилизованной на фильтре РНК;
если это происходит, следует проводить гибридизацию в при-
сутствии формамида.
1. 20X раствор Денхардта:
0,4% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 0,4% фи-
колла 400, 0,4% поливинилпирролидона (м. м. 44 000),
5 мМЭДТА (pH 7,8).
20XSSC:
3 М NaCl,
0,3 М цитрат натрия.
ДНК: К м
10 мг/мл ДНК спермы лосося или тимуса теленка в 5 мМ
ЭДТА (pH 7,8) обрабатывают ультразвуком, пока раствор
не утратит вязкость, прогревают и быстро охлаждают.
-Формамид:
формамид деионизируют, перемешивая со смолой «Амбер-
лит МВЗ» до достижения pH 6,8—7,0, удаляют смолу
фильтрованием через марлю и используют немедленно или
хранят при —70 °C.
Растворы для предгибридизации и гибридизации:
а) 4Xраствор Денхардта, 10
10 мкг/мл ДНК;
б) тот же раствор, содержащий 50% формамида.
2. Сухой нитроцеллюлозный фильтр помещают в мешочек
из толстого полиэтилена и заплавляют с трех сторон достаточно
близко к фильтру. Добавляют раствор для предгибридизации
из расчета 0,2 мл на 1 см2 фильтра, удаляют пузыри воздуха
и заплавляют четвертую сторону мешочка, оставив место, что-
бы мешочек можно было разрезать и вновь заплавить. Мешо-
чек инкубируют в водяной бане при 65 °C (раствор а) или при
42 °C (раствор б) в течение 2—5 ч.
3. Готовят смесь для гибридизации, представляющую собой
свежий раствор для предгибридизации (0,1 мл на 1 см2 филь-
тра), к которому добавлено 1—5-Ю6 имп/мин зонда, получен-
ного методом ник-трансляции, или 0,5—2,5-106 имп/мин зонда,
полученного обратной транскрипцией. Зонд следует прогреть
1—2 мин при 100°C и быстро охладить во льду перед внесе-
нием в смесь для гибридизации. Мешочек разрезают, выливают
предгибридизационный раствор, добавляют смесь для гибриди-
зации, удаляют пузыри воздуха и вновь запаивают мешочек.
Мешочек инкубируют в водяной бане при 65 °C (раствор а)
или при 42 °C (раствор б) в течение 18—24 ч.
4. Мешочек открывают и вынимают фильтр (лучше всего
сделать это, разрезав мешочек с трех сторон и раскрыв его
полностью). Фильтр помещают в подходящий сосуд и промы-
вают 4 раза 250 мл 2XSSC, содержащего 0,1% ДДС-Na. Для
раствора а каждую промывку следует проводить в течение
10—15 мин при 65°C, а для раствора б фильтр нужно сначала
один раз промыть при комнатной температуре, а затем —
при 65 °C.
5. Фильтр промокают бумагой Whatman ЗММ, сушат на
воздухе, помещают на другой лист такой же бумаги, прикры-
вают липкой пленкой и проводят авторадиографию (см. [11]).
4. Биохимический анализ
В данном разделе описаны методы определения типа, содер-
жания и размера нуклеиновой кислоты вирусных частиц, а так-
же числа и молекулярной массы индивидуальных белков, об-
разующих капсид.
В сочетании с биофизическими данными, полученными, как
описано в разд. 3, результаты этих исследований можно ис-
пользовать для характеристики состава и структуры вирусных
частиц.
4.1. Выделение нуклеиновых кислот
Легкость экстракции нуклеиновых кислот неодинакова для
разных вирусов. Перед тем как удалять капсидный белок, по-
лезно понизить прочность белок-белковых взаимодействий. Для
этого обычно используют буферные растворы с щелочным pH
(однако следует помнить, что при pH 8,5 РНК достаточно
быстро гидролизуется) и хелатирующие агенты, например
ЭДТА. Ниже приведены три метода, пользуясь которыми можно
3—369
34
Глава 1
выделить нуклеиновую кислоту из большинства вирусов. Пер-
вые два метода включают денатурацию и последующее удале-
ние капсидного белка (в денатурирующих условиях снижается
и активность нуклеаз). Третий метод применим к вирусам,
капсидные белки которых устойчивы к денатурирующим воз-
действиям (по крайней мере относительно мягким).
При работе с нуклеиновыми кислотами следует делать все
возможное, чтобы избежать загрязнения нуклеазами. Для всех
процедур нужно использовать либо пластиковую посуду одно-
разового пользования, автоклавируемую перед употреблением,
либо высококачественное стекло, которое следует вымыть де-
тергентом, тщательно промыть дистиллированной водой и про-
калить при 200 °C. При необходимости посуду перед использо-
ванием можно сполоснуть 0,1%-ным раствором диэтилпирокар-
боната (ДЭП). Все растворы по возможности следует авто-
клавировать, а затем хранить в стерильных условиях. Полезно
помнить, что активность ДНКазы подавляется ЭДТА (1—
10 мМ). Ингибировать РНКазу труднее, но ДДС-Na (0,1—0,5%)
или ДЭП (0,1%) подавляют и ее активность. Однако при этом
следует иметь в виду, что ДЭП может повлиять на биологиче-
скую активность нуклеиновых кислот, а ДДС-Na ингибирует
многие ферменты (например, обратную транскриптазу) и транс-
ляционные системы.
4.1.1. Экстракция фенолом в присутствии ДДС-Na
1. Насыщенный буфером фенол готовят, добавляя к 500 г
кристаллического фенола (он должен иметь белый цвет) 55 мл
буфера и нагревая колбу в горячей воде. Когда все кристаллы
растворятся, следует добавить еще 110 мл буфера. При охлаж-
дении раствор должен расслаиваться на фенольную (нижнюю)
и водную (верхнюю) фазы. Можно добавить к насыщенному
фенолу 8-гидроксихинолин (0,1%) и ж-крезол (10%), чтобы
предотвратить окисление фенола и связать имеющиеся в нем
примеси; раствор фенола не должен быть окрашен в розовый
или бурый цвет.
При работе с растворами фенола следует соблюдать пре-
дельную осторожность, поскольку они могут вызвать серьезные
ожоги. Работать нужно только в перчатках, а если приходится
встряхивать пробирки, надевать защитные очки. Ни в коем
случае не следует набирать содержащие фенол растворы с по-
мощью пипетки ртом. Использованные растворы необходимо
вылить, также соблюдая меры безопасности, а посуду — тща-
тельно сполоснуть, прежде чем передать для мытья обслужи-
вающему персоналу. Если фенол все же попал на кожу, постра-
давшее место нужно промыть раствором, состоящим из трех
Характеристика вирусов
35
частей насыщенного раствора полиэтиленгликоля и одной части
95%-ного этанола (эту смесь желательно всегда иметь под
рукой). Затем следует обратиться к врачу.
2. Вирус должен быть суспендирован в подходящем буфере,
содержащем при необходимости ЭДТА (1—10 мМ). К суспен-
зии добавляют ДДС-Na до концентрации 1% и прогревают
5 мин при 50 °C. После этого раствор должен быть прозрачным.
3. К содержащему вирус раствору добавляют равный объем
насыщенного фенола и встряхивают до образования гомогенной
эмульсии. Не следует затягивать пробирки парафильмом, так
как он растворяется в присутствии фенола1’; лучше использо-
вать липкую пленку.
4. Фазы разделяют центрифугированием при 5000 g в тече-
ние 10 мин и отбирают водную (верхнюю) фазу.
5. Стадии 3 и 4 повторяют до тех пор, пока в интерфазе
не перестанет обнаруживаться денатурированный белок.
6. Водную фазу дважды промывают безводным диэтиловым
эфиром, отбрасывая каждый раз верхнюю фазу (эфир).
7. Если ионная сила в растворе полученной нуклеиновой
кислоты ниже 0,1 М, добавляют 1/20 объема 3 М ацетата нат-
рия (pH 6). После этого нуклеиновую кислоту осаждают, до-
бавляя 2,5 объема охлажденного абсолютного этанола и остав-
ляя пробирку на 18 ч при —20 °C или на 1 ч при —70 °C.
Примечания: для эффективной экстракции нуклеиновой кис-
лоты концентрация белка в вирусной суспензии не должна пре-
вышать 5 мг/мл. Если нуклеиновая кислота содержит после-
довательность poly (А), для экстракции нужно использовать
смесь фенол : хлороформ (1 : 1).
4.1.2. Экстракция перхлоратом натрия
в присутствии ДДС-Na
Данный метод не требует использования фенола.
1. К раствору вируса (в буфере, не содержащем ионов ка-
лия) добавляют 0,25 объема 25%-ного (вес на объем) ДДС-Na
(высокоочищенный ДДС-Na растворяют до нужной концентра-
ции при небольшом нагревании) и прогревают 3 мин при 60 °C
в пробирке из полиалломера.
2. Добавляют три объема 100%-ного (вес на объем) NaClO4
и смесь интенсивно встряхивают.
3. Пробирку центрифугируют в бакет-роторе в микроцент-
рифуге 3—5 мин. В результате образуется слой белка, связан-
ного с ДДС-Na, расположенный над жидкой фазой.
11 Неясно, какую пленку имеет в виду автор. «Parafilm М» (поставляемый,
например, фирмой Serva) фенолом не растворяется. — Прим, перев.
3*
36
Глава 1
4. Жидкую фазу собирают, прокалывая дно пробирки.
5. Нуклеиновую кислоту осаждают, как описано выше
(стадия 7).
4.1.3. Экстракция с помощью ДДС-Na и протеазы
1. Проназу или протеазу К растворяют в SSC (0,015 М цит-
рат натрия, 0,15 М хлорид натрия) в концентрации 10 мг/мл
и преинкубируют 30 мин при 37 °C для разрушения нуклеаз.
2. Раствор вируса в SSC инкубируют с проназой (1—2%
массы вируса) и 0,1—0,5% ДДС-Na 3—18 ч при 37°C.
3. Проводят экстракцию фенолом или NaClO4 в присутствии
ДДС-Na, как описано выше.
4.2. Определение типа нуклеиновой кислоты
Нуклеиновая кислота вируса может быть представлена дву-
нитевой или однонитевой РНК или ДНК. Тип нуклеиновой
кислоты можно определить ферментативным или химическим
путем.
4.2.1. Химическое определение
типа нуклеиновой кислоты
В настоящее время этот подход широко не используется.
Однако в некоторых случаях может возникнуть необходимость
применить какой-либо из химических методов. Для обнаруже-
ния ДНК проводят дифениламиновую реакцию [13], а в случае
РНК — реакцию с орцинолом [14] или ее модификацию [15].
4.2.2. Ферментативное определение
типа нуклеиновой кислоты
Этот подход применяют в сочетании с гель-электрофорезом
нуклеиновых кислот (см. разд. 4.4).
Обработка РНКазой
1. Для освобождения РНКазы от ДНКазы раствор
РНКазы А (10 мг/мл) в 10 мМ трис-НС1 (pH 7,5) и 15 мМ
NaCl прогревают 15 мин при 100°C, медленно охлаждают до
комнатной температуры, делят на аликвоты и хранят при
—20 °C.
2. Однонитевая РНК гидролизуется РНКазой А (концентра-
ция 5 мкг/мл) при 25°C в течение 15 мин в 2XSSC (см.
разд. 4.1.3). Двунитевая РНК в этих условиях устойчива к
РНКазе, но гидролизуется при концентрации соли менее
0.1XSSC.
Характеристика вирусов
37
Обработка ДНКазой
1. Нужно использовать ДНКазу, свободную от РНКазы
(см. описание фирмы-изготовителя); ее растворяют в концент-
рации 10 мг/мл в 10 мМ трис-НС1 (pH 7,5) и 2 мМ MgCl2.
2. Для выявления ДНК нуклеиновую кислоту обрабатывают
ДНКазой (концентрация 10 мкг/мл) 15 мин при 37 °C в 10 мМ
трис-НС1 (pH 7,5) и 2 мМ MgCl2. Реакцию можно остановить
прогреванием в течение 5 мин при 70 °C или добавлением
ЭДТА до концентрации 5 мМ.
4.3. Определение содержания нуклеиновой кислоты
Как отмечено в разд. 3.5, сведения об относительном содер-
жании нуклеиновой кислоты и белка в составе вирусных частиц
необходимы для того, чтобы непрямым методом рассчитывать
их парциальный удельный объем. Использование для опреде-
ления доли нуклеиновой кислоты спектров поглощения в уль-
трафиолете или плавучей плотности может приводить к непра-
вильным результатам. Существует четыре метода определения
содержания РНК, из них три прямых и один непрямой. Мето-
ды, описанные в разд. 4.3.1, 4.3.2 и 4.3.4, можно использовать
и для определения содержания ДНК.
4.3.1. Определение содержания фосфора
Вирусные РНК содержат 8,1—9,6% фосфора; точное значе-
ние зависит от нуклеотидного состава, методы определения ко-
торого описаны в работе [14]. В принципе можно пользоваться
приблизительной величиной 9,3%.
1. Вирус диализуют против большого объема дистиллиро-
ванной воды и доводят до известной концентрации (например,
5 мг/мл).
2. Аликвоты вируса объемом 0,5 мл переносят в три мерные
пробирки объемом 4 мл.
3. В каждую пробирку добавляют 0,5 мл 60 %-ной хлорной
кислоты.
4. Готовят стандарт, растворяя 112,5 мг безводного КН2РО4
в 500 мл воды (полученный раствор содержит 50 мкг/мл Pi).
Образцы этого раствора (например, объемом 0,5, 0,3 и 0,2 мл)
переносят в мерные пробирки (при этом содержание Pi в про-
бирках составляет соответственно 25, 15 и 10 мкг), доводят при
необходимости объем до 0,5 мл и добавляют в каждую пробир-
ку по 0,5 мл 60 %-ной хлорной кислоты.
5. Пробирки инкубируют в термостате (можно использовать
песчаную баню) при 190—200 °C в течение 20—30 мин. Необ-
ходимо убедиться, что растворы вирусов не содержат больших
38
Глава 1
количеств посторонних органических веществ, например глице-
рина, так как это может вызвать взрыв.
6. Пробирки охлаждают при комнатной температуре и до-
бавляют в каждую по 5 капель не содержащей фосфора пере-
киси водорода.
7. Вновь помещают пробирки в термостат на 15 мин.
8. Пробирки охлаждают при комнатной температуре и до-
бавляют в каждую по 0,4 мл 5%-ного раствора молибдата
аммония [(ЫН4)бМо7О24-4Н2О], перемешивают раствор, вращая
пробирки, и добавляют по 0,1 мл водного раствора, содержа-
щего 0,2% 1,2,4-аминонафтолсульфоновой кислоты, 12% би-
сульфита натрия и 2,4% сульфита натрия. Объем доводят во-
дой до 4 мл.
9. С помощью спектрофотометра определяют поглощение
в синей области спектра (при 700 нм) против контроля, при-
готовленного, как описано выше, но с 0,5 мл воды вместо ис-
следуемого раствора.
10. Строят калибровочную кривую и определяют содержание
фосфора.
4.3.2. Дифениламиновая или орциноловая реакции
Содержание ДНК или РНК в препарате вируса можно опре-
делить с помощью количественных вариантов дифениламиновой
(на ДНК) или орциноловой (на РНК) реакций. Описание этих
реакций можно найти в работах [13] (дифениламиновая реак-
ция) и [14] или [15] (орциноловая реакция).
4.3.3. Гидролиз РНК
Чтобы провести точный расчет на основе данного метода,
необходимо знать нуклеотидный состав РНК. Методы опреде-
ления нуклеотидного состава приводятся в работе [14].
1. К известному количеству вируса в 0,01 М натрий-фосфат-
ном буфере (pH 7,1) добавляют 1/10 объема 11,9 М соляной
кислоты и инкубируют в плотно закрытой пробирке в течение
ночи при комнатной температуре.
2. Центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин для удаления
денатурированного белка и отбирают супернатант, содержащий
освободившиеся при гидролизе нуклеотиды.
3. Используя для разведений 1 М НС1, измеряют Е2во супер-
натанта.
4. Используя данные о нуклеотидном составе РНК и коэф-
фициенты экстинкции индивидуальных нуклеотидов, рассчиты-
вают количество РНК в образце вируса известной массы.
Характеристика вирусов
39
4.3.4. Непрямой метод
В некоторых случаях можно рассчитать относительное со-
держание нуклеиновой кислоты, зная число белковых субъеди-
ниц в вирусной частице (из структурных исследований), их
молекулярные массы и молекулярную массу нуклеиновой кис-
лоты (по данным гель-электрофореза).
4.4. Гель-электрофорез нуклеиновых кислот
Количество различных типов нуклеиновых кислот в вирус-
ном препарате и их молекулярные массы можно установить
с помощью гель-электрофореза, который используют и для оп-
ределения типа и структуры нуклеиновой кислоты (см.
разд. 4.2.2). Детальное описание методов гель-электрофореза
нуклеиновых кислот имеется в руководстве [11]. Ниже приве-
дены описания некоторых методов, не вошедших в эту книгу.
Для точного определения молекулярных масс одноцепочеч-
ных нуклеиновых кислот с помощью гель-электрофореза иссле-
дуемую нуклеиновую кислоту и маркеры необходимо денату-
рировать для разрушения вторичной структуры, которая зави-
сит от типа нуклеиновой кислоты, а также от концентрации
одно- и двухвалентных катионов.
4.4.1. Денатурация глиоксалем
1. 40%-ный глиоксаль деионизируют, перемешивая с ионо-
обменной смолой AG 501-Х8 (D) (Bio Rad) до установления
постоянного pH. Процедура может занять несколько часов и
потребовать нескольких смен смолы. После этого смолу уда
ляют фильтрованием через марлю, делят деионизированный
глиоксаль на порции и хранят его при —70 °C.
2. Готовят денатурирующий раствор (GFP) следующего со-
става:
деионизированный глиоксаль — 0,894 мл
деионизированный формамид (см. разд. 3.8.4) —3,89 мл
500 мМ фосфат натрия (pH 7,0) — 0,111 мл
дистиллированная вода — 0,195 мл
Всего: 5,0 мл
Раствор делят на порции и хранят при —70 °C.
3. 2 мкл раствора ДНК или РНК (1 мг/мл) смешивают
с 18 мкл GFP, прогревают 10 мин при 55 °C и охлаждают до
комнатной температуры, после чего добавляют 3 мкл раствора
для нанесения образцов (10% фиколла, 0,06% бромфенолового
синего, 0,06% оранжевого G и 0,5% ДДС-Na).
40
Глава 1
4. Готовят агарозный гель, например 1,2%-ный, для разде-
ления РНК длиной 2000—5000 нуклеотидов в трис-ацетатном
буфере (25 мМ трис, доведенный до pH 7,2 уксусной кислотой,
1 мМ Na2 ЭДТА, 5 мМ ацетат Na). Электрофорез ведут в том
же буфере до выхода оранжевого G из геля.
5. Окрашивание. Если РНК полностью денатурирована, она
не окрашивается интеркалирующими красителями, такими как
бромистый этидий, что может служить хорошим контролем
полноты денатурации, РНК можно освободить от глиоксаля
обработкой геля 50 мМ NaOH в течение 10—15 мин (более
длительная обработка щелочью приводит к гидролизу РНК),
затем нейтрализовать гель в 200 мМ ацетата натрия (pH 5,0)
и окрасить РНК бромистым этидием (1 мкг/мл). Флуоресци-
рующие полосы РНК можно затем обнаружить при освещении
геля ультрафиолетом. Альтернативный подход заключается в
использовании неинтеркалирующих красителей, например то-
луидинового синего. Гели окрашивают 0,05%-ным толуидино-
вым синим в 10 мМ фосфате натрия (pH 7,0) в течение 60 мин,
после чего отмывают краску фосфатным буфером.
4.4.2. Денатурация формальдегидом
1. 10Х буфер для электрофореза: 200 мМ HEPES, 10 мМ
Na2 ЭДТА, pH 7,8 (доводится NaOH).
2. Подготовка образца: смешивают 3 мкл 10Х буфера,
15 мкл деионизированного формамида (см. разд. 3.8.4), 5 мкл
36—37%-ного формальдегида, 1 мкг РНК и раствор для нане-
сения образцов (см. разд. 4.4.1) до конечного объема 30 мкл.
Раствор нагревают до 65 °C и охлаждают во льду.
3. Готовят агарозный гель, например 1,2%-ный, для разде-
ления РНК длиной 2000—5000 нуклеотидов. Для приготовления
геля используют 1,2 г агарозы, 10 мл 10Х буфера, 16,7 мл
36—37%-ного формальдегида и 73,3 мл воды. Образцы наносят
на гель и проводят электрофорез в 1Х буфере до выхода оран-
жевого G из геля. Окрашивание проводят, как описано
в разд. 4.4.1.
4.4.3. Денатурация формамидом
Денатурация формамидом легко обратима без повреждения
РНК (в отличие от щелочной). Поэтому, если есть необходи-
мость использовать денатурированную РНК для биологических
опытов, данный метод имеет преимущества. Денатурация при
этом бывает не столь полной, как при использовании двух опи-
санных выше методов.
1. Исходные растворы:
Характеристика вирусов
41
а) 50X буфер:
трис — 21,7 г,
NaH2PO4-2H2O —23,4 г,
Ыа2ЭДТА-2Н2О — 1,85 г,
вода — до 1л.
Раствор должен иметь pH 7,6—7,8;
б) деионизированный формамид (см. разд. 3.8.4). Важно,
чтобы pH формамида был близок к 7,0;
в) раствор для нанесения образцов: 30% сахарозы, 0,06%
бромфенолового синего, 0,06% оранжевого G в формамиде.
2. Образцы готовят, добавляя к РНК равный объем раство-
ра для нанесения образцов. Полученный раствор прогревают
2 мин при 90 °C и охлаждают.
3. Агарозный гель готовят, растворяя агарозу в смеси
IX буфера с формамидом (1: 1). Выливают агарозу в прибор
для электрофореза, охлаждают до комнатной температуры и
выдерживают при 4°C до формирования геля (около 20 мин).
После нанесения образцов проводят электрофорез в смеси
1Х буфера с формамидом (1:1); во время электрофореза не-
обходима циркуляция буфера.
4. После электрофореза гель около 15 мин промывают водой
и окрашивают бромистым этидием.
4.5. Гель-электрофорез белков
Как и в случае нуклеиновых кислот, электрофорез в геле —
лучший метод определения типов и размеров капсидных белков.
Перед электрофорезом белки денатурируют ДДС-Na, устраняя
тем самым большинство проблем, вызываемых различиями
удельных зарядов неденатурированных белков. Методы дена-
турации и гель-электрофореза белков описаны в руководстве
[16]. Особое внимание следует обратить на методы обнаруже-
ния нетипичной миграции денатурированных ДДС-Na белков
в геле (графики Фергюсона). Ниже описана быстрая методика
диссоциации вирусных частиц и получения нуклеиновых кислот
и белков для гель-электрофореза.
4.5.1. Быстрая денатурация вирусов
1. Приготовление диссоциирующего буфера:
10-кратный буфер для электрофореза — 5 мл
10%-ный ДДС-Na— 10 мл
10 М мочевина — 7,5 мл
2-меркаптоэтанол — 0,5 мл
сахароза — 4,5 г
Раствор делят на порции и хранят в замороженном виде.
42
Глава I
2. К суспензии вируса добавляют равный объем диссоции-
рующего буфера. Для выделения нуклеиновой кислоты раствор
прогревают 10 мин при 50—60 °C, для выделения белка раствор
прогревают 2 мин при 100 °C. К раствору добавляют 1/5 объема
0,06 %-кого бромфенолового синего, наносят на гель и проводят
электрофорез.
3. В результате получают нуклеиновую кислоту в нативном
состоянии. Если необходима денатурация, следует воспользо-
ваться одним из описанных выше методов.
4.6. Гель-электрофорез вирусных частиц
Электрофорез в геле можно использовать для определения
изоэлектрической точки и разделения по размерам и поверх-
ностному заряду мелких изометрических и некоторых палочко-
видных вирусов. Разделение лучше всего проводить в поли-
акриламидных гелях, хотя для некоторых вирусов можно ис-
пользовать и агарозные гели. Так, например, для разделения
изометрических вирусных частиц диаметром около 30 нм под-
ходит 3%-ный полиакриламидный гель (отношение акрил-
амид: бисакриламид— 20:1). pH такого геля доводят буфер-
ным раствором, содержащим трис и лактат кальция [17]. При
этом необходимо приготовить два исходных раствора:
1. 0,6 М трис, pH которого доведен молочной кислотой до
4,0—6,0 или какодиловой кислотой до 6,0—7,5. Для получения
pH 7,5—8,5 нужно использовать 0,6 М молочную кислоту, pH
которой доводят трисом.
2. 60 мМ лактат кальция, который получают, доводя pH
Са (ОН)2 до необходимого значения молочной или какодиловой
кислотой. При смешивании этих растворов в отношении 1 : 1
получают 20-кратный буфер для приготовления геля и проведе-
ния электрофореза.
Литература
1. Murant A. F., Harrison В. D., eds. (1970 to date), CMI/AAB Descriptions of
Plant Viruses, Nos., 1—275.
2. Kurstak E., ed. (1982). Handbook of Plant Virus Infections, published by
Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam.
3. Bar-Joseph M., Hull R. (1974). Virology, 62, 552.
4. Takanami У., Kabo S. (1979). J. Gen. Virol., 44, 153.
5. Brunt A. A., Kenton R. H. (1963). Virology, 19, 388.
6. Dunn D. B., Hitchborn J. H. (1965). Virology, 25, 171.
7. Rickwood D., ed. (1984) Centrifugation: A Practical Approach, 2nd Edition,
published by IRL Press, Ltd., Oxford and Washington, D. C.
8. Markham R. (1962). Adv. Virus Res., 9, 241.
9. Wrigley N. G. (1968). J. Ultrastruct. Res., 24, 454.
Характеристика вирусов
43
10. Maniatis R., Fritsch E. F., Sambrook J. (1982). Molecular Cloning: A Labo-
ratory Manual, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.
11. Rickwood D., Hames B. D., eds. (1982). Gel Electrophoresis of Nucleic
Acids: A Practical Approach, Published by IRL Press Ltd., Oxford and
Washington, D. C.
12. Wilcockson J., Hull R. (1974). J. Gen. Virol., 23, 107.
13. Burton K.. (1956). Biochem. J., 62, 315.
14. Markham R. (1955). In: Modern Methods of Plant Analysis, Vol. 4, Paech K.
and Tracey M. V. (eds.), p. 246.
15. Lin R. I.S., Schjeide 0. A. (1969). Anal. Biochem., 27, 473.
16. Hames B. D., Rickwood D., eds. (1981). Gel Electrophoresis of Proteins:
A Practical Approach, published by IRL Press Ltd., Oxford and Washington,
D.C.
17. Lane L. C., Kaesberg P. (1971). Nature New Biol., 232, 40.
ГЛАВА 2
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ
И ОЧИСТКА ПИКОРНАВИРУСОВ
77. Майнор
1. Введение
Пикорнавирусы — это мелкие, не содержащие липидов ви-
русы, геном которых представлен однонитевой РНК, выполняю-
щей функцию матричной (м. м. 2,6—3-106 D); РНК заключена
в белковый капсид диаметром 25—30 нм. Пикорнавирусы вы-
зывают распространенные заболевания человека и других мле-
копитающих; сходные с ними вирусы обнаружены также у на-
секомых и растений. В этой главе мы ограничимся рассмотре-
нием пикорнавирусов млекопитающих, которые подразделяются
на кислотоустойчивых энтеровирусов, размножающихся преиму-
щественно в желудочно-кишечном тракте, и кислоточувстви-
тельных риновирусов, обнаруживаемых главным образом в но-
соглотке [1]. Энтеровирусы в свою очередь делятся на вирусы
полиомиелита, вирусы Коксаки, вирусы ECHO (от англ, entero-
cytopathic human orphan virus), энтеровирусы, обозначаемые
номерами, и кардиовирусы мышей. Афтовирусы, этиологические
агенты ящура, объединяются с риновирусами. Классифика-
ция пикорнавирусов и типичные представители приведены
в табл. 2.11>.
Выбор методики получения вирусного препарата определя-
ется целью дальнейшего исследования. Для изучения круга хо-
зяев, серологических свойств, а также в качестве инфекционного
материала можно использовать и неочищенные препараты ви-
руса [2]. В качестве антигена или иммуногена [3], для клони-
рования и секвенирования вирусной РНК [4] и получения мат-
ричной РНК (мРНК), транслируемой в бесклеточных системах,
необходимо иметь высокоочищенный вирус, не содержащий
контаминантов клеточного или другого происхождения. Для
изучения цикла репродукции вируса в зараженной клетке, ха-
рактеристики полиовируса методом олигонуклеотидного карти-
рования РНК [6, 7], анализа вирионных белков [8] и в ряде
иммунологических исследований [9] применяют вирус, мечен-
ный радиоактивным изотопом.
О Приведенная классификация не отражает современной точки зрения на
систематику пикорнавирусов, зафиксированной в докладе Международного
комитета по систематике и номенклатуре вирусов (см.: Matthews R. Е. F.,
1982, Intervirology, V. 16, р. 1—199). — Прим, перев.
Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов
45
Таблица 2.1. Классификация пикорнавирусов
Группа Подгруппа Представитель Заболевание человека
Энтеровирусы Риновирусы Полиовирусы Вирусы Кокса- ки Вирусы ECHO Энтеровирусы Кардиовирусы Энтеровирусы ? Риновирусы Афтовирусы РЗ/Leon/CUIA (1937) Вирус Коксаки А9 Вирус Коксаки В4 ECHO 11 Энтеровирус 70 ЭМК Вирус Менго Вирус гепатита А Риновирус челове- ка, тип 1а Риновирус челове- ка, тип 14 Вирус ящура, тип SAT 1 Паралитический полио- миелит Лихорадка, поражение горла, асептический ме- нингит, ринит Асептический менингит, миокардит (особенно у детей), перикардит, ор- хит; возможно, благо- приобретенный диабет у взрослых Асептический менингит Геморрагический конъ- юнктивит, временный па- ралич Возможно, лихорадка с поражением ЦНС Гепатит Острое респираторное за- болевание
Настоящая глава состоит из четырех разделов, в которых
рассматриваются необходимые меры безопасности, методы куль-
тивирования, идентификации и очистки пикорнавирусов. В ка-
честве типичного представителя пикорнавирусов в ходе изло-
жения будет рассматриваться полиовирус типа 3, так как
именно он был основным объектом исследований, проведенных
в лаборатории автора; другие вирусы будут привлекаться для
обсуждения по мере необходимости.
2. Меры безопасности
Человек является природным хозяином многих пикорнави-
русов, представляющих в силу этого наибольший интерес. Обыч-
но энтеровирусная инфекция протекает бессимптомно, но воз-
можно развитие и симптоматических заболеваний, примеры
которых приведены в табл. 2.1. Особенно чувствительны к энте-
ровирусам дети, и поэтому беременным женщинам и людям,
имеющим маленьких детей, необходимо соблюдать предельную
осторожность. Так, например, вирус Коксаки В4, вероятно, вы-
46
Глава 2
зывает врожденные поражения сердца, развивающиеся в ре-
зультате внутриматочного заражения плода. Описано также
заражение вирусом Коксаки А в лабораторных условиях, хотя
его этиологическая роль четко не доказана. Желательно пере-
одеться и принять душ, перед тем как покинуть лабораторию,
время от времени необходимо контролировать титр антител в
сыворотке крови.
В настоящее время не существует вакцин против вирусов
Коксаки и энтеровирусов, перечисленных в табл. 2.1. С другой
стороны, имеются исключительно эффективные и совершенно
безопасные полиовирусные вакцины, и невозможно переоценить
значение проверки уровня антител, а в случае необходимости
и ревакцинации перед началом любой работы с полиовирусом.
Высокий уровень иммунитета предотвратит заболевание самих
работающих, а также развитие у них бессимптомной инфекции,
при которой они могут быть источником вируса. По-видимому,
для стимуляции образования антител к полиовирусу для взрос-
лых больше всего подходит инактивированная вакцина Солка.
Проведение любой работы с вирусом ящура строго регулиру-
ется в законодательном порядке, поскольку он вызывает эпи-
зоотии среди домашних животных.
3. Культивирование пикорнавирусов
В этом разделе после некоторых вводных замечаний приво-
дятся три конкретные методики культивирования полиовируса
разных типов.
3.1. Выбор клеток
Хотя описаны штаммы, адаптированные к размножению в
куриных эмбрионах [1], большинство пикорнавирусов размно-
жаются только в гомологичных клеточных культурах, например
пикорнавирус человека — в культуре клеток человека или дру-
гих приматов. Одна из основных трудностей в работе с пикор-
навирусами состоит в подборе подходящей клеточной культуры;
с этой точки зрения полиовирус является одним из наиболее
удобных объектов исследования, поскольку он размножается
в легко культивируемых клетках разных типов; при этом титр
его составляет 107—109 инфекционных единиц на миллилитр
культуральной среды (что соответствует примерно 10—1000 ин-
фекционным единицам в расчете на одну клетку). В то же
время другие энтеровирусы и риновирусы дают титры лишь
около 104 инфекционных единиц на миллилитр (т. е. около
0,03 инфекционной единицы на клетку), причем только в опре-
деленных клеточных линиях (например, ECHO 7 в клетках RD,
Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов 47
риновирус 1b в клетках Нер-2с). При таком низком выходе
трудно получить значительное количество очищенного вируса,
и исследования ограничиваются изучением нейтрализации ин-
фекционности с помощью антител и цикла репродукции с при-
менением иммунофлуоресценции [10]. Для выращивания рино-
вирусов рекомендована определенная сублиния клеток HeLa
(HeLa Ohio), однако часто оказывается, что свойства одной и
той же линии клеток различаются при культивировании ее в
разных лабораториях, а кроме того, разные типы риновирусов
дают неодинаковые титры в одних и тех же клетках. В табл. 2.2
перечислены некоторые линии клеток, используемые для выра-
щивания детально исследованных пикорнавирусов. Список не
претендует на полноту, в него включены только широко рас-
пространенные линии. Информацию о том, какая клеточная
Таблица 2.2. Культуры клеток для размножения пикорнавирусов
Вирус Клетки
Полиовирус Нер-2с (в настоящее время, вероятно, HeLa) HeLa HeLa (линия Манделя) Вторичная культура по- чек обезьян Эпителиальная карцинома че- ловека Карцинома человека Карцинома человека Почки обезьян
Коксаки А RD Рабдомиосаркома человека
Коксаки В HeLa (линия Манделя) LLCMK2 Карцинома человека Почки эмбрионов макак-резу- сов
ECHO 11 RD Рабдомиосаркома человека
Энтеровирус 70 RD Рабдомиосаркома человека
ЭМК Асцитные клетки мыши Кребс II Вторичная культура кле- ток мышиного эмбриона Опухоль мыши Эмбрион мыши
Вирус Менго L-клетки Клетки крысиной гепа- томы Новикова NISI-67 Вторичная культура кле- ток мышиного эмбриона Опухоль мыши Гепатокарцинома крысы Эмбрион мыши
Вирус гепатита А Первичная культура кле- ток печени обезьян мар- мозеток FRMK-6 MRC-5 Печень мармозеток Почки эмбрионов макак-резу- сов Легкие эмбриона человека
Риновирус HeLa 0 MRC-5 Карцинома человека Легкие эмбриона человека
Вирус ящура КВ внк Карцинома человека Почки сирийского хомячка
48
Глава 2
линия оптимальна для размножения того или иного пикорна-
вируса, обычно можно получить в лабораториях, предоставляю-
щих вирусный посевной материал.
3.2. Условия культивирования
Хотя инфекционность большинства пикорнавирусов доста-
точно стабильна, вирусный посевной материал лучше всего хра-
нить при —70 °C. Оттаивание вируса необходимо проводить
при комнатной температуре, поскольку пикорнавирусы обычно
термолабильны и при неоднократном оттаивании при 37 °C их
инфекционность падает. При необходимости клетки заражают
пикорнавирусами с высокой множественностью инфекции, так
как в отличие от других вирусов при этом не происходит быст-
рого накопления дефектных интерферирующих частиц (см. од-
нако, [И]).
Выбранную культуру клеток можно выращивать на поверх-
ности культурального флакона в стационарных условиях или
в роллерной установке (в последнем случае используют бутыл-
ки и пробирки), а также в суспензии при осторожном переме-
шивании. Клетки наращивают до монослоя или высевают с
нужной плотностью из трипсинизированной культуры за сутки
до использования (хотя следует помнить о чувствительности
рецепторов пикорнавирусов к протеазам [12]). В нашей лабо-
ратории оказалось наиболее удобным использовать для полу-
чения небольших количеств (до 100 мкг) полиовируса вращаю-
щиеся пробирки, поскольку в них значительное количество
клеток (107 клеток на площади 66 см2) покрывается небольшим
объемом среды (1 мл), что обеспечивает экономный расход
радиоактивных соединений и позволяет получить препарат ви-
руса, не требующий концентрирования перед очисткой. Культи-
вирование полиовируса в роллерных установках обычно дает
такой же выход и удельную радиоактивность, как и выращива-
ние в монослое на флаконах при одинаковых концентрациях
клеток, вируса и радиоактивного предшественника. Риновиру-
сы, однако, предпочтительнее выращивать в роллерных культу-
рах, поскольку для их репродукции нужны хорошая аэрация
и слабокислый pH, хотя сами вирионы в кислой среде лабильны.
Риновирусы лучше всего размножаются при 33 °C, хотя впол-
не удовлетворительный выход достигается и при 35°C [13];
все полученные Сэбином вакцинные штаммы полиовируса тер-
молабильны, температурный оптимум их размножения — 33—
35 °C. Сыворотки крупного рогатого скота и лошадей часто
содержат ингибиторы репликации полиовируса, и культуры
клеток для его выращивания следует вести на фетальной сы-
воротке крупного рогатого скота или выдерживать в бессыво-
роточной среде в течение суток перед заражением.
Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов
Рис. 2.1. Действие полиовируса на клетки Нер-2с. а — культура клеток Нер-2с
через 24 ч после заражения полиовирусом типа 3; б — контрольная незаря-
женная культура. 200 X
3.3. Сбор вирусов
Размножение вируса и его выход из клеток обычно сопро-
вождаются дегенерацией последних, причем цитопатическое
действие (ЦПД) наиболее четко выражено при размножении
вируса в монослое клеток. Начиная работу, полезно ставить
в качестве контроля незараженную культуру, хотя обычно де-
генерация клеток очевидна и выражается в их частичной гибе-
ли и деструкции монослоя. Рис. 2.1 иллюстрирует ЦПД, вызы-
ваемое полиовирусом. Однако размножение пикорнавирусов не
всегда сопровождается видимыми эффектами. Вирус гепатита А
не дает заметного ЦПД в клетках FRh К-6, причем в культу-
ральной среде воспроизводимо обнаруживается лишь неболь-
шое количество вируса. Обычно при достижении максимального
ЦПД энтеровирусы полностью высвобождаются из зараженных
клеток, в то время как риновирусы остаются частично связан-
ными с клетками. В некоторых случаях очень важно время
сбора вируса; так, имеются сообщения, что вирионы вируса
ящура содержат связанную рибонуклеазу, которая разрушает
геномную РНК, если собирать вирус через 12, а не через 8 ч
после заражения [14]. Аналогичные данные имеются и для
риновирусов.
4—369
50
Глава 2
Общепринятый метод разрушения зараженных клеток — три
цикла замораживания и оттаивания; после этого в случае не-
обходимости клеточную суспензию пропускают через иглу для
инъекций. Остатки клеток обычно удаляют низкоскоростным
центрифугированием.
3.4. Наращивание полиовируса типа 3 для заражения клеток
Все процедуры следует проводить в стерильных условиях.
1. Клетки Нер-2с (~5-106) высевают на стеклянную бутылку
объемом 16 унций или на пластиковый культуральный флакон
площадью 150 см2 в 100 мл минимальной питательной среды
Игла (МЕМ), содержащий 4% эмбриональной телячьей сыво-
ротки (ЭТС), 2,2 г/л бикарбоната натрия, 120 мг/л пеницил-
лина и 100 мг/л стрептомицина. Клетки выращивают до обра-
зования монослоя при 35—37 °C.
2. Среду осторожно сливают. На монослой наливают 0,1 мл
(или меньший объем) культуральной жидкости, содержащей
полиовирус типа 3. Для адсорбции вируса клетки инкубируют
30 мин при комнатной температуре, периодически покачивая
флакон.
3. Добавляют 50 мл среды МЕМ, содержащей бикарбонат и
антибиотики, как указано выше (стадия 1), но без сыворотки.
Инкубируют при 35 °C до полной деструкции монослоя
(1—3 сут).
4. Содержимое флакона замораживают при —70 °C и оттаи-
вают при комнатной температуре. Остатки клеток удаляют низ-
коскоростным центрифугированием (2000 g, 5 мин), суперна-
тант сливают и сохраняют.
5. Аликвоты супернатанта хранят при —70°C.
В результате получают пул полиовируса, содержащий 108—
109 БОЕ/мл.
3.5. Получение меченного [35Б]-метионином полиовируса типа 3
на монослойных клеточных культурах в химических пробирках
Все процедуры проводятся в стерильных условиях.
1. Путем трипсинизации монослоя получают суспензию кле-
ток Нер-2с в среде МЕМ, содержащей сыворотку, антибиотики
и бикарбонат, как указано в разд. 3.4, стадия 1. Суспензию
разводят до концентрации 2-106 кл/мл. В стерильные вымытые
кислотой химические пробирки (13,5X1,5 см) высевают по 5 мл
клеточной суспензии; пробирки затыкают резиновыми силико-
новыми пробками, в горизонтальном положении помещают в ба-
рабан роллерной установки, вращающийся со скоростью 5 об/ч
и инкубируют в термостате при 35 °C. В течение ночи клетки
прикрепляются к стеклу.
Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов
51
2. Среду осторожно сливают и в каждую пробирку вносят
0,1—0,3 мл неразведенной культуральной жидкости, содержа-
щей полиовирус типа 3 (около 108 инфекционных единиц на
пробирку). Пробирки инкубируют в роллерной установке 1 ч
при 35°C, после чего добавляют 1 мл среды МЕМ без метио-
нина, но содержащей 1% ЭТС, 2,2 г/л бикарбоната натрия,
120 мкг/л пенициллина и 100 мкг/л стрептомицина. Пробирки
инкубируют в роллерной установке еще 5 ч; при этом начина-
ется инфекционный процесс и подавляется синтез клеточных
белков.
3. В каждую пробирку вносят по 25 мкКи [35S]-метионина
(~2 мкл). Пробирки инкубируют в роллерной установке в те-
чение ночи при 35 °C.
4. Через 24 ч после заражения должно наблюдаться полное
ЦПД, при этом не должно оставаться клеток, прикрепленных
к стеклу. Пробирки замораживают при •—70 °C и оттаивают
в водяной бане при комнатной температуре. Среду из всех
пробирок объединяют и остатки клеток удаляют низкоскорост-
ным центрифугированием (5 мин при 2000 g). Вирус, содержа-
щийся в супернатанте, подвергают дальнейшей очистке (см.
разд. 5). Обычный выход вируса из трех пробирок (3-ГО7 кле-
ток)— около Ю10 БОЕ при удельной радиоактивности
2-10-4 имп/мин на 1 БОЕ.
3.6. Получение вируса в суспензионной культуре клеток HeLa
Все процедуры проводятся в стерильных условиях.
1. Определенные сублинии клеток HeLa (например, HeLa S3)
могут расти в средах с низкой концентрацией ионов кальция
(например, CaS2MEM). Для эффективного заражения сущест-
венно, чтобы клетки хорошо росли в виде однородной суспен-
зии. Клетки осаждают низкоскоростным центрифугированием
(15 мин при 900 g) и ресуспендируют в среде CaS2MEM до
концентрации -2-Ю7 кл/мл ( — 1/20 исходного объема).
2. К клеточной суспензии добавляют вирус в концентрации
10—50 БОЕ на клетку; инкубируют ее на магнитной мешалке
в течение 1 ч при 35 °C.
3. Суспензию разводят той же средой до концентрации
2-Ю6 кл/мл и добавляют 100 мкКи [3Н]-уридина.
4. Клеточную суспензию инкубируют в течение 8 ч, после
чего осаждают клетки низкоскоростным центрифугированием
(15 мин при 900 g) и промывают один раз фосфатным буфер-
ным раствором (PBS), не содержащим ионов магния и кальция.
5. Клетки ресуспендируют в PBS (5-107кл/мл) и проводят
три цикла замораживания — оттаивания.
6. Остатки клеток удаляют центрифугированием.
7. Супернатант сохраняют для дальнейшей очистки.
4*
52
Глава 2
4. Идентификация вирусов
Многие пикорнавирусы в определенных условиях агглюти-
нируют эритроциты некоторых видов животных; эту реакцию
можно использовать для выявления вируса. Однако наиболее
часто определяют инфекционность вируса, его антигенные свой-
ства или идентифицируют отдельные компоненты вириона (на-
пример, РНК или белок) после фракционирования.
4.1. Методы определения инфекционное™
Все методы определения инфекционности требуют чувстви-
тельной линии клеток и тщательного соблюдения стерильных
условий.
4.1.1. Определение TCIDso*) полиовируса типа 3 [15]
1. Готовят стерильные пробирки, содержащие по 0,9 мл
раствора для разведения (среда МЕМ, содержащая 1,3 г/л би-
карбоната натрия, 4% ЭТС, 120 мкг/л пенициллина и 100 мкг/л
стрептомицина).
2. Готовят последовательные 10-кратные разведения вирус-
ного препарата, внося в первую пробирку 0,1 мл препарата,
перемешивая и перенося 0,1 мл в следующую пробирку и т. д.
Для приготовления каждого разведения используют чистую пи-
петку.
3. Стерильные микропланшеты, подходящие для выращива-
ния культуры клеток, выпускаются, например, фирмой Linbro.
Каждый планшет содержит 96 плоскодонных лунок объемом
0,3—0,4 мл. С помощью микропипетки по 0,025 мл каждого
разведения вируса вносят в четыре лунки. В перерывах между
внесениями вируса для сохранения стерильности планшет мож-
но прикрыть стерильной фильтровальной бумагой.
4. Клетки Нер-2с трипсинизируют, снимают со стекла и раз-
водят средой (см. стадия 1) до концентрации 5000—10 000кл/мл.
В каждую лунку вносят по 0,1 мл клеточной суспензии. Для
контроля вносят клетки в один ряд лунок, не содержащих
вируса.
5. Планшет заклеивают достаточно прочной клейкой лентой
и инкубируют при 35°C.
6. На четвертый и седьмой день после заражения исследуют
клетки с помощью инвертированного микроскопа и выявляют
дегенеративные изменения.
” TCID50 — от англ, tissue culture infectious dose — доза, инфекционная
для 50% зараженных клеток. — Прим, перев.
Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов 53
7. Рассчитывают титр вируса. Титром считается разведение,
достаточное для проявления ЦПД в 50% лунок (TCID50). Так,
- например, если при разведении 10~7 дегенерация клеток на-
' блюдается в 50% лунок (т. е. в двух из четырех), то титр
вируса составляет 107 единиц TCID50 на 0,025 мл. Если при
разведении ГО-7 дегенерация наблюдается во всех лунках,
- а при разведении 10~8 — ни в одной, то титр считается равным
IO7,5 единиц TCID50 на 0,025 мл. Дегенерация клеточного мо-
нослоя в одной лунке соответствует изменению титра примерно
на 100’23 единиц TCID50. Титр вируса выражают обычно в
TCID50 на 1 мл.
4.1.2. Определение инфекционности полиовируса типа 3
методом бляшек
1. Планшеты с 6 лунками диаметром 3,5 см (например,
планшеты фирмы Linbro типа FB6) засевают клетками Нер-2с
в концентрации 3-106 на лунку в 3 мл среды (см. разд. 4.1.1,
стадия 1) для использования на следующий день. Можно также
засевать планшеты клетками в количестве 3-105 на лунку и вы-
ращивать до формирования монослоя (3 сут) в термостате в
атмосфере 5% СО2 при 35 °C.
2. Готовят 2%-ный агар (агар Нобль, фирма Difco) на ди-
стиллированной воде в количестве около 1,5 мл на лунку. Агар
автоклавируют (—1 атм, 15 мин) и держат расплавленным
при 56 °C.
3. Готовят двукратный концентрат среды Лейбовича L15,
содержащий 2% ЭТС, 240 мкг/л пенициллина и 200 мкг/л
стрептомицина, в количестве 1,5 мл на лунку. Среду держат
при 37 °C.
4. Готовят последовательные 10-кратные разведения вируса
(см. разд. 4.1.1, стадия 2) на среде Лейбовича L15, содержащей
1% ЭТС, 120 мкг/л пенициллина и 100 мкг/л стрептомицина.
5. Из лунок удаляют среду и вносят по 0,1—0,25 мл вируса
(каждое разведение в две лунки). Вирус ровно распределяют
по поверхности клеточного монослоя и проводят адсорбцию при
комнатной температуре в течение 15—60 мин с периодическим
покачиванием. При этом необходимо следить за тем, чтобы мо-
нослой не подсыхал.
6. Смешивают равные объемы 2 %-кого агара и двукратного
концентрата среды Лейбовича. Смесь слегка охлаждают (при-
мерно до 40 °C) и вносят в каждую лунку по 3 мл. Планшет
покачивают, чтобы агар смешался с вирусом, и дают агару
затвердеть при комнатной температуре.
7. Планшет инкубируют в перевернутом виде, чтобы избе-
жать просачивания конденсата между агаром и монослоем. Ин-
54
Глава 2
кубацию проводят при 35 °C в увлажненном контейнере в тер-
мальной комнате или в увлажненном термостате в атмосфере
5% СО2.
8. Бляшки достигают оптимального размера через 3—4 сут.
Их окрашивают нафталиновым черным, красителем Лейшмана,
кристаллическим фиолетовым по Гимза или каким-либо другим
подходящим красителем. Для приготовления рабочего раствора
нафталинового черного используют 1 г сухого красителя (фир-
ма BDH, Пул, Дорсет, Великобритания), 13,6 г ацетата натрия,
60 мл ледяной уксусной кислоты и дистиллированную воду до
общего объема 1 л.
9. Рассчитывают титр вируса. Если при разведении 10~6 и
внесении 0,1 мл вируса в лунку обнаруживается 19 бляшек,
19-10s
титр инфекционности составляет-^—= 1,9-10а БОЕ/мл,
4.1.3. Сравнение методов определения инфекционности
по TCIDso и по бляшкам
Преимущество метода определения инфекционности по
TCID50 состоит в том, что он не требует сложного оборудова-
ния, легок в исполнении и предполагает использование неболь-
шого количества клеток. Кроме того,— и это, по-видимому, наи-
более существенно в случае пикорнавирусов — для определения
ТСЮ50 достаточно иметь клеточную систему, в которой вирус
вызывает дегенерацию, в то время как метод бляшек требует,
чтобы в толстом клеточном слое формировались хорошо за-
метные бляшки. Если необходима непрерывная регистрация
результатов, можно окрашивать клетки, хотя опытный специа-
лист обычно обнаруживает деструктивные изменения клеточ-
ного слоя и без окрашивания. Метод определения инфекцион-
ности по TCID5o, описанный здесь, не так точен, как метод
бляшек, и позволяет в лучшем случае определять титр вируса
с точностью до 100’5. Однако точность метода можно повысить,
используя большее число лунок на одно разведение вируса.
В любом случае для определения инфекционности по TCID5o
требуется больше разведений вируса, чем для определения ме-
тодом бляшек.
4.2. Методы определения антигенных свойств
Антигенная структура пикорнавирусов необычна в том от-
ношении, что пустые капсиды и некоторые другие неинфекцион-
ные частицы, как правило, несут на своей поверхности анти-
гены, отсутствующие у инфекционных частиц, например «С»- или
«Н»-антигены полиовируса. Аналогичным образом на поверх-
Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов 55
ности инфекционных частиц имеются антигены, не обнаружи-
ваемые в пустых капсидах («D»- или «М»-антигены полиови-
руса). Возможно, на поверхности инфекционных и неинфекци-
юнных частиц есть и общие антигенные детерминанты. «D» или
«N» антигены, характерные для инфекционных частиц, неста-
бильны. Прогревание полиовируса при 56 °C в течение 30 мин
способствует переходу практически всего «D» («Ы»)-антигена
в «С» («Н»)-антиген. Такой же переход в разной степени про-
исходит и в результате адсорбции вируса на твердых подлож-
ках, используемых в радиоиммуноанализе (RIA) и в иммуно-
ферментном анализе (ELISA). ELISA и другие иммуносорбент-
ные методы использовались для выявления антигенов вируса
гепатита А [16], полиовируса [17] и вируса ящура [18]. Мы
встретились со значительными трудностями, пытаясь применить
методы этого типа. Возможно, трудности были вызваны неэф-
фективной адсорбцией вируса, взаимопревращением антигенов,
а частично — неспецифическими эффектами, связанными с тем,
что даже препараты вируса с высоким титром инфекционности
содержат больше клеточного, чем вирусного материала.
Для исследования репродукции вируса применяют также
иммунофлуоресцентные методы [10], но рутинным методом,
используемым в нашей лаборатории для выявления очищенного
вирусного антигена, является одиночная радиальная иммуно-
диффузия [3].
4.2.1. Идентификация полиовируса типа 3
методом одиночной радиальной иммунодиффузии
1. 10 г агарозы типа Seakem ME (фирма Marine Colloids Inc.,
США) растворяют в 1 л фосфатного буферного раствора Дюль-
бекко A (PBSA) в кипящей водяной бане при перемешивании.
2. Раствор агарозы фильтруют через фильтровальную бу-
магу Whatman 113г и добавляют азид натрия до концентра-
ции 0,05%. Раствор делят на аликвоты по 20—25 мл.
3. Стеклянные пластины размером 12X12 см моют детерген-
том, ополаскивают водой и высушивают.
4. Расплавляют агарозу из расчета 14 мл на одну пластину.
Каждая пластина вмещает 16 образцов. Агарозу разливают
в предварительно нагретые сосуды порциями по 12 мл и остав-
ляют при 60 °C; оставшейся агарозой смачивают кусок папи-
росной бумаги, протирают им поверхность каждой стеклянной
пластины и дают агарозе застыть.
5. На внутренний край формы диаметром 9 см наносят тон-
кий слой силиконовой смазки и помещают форму на покрытую
тонким слоем агарозы поверхность стеклянной пластины
(рис. 2.2).
56
Глава 2
Рис. 2.2. Приспособление для приготовления геля для одиночной радиальной
иммунодиффузии, а — стеклянная пластина (12x12 см); б — готовая пластина
агарозного геля; в — форма из оргстекла (16x16 см)
6. Чтобы закрепить форму на пластине, по ее внутреннему
краю наливают небольшое количество расплавленной агарозы
и дают ей затвердеть (5 мин).
7. К каждой порции расплавленной агарозы (12 мл) добав-
ляют нужное количество гипериммунной антиполиомиелитной
сыворотки (обычно 10—15 мкл), тщательно перемешивают, из-
бегая образования пузырей, и выливают в форму, удаляя пузы-
ри, если они все же образуются, пастеровской пипеткой.
8. Агарозе дают затвердеть в течение 10 мин, после чего
удаляют форму резким движением, слегка надавливая на нее
сверху. С помощью штопора или другого подходящего приспо-
собления в агарозе проделывают 16 симметрично расположен-
ных лунок диаметром 4 мм (рис. 2.2).
9. Два объема антигена смешивают с одним объемом
20%-ного (объем на объем) раствора детергента (Мульфоген
BCV-720, фирма GAF Ltd., Манчестер, Великобритания). Чтобы
один раз заполнить лунку, достаточно образца объемом 20 мкл.
После того как жидкость впитается, можно заполнить лунку
еще раз.
10. Слой агарозы накрывают крышкой от чашки Петри (диа-
метр 9 см) и помещают стопку пластин во влажную камеру.
Диффузию проводят в течение 1—3 сут.
Культивированне, идентификация и очистка пикорнавирусов
57
11. Для удаления избытка сыворотки пластины на ночь по-
мещают в PBSA.
12. Буферный раствор сливают и на поверхность агарозы
помещают кружок из фильтровальной бумаги. Пластины высу-
шивают в термальной комнате (37°C) в токе воздуха. Агарозу
окрашивают каким-либо красителем, выявляющим белок (на-
пример, кумасси бриллиантовым синим в 20 %-ной уксусной
кислоте и 50%-ном метаноле), 5 мин при комнатной темпера-
туре. Затем отмывают пластины 20%-ной уксусной кислотой,
50%-ным метанолом и вновь высушивают. Этот метод исклю-
чительно гибок; его легко адаптировать для авторадиографии
или тестирования антител, в том числе моноклональных. Анти-
гены, используемые при этом, должны быть, однако, очищены
во избежание неспецифических эффектов.
4.3. Другие методы идентификации пикорнавирусов
После того как зараженная клеточная культура подверга-
ется дифференциальному центрифугированию или какой-либо
другой процедуре фракционирования, необходимо идентифици-
ровать фракции, содержащие нужный материал. При необхо-
димости можно использовать методы, описанные в разд. 4.1
и 4.2, но они требуют довольно много времени; альтернативные
подходы состоят в том, что во фракциях градиента по погло-
щению в ультрафиолете идентифицируют пики РНК или белка
или же в материал, подвергаемый очистке, включают в каче-
стве маркера радиоактивно меченный вирус. Затем в аликвотах
из каждой фракции любым стандартным методом (например,
с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика) можно
определить радиоактивность. Если есть возможность получить
радиоактивно меченный материал, данный метод очень удобен,
поскольку он занимает мало времени, точен и прост в испол-
нении.
5. Очистка вирусов
5.1. Общие замечания
Препараты пикорнавирусов, полученные из культур тканей,
контаминированы клеточными компонентами, в том числе мемб-
ранами, и если вирус предполагается использовать для анти-
генного или биохимического анализа, его необходимо очистить.
При этом, как правило, используют тот или иной метод центри-
фугирования в градиенте плотности. Если работа ведется со
значительными количествами вируса, очистке обычно предшест-
вует концентрирование, например осаждение вируса сульфатом
58
Глава 2
аммония или полиэтиленгликолем в присутствии хлористого
натрия; осадок затем собирают с помощью низкоскоростного
центрифугирования. Применяют и непосредственное осаждение
вируса ультрацентрифугированием, особенно если исходный
объем невелик.
5.2. Концентрирование пикорнавирусов
5.2.1. Осаждение сульфатом аммония
1. Берут навеску сульфата аммония (используют соль высо-
кой чистоты) из расчета 0,4 г на 1 мл культуральной жидкости.
2. К сульфату аммония приливают культуральную жидкость,
содержащую 1% сыворотки для ускорения осаждения вируса,
и тщательно перемешивают до растворения кристаллов. Раствор
при этом подкисляется и слегка мутнеет.
3. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 g и 4 °C
в течение 1—2 ч, например на центрифуге MSE 4L (Mistral).
4. Супернатант осторожно сливают, а осадок растворяют в
буферном растворе, объем которого должен составлять не ме-
нее 10% исходного, чтобы обеспечить достаточное разбавление
сульфата аммония. Данный метод с успехом применялся как
для кислоточувствительных риновирусов, так и для кислото-
устойчивых энтеровирусов. При этом удается сконцентрировать
вирус не более чем в 10 раз, но преимущество метода в его
быстроте. Выход вируса составляет 99% или больше.
5.2.2. Осаждение полиэтиленгликолем
в присутствии хлористого натрия
1. В 100 мл культуральной жидкости при 4 °C на магнитной
мешалке растворяют 2,22 г хлористого натрия.
2. После растворения соли добавляют 7 г полиэтиленглико-
ля 6000 (фирма BDH, Великобритания).
3. Суспензию перемешивают по крайней мере 4 ч (лучше —
в течение ночи).
4. Суспензию центрифугируют при 2000 g и 4 °C 2 ч, напри-
мер на центрифуге MSE 4L.
5. Супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в PBS,
содержащем 2% бычьего сывороточного альбумина (1/50—
1/100 исходного объема). Суспензию обрабатывают ультразву-
ком или гомогенизируют, чтобы разрушить крупные агрегаты.
6. Суспензию центрифугируют при 3000 g 10 мин для уда-
ления нерастворившегося материала. Данный метод обеспечи-
вает 100%-ный выход вируса, позволяет избежать колебаний
pH и достигнуть более высокой степени концентрирования, чем
метод с использованием сульфата аммония. Однако осаждение
полиэтиленгликолем требует больше времени.
Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов
59
5.2.3. Концентрирование пикорнавирусов
с помощью ультрацентрифугирования
Из пробирки высотой 5 см полиовирус можно количественно
осадить центрифугированием при 100 000 g в течение 1 ч, а из
пробирки высотой 12 см — в течение 3 ч. Данный метод имеет
преимущество перед описанными выше, поскольку не требует
добавления никаких реагентов к препарату вируса, что снижает
вероятность соосаждения примесных белков. Однако метод
удобен лишь при работе с образцами небольшого объема; воз-
можны затруднения и при растворении осадка вируса.
5.3. Очистка пикорнавирусов
5.3.1. Общие замечания
Хотя сами по себе вирионы пикорнавирусов не содержат
липидов, в клеточных фракциях они часто связаны с мембра-
нами, и для разрушения этой связи обычно применяют детер-
гент в концентрации 1%. Если не удалить клеточные мембраны,
то на следующих стадиях очистки не удается освободить вирус
от примесей. Использовались самые разные детергенты, начи-
ная с мягкого неионного детергента нонидета Р-40 (NP-40) и
кончая ДДС-Na или саркозилом. По-видимому, наиболее ра-
зумно использовать мягкие детергенты, так как пустые капсиды
и вирионы некоторых вирусов (например, определенных штам-
мов полиовируса типа 3) могут разрушаться более сильно дей-
ствующими агентами. Мы, как правило, используем 1°/о-ный
NP-40.
Обычно пикорнавирусы очищают центрифугированием в гра-
диенте плотности (хотя применялась и гель-фильтрация, в том
числе в промышленных масштабах). В связи с малыми разме-
рами пикорнавирусы имеют коэффициент седиментации 150—
160 S, меньший, чем у большинства других вирусов. Однако
благодаря отсутствию липидов и исключительно компактной
структуре они имеют высокую плавучую плотность (около
1,34 г/см3 в градиенте плотности хлористого цезия; однако см.
ниже разд. 5.3.3). В градиентах концентрации сахарозы такая
плотность не достигается. Поэтому при очистке применяется
разделение в сахарозных градиентах по скорости седиментации
или разделение по плавучей плотности в градиентах хлорида
или сульфата цезия.
Градиенты фракционируют с помощью имеющихся в прода-
же специальных приспособлений или с помощью той или иной
модификации прибора, изображенного на рис. 2.3.
Среди вирионов полиовируса обнаруживаются инфекционные
частицы с коэффициентом седиментации 150—160 S, обладаю-
60
Глава 2
Рис. 2.3. Приспособление для фракционирования градиентов плотности после
центрифугирования. Черная стрелка в каждом случае указывает направление
вытекания фракций градиента, а белая — направление потока минерального
масла, используемого для вытеснения градиента, п — пробка; с — трубка из
нержавеющей стали; ш — силиконовый шланг; ст — стеклянная трубка. Дета-
ли работы с данным устройством приведены в тексте
щие «П»-антигенностью, и неинфекционные частицы с коэффи- <
циентом седиментации 330 S, обладающие «С»-антигенностью *
и образующиеся, вероятно, из-за неспособности части вирионов
проникнуть в клетки после адсорбции [3]. Пустые капсиды
имеют коэффициенты седиментации около 80 S и несут «С»-ан-
тиген, однако иногда обнаруживаются и частицы с «О»-анти-
геном и коэффициентом седиментации 70 S; могут образоваться
также субвирусные частицы с коэффициентом седиментации
14 S. Очевидно, что если вирус выделяют для иммунологиче-
ского анализа, необходимо разделить все эти компоненты.
Иг К ул ьтивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов 61
К 5.3.2. Очистка пикорнавирусов с использованием градиентов
W концентрации сахарозы
К 1. Готовят два раствора сахарозы в буфере, содержащем
ft 10 мМ трис-НС1 (pH 7,4) и 50 мМ NaCl. Первый раствор со-
Ж держит 15 г, а второй — 45 г сахарозы в 100 мл буфера.
4 2. Используя по 15 мл каждого из этих растворов и при-
способление для получения градиентов, готовят линейные гра-
-диенты концентрации сахарозы (15—45%) объемом 30 мл в
t пробирках объемом 35—40 мл (например, от ротора SW28r
Beckman).
3. Готовят 10%-ный раствор NP-40 в буфере PBS. К образ-
цу добавляют 1/10 объема этого раствора; объем образца не
должен превышать 6 мл. При встряхивании образца с детер-
гентом раствор должен становиться прозрачным.
4. Образец осторожно наслаивают на полученный ранее
градиент. Пробирки уравновешивают минеральным маслом.
5. Пробирки центрифугируют при 80 000 g и 4 °C в течение
4 ч (например, в роторе SW28 на центрифуге L8, Beckman,
при 25 000 об/мин).
6. Градиент фракционируют, как описано в разд. 5.4, или
каким-либо другим методом. Во фракциях определяют содер-
жание вируса. Инфекционный вирус должен давать пик при-
мерно на расстоянии 2/3 длины пробирки от мениска.
Данный метод очистки пикорнавирусов в градиентах кон-
центрации сахарозы не требует много времени и существенных
материальных затрат и мало сказывается на свойствах вирусов
(см. ниже). Однако при этом препараты вирусов могут содер-
жать некоторые контаминанты. Если требуется исключительно
высокая степень очистки, может возникнуть необходимость в
дополнительном центрифугировании в градиенте плотности хло-
ристого цезия. Как правило, это необязательно; можно осадить
вирус для удаления сахарозы (разд. 5.2.3).
5.3.3. Очистка пикорнавирусов центрифугированием
в градиентах плотности хлористого цезия
Можно предложить следующую методику с использованием
преформированных градиентов.
1. Готовят 40%-ный раствор хлористого цезия (вес на вес)»
растворяя 4 г сухой соли в 6 мл 0,01 М трис-НС1 (pH 7,4).
2. Готовят 5%-ный раствор хлористого цезия (вес на вес),
растворяя 0,5 г хлористого цезия в 9,5 мл 0,01 М трис-НС1
(PH 7,4).
3. Используя по 5 мл каждого из приготовленных растворов
и приспособление для получения градиентов, готовят 10 мл ли-
нейного градиента концентрации хлористого цезия (5—40%)
62
Глава 2
в пробирке для ультрацентрифуги объемом 12 мл (например,
от ротора SW41, Beckman). Образец объемом 1 мл, содержа-
щий 1% NP-40, наслаивают на градиент. Можно для приготов-
ления градиента вместо 5%-ного раствора хлористого цезия
использовать 6 мл образца, содержащего 1% NP-40, и 6 мл
40%-ного CsCl. После приготовления градиента используемое
приспособление промывают и дезинфицируют. Пробирки урав-
новешивают минеральным маслом.
4. Градиенты центрифугируют при 120000 g и 4°C по край-
ней мере около 4 ч (предпочтительно в течение ночи, например,
в роторе SW41 на центрифуге L8, Beckman, при 30 000 об/мин).
5. Градиенты фракционируют, как описано в разд. 5.4 или
каким-либо другим методом, и определяют содержание вируса
во фракциях. Можно фракционировать образцы и в устанавли-
вающихся по ходу центрифугирования градиентах, пользуясь
следующей методикой.
1. К раствору образца добавляют сухой хлористый цезий
из расчета 0,46 г на 1 мл конечного объема раствора. Если
объем пробирки 4,5 мл, к образцу добавляют 2,07 г сухого
хлористого цезия и доводят объем до 4,5 мл PBS или 0,01 М
трисом; добавляют NP-40 до концентрации 1% (объем на
объем).
2. Центрифугируют раствор при 140 000 g и 4 °C в течение
24 ч (например, в роторе SW50 на центрифуге LB, Beckman,
при 38 000 об/мин).
3. Градиенты фракционируют, как описано ниже или каким-
либо другим методом, и определяют содержание вируса во
фракциях.
Методы с использованием хлористого цезия требуют суще-
ственных материальных затрат, но позволяют получить высоко-
очищенный вирус и работать с большими объемами образцов
как в случае преформированного, так и формирующегося по
ходу центрифугирования градиента. Использование ДДС-Na в
качестве детергента не рекомендуется, так как додецилсульфат
цезия нерастворим. Существенный недостаток градиентов хло-
ристого цезия помимо высокой стоимости этой соли состоит в
том, что в них может происходить модификация вирусов. В част-
ности, имеются данные, что риновирусы могут поглощать ионы
цезия и в результате приобретать аномально высокую плотность
(1,4 г/мл вместо 1,34 г/мл, обычной для пикорнавирусов) [19].
Аналогичное явление описано и для полиовируса.
5.4. Фракционирование градиентов
В продаже имеются устройства для фракционирования гра-
диентов, но простое самодельное приспособление дает не худ-
шие результаты; при этом оно дешевле и удобнее в обращении.
Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов
63
Это приспособление (рис. 2.3,а) представляет собой рези-
новую пробку, подходящую по диаметру к используемой цент-
рифужной пробирке. В центральное отверстие пробки вставлена
тонкая стальная трубочка; на нее сверху натянут небольшой
кусок силиконового шланга.
1. Пробирку с градиентом зажимают вертикально в штативе
и затыкают пробкой.
2. Силиконовый шланг зажимают, после чего дно пробирки
прокалывают нагретой иглой.
3. Под отверстием в дне пробирки помещают какой-либо
подходящий сосуд и вытекание раствора контролируют, отпус-
кая или частично зажимая силиконовый шланг.
Определяя объем на глаз, легко собирать фракции по 0,5—
2 мл; этим методом удобно пользоваться, если нужно собрать
пиковые фракции, а в точном определении скорости седимен-
тации необходимости нет. На рис. 2.4, а приведен результат
подобного раскапывания градиента объемом 36 мл на 2-мл
фракции; в градиенте центрифугировали вирус, меченный
[3SS]-метионином. Здесь А — пик инфекционных частиц (155 S),
а В (80 S) —пик пустых капсидов.
Градиенты можно фракционировать, не прокалывая дно
пробирки, с помощью приспособления, показанного на рис. 2.3, б.
Оно представляет собой резиновую пробку, в которую вставле-
ны тонкая стальная трубка, соединенная с коротким куском
силиконового шланга (/), стеклянная трубка, соединенная си-
ликоновым шлангом с резервуаром, содержащим жидкое мине-
ральное масло (2), и стеклянная трубка, одним концом доходя-
щая до дна центрифужной пробирки, а другим соединенная
с силиконовым шлангом (<?).
а) пробирку вертикально зажимают в штативе;
б) трубки 2 и 3 зажимают и пробку осторожно вставляют
в пробирку;
в) с трубки 2 снимают зажим и впускают в верхнюю часть
пробирки масло так, чтобы оно заполнило трубку /;
г) трубку 1 зажимают;
д) с трубки 3 снимают зажим и, по мере того как раствор
вытесняется со дна пробирки, собирают фракции объемом
0,5—2 мл каждая.
Данный метод позволяет повторно использовать пробирки,
но можно предположить, что в этом случае произойдут нару-
шение градиента и контаминация вируса. На практике, однако,
мы с этим не встречались. На рис. 2.4,6 приведены результаты
раскапывания градиента объемом 36 мл, в котором центрифу-
гировали меченный 32Р полиовирус, на 2-мл фракции. Здесь
А— пик инфекционного вируса.
Более точное раскапывание градиента на фракции опреде-
64
Глава 2
Номер франции
Рис. 2.4. Примеры фракционирования градиентов, содержащих радиоактивно
меченный вирус, с помощью устройства, показанного на рис. 2.3. а — мечен-
ный f35S]-метионином вирус, фракционирование градиента с помощью устрой-
ства типа (а) (фракции по 2 мл); б — меченный 32Р вирус, фракционирование
градиента с помощью устройства типа (б) (фракции по 2 мл); в — меченный
[36S] -метионином вирус, фракционирование с помощью устройства типа (в)
(фракции по 0,5 мл). По оси абсцисс отложены номера фракций, а по оси
ординат — радиоактивность в 50 мкл, выраженная в имп./мин-10-3. Направ-
ление центрифугирования во всех случаях справа налево; данные для верх-
них фракций градиентов не приведены. А — пик инфекционных вирионов
(160S); В — пик пустых капсидов (80S); С — пик неинфекционных РНК-со-
держащих частиц (130S)
ленного объема может быть достигнуто с помощью приспособ-
ления, показанного на рис. 2.3, в. Оно, как и описанные выше
приспособления, представляет собой резиновую пробку, в ко-
торую вставлены стальная трубка, соединенная с коротким
куском силиконового шланга (/), и стеклянная трубка, соеди-
ненная с дозатором, позволяющим вводить в пробирку порции
минерального масла объемом 0,5—2 мл (2).
Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов
65
а) пробирку в вертикальном положении зажимают в шта-
тиве;
б) в пробирку вставляют резиновую пробку;
в) в пробирку вводят масло до тех пор, пока оно не нач-
нет вытекать из трубки 1, после чего трубку J зажимают;
' г) дно центрифужной пробирки прокалывают;
, д) вытесняя из пробирки порции раствора равного объема
введением соответствующих порций масла, собирают фрак-
ции.
На рис. 2.4, в приведен результат раскапывания градиента
объемом 36 мл, содержащего меченный [35S]-метионином по-
лиовирус типа 3, на фракции объемом 0,5 мл. Здесь А — пик
инфекционного вируса (155 S), В — пик пустых капсидов (80S),
;С— пик неинфекционных частиц, содержащих РНК (130 S).
Г Литература
* 1. Andrewes С., Pereira Н. G., Wildy Р. (1978). Viruses of Vertebrates, 4th
(edition, published by Balliere Tindall, London.
2. Crainic R., Coullin P., Blondel B., Cabau N., Boue A., Horodniceanu F.
(1983). Infect. Immun., 41, 1217.
3. Minor P. D., Schild G. C„ Wood J. M., Dandawate C. N. (1980). J. Gen. Virol.,
51, 147.
4. Cann A. J., Stanway G., Hauptmann R., Minor P. D., Schild G. C., Clar-
ke L. D., Mountford R. C., Almond I. №. (1983). Nucleic Acids Res., 11,
1267.
*. . 5, Crowell R. L., Philipson L. (1971). J. Virol., 8, 509.
6. Nottay B. R., Rew О. M„ Hatch M. H., Heyward J. T., Obijeski J. F. (1981).
Virology, 108, 405.
7. Minor P. D. (1982). J. Gen. Virol., 59, 307.
8. Semler B. L., Anderson C. W„ Kitamura N., Rothberg P. G., Wictor W. L„
Wimmer E. (1981). Proc. Natl. Acad. Set. USA, 78, 3464.
9. Ferguson M., Qi Yi-Hua, Minor P. D., Magrath D. I., Spitz M., Schild G. C.
(1982). Lancet, II, 122.
, 10. Provost P. I., Hilleman P. R. (1979). Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 60, 213.
11. McClaren L. C., Holland J. J. (1974). Virology, 60, 579.
12. Zagac I., Crowell R. L. (1965). J. Bacteriol., 89, 574.
13. Erickson J. W., Frankenbergen E. A., Rossmann M. G., Font G. S., Me-
dap pa R. C., Rueckert R. R. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 931.
14. Denoya C. D., Scodeller E. A., Vasquez C., La Torre J. L. (1978). Arch. Virol.,
57, 153.
15. Domok I., Magrath D. I. (1979). WHO Offset Publication, No. 46.
16. Mathieson L. R., Freestone S. M., Wong D. C., Skinboej P., Purcell R. H.
(1978). J. Clin. Microbiol., 1, 184.
. 17. Hagenaars A. M., van Delft R. W„ Nagel J., van Steenis G., van Wezel A. L.
(1983). Intervirology, 6, 233.
18. Doel T. R., Collen T. (1983). J. Biol. Stand., 10, 69.
19. Medappa R. C., Rueckert R. R. (1974). Am. Soc. Microbiol. Abstr., 207.
5—369
ГЛАВА 3
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, ТИТРОВАНИЕ
И ОЧИСТКА ТОГАВИРУСОВ
Е. Гулд и Дж. Клегг
1. Введение
В семействе Togaviridae выделяют два основных рода — аль-
фавирусы и флавивирусы1), ранее называвшиеся соответственно
вирусами групп А и В. Вирусы в пределах каждого из родов
имеют антигенное родство, сходные циклы репродукции и мор-
фологические особенности; в то же время вирусы, принадлежа-
щие к разным родам, различаются по антигенным свойствам
[1]. К указанным выше вирусам применяют также название
«арбовирусы» (от англ, arthropod-borne viruses, т. е. вирусы,
переносимые членистоногими) из-за их способности размно-
жаться как в организме позвоночных, так и в организме чле-
нистоногих. Другие роды данного семейства не рассматрива-
ются в настоящей главе.
В течение многих лет основным способом выделения диких
штаммов арбовирусов было заражение новорожденных мышат,
однако в настоящее время с этой целью начинают использовать
комаров, их личинки, а также и культуры клеток беспозвоноч-
ных. Данные системы особенно важны для выделения некото-
рых медленно размножающихся арбовирусов, например вируса
денге.
Методы, используемые для определения инфекционности,
зависят от имеющегося оборудования, конкретного вида вируса
и характера данных, которые должны быть получены. Так, на-
пример, в некоторых странах заражение новорожденных мышат
является более удобным и дешевым способом титрования ин-
фекционности арбовирусов, чем заражение культур клеток ко-
маров, в то время как в других странах ситуация противопо-
ложная. Кроме того, в тех случаях, когда нужна максимальная
точность, используют линии клеток комаров. С другой стороны,
пока не доказано, что все тогавирусы способны размножаться
в этих клетках.
Там, где возможно, мы будем описывать несколько методов,
их преимущества и недостатки, приводя конкретные примеры.
Очищенные вирионы необходимы для различных целей: их
В настоящее время флавивирусы выделяют в отдельное семейство
Flaviviridae. — Прим, перев.
₽ Культивирование, титрование и очистка тогавирусов 67
используют для изучения состава и строения самих вирионов,
4 также в качестве исходного материала для получения инди-
видуальных структурных компонентов. В зависимости от задач
эксперимента в препарат вируса можно ввести радиоактивную
метку, выращивая вирус в присутствии радиоактивных изото-
нов, например [2 3Н] -уридина или [32Р]-ортофосфата для мече-
ния РНК, [35S] -метионина для мечения белков или [3Н]-глю-
козамина или маннозы для мечения гликопротеинов. Если при
очистке меченого вируса обычно используют небольшое коли-
чество клеточной культуры и соответственно работу ведут
с малым объемом жидкости, то при очистке больших количеств
немеченого вируса может потребоваться обработка нескольких
литров культуральной жидкости; при этом на последних стади-
ях очистки может быть достигнута исключительно высокая кон-
центрация инфекционного вируса.
Важно отметить, что многие вирусы данного семейства счи-
таются опасными. Поэтому необходимо принимать соответству-
ющие меры к тому, чтобы между экспериментатором и вирусом
всегда существовала физическая преграда. В большинстве
стран действуют строгие правила, допускающие использование
в целях обучения и фундаментальных исследований лишь опре-
деленных штаммов. Названия вирусов, их хозяева-беспозво-
ночные, необходимые меры безопасности, наиболее распростра-
ненные лабораторные хозяева и чувствительные клеточные
культуры описаны в Каталоге арбовирусов [2].
2. Культивирование тогавирусов
2.1. Заражение новорожденных мышат
При интрацеребральном заражении новорожденных мышат
содержащим тогавирусы материалом во многих случаях удает-
ся получить вирус в высоком титре. При заражении многими
вирусами мышата погибают в течение 2—8 сут, хотя для не-
которых природных изолятов может потребоваться один или
два «слепых» пассажа (см. ниже), прежде чем будет достигнут
высокий титр. Мозг зараженных мышат в качестве источника
вируса следует брать не раньше чем за несколько часов до их
гибели. Обычно в последние сутки жизни у зараженных жи-
вотных нарушается координация движений, часто наступает
паралич задних конечностей, и через несколько часов они поги-
бают. Следует ежедневно наблюдать за инфицированными жи-
вотными; гибель в течение первых суток после заражения счи-
тается неспецифической.
Если в течение 6 сут после заражения нет очевидных симп-
томов заболевания, следует забить половину животных и их
68
Глава 3
мозг ввести новой группе новорожденных мышат. Такую про-
цедуру называют «слепым пассажем». Если после двух слепых
пассажей по-прежнему не обнаруживается симптомов заболе-
вания, считают, что исследуемый материал не содержит вируса.
Природный материал в отличие от штаммов вируса, адаптиро-
ванных в лаборатории, может и не давать одинаковой картины
заболевания во всей группе зараженных животных. Поэтому
целесообразно исследовать отдельно мозг каждого животного,
заболевшего через двое суток после заражения или позже.
2.1.1. Подготовка материала
для заражения новорожденных мышат
Беременных мышей незадолго до родов отсаживают в от-
дельные чистые клетки и наблюдают за ними ежедневно. Дату
рождения мышат регистрируют и через 2—3 сут? после рожде-
ния оставляют не более 10 новорожденных на одну мать. Для
снижения риска поедания новорожденных матерями при работе
с ними следует пользоваться перчатками. Если имеется не-
сколько пометов одного и того же возраста, их объединяют
и распределяют по 8—10 штук на клетку. Как правило, для
выделения и наращивания вирусов используют мышат не стар-
ше 4 сут, если только по специфическим условиям экспери-
мента не требуются детеныши большего возраста. Для выделе-
ния вируса из образцов сыворотки последнюю вводят в мозг
мышат без разведения. Из мозга и других тканей готовят
10%-ную суспензию в растворе, содержащем 25% инактивиро-
ванной нагреванием ЭТС. Комаров или их личинок для приго-
товления суспензии тоже растирают в ступке, затем добавляют
2 мл раствора, содержащего 25% ЭТС. После растирания сус-
пензию разливают по пробиркам, центрифугируют при 1500 g
в течение 15 мин и супернатант используют для заражения.
Суспензию можно длительно хранить при —70 °C. Если извест-
но, что препараты содержат вирус в высоком титре, готовят
серию 10-кратных разведений. Максимальным титром вируса
считают то наибольшее разведение, которое еще обеспечивает
развитие заболевания у всего помета мышат. Вся работа по
заражению животных должна проводиться в полностью изоли-
рованных ламинарных боксах, удовлетворяющих правилам
техники безопасности, принятым в данной стране.
Необходимо также иметь следующее дополнительное обору-
дование и материалы: перчатки одноразового пользования,
стерильные шприцы одноразового пользования объемом 1 мл,
стерильные иглы для инъекций № 26 одноразового пользова-
ния, бумажные полотенца, пробковую панель для фиксации
мышат, метанол.
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов
69
2.1.2. Методика заражения
йх<1. Внутри ламинарного бокса на пробковую панель кладут
бумажное полотенце.
2. В шприц набирают используемый для заражения матери-
ал (работать необходимо в перчатках внутри ламинарного
бокса).
3. Новорожденного мышонка помещают на бумажное поло-
тенце.
4. Как показано на рис. 3.1, животное крепко, но осторожно
зажимают пальцами и вводят в одно из полушарий мозга
1X01 мл образца. Нельзя вводить иглу в мозг слишком глубоко;
Рис. 3.1. Интрацеребральное заражение новорожденного мышонка. Иглу сле-
дует вводить в левое или правое полушарие головного мозга на глубину не
более 1,5 мм
ее следует задержать в мозге на две секунды и затем медлен-
но вынуть. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не будет
заражен весь помет. Во время заражения, для того чтобы руки
экспериментатора не дрожали, можно опираться ими о перед-
нюю панель ламинарного бокса.
5. При выделении вируса из природного материала следует
использовать не менее двух пометов мышат. Титрование виру-
са начинают с максимального разведения* чтобы для всей ра-
боты можно было использовать одни и те же иглу и шприц.
6. Каждый помет мышат возвращают к матери. Клетку ну-
меруют и ставят обратно на стеллаж.
70
Глава 3
2.1.3. Методика учета результатов и сбора вируса
1. Животных осматривают ежедневно, предпочтительно рано
утром. Их состояние регистрируют следующим образом: П —
павшее животное; С — имеются симптомы заболевания; Н —
состояние нормальное; О — животное отсутствует. Павших жи-
вотных удаляют из клеток с помощью пинцета, используя для
каждой клетки отдельный пинцет.
2. В мозге мышат как с выраженными симптомами заболе-
вания, так и у павших, но не более чем за 1—2 ч до момента
наблюдения, должно содержаться значительное количество ви-
руса. Мышат, у которых имеются четкие симптомы, умерщвля-
ют в закрытом сосуде парами хлороформа или эфира.
Рис. 3.2. Новорожденный мышонок, умерщвленный эфиром и приколотый
к пробковой панели для извлечения головного мозга
3. На пробковую панель кладут одно поверх другого два
бумажных полотенца.
4. Умерщвленного мышонка прикрепляют к пробковой па-
нели, вводя одну иглу в нос и другую в основание хвоста, как
показано на рис. 3.2.
5. Животное протирают достаточным количеством метано-
ла, после чего отделяют скальп, пользуясь стерильными пинце-
том и ножницами. Затем, используя другую пару стерильных
инструментов (свою для каждого животного), вскрывают че-
реп. Для этого применяют ножницы с одним острым, а другим
тупым концом. Острый конец ножниц вводят в череп сзади по
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов
71
Рис. 3.3. Метод вскрытия черепа для извлечения мозга. Острый конец ножниц
вводят сзади под свод черепа, вскрывают череп с одной стороны, затем пере-
ворачивают ножницы и вскрывают череп с другой стороны
Центру и делают разрез под сводом черепа в направлении кон-
чика морды (рис. 3.3, а). Затем ножницы переворачивают и де-
лают такой же разрез с другой стороны головы. После этого
свод черепа можно поднять, обнажив мозг (рис.3.3б), который
легко вынуть концом закрытых ножниц.
72
Глава 3
6. Мозг немедленно помещают в стеклянный флакон объе-
мом 25 мл, содержащий стеклянные бусы (диаметр 3—5 мм).
В один флакон можно поместить мозг от 15 животных.
7. Крышку флакона плотно закручивают и содержимое тща-
тельно перемешивают 30 с, либо энергично встряхивая, либо
с помощью миксера (типа «Вортекс»).
8. Во флакон добавляют используемый для приготовления
суспензии раствор из расчета 1 мл на мозг одного новорожден-
ного мышонка или 1,5 мл на мозг сосунка. Работу проводят
в ламинарном боксе, экспериментатор должен пользоваться
перчатками.
Рис. 3.4. Метод извлечения мозга новорожденного мышонка, замороженного
при —70 °C
9. Флакон вновь плотно закрывают и энергично встряхива-
ют, как описано выше, 30 с.
10. Суспензию центрифугируют при 1500 g и 4 °C в течение
15 мин.
11. Полупрозрачный супернатант, представляющий собой
20%-ную суспензию вирусного антигена из мозга мышат, от-
бирают, делят на порции и хранят при —70 °C. Работу ведут
в ламинарном боксе.
Этот метод можно модифицировать, начиная со стадии 5,
если у новорожденных мышат симптомы развились не позже
пятого-шестого дня. В этом случае мышат можно непосредст-
венно заморозить при —70°C.
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов
73
1. Замороженного мышонка помещают в ламинарный бокс
ают ему полностью оттаять.
2. Мышонка фиксируют, как описано выше, прокалывают
еп сзади и набирают в шприц полужидкий мозг (при этом
ользуют одноразовый шприц и иглу № 18).
3. Тем же шприцем (не опустошая его и не вынимая из
са) из пробирки, содержащей 2 мл раствора для разведе-
; (2% ЭТС), отбирают 0,5 мл. Суспензию мозга осторожно
(авливают из шприца в ту же пробирку. При этом необхо-
ю быть уверенным в том, что конец иглы находится ниже
ерхности раствора. Иначе зараженный материал образует
озоль.
4. Суспензию центрифугируют, как описано выше. Осветлен-
i супернатант соответствует примерно 10%-ной суспензии
.усного антигена из мозга сосунков.
Получив вирусный антиген, необходимо уничтожить путем
мигания все трупы животных, бумажные полотенца, перчатки
^.инструменты одноразового пользования. Остальные инстру-
ненты и клетки для животных стерилизуют, а ламинарный бокс
тщательно дезинфицируют.
' 2.2. Выделение и наращивание тогавирусов
в культуре клеток комаров
Показано, что во многих случаях культуры клеток беспо-
звоночных более чувствительны к альфа- и флавивирусам, чем
новорожденные мышата или культуры клеток позвоночных.
В особенности это относится к первичному выделению вирусов.
Если в лаборатории имеются условия для культуральной ра-
боты, клетки беспозвоночных можно легко нарастить и исполь-
зовать для постоянной работы с тогавирусами. Для некоторых
линий клеток комаров характерна высокая чувствительность
к переносимым комарами альфа- и флавивирусам [3, 4], при-
чем многие из этих вирусов способны образовывать бляшки,
ХОТЯ результаты, по-видимому, до некоторой степени зависят
от конкретных условий эксперимента [5]. Если какой-либо
конкретный метод не дал хороших результатов, имеет смысл
попытаться применить другой. Например, обычно клетки кома-
ров для культивирования и выделения вирусов инкубируют при
*7 28°C, но в случае вируса денге лучшие результаты полу-
чают при повышении температуры до 32 °C [6]. Имеется ряд
стандартных клеточных линий, и если размножение вируса не
Удается в одной из них, имеет смысл испытать другую. Подроб-
ные сведения об используемых средах приведены в при ложе-
74
Глава 3
Культивирование, титрование и очистка
2.2.1, Культивирование клеток комаров
1. С монослоя клеток сливают среду и добавляют в каждый
флакон 5—10 мл свежей среды.
2. Клетки снимают со стекла либо пипетированием, либо
с помощью стерильной палочки с резиновым наконечником.
3. Убедившись в том, что получена гомогенная суспензия,
с помощью гемоцитометра определяют концентрацию клеток.
Для этого подсчитывают клетки в четырех больших угловых
квадратах (каждый из которых состоит из 16 маленьких квад-
ратов). Число клеток в 1 мл подсчитывают, умножая среднее
число клеток в одном большом квадрате на 104. Обычно ре-
зультаты получаются наиболее точными, если в одном большом
квадрате содержится 100—200 клеток. С таким расчетом и сле-
дует готовить разведение клеток.
4. После подсчета суспензию разводят культуральной средой
до концентрации 2-105 кл/мл и разливают по стерильным куль-
туральным сосудам. Необходимый объем суспензии зависит от
типа используемого сосуда; толщина слоя жидкости в сосуде
должна составлять 2—4 мм.
5. Клетки инкубируют при 28 °C. Если среда содержит
в качестве буфера бикарбонат натрия, культуру инкубируют
во влажной камере в атмосфере 5% СО2, причем пробки
в культуральных сосудах закрывают неплотно.
6. Плотный монослой клеток формируется обычно в течение
3—6 сут.
2.2.2. Наращивание тогавирусов в культурах клеток комаров
1. С монослоя клеток удаляют культуральную среду и- не-
посредственно на монослой в небольшом объеме наносят ви-
рус. Раствор, содержащий вирус, распределяют по всему моно-
слою и инкубируют клетки 1 ч при комнатной температуре,
проверяя каждые 10 мин, покрыт ли монослой жидкостью. При-
родный материал, обычно хранящийся в растворе с 25% ЭТС
и антибиотиками, не разводят перед заражением. Если же ис-
пользуют вирус, уже адаптированный к размножению в культу-
ре клеток или мозге мышей, его разводят соответствующей
средой по крайней мере в 100 раз.
2. После адсорбции вируса к клеткам добавляют среду,
чтобы получить слой жидкости толщиной 2—4 мм, и инкуби-
руют клетки при 28 °C (в случае необходимости в СО2-инкуба-
торе). Если есть основания предполагать, что вирус лучше
размножается при более высокой температуре, часть флаконов
с культурой инкубируют в соответствующих условиях.
3. Состояние культур проверяют ежедневно, пользуясь ин-
вертированным микроскопом с небольшим увеличением.
На соответствующем
Жаке супернатант отбира-
ТИЁй центрифугируют при
щО g и 4 °C в течение 15
38'- 5. Осветленную культу-
ральную жидкость хранят
фри —70 °C, что способству-
ет сохранению инфекцион-
восги.
^--Контрольная незаражен-
здя культура должна со-
хранять нормальный вид по
крайней мере в течение 14
сут. Многие альфа- и фла-
вивирусы не дают ЦПД при
размножении в клетках ко-
маров при 28 °C. В этих
случаях вирус необходимо
идентифицировать каким-то
другим методом, например
Су помощью иммунофлуорес-
ценции, гемагглютинации
или по способности вызы-
вать летальное заболевание
у новорожденных мышат.
Ожидаемый тип ЦПД зави-
сит от вируса и от частоты
пассирования клеток. Наи-
более часто встречаются
Д>а типа ЦПД — образова-
ние сйнцитиев и округление
клеток, сопровождающееся
их отделением от субстрата
(рис. 3.5, а, б, в). Инфекци-
онный вирус выделяется в
Культуральную среду. Как
правило, альфавирусы об-
Рис. 3.5. Действие тогавируса на
монослойную культуру клеток ко-
маров (линия АР61) . а—кон-
трольная незараженная культура:
о—гигантский синцитий, возник-
ший в результате слияния мембран
Отдельных клеток; в — округлив-
шиеся клетки, которые могут от-
делиться от субстрата
76
Глава 3
наруживаются в среде в достаточно высоком титре, начиная
со второго дня после заражения клеток. Однако для того, чтобы
получить высокий выход флавивирусов, может потребоваться
5 сут или более. При ежедневной смене культуральной среды
продукция вируса сохраняется. Это особенно полезно, если для
концентрирования и анализа требуется большое количество
вируса.
2.2.3. Метод непрямой иммунофлуоресценции
как способ идентификации вируса при отсутствии ЦПД
Данный метод предполагает использование специфической
антивирусной сыворотки, антител против нее, конъюгирован-
ных с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), и флуоресцентного
микроскопа. Некоторые ФИТЦ-конъюгированные антитела име-
ются в продаже.
1. Снимают небольшую часть инфицированных клеток с по-
верхности культурального флакона,
2. Клетки осаждают центрифугированием при 1500 g в те-
чение 10 мин.
3. Клетки ресуспендируют в небольшом объеме PBS (около
0,5 мл; см. приложение).
4. Готовят стекло для микроскопии, вычерчивая на обезжи-
ренном предметном стекле несколько небольших кружков ал-
мазным пером.
5. В каждый кружок на стекле наносят по капле клеточной
суспензии.
6. Каплям дают высохнуть при комнатной температуре, ос-
тавляя стекло в ламинарном боксе, затем погружают его на
10 мин в охлажденный до 4 °C ацетон. Стекло используют не-
посредственно или хранят при —70 °C.
7. На высушенные капли наносят соответствующие разведе-
ния антивирусной сыворотки.
8. Стекло помещают на 5 мин в PBS, буферный раствор за-
меняют свежим и инкубируют стекло дважды (5 и 10 мин).
9. Стекло насухо промокают фильтровальной бумагой и на-
носят на каждое пятно ФИТЦ-конъюгированные антитела.
Стекло инкубируют, промывают и сушат, как описано выше.
10. На стекло наносят забуференный глицерин (9 объемов
глицерина и 1 объем забуференного фосфатами NaCl) и накры-
вают покровным стеклом.
11. Препарат исследуют с помощью флуоресцентного микро-
скопа, используя источник ультрафиолета и светофильтр, обес-
печивающий регистрацию флуоресценции.
12. Зараженные клетки можно узнать по интенсивной флуо-
ресценции, в то время как незараженные выглядят темными
или вообще не видны. Специфичность флуоресценции можно
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов 77
проверить, исследуя контрольные незаряженные клетки. Если
"наблюдается неспецифическая флуоресценция всех клеток,
>антисыворотку разводят до тех пор, пока не удается зарегист-
рировать специфическую флуоресценцию зараженных клеток.
U3. На рис. 3.6 приведена черно-белая фотография типич-
ного препарата, приготовленного описанным способом.
Рис. 3.6. Иммунофлуоресценция клеток, зараженных вирусом денге, после дот-
блот гибридизации. В этом случае клетки не распластываются, как в моно-
слое. Зараженные клетки дают яркую иммунофлуоресценцию (на фотогра-
фии они белые)
2.3. Наращивание вирусов в культуре клеток млекопитающих
Имеется несколько линий клеток млекопитающих, чувстви-
тельных к тогавирусам. Применение этих линий особенно эф-
фективно после того, как вирусы выделены и их титры повы-
шены путем адаптации в лабораторных условиях. Поскольку
методы культивирования указанных выше клеток в основном
одни и те же, мы опишем только один. В большинстве случаев
можно использовать любую из широко распространенных ли-
ний клеток (например, Vero, LLCMK2, ВНК-21 или РК15).
Имеется много сред разного состава (см. приложение); лучше
всего использовать ту среду, в которой данная клеточная ли-
ния постоянно культивируется поставщиком. Однако следует
отметить, что среда Лейбовича-Ы5 имеет определенные пре-
имущества, так как не требует СОг-инкубатора или HEPES-
буфера; в присутствии 10% ЭТС эта среда подходит для роста
78
Глава 3
всех перечисленных выше линий клеток. Полезно также заме-
тить, что клетки, Vero исключительно стабильны и их можфо
оставлять на 10—14 сут при 37°С без пересева. )
2.3.1. Пересев клеток млекопитающих
1. С плотного монослоя клеток удаляют культуральную
среду. На монослой наносят 5 мл теплой (37°C) смеси трип-
сина и версена (см. приложение), быстро ополаскивают клет-
ки и сливают раствор. Эту процедуру повторяют трижды.
2. Культуральный флакон на 1—2 мин помещают в термо-
стат с температурой 37 °C, после этого энергично постукивают
по стеклу рукой; при этом клетки должны отделиться от субст-
рата. Как только это произойдет, клетки ресуспендируют
в подходящем объеме (5—10 мл) свежей среды.
3. С помощью гемоцитометра определяют концентрацию
клеток и доводят ее культуральной средой до 2-Ю5 кл/мл.
4. Клеточную суспензию разливают по культуральным сосу-
дам таким образом, чтобы толщина слоя жидкости составляла
2—4 мм.
5. Клетки инкубируют при 37 °C, в случае необходимости
в СОг-инкубаторе с увлажненной атмосферой.
2.3.2. Наращивание тогавирусов
в клетках млекопитающих
На практике в большинстве случаев титр инфекционного
вируса, истТользуемого для заражения, известен и составляет
около 10® БОЕ/мл или выше. Если отсутствует особая необхо-
димость использовать для заражения очень большое или, на-
оборот, очень маленькое количество вируса, лучше всего вно-
сить его с таким расчетом, чтобы зараженными оказались 1—
10% клеток в монослое. Если титр вируса неизвестен, следует
сначала взять для заражения 2—3 разные концентрации. Из-
быток вируса при заражении клеток не приводит к повышению
его выхода.
1. Перед заражением клеточного монослоя из культурально-
го сосуда удаляют среду.
2. На монослой наносят небольшой объем вируса в соответ-
ствующем разведении (в той же среде) так, чтобы только по-
крыть клетки.
3. Клетки инкубируют 1 ч при комнатной температуре, каж-
дые 10 мин проверяя, покрыт ли монослой средой.
4. Если клетки используются для выделения вируса из
природных образцов, то после часовой адсорбции вируса к ним:
сразу же добавляют свежую среду. Если же вирус уже адап-
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов
79
йрован к размножению в культуре клеток или мозге новорож-
денных мышат, то его удаляют, клетки осторожно промывают
(А—20 мл культуральной среды и добавляют такой объем сре-
,ы\ чтобы толщина слоя жидкости в сосуде составляла 2—4 мм.
5- При появлении признаков ЦПД среду собирают, центри-
фугируют 15 мин при 1500 g и хранят при —70°С или исполь-
зуют \ непосредственно для заражения свежей культуры.
’ Большинство альфавирусов в течение 2 сут дают выражен-
ное Щ1Д. При этом сначала клетки вытягиваются и приобре-
тают очень длинные отростки (рис. 3.7, а и б); затем они ок-
ругляются и отрываются от субстрата. При заражении клеток
флавивирусами ЦПД обычно развивается медленнее, начиная
с третьего или четвертого дня после заражения. Во многих
случаях монослой сохраняет целостность в течение нескольких
'дней, хотя отдельные клетки округляются и отрываются от
субстрата. Если клетки такого монослоя пересеять на свежую
среду, они обычно вновь дают монослой и продолжают проду-
цировать инфекционный вирус. Пока монослой сохраняет свою
.-целостность, ежедневно меняя культуральную среду, можно
получить значительное количество вируса.
Альтернативный подход состоит в том, чтобы заражать сус-
пензию клеток, а затем высевать ее в культуральные сосуды
для образования монослоя. Этот метод имеет определенные
преимущества, например, при исследовании клеток путем имму-
нофлуоресценции или при необходимости одновременной обра-
ботки большого числа образцов.
1. Клетки снимают со стекла смесью трипсина и версена,
как описано выше.
2. Готовят суспензию клеток, определяют их концентрацию
и доводят ее культуральной средой до 2-Ю7 кл/мл.
3. К аликвотам клеток добавляют вирус в таком разведе-
нии, чтобы заразить 1—10% клеток. Перемешивают содержи-
мое 1 ч при комнатной температуре.
4. Если зараженные клетки используются для иммунофлуо-
ресценции, аликвоты клеточной суспензии разводят до концент-
рации 2-Ю5 кл/мл и высевают в чашки Петри с покровными
стеклами.
5. Чашки инкубируют при 37°C до тех пор, пока в 30—50%
клеток методом иммунофлуоресценции не будет обнаруживать-
ся вирусный антиген.
По этому же принципу можно получить культуру заражен-
ных клеток на покрытых тефлоном пластинах или пластинах
Терасаки. Кроме того, таким же способом получают персис-
тентно зараженные клеточные культуры. В этом случае панели
«ли стекла с клетками инкубируют 4—6 ч при 37 °C во влаж-
ной камере.
80
Глава 3
Рис. 3.7. Действие альфавируса на клетки Vero, а — контрольная незаражен-
ная культура; б — монослой клеток на относительно ранней стадии инфекции
альфавирусом, например вирусом Синдбис или вирусом леса Семлики. Обра-
тите внимание на длинные отростки зараженных клеток. На каждом из этих
отростков на последующих стадиях инфекции обнаруживается большое число
почкующихся вирионов
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов
8t
. 2.4. Выращивание вирусов на комарах и их личинках
Для работы этим методом необходимо располагать поме-
тем, пригодным для содержания насекомых, и квалифици-
анным персоналом. Работа с насекомыми требует извест-
; навыков. Вирус денге и некоторые другие флавивирусы,
к правило, трудно выделить из природного материала. Пока-
ио, что методы определения инфекционности путем зараже-
я комаров и их личинок высокочувствительны, а в случае
чинок, кроме того, занимают немного времени [7]. Ниже
атко описаны конкретные методики, но рекомендуется поль-
ваться ими лишь при наличии соответствующего оборудова-
Я и возможности потратить некоторое время на освоение
аовных методических приемов.
2.4.1. Интраторакальное заражение комаров
9 Оборудование, необходимое для заражения комаров, по-
дробно описано в работе Розена и Габлера [8]. Комаров по-
мещают в охлажденный контейнер или пробирку, погруженную
Жледяную баню. При этом подвижность комаров резко снижа-
йся, но они не погибают. Перед заражением следует убедить-
ж в том, что используемый микрошприц заполнен воздухом
Зяглу необходимо изолировать трехходовым клапаном от ка-
1|йллярной трубки, содержащей инфекционный материал). Не-
подвижного комара помещают на предметный столик микрос-
копа и, глядя в микроскоп, вводят иглу в грудь непосредствен-
но под кутикулу. Имеющийся на шприце переключатель
'Ставят в рабочее положение и вводят в грудь комара около
0>2 мкл содержащего вирус препарата. Инъекцию прекраща-
ет, переводя переключатель в открытое положение. Иглу из-
влекают и комара пересаживают во временный контейнер. Всю
"Орерацию нужно проводить максимально быстро, чтобы
-Комар не успел улететь. После окончания заражения комаров
помещают обратно в постоянные инкубаторы.
- 2.4.2. Интрацеребральное заражение личинок комаров
Используют то же оборудование, что и для описанного вы-
itte заражения комаров. На предметный столик микроскопа
Помещают кусок влажной ткани, а на него личинку, которую
Осторожно придерживают пинцетом. Иглу вводят на глубину
около 0,5 мм в дорзальную часть головной капсулы, позади
глаз и между передними экдизиальными линиями (рис. 3.8).
Вводят примерно 0,1—0,2 мкл раствора, после чего удаляют
иглу, а зараженную личинку возвращают в инкубатор. С ин-
0—-369
«2
Глава 3
Рис. 3.8. Интрацеребральное заражение личинок комаров. Показана точка,
в которую следует вводить иглу
тервалом в сутки из зараженных комаров или личинок готовят
отпечатки и исследуют их на присутствие вирусного антигена
методом иммунофлуоресценции, как описано ниже.
2.4.3. Обнаружение вирусного антигена
методом иммунофлуоресценции
1. Готовят стекло для микроскопии, вычерчивая на пред-
метном стекле 4 кружка диаметром около I см; кружки долж-
ны быть расположены на значительном расстоянии друг от
друга.
2. Комара помещают в центр кружка и с помощью скаль-
пеля отделяют голову от груди и грудь от брюшка.
3. Грудь отбрасывают, голову оставляют в верхней полови-
не кружка, а брюшко — в нижней.
4. Эту операцию проводят со всеми исследуемыми кома-
рами.
5. На стекло с 4 комарами помещают другое предметное
стекло и с силой сжимают их.
6. Верхнее стекло удаляют, смещая его относительно ниж-
него примерно на 3 мм и затем поднимая. В результате полу-
чают одинаковые отпечатки на обоих стеклах.
Культивирование титрование и очистка тогавирусов
83
Y. Пользуясь пинцетом с тонкими концами, удаляют види-
[Ажесткие части комаров, например крылья. Стекла подсу-
[ва^от при комнатной температуре и помещают в охлажден-
й Ацетон (4°C) на 10 мин.
8. Препараты либо используют для иммунофлуоресценции,,
бо хранят при —70 °C.
Личинки комаров обрабатывают почти так же. Отделяют
ловы, готовят парные отпечатки, фиксируют их ацетоном и
следуют с помощью иммунофлуоресценции, как описано вы-
s. Если имеются конъюгированные с флуоресцеином антите-
, против данного вируса, флуоресцентный анализ можно
ювести еще быстрее.
Следует отметить, что для интерпретации результатов нуж-
I практический навык и большое терпение; в каждый опыт
обходимо включать негативные контроли.
3. Титрование тогавирусов
Обычно для титрования тогавирусов используют новорож-
нных мышат (например, для определения защитного титра
.тител). Однако в некоторых случаях использование клеточ-
.ых культур явно предпочтительнее.
3.1. Титрование путем интрацеребрального заражения
новорожденных мышат
3.1.1. Титрование вируса
1. Пометы новорожденных мышат (не более 10 животных
W возрасте 1—3 сут) рассаживают в пронумерованные клетки
Вместе с матерями.
2. Для титрования готовят последовательные 10-кратные
разведения вируса на соответствующей культуральной среде.
3. В ламинарный бокс помещают пробковую панель для за-
ражения, покрытую бумажными полотенцами одноразового
пользования.
4. Первый помет мышат (без матери) помещают на панель
Для заражения; работать при этом необходимо в перчатках.
Каждое животное интрацеребрально заражают 0,02 мл послед-
него разведения вируса, используя иглу № 26 и шприц одно-
разового пользования объемом 1 мл. Зараженных животных
немедленно возвращают в клетку. Метод внутримозгового за-
ражения был уже проиллюстрирован и описан выше (см,
,р»с. 3.1, разд. 2.1.2). Для всех разведений вируса можно ис-
пользовать одни и те же иглу и шприц, если работу начинать
с максимального разведения.
6*
84
Глава 3
5. Если нужно протитровать несколько вирусов, следует
менять перчатки, шприц, иглу и панель для заражения. Преж-
де чем начинать работу с очередным вирусом, необходимо
тщательно дезинфицировать ламинарный бокс.
6. В конце каждого опыта все оборудование уничтожают
или стерилизуют.
7. Мышей наблюдают ежедневно и регистрируют число пав-
ших. В большинстве случаев титрование можно считать закон-
ченным через две недели.
8. Титром считается разведение вируса, вызывающее гибель
-50% зараженных мышей, в данном случае его называют 50%.
ной конечной точкой, или ЛД50 (от «летальная доза»). Пример
расчета титра инфекционного вируса по методу [9] приведен
в табл. 3.1. Очевидно, что в этом примере 50%-ная конечная
точка лежит между 1-Ю-4 и 1-10~5.
Таблица 3.1. Метод расчета титра инфекционного вируса
Разведение вируса (10-кратные разведения, flg) Число павших мышей Число выживших мышей Кумулятивные индексы
Общее коли- чество пав- ших мышей1) Общее коли- чество вы- живших мы- шей1) Смертность
Отношение %
—2 10 0 28 0 28/28 100
—3 10 0 18 0 18/18 100
4 6 4 8 4 8/12 66,66
—5 2 8 2 12 2/14 14,29
—6 0 10 0 22 0/22 0
1) Кумулятивные индексы получаются в результате суммирования чисел в данной
строке и последующих строках (для павших животных) или в данной и предшествую-
лцих строках (для выживших животных).
Точный расчет делается следующим образом:
.(% мышей, павших при максимальном разведении, давшем ле-
_______________тальность выше 50%) —50_____________
(% мышей, павших при максимальном разведении, давшем ле-
тальность выше 50%)—(% мышей, павших при минимальном
разведении, давшем летальность ниже 50%)
В данном примере:
66,66—50=16,66,
66,66—14,29 = 52,37,
16,66 : 52,37 = 0,32.
Таким образом, инокулят содержит ЫО4-32 ЛД5о. Если объ-
ем инокулята 0,02 мл, то титр вируса составляет ЫО4-32-
•5ОЛД5о=Ь1О6>02 ЛДбо/мл.
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов
85
3.1.2. Определение титра антивирусных антител
в опытах по защите мышей
С помощью модификации описанного выше метода можно
определить способность антисыворотки защищать новорожден-
ных мышат от заражения летальной дозой тогавируса.
1. Из титра, определенного в описанном выше опыте, рас-
считывают, какое разведение вируса нужно приготовить, что-
бы в 0,02 мл содержалось 100 ЛД50. Например, если титр виру-
са 5-Ю6 ЛДзо/мл, потребуется разведение 1 : 1000.
2. Готовят нужное разведение на культуральной среде.
3. Готовят последовательные 10-кратные разведения иссле-
дуемой антисыворотки.
4. Аликвоты используемого разведения вируса объемом
0,1 мл смешивают с таким же объемом каждого разведения
сыворотки.
5. Смеси инкубируют при 37 °C 60 мин. В качестве контроля
готовят также смесь вируса с неразведенной преиммунной сы-
вороткой.
6. Смеси вводят интрацеребрально группам новорожденных
мышат дозами по 0,2 мл, пользуясь описанным выше методом.
Заражение начинают с минимального разведения антител и
для введения каждой смеси используют новые шприц и иглу.
7. Каждый день регистрируют число павших животных.
Вся контрольная группа должна погибнуть. Титром антител
считается их разведение, защищающее 50% животных. Эту
50%-ную протективную дозу (ПД50) можно рассчитать мето-
дом, описанным выше для ЛД50 [9].
3.2. Титрование в культуре клеток
Хотя во всех описанных ниже методах в качестве тест-куль-
туры взяты клетки Vero, однако можно использовать с этой
целью ВНК-21, LLCMK2, РК15 и другие линии клеток млеко-
питающих. Первый метод оптимален при исследовании большо-
го числа образцов; его легко адаптировать для работы с микро-
планшетами для титрования, как описано здесь, или с планше-
тами или чашками большего размера, например для определе-
ния морфологии бляшек. В этом случае для титрования исполь-
зуют карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ). Далее описан еще один
метод, предполагающий использование агарозы и окрашивание
клеток нейтральным красным. Он особенно полезен при работе
с вирусными клонами, когда необходимо, чтобы бляшки со-
держали инфекционный вирус.
86
Глава 3
3-2.1. Метод бляшек с использованием покрытия
из карбоксиметилцеллюлозы
1. Готовят 8 последовательных 10-кратных разведений ви-
руса на культуральной среде.
2. С помощью пастеровской пипетки одну каплю восьмого
разведения вируса помещают на дно лунки в восьмом ряду
плоскодонного микропланшета для титрования.
3. Из пипетки удаляют весь оставшийся вирус и описанную
процедуру повторяют с седьмым разведением, внося каплю
в соответствующую лунку в седьмом ряду.
4. Описанную процедуру повторяют со всеми разведениями
вируса.
5. Сразу после заполнения планшета в каждую лунку вно-
сят каплю суспензии клеток Vero (4-Ю6 кл/мл).
6. Планшеты инкубируют 3 ч при 37°C. Затем в каждую
лунку вносят по две капли культуральной среды, содержащей
1,5% КМ.Ц (см. приложение).
7. Планшеты инкубируют в герметически закрытом контей-
нере при 37 °C.
8. Большинство альфавирусов формируют бляшки через
2—3 дня, а флавивирусов — через более длительный срок. По-
ка вирус не охарактеризован, необходимо ежедневно осматри-
вать планшеты.
9. Исследуют культуры с помощью инвертированного микро-
скопа. Из лунок, в которых обнаружено ЦПД вируса, удаляют
культуральную среду.
10. В каждую лунку добавляют 2—3 капли солевого раство-
ра с формальдегидом (см. приложение), инкубируют 10 мин
при комнатной температуре, удаляют раствор и добавляют ра-
створ красителя нафталинового черного (см. приложение).
Планшеты инкубируют 30 мин при комнатной температуре и
промывают водой.
11. Рассчитывают титр образцов вируса (выраженный
в БОЕ). Для этого подсчитывают число бляшек, образуемых
каждым разведением вируса.
Пример:
Число бляшек—9
Разведение вируса— 1-Ю7
Объем инокулята — 0,04 мл
Титр вируса = 9-1-107-1/0,04 БОЕ/мл = 2,25-109 БОЕ/мл
Следует подчеркнуть, что для каждого разведения вируса
необходимо ставить по крайней мере три пробы, чтобы избе-
жать влияния небольших экспериментальных ошибок. Однако
в целом при сравнении большого числа образцов описанный
метод дает обычно удовлетворительные результаты.
В; Культивирование, титрование и очистка тогавирусов 87
3.2.2. Метод бляшек с использованием
агарозного покрытия
1. Выращивают плотный монослой клеток в небольших фла-
конах одноразового пользования площадью 25 см2 или в чаш-
ках Петри.
2. Готовят последовательные 10-кратные разведения вируса
на культуральной среде.
3. Удаляют среду и вносят по 0,2 мл вируса, начиная с мак-
симального разведения. При этом необходимо следить, чтобы
жидкость полностью покрывала монослой.
4. Флаконы помещают на качалку или в течение несколь-
ких минут покачивают вручную, после этого оставляют на 1 ч
при комнатной температуре.
5. Вирус удаляют из флаконов, лучше всего с помощью пи-
петки, и добавляют 5 мл агарозного покрытия (см. приложе-
ние).
6. Убедившись, что покрытие равномерно распределилось по
монослою, флаконы, оставляют на 10 мин при комнатной тем-
пературе и далее инкубируют при 37°C.
7. Разные вирусы формируют бляшки на разных сроках
после заражения. Оптимальное время инкубации определяют,
ежедневно осматривая флаконы, начиная со второго дня после
заражения для альфавирусов и с четвертого дня для флавиви-
русов.
8. Когда начинают появляться бляшки, в каждый флакон
добавляют по 2 мл агарозного покрытия, содержащего 0,02%
нейтрального красного. Флаконы оставляют на 10 мин, чтобы
агароза застыла, после этого инкубируют при 37°C в темноте.
9. В течение нескольких часов живые клетки окрашиваются
в красный цвет, в то время как бляшки остаются прозрачными.
Если необходимо извлечь из бляшек инфекционный вирус, не
следует оставлять флаконы на свету дольше чем на несколько
секунд.
10. Для стойкого окрашивания после формирования бляшек
и внесения нейтрального красного в каждый флакон добавля-
ют 2—4 мл солевого раствора с формальдегидом. После инку-
бации при комнатной температуре в течение 30 мин формалин
вместе с агарозой удаляют и промывают монослой водой.
И. Титр вируса (в БОЕ/мл) определяют, как описано выше,
подсчитывая число бляшек при соответствующем разведении
вируса.
88
Глава 3
3.2.3. Определение титра нейтрализующих антител
по уменьшению числа бляшек
Как и в предыдущих случаях, мы описываем методику ра-
боты с клетками Vero, однако можно использовать и многие
другие линии клеток млекопитающих и комаров. Описанный
микрометод титрования позволяет выразить титр антител либо
через индекс нейтрализации, либо через конечное активное
разведение. Последний способ более точен, но требует больше
времени и специального оборудования.
1. Исследуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56 °C для
инактивации некоторых компонентов комплемента и неспеци-
фических ингибиторов.
2. Готовят последовательные 10-кратные разведения вируса
и сыворотки на культуральной среде. Если предполагается, что
титр антител невысок, то вместо 10-кратных используют дву-
кратные разведения сыворотки.
3. Одну каплю максимального разведения вируса помеща-
ют в каждую лунку ряда «Н» микропланшета для титрования,
следующее разведение вносят в ряд «G» и т. д. до ряда «А».
4. В каждую лунку рядов 11 и 12 вносят по капле культу-
ральной среды, ряда 10 — по капле максимального разведения
сыворотки, в ряд 9 — по капле следующего разведения сыво-
ротки и т. д. до ряда 1.
5. Планшеты инкубируют 60 мин при 37 °C и в каждую лун-
ку вносят каплю суспензии клеток Vero (4-1О6 кл/мл).
6. Планшеты инкубируют 3 ч при 37 °C, далее в каждую
лунку добавляют по две капли культуральной среды, содержа-
щей 1,5% КМЦ, и инкубируют планшеты при 37 °C в гермети-
чески закрытом контейнере или в СОг-инкубаторе, если ис-
пользуется среда, содержащая в качестве буфера бикарбонат.
7. Когда в, рядах, не содержащих сыворотки, образуются
бляшки, среду удаляют и заменяют солевым раствором, содер-
жащим 10% формальдегида. С этим раствором планшеты ин-
кубируют 10 мин, затем в течение 30 мин окрашивают нафта-
линовым черным и промывают водой.
Титр нейтрализующих антител может быть рассчитан одним
из двух способов. В первом случае определяют разведение сы-
воротки, которое вызывает снижение числа образующихся бля-
шек на 50%. Например, если при внесении сыворотки в разве-
дении 1 : 1000 число бляшек уменьшается от 20 до 10, титр
нейтрализующих антител равен 1000. Чтобы точно определить
его значение, можно построить график зависимости числа
бляшек от разведения антител.
Во втором случае (результаты получаются менее точные)
рассчитывают индекс нейтрализации для данной сыворотки
(ИНС), который представляет собой разницу между титром
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов 89
контрольного вируса и титром вируса при максимальной кон-
центрации антител.
Пример:
если титр контрольного вируса составляет 1-105 БОЕ/мл,
а титр вируса при разведении антител 1 :20 — 1 •
• 102 БОЕ/мл,
то ИНС (в логарифмических единицах) равен 3.
3.2.4. Тест на повышение инфекционное™ вируса
Данный метод основан на использовании Fc-рецепторов,
имеющихся на поверхности выращиваемых в культуре челове-
ческих или мышиных макрофагов [10]. Вирус, не адсорбиро-
вавшийся на клеточной поверхности, может проникнуть в ци-
топлазму в результате образования комплексов с вирус-специ-
фическими антителами. Комплексы антиген антитело связы-
ваются с Fc-рецепторами, и в результате этого повышается
инфекционность вирусного препарата. Использование этого
явления особенно полезно при работе с моноклональными ан-
тителами, так как удается идентифицировать антитела, реаги-
рующие с поверхностью вириона. С помощью этого метода
можно получить данные трех типов: о повышении инфекцион-
ности вируса в присутствии антител, о титре нейтрализующих
антител и о стандартной инфекционности вируса. Многие тога-
вирусы размножаются в макрофагах мыши (линия Р388 D1),
имеющих на поверхности Fc-рецепторы. Эти клетки хорошо
прикрепляются к поверхности культуральных сосудов, поэтому
с ними можно работать, как с обычными культурами клеток.
1. Готовят последовательные 10-кратные разведения вируса
на среде L15.
2. С помощью стерильной пастеровской пипетки в 12 лунок
каждого ряда микропланшета для титрования вносят по одной
капле каждого разведения вируса, начиная с максимального.
3. В ряды 11 и 12 (каждый из которых содержит последо-
вательные разведения вируса) вносят по одной капле среды
L15. Эти ряды не содержат антител и служат контролем.
4. Готовят двукратные последовательные разведения сыво-
ротки на культуральной среде.
5. По одной капле каждого из разведений сыворотки до-
бавляют в 8 лунок, содержащих разведение вируса; в лунки
ряда 10, таким образом, попадет по капле максимального раз-
ведения сыворотки, в лунки ряда 9 — по капле предыдущего
разведения и т. д.
6. Планшет, закрытый крышкой, инкубируют 30 мин при
30 °C в герметичном контейнере.
90
Глава 3
7. Тем временем готовят суспензию клеток Р388 D1. Для
этого с плотного монослоя клеток сливают среду и снимают
клетки со стекла пипетированием или с помощью резиновой
палочки.
8. Определяют концентрацию клеток, доводят ее до 1 •
• 106 кл/мл и добавляют в каждую лунку по капле клеточной
суспензии.
9. Планшеты инкубируют 3 ч при 37 °C в герметичном кон-
тейнере, затем в каждую лунку вносят по две капли покрытия,
содержащего КМЦ, на основе среды L15. Планшеты инкубиру-
ют при 37°C. Для большинства альфавирусов ЦПД проявля-
ется не позднее чем через 3 сут после заражения, а в случае
флавивирусов — через 4—7 сут.
10. Оптимальное время инкубации определяют, ежедневно
осматривая клетки. После появления явных признаков цито-
патических изменений среду удаляют и добавляют солевой
раствор с формальдегидом (см. приложение).
И. Через 10 мин раствор с формальдегидом, заменяют на
раствор нафталинового черного и проводят окрашивание в те-
чение 30 мин.
12. Планшеты промывают водой, высушивают и подсчитыва-
ют бляшки в каждой лунке. Титр вируса можно рассчитать
следующим образом: число бляшек в лункеХфактор разве-
дения X 1/объем инокулята.
Пример:
если в лунке образовалось 15 бляшек при разведении ви-
руса 1 • 106, а исходный объем вируса, внесенный в лунку,
0,04 мл, то титр вируса составляет 15-1 • 106-1/0,04 =
= 3,75-108 БОЕ/мл.
13. Рассчитывают степень увеличения инфекционности ви-
руса, определяя титр в каждом ряду планшета. Максималь-
ный титр сравнивают с контрольным титром. Разница между
ними и представляет собой искомую степень.
Пример:
контрольный титр — 6-10® БОЕ,
максимальный титр — 3,6-107 БОЕ.
Следовательно, инфекционность увеличилась в 6 раз.
14. На основе этих же данных можно рассчитать и индекс
нейтрализации для используемой антисыворотки. Для этого
сравнивают самый низкий титр в присутствии антител с конт-
рольным титром.
Пример:
контрольный титр — 6-Ю6 БОЕ,
минимальный титр — 6-Ю4 БОЕ.
Следовательно, индекс нейтрализации равен 2,0.
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов 91
3.3. Титрование методом гемагглютинации
Все тогавирусы агглютинируют эритроциты различного про-
исхождения, хотя конкретные условия проведения гемагглюти-
нации (ГА) неодинаковы для разных вирусов. Чаще всего ис-
пользуют эритроциты гусей или цыплят, поскольку с ними ре-
акция наиболее чувствительна. Титрование неохарактеризован-
ного вируса проводят при нескольких значениях pH. После того
как оптимум pH определен, в дальнейшем гемагглютинацию
проводят при этом значении.
Как и для остальных вирусов, агглютинирующих эритроци-
ты, в реакции гемагглютинации определяют число физических
частиц тогавирусов, а не инфекционный титр вируса. Тем не
менее во многих случаях это хороший способ оценки качества
вирусного препарата.
3.3.1. Получение и концентрирование вирусного гемагглютинина
из монослойных культур клеток
В описанном ниже методе для получения гемагглютинина
используют монослой клеток Vero. В нашей лаборатории метод
дает хорошие результаты в случае альфа- и флавивирусов при
использовании среды с очень низким содержанием сыворотки.
Однако высокие выходы гемагглютинина могут быть получены
и на других линиях клеток млекопитающих и комаров. Ранее
использовали антиген из мозга мышат-сосунков, который перед
постановкой реакции обрабатывали органическими растворите-
лями. Эти методы очень четко описаны Кларком и, Казалсом
[11] и здесь обсуждаться не будут. Гемагглютинин, продуци-
руемый монослоем зараженных клеток, не требует такой обра-
ботки. Многие вирусы дают выход гемагглютинина более
10 000 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ).
1. С плотного монослоя клеток сливают среду.
2. Наносят на монослой небольшой объем вируса, разведен-
ного с таким расчетом, чтобы множественность инфекции со-
ставляла около 0,1 БОЕ на одну клетку (т. е. заражается около
10% клеток). Убедившись, что инокулят полностью покрывает
монослой, клетки оставляют на 1 ч при комнатной температуре.
3. Каждые 10 мин флаконы покачивают, чтобы вирус рав-
номерно распределялся по монослою.
4. Добавляют такой объем культуральной среды, чтобы мо-
нослой был покрыт слоем жидкости в 2—3 мм, и инкубируют
клетки при 37°С (клетки комаров — при 28°С).
5. Большинство альфавирусов дают выраженное ЦПД в те-
чение 2—3 сут. На этой стадии собирают культуральную жид-
кость.
92
Глава 3
6. С монослоя, зараженного флавивирусом, при первых приз-
наках ЦПД (обычно через 2—6 сут) удаляют среду и заменя-
ют свежей, содержащей 0,5% ЭТС.
7. Каждый день собирают культуральную жидкость и не-
медленно заменяют ее свежей средой с 0,5% сыворотки.
8. Пробы культуральной жидкости объединяют и центрифуги-
руют 15 мин при 2000 g и 4 °C. К осветленному супернатанту
добавляют хлористый натрий до концентрации 23,36 г/л и ПЭГ
6000 до концентрации 60 г/л.
9. Суспензию перемешивают до растворения соли и поли-
этиленгликоля и оставляют на ночь при 4 °C.
10. Осадок вируса собирают центрифугированием при 5000 g
в течение 1 ч. Супернатант отбрасывают, а центрифужные про-
бирки оставляют в перевернутом виде для удаления остатков
среды.
11. Осадок растворяют в боратном буферном растворе (BBS;
см. приложение), используя 1% исходного объема среды. Та-
ким образом достигается 100-кратное концентрирование вируса.
12. Полученный этим методом гемагглютинин можно хра-
нить практически неопределенное время при —70 °C или не-
сколько месяцев при 4 °C.
3.3.2. Титрование гемагглютинина
Вместо объемов, указанных ниже, можно использовать и
другие, сохраняя при этом соотношения между ними. Более
того, суспензию эритроцитов, промытых глюкозо-желатиновым
буфером (DGV, см. приложение), можно в течение нескольких
дней хранить при 4 °C. Однако суспензию эритроцитов в рас-
творе с pH 6,0—7,0 необходимо готовить непосредственно перед
титрованием.
1. Эритроциты гусей или цыплят промывают DGV, центри-
фугируя суспензию 5 мин при 1500 g. Промывку повторяют не
менее трех раз, причем в последний раз клетки центрифугиру-
ют 10 мин. Осадок клеток ресуспендируют в DGV, так чтобы
концентрация эритроцитов составила 10%.
2. В каждую лунку микропланшета с коническим дном вно-
сят по 25 мкл BBS, pH 9,1.
3. В первую лунку каждого ряда вносят по 25 мкл исследу-
емого образца ГА.
4. Пользуясь многоканальной микропипеткой с одноразовы-
ми наконечниками, готовят последовательные двукратные раз-
ведения ГА на BBS. Все разведения можно готовить, исполь-
зуя один набор наконечников на планшет.
5. Готовят несколько буферных растворов с разными значе-
ниями pH в интервале от 6,0 до 7,0. На каждом растворе го-
товят 0,5% суспензии эритроцитов.
_________Культивирование, титрование и очистка тогавирусов__93
6. В ряд лунок, содержащих разведения вируса, и в кон-
трольный ряд лунок без вируса немедленно вносят по 25 мкл.
; 0,5 % -ной суспензии эритроцитов.
7. Планшеты накрывают крышками и инкубируют 40 мин
; при 37°C. В лунках, где не произошла гемагглютинация, видны
небольшие «бляшки» из клеток и прозрачная надосадочная
жидкость; с другой стороны, содержимое лунок, в которых про-
. изошла агглютинация, гомогенно, и клеточная «бляшка» в них
отсутствует.
Титром ГА считается максимальное разведение, при кото-
ром образующаяся «бляшка» еще видна невооруженным гла-
?зом. Оптимальным значением pH считается то, при котором
J ГА имеет самый высокий титр. Типичный результат титрования^
проведенного описанным здесь методом, показан на рис. 3.9.
. w 4 » ' * ♦ * * * « & ь
; - - * > ’
Н й ч» У » -4 - ‘
Рис. 3.9. Титрование гемагглютинина при различных pH для подбора оптн--
мальных условий
Некоторые тогавирусы лучше всего агглютинируют эритроциты
при 4°С, а другие — при 22°С; поэтому в начальных опытах
имеет смысл поставить реакцию при обеих температурах.
3.3.3. Титрование гемолизина тогавирусов
Агглютинация эритроцитов часто сопровождается их лизи-
сом. Лизис обусловлен активностью поверхностного гликопро-
теина вирусов, отличного от гем агглютинирующего компонента
[12]. Особенно сильно выражен гемолиз, вызываемый альфа-
вирусами. Хотя титрование гемолизина (ГЛ) в большинства-
94
Глава 3
лабораторий не является стандартным приемом, оно может
быть полезным как дополнительный метод анализа гликопроте-
инов оболочки вирусов.
1. Проводят титрование ГА, как описано выше, при опти-
мальном pH.
2. Как только рассчитан титр ГА, эритроциты в планшете
ресуспендируют, осторожно постукивая по бортику планшета.
Необходимо убедиться в том, что все эритроциты ресуспенди-
рованы.
3. Планшеты инкубируют 4—6 ч при 37°C, а затем центри-
фугируют 1—2 мин при 1000 g. Имея практический опыт, титр
ГЛ можно определить уже на этой стадии. Лунки, в которых
произошел лизис, окрашены в ярко-красный цвет; «бляшки»
в них совсем маленькие или вообще отсутствуют. В лунках, где
лизиса клеток не произошло, четко видна клеточная «бляшка»,
супернатант остается прозрачным.
4. Более точный расчет можно провести, если использовать
большие объемы каждого из реагентов и проводить реакцию
в стеклянных пробирках Кана. После того как произошел ли-
зис, пробирки центрифугируют, супернатант собирают и спект-
рофотометрически определяют процент лизиса по поглощению
при 410 или 540 нм. Для построения калибровочной кривой
готовят серию пробирок, содержащих лизированные в разной
степени (от 0 до 100%) эритроциты; их получают, обрабатывая
суспензию эритроцитов ультразвуком.
3.3.4. Титрование антител в реакциях торможения
гемагглютинации и гемолиза
Сыворотки, используемые в реакциях торможения гемагглю-
тинации (РТГА) и гемолиза (РТГ), обрабатывают для удале-
ния неспецифических ингибиторов гемагглютинации (см. при-
ложение). В присутствии ТГА-антител гемолиз не происходит;
следовательно, описанная ниже РТГ может проводиться только
•с антителами против индивидуальных антигенов, не обладаю-
щими ТГА-активностью, или с соответствующими моноклональ-
ными антителами.
1. Рассчитывают ГА-титр вируса, как описано выше.
2. В каждую лунку микропланшета с коническим дном вно-
сят по 25 мкл BBS.
3. С помощью многоканальной микропипетки готовят после-
довательные двукратные разведения обработанной антисыво-
ротки.
4. Рассчитывают, какое разведение вируса соответствует
4 единицам гемагглютинации; например, если ГА-титр равен
1/256, то 4 единицы соответствуют разведению вируса 1/64.
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов 95
5. Готовят соответствующее разведение вируса на BBS и
вносят по 25 мкл в каждую лунку планшета с разведениями
сыворотки.
6. Закрытые планшеты инкубируют 1 ч при 37°C.
7. Готовят 0,25%-ную суспензию эритроцитов на буферном
растворе с pH, оптимальным для данного вируса.
8. В каждую лунку немедленно вносят по 50 мкл суспензии
эритроцитов и инкубируют закрытый планшет 40—60 мин при
37°C (22 или 4 °C, если в этих условиях реакция идет луч-
ше). Максимальное разведение сыворотки, которое еще по-
давляет гемагглютинацию, считают ТГА-титром.
9. В каждый опыт по определению ТГА-титра включают
контроль с 4 ГАЕ.
10. Если определяется ТГ-титр, то в контроле результат дол-
жен быть негативным, т. е. ТГА-активность должна отсутство-
вать. Эритроциты ресуспендируют, осторожно постукивая по
планшету, инкубируют планшеты 2—4 ч при 37 °C, а затем
центрифугируют 1—2 мин при 1000 g. Максимальное разведе-
ние сыворотки, еще подавляющее гемолиз, считают ТГ-титром.
Как и титрование гемолизина, эту реакцию можно ставить
в пробирках, используя большие объемы реагентов. Для неко-
торых вирусов может возникнуть необходимость увеличения
стандартной дозы от 4 ГАЕ до 8 или 16 (в тех случаях, когда
при 4 ГАЕ трудно определить лизис эритроцитов).
4. Очистка тогавирусов
4.1. Культивирование тогавирусов
4.1.1. Системы для культивирования
Культивирование тогавирусов уже детально рассмотрено
в одном из предыдущих разделов настоящей главы. Оптималь-
ную систему для культивирования следует подбирать специаль-
но в каждом случае. В целом лучшей можно считать ту систе-
му, ц которой вирус дает максимальный титр, хотя нужно
иметь в виду, что очистка вируса из тканей зараженных жи-
вотных, например экстрактов мозга, затруднена в связи с боль-
шим содержанием в препаратах клеточных компонентов; кроме
того, радиоактивное мечение вируса в организме животных, как
правило, невозможно. В тех случаях, когда вирус хорошо раз-
множается в культуре ткани, имеет смысл потратить некоторое
время, чтобы оптимизировать его выход. Выбор же таких па-
раметров, как чувствительная линия клеток, культуральная
среда, множественность инфекции, температура инкубации и
время сбора вируса, существенно влияет на выход. При опти-
Глава 3
<96
мизации условий культивирования важно пользоваться таким
методом, который позволяет определить реальное количество
вируса в исходном материале для очистки. Использование
только непрямых методов, например определения доли зара-
женных клеток с помощью иммунофлуоресценции, может при-
вести к неправильным выводам.
Количество клеток, используемых для культивирования ви-
руса, определяется, естественно, теми целями, для которых
лроводится очистка вируса, и выходом вируса в расчете на I
клетку. Нередко достаточное количество радиоактивно мечен- I
«ого вируса можно получить на монослойной культуре во фла-
коне площадью 75 см2, однако в целом для проведения экспе-
риментов как в малом, так и в большом масштабе более удоб-
ны роллерные культуры. В настоящее время имеются
в продаже пластиковые роллерные бутылки одноразового поль-
зования объемом, от 490 до 1750 см3; можно использовать и
стеклянные бутылки тех же размеров. Площадь ростовой по-
верхности роллерного флакона можно значительно увеличить
с помощью микроносителей, например гранул цитодекса. Кроме
того, имея соответствующее оборудование, клетки можно выра-
щивать в виде гомогенной суспензии или в суспензии на мик-
роносителях, что значительно упрощает работу и сокращает
расход среды. Полезную информацию об использовании микро-
носителей для культур клеток можно найти в методической
литературе, издаваемой фирмой Pharmacia [13].
4.1 Л. Радиоактивное мечение
1. РНК. Геном тогавирусов можно пометить, выращивая
вирус в присутствии [3Н]-уридина или [32Р]-ортофосфата.
[3Н]-уридин можно просто добавить в обычную культуральную
среду; клетки при этом эффективно поглощают его путем ак-
тивного транспорта. Как правило, для мечения РНК использу-
ют концентрации метки 5—20 мкКи/мл. Меченый уридин вно-
сят одновременно с вирусом и не отмывают вплоть до сбора
накопившегося вируса. Чтобы пометить РНК по фосфору, ис-
пользуют два подхода. В первом случае в культуральную среду
вносят радиоактивный изотоп (32Р) в высокой концентрации
(100—200 мкКи/мл) для обеспечения необходимой удельной
радиоактивности, поскольку обычно используемые культураль-
ные среды содержат фосфаты в значительных концентрациях.
.Во втором случае в не содержащую фосфатов среду вносят
радиоактивный изотоп в меньших концентрациях (10—
.25 мкКи/мл). Преимущество второго подхода состоит в том, '
что удается работать с меньшим уровнем радиоактивности; (
«однако в не содержащей фосфатов среде вирус иногда разм- ;
_________Культивирование, титрование и очистка тогавирусов
ножается намного хуже, чем в нормальной, и это приводит
к недопустимо низкому включению метки. Чтобы определить
оптимальный способ введения метки в каждом конкретном
случае, могут потребоваться предварительные эксперименты. Не
содержащие фосфатов среды имеются в продаже (например, их
поставляет фирма Flow Laboratories). В этом случае сыворотку
необходимо диализовать против не содержащей фосфатов сре-
ды и затем стерилизовать фильтрованием.
2. Белки. В качестве радиоактивной метки для белков
чаще всего используют [35S]-метионин, поскольку он обладает
высокой удельной радиоактивностью и относительно недорого
стоит. Чтобы пометить белки тогавирусов, метионин использу-
ют в концентрации 5—50 мкКи/мл. Для мечения белков, не
содержащих метионина, используют [35S]-цистеин, удельная
активность которого такая же, как [35S]-метионина. Можно
также использовать смесь [3Н]-аминокислот. Обычно меченые
аминокислоты используют в сочетании со средой, не содержа-
щей данных аминокислот; такие среды имеются в продаже. Бо-
лее удобный альтернативный подход состоит в том, что крат-
ковременное (несколько часов или менее) мечение проводят
в буферном растворе, например в растворе Хэнкса, содержа-
щем 20 мМ HEPES в качестве буфера, 2% диализованной сы-
воротки крупного рогатого скота или 0,1% БСА.
3. Гликопротеины. Углеводные остатки гликопротеинов
обычно метят, добавляя в среду [3Н] -сахара. Чаще всего ис-
пользуют [3Н]-маннозу и [3Н]-глюкозамин в концентрациях
50—-100 мкКи/мл. Иногда уровень включения удается повысить,
используя среду с небольшим содержанием глюкозы или дру-
гого сахара (например, галактозы или фруктозы) в качестве
источника энергии.
4.2. Концентрирование вирусов
Первый этап, необходимый для очистки вирусов, во всяком
случае при их выделении из культуральной жидкости, — это
концентрирование. Поскольку вирусные частицы имеют не-
сколько большие размеры по сравнению с другими компонен-
тами культуральной жидкости, концентрирование приводит и
к очистке вируса от низкомолекулярных контаминантов, на-
пример от любых соединений, используемых в качестве радио-
активной метки.
4.2.1. Удаление клеточного дебриса
Культуральная жидкость, собранная с зараженных клеток,
кроме вируса может содержать значительное количество кле-
точного дебриса, образованного погибшими клетками и субкле-
7—369
98
Глава 3
точными частицами. Лучший способ удаления дебриса — цент-
рифугирование при высокой скорости с охлаждением (10—
15 мин при 5000—10000g). Для работы с большими объемами
культуральной жидкости необходим достаточно вместительный
ротор (например, ротор GS-3 объемом 6X500 мл для центри-
фуги RC-5B, Sorvall). Следует использовать пробирки с плотно
закрывающимися крышками, а при работе с патогенными виру-
сами заполнять пробирки с таким расчетом, чтобы даже при
поломке крышки жидкость не вылилась из пробирки. Обыч-
но соответствующее значение объема приведено в инструкции
по использованию центрифуги. После центрифугирования су-
пернатант, содержащий вирус, осторожно переливают в подхо-
дящий сосуд, помещенный в ледяную баню; в пробирке при
этом остается небольшой плотный осадок.
4.2.2. Осаждение вируса ультрацентрифугированием
Из относительно небольшого объема культуральной жид-
кости вирус можно сконцентрировать ультрацентрифугировани-
ем. Обычно тогавирусы осаждают центрифугированием при
50 000 g в течение 2 ч. Можно использовать как угловые рото-
ры, так и бакет-роторы в зависимости от объема материала и
имеющегося оборудования. Пробирки для угловых роторов сле-
дует тщательно закрывать, лучше всего термическим способом,
предложенным фирмой Beckman.
Определенной степени очистки на этой стадии можно дости-
гнуть, наслаивая содержащую вирус жидкость на небольшой
объем буферного раствора, содержащего 20% сахарозы. При
этом вирус проходит через сахарозную «подушку» и образует
осадок, а низкомолекулярные контаминанты, включая раство-
римые белки, задерживаются «подушкой». Подходящим буфе-
ром является GTNE (200 мМ глицин, 50 мМ трис-НС1, 100 мМ
NaCl, 1 мМ ЭДТА, pH доводят до 7,5 с помощью НС1). Соот-
ветствующий объем раствора сахарозы в этом буфере (10—
20% объема пробирки) вносят в каждую пробирку. При работе
с угловыми роторами следует убедиться в том, что используе-
мый объем достаточен, чтобы полностью покрыть осадок, даже
после остановки ротора. На слой сахарозы осторожно наслаи-
вают содержащую вирус жидкость; она должна медленно сте-
кать по стенке пробирки. Чтобы избежать перемешивания при
разгоне ротора, следует использовать приспособление для мед-
ленного разгона, если оно имеется, однако это не является
строго необходимым.
В данных условиях вирус образует плотный осадок. Супер-
натант декантируют и остаток жидкости удаляют, оставляя про-
бирку в перевернутом положении. Необходимо помнить, что
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов 99
супернатант содержит некоторое остаточное количество инфек-
ционного вируса, и обращаться с ним следует осторожно. Оса-
док вируса медленно суспендируют в GTNE; для этого раствор
приливают к осадку и оставляют на ночь при 4 °C или обраба-
тывают в течение нескольких минут ультразвуком, помещая
пробирку в водяную баню.
4.2.3. Осаждение вирусов полиэтиленгликолем
Вместо непосредственного ультрацентрифугирования вирус
можно осадить центрйфугированием при меньшей скорости
после добавления ПЭГ. Преципитация обычно ускоряется при
добавлении NaCl вместе с ПЭГ. Этот метод в общем более
удобен при работе с большими объемами содержащей вирус
жидкости, так как вместительные роторы для относительно
низкоскоростного центрифугирования намного более доступны
для большинства лабораторий, чем такие же роторы для уль-
трацентрифугирования. Кроме того, этот метод более мягкий и
обычно приводит к меньшим потерям инфекционности, чем не-
посредственное ультрацентрифугирование. Описанная ниже ме-
тодика пригодна для концентрирования некоторых тогавирусов
(и других оболочечных вирусов), причем используемые кон-
центрации NaCl и ПЭГ, по-видимому, не имеют принципиаль-
ного значения, однако в конкретных случаях для оптимизации
выхода вируса могут потребоваться отдельные модификации.
Определяют объем содержащей вирус жидкости и помеща-
ют ее в ледяную баню, расположенную на магнитной мешалке.
При постоянном перемешивании медленно добавляют сухой
NaCl до концентрации 0,5 М и ПЭГ 6000 до концентрации 7%.
Суспензию продолжают осторожно перемешивать 20—30 мин
до полного растворения ПЭГ и оставляют на 2 ч при 4 °C для
формирования агрегатов вируса. Затем суспензию центрифуги-
руют 30 мин при 10 000 g. Осадок обычно распределен по стен-
ке пробирки, поэтому супернатант следует сливать осторожно,
держа пробирку так, чтобы осадок был расположен на верхней
стороне. Остаток супернатанта, насколько возможно полно,
удаляют с помощью пипетки и осадок ресуспендируют в не-
большом (1% от исходного) объеме GTNE. Обычно осадок
легко растворяется, если смыть его со стенки пробирки, а за-
тем энергично пипетировать суспензию или пропустить через
шприц с толстой иглой. Материал, который при этом не рас-
творяется, удаляют центрифугированием в течение 5 мин при
7*
100
Глава 3
4.3. Очистка вирусов градиентным центрифугированием
Материал, полученный одним из описанных выше методов,
обычно контаминирован клеточными компонентами. Однако
в тех случаях, когда высокая степень очистки не обязательна
(например, для постановки RIA или ELISA), его можно ис-
пользовать уже на этой стадии. Тем не менее для большинства
исследований необходима дальнейшая очистка вируса с по-
мощью зонально-скоростного или изопикнического центрифуги-
рования в градиенте. При скоростном центрифугировании поло-
жение вируса в градиенте определяется его коэффициентом се-
диментации, а при изопикническом — плавучей плотностью.
Для достижения максимальной степени очистки вирусных час-
тиц от примесей изменение концентрации образующего градиент
вещества должно быть плавным; в то же время на промежу-
точных стадиях очистки нередко используют ступенчатые гра-
диенты. В некоторых случаях принципы скоростного и изопик-
нического центрифугирования совмещаются; примером может
служить использование градиентов глицерина — тартрата ка-
лия [14]. В таких градиентах концентрация тартрата калия
возрастает в направлении дна пробирки, достигая плотности,
соответствующей плавучей плотности вируса; концентрация
глицерина, наоборот, максимальна на мениске, что препятству-
ет продвижению медленно седиментирующего материала в на-
правлении дна. Все типы градиентов обычно центрифугируют
в бакет-роторах, но в случае изопикнических градиентов такие
же или даже лучшие результаты можно получить в угловых или
вертикальных роторах с помощью приспособлений для медлен-
ного разгона и остановки, обеспечивающих переориентацию
градиента без перемешивания. При очистке конкретного вируса
часто приходится проводить целую серию последовательных
стадий центрифугирования в разных типах градиентов, чтобы
добиться нужной степени очистки.
4.3.1. Ступенчатые градиенты концентрации сахарозы
Минимальную концентрацию сахарозы подбирают таким
образом, чтобы плотность соответствующего раствора была вы-
ше плавучей плотности вируса; при этом вирус проходит через
верхний слой раствора сахарозы, обгоняя медленно седименти-
рующие частицы, и образует узкую зону на границе слоев
с различной концентрацией сахарозы. При работе с тогавиру-
сами в качестве верхнего и нижнего слоев используют соответ-
ственно 20%-ный и 50%-ный (вес на вес) растворы сахарозы
в GTNE. В центрифужную пробирку вносят около 1/10 объема
50%-ного раствора сахарозы и осторожно наслаивают сверху
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов ЮГ
около 3/10 объема 20%-ного раствора. Чтобы избежать переме-
шивания, пробирку следует держать в наклонном положении,
а верхний раствор наносить медленно по стенке пробирки. На
полученный ступенчатый градиент осторожно наслаивают рас-
твор частично очищенного вируса. Градиенты центрифугируют
2—3 ч при 80 000—100 000 g и 4 °C. После центрифугирования
из градиента извлекают зону вируса, образующуюся на грани-
це между слоями сахарозы (см. разд. 4.3.4).
4.3.2. Зональное центрифугирование
в градиентах концентрации сахарозы
Зональное центрифугирование лучше всего проводить в ба-
кет-роторах или вертикальных роторах, чтобы избежать неже-
лательного взаимодействия материала со стенками пробирки.
Линейные градиенты сахарозы (5—20%, вес на вес) готовят
одним из стандартных методов (см. гл. 1, разд. 2.5.1) и сверху
осторожно наслаивают раствор вируса. Поскольку при исполь-
зовании данного метода отсутствует эффект концентрирования
в результате образования зоны с соответствующей плавучей
плотностью, объем образца не должен превышать 1/10 объема
градиента. Центрифугирование следует проводить при 4 °C.
Время и скорость центрифугирования во многом зависят от
геометрии используемого ротора, поэтому можно дать лишь
самые приблизительные указания относительно режима. Перво-
начально используемый режим центрифугирования обычно
приходится модифицировать после первых опытов с учетом
полученных результатов. В бакет-роторе, например SW27,
центрифугирование в течение 2 ч при 27 000 об/мин позволяет
получить достаточную степень очистки большинства тогавиру-
сов.
4.3.3. Изопикническое центрифугирование и центрифугирование
в комбинированных зонально-плотностных градиентах
Для изопикнического центрифугирования большинства тога-
вирусов подходят 20—50%-ные (вес на вес) непрерывные ли-
нейные градиенты концентрации сахарозы. В комбинированных
градиентах глицерина — тартрата калия [14] верхнюю (менее
плотную) часть образует 30%-ный (вес на вес) раствор глице-
рина в 50 мМ. трис-НС1, 1 мМ. ЭДТА (pH 7,5), а нижнюю (бо-
лее плотную)—50%-ный (вес на вес) раствор тартрата калия.
pH раствора тартрата калия не должен быть ниже 8,5, так как
при более кислых значениях образуется осадок. Из этих рас-
творов обычными способами готовят линейные градиенты. По-
скольку в таких градиентах вирус концентрируется в зоне с со-
102
Глава 3
ответствующим значением плавучей плотности, объем вирусной
суспензии, наслаиваемой на градиент, не имеет принципиаль-
ного значения; он может доходить до 'Д объема градиента.
Градиенты центрифугируют в течение ночи при 80 000—
100000 g.
4.3.4. Обнаружение вирусов в градиентах и фракционирование
1. Фракционирование градиентов. Если очистке подвергают
достаточно большое количество материала, то зону вируса
в изопикническом градиенте можно идентифицировать визуаль-
но как голубовато-белый опалесцирующий слой. Чтобы зона
была видна лучше, пробирку, расположенную на темном фоне,
освещают лучом света (например, от небольшой лампы).
Если при этом вирус удается четко идентифицировать, его
можно извлечь из градиента, прокалывая пробирку сбоку.
Если пробирка была закрыта термическим способом, сверху
проделывают небольшое отверстие для обеспечения доступа
воздуха. Пробирку прокалывают сбоку непосредственно под
зоной вируса иглой для подкожных инъекций, надетой на
шприц объемом 5—10 мл; просвет иглы должен быть обращен
вверх. Из пробирки медленно удаляют раствор до тех пор, по-
ка не будет извлечена большая часть вируса. Если в градиенте
видно несколько зон, то их извлекают по отдельности, начиная
с верхней, и идентифицируют вирусную зону с помощью специ-
фического теста (см. ниже). Однако при работе с патогенными
вирусами прокалывание пробирки сбоку представляет слишком
большую опасность, и зоны следует отбирать с помощью длин-
ной загнутой иглы, которая вводится в градиент сверху (см.
гл. 2, разд. 5.4).
В тех случаях, когда визуально идентифицировать вирусную
зону не удается, приходится фракционировать весь градиент.
Это делается одним из двух способов. В первом случае дно
пробирки смазывают силиконовой смазкой, осторожно прока-
лывают толстой иглой, чтобы не ввести пузыри воздуха, кото-
рые могут нарушить градиент; после этого градиент раскапы-
вают на фракции равного объема, подсчитывая вытекающие
капли. Во втором случае в верхнюю часть пробирки осторож-
но, чтобы не повредить градиент, вводят тонкий шланг, при-
соединенный к перистальтическому насосу, и с помощью кол-
лектора медленно (со скоростью 2—3 мл/мин) собирают фрак-
ции.
2. Локализация вируса во фракциях градиента. Методы, ис-
пользуемые для идентификации содержащих вирус фракций
градиента, можно разделить на две группы: а) основанные на
специфических свойствах вируса, например инфекционности или
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов 103s
гемагглютинации, и б) неспецифические методы, например оп-
ределение поглощения в ультрафиолете или радиоактивности
(в случае меченого вируса). Разрабатывая схему очистки ви-
руса, следует иметь в виду, что для локализации нужных фрак-
ций лучше использовать специфический метод, но, однако,
в дальнейшем при стандартной работе можно ограничиться
неспецифическим методом. Методы определения инфекционно-
сти и гемагглютинации описаны выше (разд. 3); их можно без
всяких изменений применять к очищенным препаратам вирусов.
При необходимости измеряют поглощение неразведенных фрак-
ций градиентов при длине волны 260 или 280 нм. Для локали-
зации радиоактивно меченного вируса небольшие аликвоты из
каждой фракции (объемом не более 25 мкл) наносят на прону-
мерованные квадраты бумаги Whatman ЗММ со стороной 1 см.
Все квадраты промывают в одном и том же сосуде тремя сме-
нами 5°/о-ной трихлоруксусной кислоты (из расчета примерно
5 мл на один квадрат), затем двумя сменами этанола и высу-
шивают на воздухе. Далее квадраты помещают в сцинтилля-
тор и определяют радиоактивность при помощи сцинтилляци-
онного счетчика. Использование этого метода позволяет отмыть
остаток невключившейся метки и избежать трудностей, связан-
ных с тушением флуоресценции содержащимися в градиенте
примесями.
3. Получение вирусов из фракций градиентов. На последней
стадии очистки необходимо удалить вещество, образующее гра-
диент. На промежуточных стадиях обычно достаточно развести
содержащие вирус фракции равным объемом буферного рас-
твора, чтобы материал можно было непосредственно наносить
на следующий изопикнический градиент. Поскольку для зо-
нального центрифугирования объем образца должен быть не-
большим, разведение фракций предыдущего градиента в этом
случае, как правило, невозможно; поэтому предпочтительно
проводить зональное центрифугирование перед изопикническим,
если используемая схема очистки включает оба варианта цент-
рифугирования. Полного удаления вещества, образующего гра-
диент, достигают диализом, гель-фильтрацией через колонку
с сефадексом G-50 или разведением с последующим ультра-
центрифугированием. Диализ очищенного материала проводят
в нескольких сменах подходящего буферного раствора (напри-
мер, GTNE, хотя в! некоторых случаях для последующего ис-
пользования очищенного вируса может потребоваться другой
буфер). Колонку с сефадексом уравновешивают, пропуская
через нее пятикратный по отношению к образцу объем того
буферного раствора, в котором должен быть растворен очи-
щенный вирус. Появление вируса в свободном объеме колонки
при элюции регистрируют по поглощению в ультрафиолете или
104
Глава 3
по радиоактивности; содержащие вирус фракции объединяют.
Дополнительным преимуществом ультрацентрифугирования яв-
ляется достигаемое при этом концентрирование вируса. Объ-
единенные фракции градиента разводят буферным раствором
по крайней мере вдвое для уменьшения плотности и центрифу-
гируют 2,5 ч при 80 000—100 000 g и 4 °C. Супернатант удаля-
ют по возможности полностью; образующийся осадок вируса
должен быть бесцветным и прозрачным. Его ресуспендируют
в УЗ-дезинтеграторе; при этом образуется голубовато-белая
опалесцирующая суспензия, которую хранят при •—70°C.
4.3.5. Определение степени чистоты
Лучший метод, позволяющий определить степень чистоты
препаратов тогавирусов, — это электрофорез структурных бел-
ков в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na. Иссле-
дованные до сих пор альфа- и флавивирусы имеют небольшое
число структурных белков характерного размера, образующих
при электрофорезе в геле уникальный набор. Вирионы альфа-
вирусов содержат нуклеокапсидный белок с мол. массой 30—
35 кД и 2 более крупных гликопротеина оболочки (в некото-
рых случаях они не разделяются при электрофорезе) с мол.
массами 45—55 кД. Вирионы флавивирусов содержат белок
оболочки, обычно гликозилированный, с мол. массой 50—55<кД
и 2 более мелких внутренних структурных белка с мол. масса-
ми 15 и 7 кД.
Удобно использовать систему диск-электрофореза Лэммли
[15]. Гели в виде пластин обладают преимуществами по срав-
нению с трубчатыми гелями, поскольку в пластине можно па-
раллельно анализировать несколько образцов, что дает воз-
можность с высокой точностью сравнивать степени очистки на
разных стадиях. Для анализа белков альфавирусов подходит
10%-ный разделяющий гель; в то же время эффективное раз-
деление вирионных белков флавивирусов (для которых харак-
терен широкий диапазон мол. масс) достигается в 8—20 %-ном
градиентном геле. В исследуемом образце (он должен содер-
жать 10—50 мкг белка в объеме 30 мкл или менее) вирионы
разрушают, добавляя 1/5 объема раствора, содержащего 10%
ДДС-Na, 5% 2-меркаптоэтанола, 50% глицерина и 0,05%
бромфенолового синего. Смесь прогревают 2 мин в кипящей во-
дяной бане, охлаждают и наносят на гель; в качестве контроля
используют стандартный набор белков с известными мол. мас-
сами. Когда бромфеноловый синий дойдет до конца геля, элек-
трофорез прекращают и гель окрашивают, инкубируя его 2 ч
при постоянном перемешивании в растворе, содержащем 1 %
кумасси синего, 25% изопропанола и 10% уксусной кислоты;
Культивирование, титрование и очистка тогавирусов 105
после этого в течение ночи отмывают избыток красителя рас-
твором, содержащим 10% изопропанола и 10% уксусной кисло-
ты. При анализе радиоактивно меченных вирусных белков гель
высушивают и проводят авторадиографию [16].
5. Общие выводы
Выделение и культивирование тогавирусов не представляет
принципиальных трудностей благодаря значительному разнооб-
разию возможных экспериментальных систем. Для молекуляр-
но-биологических исследований, как правило, необходим вирус
в очень высоком титре. В случае альфавирусов подобные титры
можно получить на культуре клеток. С другой стороны, многие
флавивирусы дают в культуре более низкие титры, и это мо-
жет потребовать соответствующей модификации условий экс-
перимента. Например, относительно высокой множественности
инфекции достигают, выращивая клетки в виде монослоя на
поверхности небольших культуральных сосудов.
Флавивирусы сравнительно мало изучены и открывают для
исследователей особенно широкое поле деятельности, поскольку
многие из них представляют опасность для человека и, кроме
того, данный род состоит из огромного количества видов.
Применяемые для флавивирусов методы очистки сходны с ис-
пользуемыми для других вирусов. Однако и здесь имеются
большие возможности для создания новых, более эффективных
методов, которые позволили бы идентифицировать неструктур-
ные белки и детально изучить механизмы репродукции.
Многие из описанных здесь методов титрования исходно со-
здавались для диагностических целей; тем не менее они вполне
применимы и для исследования антигенного родства между
вирусами или механизмов репродукции. Титры инфекционное™
одного и того же вируса, определенные разными методами, как
правило, неодинаковы. Обычно максимальный титр получают
при внутримозговом заражении новорожденных мышат, однако
материал из мозга животных иногда невозможно использовать
без дополнительной многостадийной очистки.
Еще одна до сих пор нерешенная проблема заключается
в вариабельности вируса при серийном пассировании в одном
и том же хозяине или при смене хозяина. Известно, что многие
тогавирусы в клетках комаров дают персистентную инфекцию,
в то время как в клетках млекопитающих персистенция может
и не наблюдаться. Вирус, образующийся при таких персистент-
ных инфекциях, часто имеет сниженную вирулентность для
мышей и для человека. Возможность подобных изменений нуж-
но иметь в виду, например, при получении гемагглютинина из
длительно культивируемых зараженных клеток (см. выше).
106
Глава 3
Наконец, не подлежит сомнению, что культуры клеток ко-
маров, как правило, высокочувствительны к природным изоли-
там вирусов, что является их преимуществом; однако во мно-
гих случаях заражение культур клеток млекопитающих дает
столь же хорошие результаты, причем в большинстве лабора-
торий работать с этими клетками проще.
6. Благодарность
Авторы глубоко признательны Мейвис Эдмондс за редак-
тирование и печатание рукописи и Алану Бакли за помощь
в подготовке фотографий.
ПРИЛОЖЕНИЕ
1. Среды для культур тканей
В составе всех сред указана эмбриональная телячья сыво-
ротка (ЭТС); однако она вполне заменима сывороткой ново-
рожденных телят. Можно снизить концентрацию сыворотки
в среде до 5%; это не влияет на рост клеток. Кроме того,
триптозо-фосфатный бульон (ТФБ) используется не во всех
лабораториях. Поэтому лучше всего подобрать конкретные
условия роста нужной линии клеток.
1. Среда Игла (модификация Глазго) —80 мл
ЭТС — 10 мл
ТФБ — 10 мл
Пенициллин— 100 ед./мл
Стрептомицин — 100 мкг/мл
Бикарбонат натрия (если отсутствует в среде Игла) —
0,275%
На данной среде растут все культуры клеток млекопитаю-
щих, упомянутые в настоящей главе, однако для этого необхо-
дим СОг-инкубатор.
2. Среда Лейбовича L-15 (pH 7,2) — 80 мл
ЭТС — 10 мл
ТФБ — 10 мл
Пенициллин — 100 ед./мл
Стрептомицин — 100 мкг/мл
На данной среде также растут все упомянутые в тексте
культуры, однако некоторые из них могут потребовать специ-
альной адаптации. СО2-инкубатор в данном случае не нужен.
pH среды доводится НС1 перед стерилизацией фильтрованием.
3. RPMI-1640 (голландская модификация) —80 мл
ЭТС — 10 мл, ТФБ — 10 мл
Бикарбонат натрия (если не содержится в RPMI) —
0,1%
Пенициллин— 100 ед./мл
Стрептомицин— 100 мкг/мл
Среда содержит в качестве буфера HEPES, поэтому СО2-
инкубатор для культивирования клеток не нужен. Эта среда
подходит для выращивания клеток линии С6/36 при 28—33 °C.
4. Среда MM/VP12 —85 мл
108
Приложение
ЭТС — 15 мл
Пенициллин— 100 ед./мл
Стрептомицин — 100 мкг/мл
На этой среде клетки могут расти в отсутствие СОг. На этой
среде особенно хорошо растут клетки комара Aedes pseudos-
cutellaris линии АР61 при 28 °C. Состав этой среды описан Вар-
ма и Пудни [17].
2. Среды для поддержания культур клеток
1. Во всех средах, используемых для поддержания культур,
кроме MM/VP12, концентрацию сыворотки снижают до 1—2%.
В случае клеток АР61 вместо MM/VP12 используют среду Лей-
бовича L-15, содержащую 2% ЭТС.
2. Среда для покрытия, содержащая карбоксиметилцеллю-
лозу (КМЦ)
Среда Лейбовича L-15 (двойной концентрации)—44 мл
КМЦ (3% в дистиллированной воде) —44 мл
ТФБ — 10 мл
ЭТС — 2 мл
Пенициллин— 100 ед./мл
Стрептомицин — 100 мкг/мл
3%-ную КМЦ готовят, добавляя 3 г КМЦ к 100 мл дистил-
лированной воды. Суспензию перемешивают в течение ночи
при 56 °C до растворения КМЦ, после чего раствор делят на
порции по 44 мл, автоклавируют 10 мин при 1 атм и хранят
при 4 °C.
3. Среда для покрытия, содержащая агарозу
Агароза1) — 10 г
Дистиллированная вода — 100 мл
Для приготовления среды с агарозой суспензию помещают
в кипящую водяную баню, до того как агароза расплавится.
Затем раствор автоклавируют 10 мин при 1 атм, охлаждают
до 42—44 °C и добавляют 10 мл данного раствора к 90 мл сре-
ды для поддержания культур, нагретой до 44 °C.
3. Растворитель для природного материала
Солевой раствор Хэнкса — 75 мл
ЭТС — 25 мл
Пенициллин — 500 ед./мл
Стрептомицин — 500 мкг/мл
> Существует несколько разных типов агарозы, и большинство из них
подходит для приготовления данной среды. Тем не менее полезно проверить
тот или иной тип, прежде чем заказывать его в больших количествах.
Приложение
109
4. Приготовление суспензии природного материала
Образец ткани помещают в бутылку с 8—10 стеклянными
бусинами диаметром 5—6 мм и заливают растворителем
(10 мл на 1г ткани). Крышку крепко завинчивают и бутылку
интенсивно встряхивают 30 с, предпочтительно с помощью мик-
сера (типа «Вортекс»), Препарат центрифугируют, отбирают
супернатант, используют его немедленно или хранят при
—70 °C.
5. Обработка сывороток, используемых в РТГА
Сыворотку прогревают 30 мин при 56 °C. 0,1 мл сыворотки
смешивают с 1,0 мл промытого кислотой каолина (26%-ная
суспензия в BBS). Смесь интенсивно встряхивают 15 мин при
комнатной температуре и центрифугируют 10 мин при 200 g.
Прозрачный супернатант отбирают и добавляют к плотному
осадку эритроциты гуся или цыпленка с таким расчетом, чтобы
получить 10%-ную суспензию. Суспензию инкубируют 1 ч при
комнатной температуре, ресуспендируя эритроциты каждые
15 мин, и затем центрифугируют 5 мин при 1500 g. Супернатант
отбирают, используют немедленно в РТГА или хранят при
—20°C (можно при более низкой температуре).
6. Реактивы и буферные растворы
Краситель нафталиновый черный;
Нафталиновый черный — 1 г
Ледяная уксусная кислота — 60 мл
Ацетат натрия — 13,6 г
Дистиллированная вода — до 1000 мл
Боратный буферный раствор (BBS):
Хлористый натрий — 7,02 г
Борная кислота — 3,09 г
Оба вещества растворяют в небольшом объеме теплой дис-
тиллированной воды и доводят объем до 100 мл. pH доводят
до 9,0 концентрированным NaOH, стерилизуют раствор авто-
клавированием 10 мин при 1 атм и добавляют 4 г порошка
бычьего сывороточного альбумина.
Глюкозо-желатиновый буферный раствор (DGV):
Веронал (барбитал) — 0,58 г
Желатин — 0,60 г
Веронал натрия — 0,38 г
Хлористый кальций (безводный) — 0,02 г
Сульфат магния (гидратированный) —0,12 г
Хлористый натрий — 8,5 г
110
Приложение
Глюкоза — 10,0 г
Дистиллированная вода — до 1 л
Вначале растворяют веронал и желатин примерно в 250 мл
воды при 56 °C, затем добавляют остальные реактивы. После
стерилизации автоклавированием в течение 10 мин при 1 атм
доводят pH до нужного значения.
Растворы для доведения pH суспензии эритроцитов:
Раствор А:
Хлористый натрий — 8,76 г
Двухзамещенный фосфат натрия — 28,39 г
Дистиллированная вода — до 1 л
Раствор Б: (дистиллированная вода — до 1 л)
Хлористый натрий — 8,76 г
Однозамещенный фосфат натрия — 31,20 г
Чтобы получить нужное значение pH для постановки реак-
ции гемагглютинации, растворы А и Б смешивают, как указано
в приведенной таблице.
Конечный pH” Раствор А, мл
6,0 12,5
6,2 22,0
6,4 32,0
6,6 45,0
6,8 55,0
7,0 64,0
Объем раствора в каждом случае доводят до 100 мл до-
бавлением соответствующего количества раствора Б.
Фосфатный буферный раствор (PBS):
Этот буфер имеется в продаже в виде таблеток; каждую
таблетку растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
Раствор версена:
PBS — 100 мл
Версенат натрия — 0,2 г
Глюкоза — 0,2 г
Следующие растворы стерилизуют фильтрованием:
Раствор трипсина (2,5%; имеется в продаже)—2 мл
Раствор версена— 18 мл
Трипсин разливают на порции по 2 мл и хранят при
—20 °C. Перед употреблением порцию оттаивают, смешивают
с версеном, нагревают смесь до 37 °C и используют немедлен-
но. Версен можно в течение длительного времени хранить при
4 °C. Смесь трипсин — версен при 4 °C хранить не следует.
Раствор глицерина для заключения срезов:
” Указано значение pH, которое получают при смешивании 1 объема дан-
ной смеси с 1 объемом BBS (pH 9,0).
Приложение
111
Глицерин — 90 мл
PBS — 10 мл
pH доводят до 8,3.
Литература
1. Porterfield J. S. (1980). In: The Togaviruses, Schlesinger R. W. (ed.),
Academic Press Inc., London and New York, p. 13.
2. Berge T. 0., ed. (1975). International Catalogue of Arboviruses, 2nd ed.,
DHEW Publ., No. (CDC) 75—8301, published by US Department of Health,
Education and Welfare, Public Health Service, Washington, D. C.
3. Varma M. G. R„ Pudney M-, Leake C. J. (1974). Trans. R. Soc. Trop. Med.
Hyg., 68, 374.
4. Singh K. R. P. (1972). Adv. Virus Res., 17, 187.
5. Pudney M„ Leake C. L, Varma M. G. R. (1979). In: Arctic and Tropical
Arboviruses, Yunker E. (ed.), Academic Press Inc., London and New York,
p. 245.
6. Tesh R. B. (1979). Ann. J. Top. Med. Hyg., 28, 1153.
7. Pang T„ Lam S. K., Chew С. B., Poon G. K., Ramalingam S. (1983). Lancet,
(i), No. 8336, 1271.
8. Rosen L„ Gubler D. (1974). Am. J. Trop. Med. Hyg., 23, 1153.
9. Reed L. J., Muench H. (1938). Am. J. Hyg., 27, 493.
10. Peiris J. S. M., Porterfield J. S. (1979). Nature, 282, 509'.
11. Clarke D. H„ Casals J. (1958). Am. J. Trop. Med. Hyg., 7, 561.
12. Chanas A. C., Gould E. A., Clegg J. C. S., Varma M. G. R. (1982). J. Gen.
Virol., 58, 37.
13. Microcarrier Cell Culture, Principles and Methods, Pharmacia Fine Chemi-
cals.
14. Obijeski J. F., Marchenko A. T., Bishop D. H. L„ Cann B. W., Murphy F. A.
(1974). J. Gen. Virol., 22, 21.
15. Laemmli U. K. (1970). Nature, 227, 680.
16. Laskey R. A. (1980). Methods in Enzymology, Vol. 65, Grossman L. and
Moldave K. (eds.), Academic Press Inc., London and New York, p. 363.
17. Varma M. G. R., Pudney M. (1969). J. Med. Ent., 6, 432.
ГЛАВА 4
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, ОЧИСТКА
И ТИТРОВАНИЕ РАБДОВИРУСОВ
В. Вуннер
1. Введение
В настоящее время известно более 80 вирусов семейства
Rhabdoviridae, вызывающих инфекции позвоночных, членисто-
ногих и растений. Многие из этих вирусов хорошо размножа-
ются не только в организме своего природного хозяина, но
и в культуре клеток. В то же время некоторые рабдовирусы,
не дающие высоких титров in vivo, требуют и длительной адап-
тации для культивирования in vitro. Изучение эксперименталь-
ной рабдовирусной инфекции, особенно на моделях вирусов,
интенсивно размножающихся в культуре клеток, сыграло важ-
ную роль в исследованиях стратегии репликации вирусного
генома и морфогенеза вирионов. Для успеха биохимических
работ по расшифровке структуры и функции индивидуальных
компонентов рабдовирусов также решающее значение имеют
культуры клеток, дающие высокий выход вирусных частиц.
Поскольку рабдовирусы являются одним из лучших источников
высокоочищенных белков и нуклеиновой кислоты (РНК), мно-
гими достижениями на пути изучения принципов структуры и
репродукции вирусов вообще мы обязаны именно вирусам этой
группы (см. обзоры [1—6]). Представленное в настоящей гла-
ве описание некоторых методов культивирования, очистки и
титрования рабдовирусов не претендует на роль детального
обзора методологии изучения этого обширного семейства виру-
сов. Цель автора ограничивалась лишь тем, чтобы по возмож-
ности четко выделить некоторые практические особенности ме-
тодов получения этих вирусов. В качестве моделей более де-
тально рассматриваются два рабдовируса позвоночных: вирус
везикулярного стоматита (ВВС) и вирус бешенства. Безус-
ловно, из этих двух моделей и из всех рабдовирусов вообще
наиболее удобным объектом лабораторного исследования явля-
ется ВВС. Исследователи не должны забывать о том, что оба
вируса вызывают опасные заболевания животных, а инфекция,
вызываемая вирусом бешенства, у человека обычно приводит
к летальному исходу. Для работы и хранения таких вирусов,
как правило, требуется разрешение руководства здравоохране-
ния данной страны; при этом в лаборатории необходимо со-
блюдать принятые меры безопасности. Персонал, работающий
Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов ИЗ
с вирусом бешенства, обязательно должен быть вакцинирован
и иметь в крови защитный титр противовирусных антител, за-
данный нормами Всемирной организации здравоохранения
[7]. Кроме того, в настоящей главе особое внимание уделено
очистке рабдовирусов растений, поскольку эта процедура встре-
чается с значительными трудностями.
2. Наращивание рабдовирусов в культурах клеток
Обычно лабораторные культуры заражают либо адаптиро-
ванным к размножению in vitro вирусом, либо неадаптирован-
ным, содержащимся в зараженных тканях или выделениях.
Многие первичные клеточные культуры и перевиваемые линии,
используемые для выделения рабдовирусов, детально рассмот-
рены в недавно опубликованном обзоре [8]. ВВС эффективно
размножается почти во всех известных в настоящее время ли-
ниях клеток млекопитающих и птиц. Особенно высокий выход
ВВС дает на первичной культуре фибробластов куриного эмб-
риона [9] или перевиваемой линии клеток ВНК-21 [10], при-
чем одинаково высокие титры получают как при размножении
вируса в монослойной, так и в суспензионной культурах [И].
Кривые нарастания титра ВВС в одиночном цикле размноже-
ния практически совпадают для двух типов культур. Выход
дочерних частиц ВВС из клеток начинается через 2 ч после
заражения; после этого в течение 6—8 ч выход вируса нараста-
ет по логарифмическому закону. Максимальный выход, дости-
гающий 1000 БОЕ/кл, наблюдается через 10—12 ч после зара-
жения.
2.1. Кривая нарастания титра в одиночном цикле размножения
Для определения продолжительности цикла размножения
рабдовируса в культуре клеток вирус вносят в концентрации,
достаточной для заражения всех клеток. После адсорбции ви-
руса на монослое клетки отмывают от несвязавшегося вируса,
добавляют предварительно нагретую культуральную среду и
продолжают инкубацию при 37 °C. Через определенные проме-
жутки времени в образцах зараженной культуры определяют
содержание вируса. Для этого либо снимают клетки со стекла
палочкой и разрушают их с помощью 3 циклов заморажива-
ния —• оттаивания (можно также один раз заморозить клетки
при —60 °C в бане из метанола и сухого льда и дать им быстро
оттаять при 37°C), либо обрабатывают клетки 1—2 мин уль-
тразвуком, чтобы освободить вирус, ассоциированный с клетка-
8—369
114
Глава 4
ми, либо, наконец, просто отбирают культуральную жидкость,
содержащую свободный вирус. Подсчитывают также число за-
раженных клеток (инфекционных центров), что позволяет оп-
ределить выход вируса в расчете на одну клетку.
Цикл размножения некоторых рабдовирусов, например ВВС,
короткий и составляет несколько часов, других же, например
вируса бешенства, — более длинный и составляет несколько
суток. Точно неизвестно, почему одни вирусы размножаются
более эффективно, чем другие, хотя предполагают, что эффек-
тивность размножения определяется уровнем активности вири-
онной транскриптазы.
Для постановки опыта готовят серию чашек (удобно ис-
пользовать чашки Петри диаметром 60 мм) с монослоем из
106 клеток или аналогичные культуры в каких-то других сосу-
дах. Чашки удобно подписать следующим образом: ИЦ («ин-
фекционные центры»), 0, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 и 18 (временные ин-
тервалы следует подбирать специально для каждого вируса).
Для проведения подобных опытов с ВВС часто используют
клетки ВНК-21 [12], выращиваемые на модифицированной
Дюльбекко среде Игла (МЕМ) или на среде МЕМ в модифи-
кации Глазго (фирма Gibco), содержащей 10% ЭТС.
В момент заражения монослой должен быть еще не плот-
ным. Для некоторых рабдовирусов иногда трудно обеспечить
строгую синхронизацию, необходимую для прохождения одного
цикла размножения, даже при очень высокой множественности
инфекции. Тем не менее инфицирование клеток большим коли-
чеством вируса для того, чтобы заразить каждую клетку, по-
зволяет приблизиться к таким условиям. Действительно, если
все клетки заражены, то, естественно, может пройти только
один цикл репродукции вируса. Однако существует и верхний
предел множественности инфекции. При очень высокой мно-
жественности может наблюдаться аномальная картина размно-
жения вируса, обусловленная накоплением дефектных интер-
ферирующих частиц (см. разд. 3.1.1) и реадсорбцией вирионов
потомства на клеточном дебрисе. По-видимому, лучше всего
в первом опыте использовать множественность инфекции
10 БОЕ/кл, а затем в случае необходимости увеличивать или
уменьшать ее в 10 раз. Можно добавить к вирусу или культу-
ральной среде некоторые полиионы для стимуляции связыва-
ния вируса с клетками и повышения инфекционности [13]. Та-
кое стимулирующее воздействие оказывают диэтиламиноэтил
(ДЭАЭ)-декстран и протаминсульфат в концентрациях 50 и
100 мкг/мл соответственно, если их добавляют к клеткам до
внесения вируса (за 4 ч или менее). После внесения вируса
полиионы не оказывают стимулирующего действия. Важно от-
метить, что некоторые полиионы хотя и способствуют адсорб-
Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов 115
ции вируса на клетках, но не повышают его инфекционное™
[И].
1, С клеточного монослоя, пастеровской пипеткой удаляют
культуральную среду. Рекомендуется работать в ламинарном
боксе для соблюдения стерильности и правил техники безопас-
ности.
2. На каждую чашку наносят 0,2 мл вируса, разведенного
с таким расчетом, чтобы получить нужную множественность
инфекции (например, 10 БОЕ/кл).
3. Чашки осторожно покачивают для равномерного распре-
деления вируса по монослою и инкубируют 1 ч в СОг-инкуба-
торе.
4. По окончании адсорбции избыток вируса удаляют пасте-
ровской пипеткой.
5. Клетки 3 раза осторожно промывают 1,5 мл PBS, содер-
жащего сыворотку. Промывающий раствор сливают в какой-
либо сосуд для инактивации вируса.
6. Во все чашки, кроме чашки, помеченной «ИЦ», вносят
по 5 мл среды МЕМ, содержащей 2% ЭТС или 0,2% БСА.
Чашки, помеченные «2—18», вновь помещают в СОг-инкубатор
с температурой 37 °C.
7. В чашку, помеченную «ИЦ», вносят 0,5 мл раствора трип-
сина и помещают ее на 5 мин в инкубатор или же оставляют
при комнатной температуре до отделения клеток от субстрата.
8. К отделившимся от субстрата клеткам добавляют 4,5 мл
культуральной среды с 10% ЭТС (МЕМ-10), переносят полу-
ченную суспензию в другой флакон и готовят разведения 10~2
и 10-3.
9. К разведенным зараженным клеткам немедленно добав-
ляют суспензию клеток ВНК-21 и определяют число инфекци-
онных центров методом бляшек, как описано ниже в разд. 2.2.
10. В чашке, помеченной «0», клетки с субстрата снимают
с помощью резиновой палочки.
11. Полученную суспензию клеток переносят в соответству-
ющим образом подписанную пробирку и проводят три цикла
замораживания — оттаивания или обрабатывают суспензию
ультразвуком в течение 1—2 мин.
12. Во время приготовления следующих образцов разрушен-
ные клетки хранят при 4 °C или в замороженном виде.
13. Через 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 и 18 ч после заражения соот-
ветствующие чашки обрабатывают для сбора вируса, как опи-
сано выше (см. стадии 10—12).
14. После того как все пробы, необходимые для исследова-
ния кинетики размножения вируса, приготовлены, их оттаива-
ют и готовят последовательные разведения следующим обра-
зом:
8*
116
Глава 4
PBS с сывороткой, мл 1,98 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8
Вирус, мл 0,02 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Разведение IO'2 IO’3 ю-4 10~5 ю-6 10~7
Для разных точек кинетической кривой наиболее целесообраз-
но использовать следующие разведения:
Время после
заражения, ч
О
2
3
4
6
8
10
12
18
Разведение
102, 10-3
IO”2, 10-3
IO”2, 10-3, 10-4
IO”3, 10-4
IO"3, 104, 10-5
10-4, 10-5
10-4, 10-5, 10-6
10-5, 10-6, 10-7
10-5, 10-6, 10-7
2.2. Титрование вирусов
2.2.1. Метод бляшек
Рабдовирусы, обладающие цитопатогенным действием на
клеточные культуры, дают бляшки, число которых пропорцио-
нально количеству вируса. Определение числа бляшек, обра-
зующихся в результате дегенерации зараженных клеток, ле-
жит в основе наиболее точного метода титрования. Число бля-
шек (х), сформировавшихся при нанесении на клеточный моно-
слой определенного разведения вируса (у) в объеме V, можно
использовать для расчета титра (п) в БОЕ/мл по уравнению
X
п=----.
y-v
ВВС титруют стандартным методом бляшек. Однако этот
простой и точный метод определения инфекционности приме-
ним не ко всем рабдовирусам. Для многих с успехом применя-
лись альтернативные подходы, в том числе модификации ме-
тода бляшек.
Классический метод бляшек для определения инфекционно-
сти вирусов животных, впервые описанный Дюльбекко [15],
заключается в адсорбции вируса на монослое чувствительных
клеток с последующим добавлением содержащей агар культу-
ральной среды, затвердевающей при охлаждении. После инку-
бации в течение определенного промежутка времени при окра-
шивании клеток нейтральным красным становятся видны
бляшки.
Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов 117
Инфекционность ВВС определяют, заражая вирусом моно-
слойную или суспензионную культуру клеток ВНК-21. Как
правило, предпочитают суспензионную культуру, поскольку
в этом случае адсорбция проходит более равномерно. Для оп-
ределения титра ВВС можно использовать и другие культуры,
в частности фибробласты куриного эмбриона или L-клетки
мыши [10, 16].
1. Перед опытом необходимо подписать пробирки, исполь-
зуемые для каждого разведения вируса, например «0 ч 10-2»,
«0 ч 10-3» и т. д.
2. В каждую пробирку вносят по 2 мл клеточной суспензии
(4-106 кл/мл).
3. Добавляют по 0,4 мл соответствующего разведения ви-
руса.
4. Суспензию клеток с вирусом встряхивают 20 мин при
37 °C.
5. После встряхивания по 1 мл зараженных клеток вносят
в подписанные чашки Петри диаметром 60 мм, содержащие по
4 мл культуральной среды с противовирусной антисывороткой.
Антитела, содержащиеся в сыворотке, нейтрализуют несвязав-
шийся вирус и предотвращают образование вторичных бля-
шек.
6. Клетки инкубируют 10—24 ч при 37 °C. В некоторых слу-
чаях для формирования бляшек может потребоваться и более
длительное время.
7. После инкубации среду удаляют и клетки осторожно про-
мывают PBS. Клетки окрашивают нейтральным красным или
по Гимза и подсчитывают бляшки.
Некоторые штаммы вируса бешенства тоже образуют чет-
кие бляшки на монослое клеток хомячка CER; в настоящее
время эта линия клеток широко используется для размножения
и титрования вируса бешенства и других вирусов [17]. Метод
бляшек с использованием клеток CER особенно чувствителен
при титровании стандартного штамма вируса бешенства CVS.
При работе этим методом используют монослойные культуры,
выращиваемые в шестилуночных планшетах (диаметр лунки
составляет 35 мм).
1. За сутки до заражения в каждую лунку вносят 1—1,25-
•106 клеток в 3 мл среды МЕМ-10; на следующий день, как
правило, формируется плотный монослой.
2. Для заражения клеток среду удаляют и в лунки вносят
по 0,1 мл вируса в PBS или МЕМ с 0,2% БСА.
3. Адсорбцию проводят 1 ч при 37 °C в СО2-инкубаторе
(при этом следует часто покачивать планшеты для равномерно-
го распределения вируса по монослою). После адсорбции
в каждую лунку вносят по 2 мл покрытия, состоящего из 0,5%-
118
Глава 4
ной агарозы в соответствующей среде (см. разд. 2.2.2), и инку-
бируют клетки 4—5 сут при 37 °C в СОз-инкубаторе. Бляшки
подсчитывают после окрашивания нейтральным красным в со-
ставе агарозного покрытия или кристаллическим фиолетовым
после удаления агарозы.
2.2.2. Модифицированный метод бляшек
с использованием агарозы
Описаны различные модификации метода бляшек с исполь-
зованием суспензии клеток в агарозе или агарового покрытия
[16, 18]. Один из этих методов разработан для медленно
размножающегося вируса бешенства [19]. Сублиния клеток
ВНК-21 (клон 13S) была адаптирована к росту в суспензион-
ной культуре в присутствии агарозы в течение 1,5—2 нед [20]
(эти клетки способны расти как в монослое, так и в суспензи-
онной культуре на среде МЕМ-10). Клетки, хранящиеся в жид-
ком азоте, сначала выращивают в виде монослоя, а затем пас-
сируют путем регулярной трипсинизации. Размороженные клет-
ки проходят около 30 пассажей. После этого их способность
давать бляшки может нарушиться.
1. Для подготовки клеток к титрованию методом бляшек
монослойные культуры клеток BHK/13S из нескольких куль-
туральных флаконов (типа Т-150) трипсинизируют и ресуспен-
дируют в среде МЕМ с 2% ЭТС (МЕМ-2) из расчета 10 мл
среды на один флакон.
2. Определяют концентрацию клеток и доводят ее до (8—
10) • 106 кл/мл средой МЕМ-2. Для титрования на 100 чашках
необходимо 50 мл такой клеточной суспензии. Суспензию инку-
бируют при 37 °C.
3. Готовят агарозную подложку. Для этого смешивают 250 мл
среды для агарозы [основная среда [21] удвоенной концентра-
ции без фенолового красного, 4% инактивированной ЭТС,
200 ед./мл пенициллина, 200 мкг/мл (156 ед./мл) стрептомицина,
100 ед./мл микостатина], нагретой до 37°С, и 250 мл 1%-ной
(вес на объем) агарозы (Seakem, фирма Bausch and Lomb,
Rochester, NY), для приготовления которой суспензию агарозы
кипятят до растворения и охлаждают до 42 °C. Смесь немедлен-
но разливают в чашки Петри (по1 4 мл) и дают агарозе за-
стыть; чашки при этом должны располагаться на ровной по-
верхности.
4. 50 мл клеточной суспензии смешивают с 50 мл 0,5%-ной
агарозы в описанной выше среде и пипеткой наносят по 1 мл
этой смеси на твердую агарозную подложку в каждой чашке.
5. Клеточную суспензию равномерно распределяют по по-
верхности подложки и дают ей затвердеть. Конечная концент-
К ул ьтивирование, очистка и титрование рабдовирусов И9
рация агарозы в содержащем клетки слое составляет, таким
образом, 0,25%. Чашки используют немедленно или после ин-
кубации в течение 24 ч в СОг-инкубаторе с влажной атмосфе-
рой.
6. Клетки в агарозном слое инфицируют, нанося на поверх-
ность по 0,1 мл вирусного инокулята. Зараженные культуры
инкубируют в течение 5—7 сут [в зависимости от штамма ви-
руса) в СО2-инкубаторе с влажной атмосферой.
7. Для выявления бляшек в каждую чашку вносят по 2 мл
0,5%-ной агарозы, содержащей нейтральный красный в разве-
дении 1 : 10 000. Через 2—4 ч подсчитывают бляшки.
2.2.3. Интерпретация результатов титрования
методом бляшек
Бляшки, образуемые каждым разведением вируса, подсчи-
тывают на нескольких идентичных (параллельных) чашках.
Титр вируса в неразведенном препарате (в БОЕ/мл) можно
рассчитать, исходя из суммы всех бляшек в данном разведе-
нии при соблюдении следующих условий.
1. Среднее число бляшек, как правило, обратно пропорцио-
нально разведению. Это соотношение обычно не соблюдается
при большой плотности бляшек, когда они сливаются друг
с другом. Поэтому не следует использовать при расчете титра
разведения, дающие такую картину.
2. Разброс числа бляшек на чашках с одним и тем же раз-
ведением вируса не должен превышать ожидаемого, исходя из
случайного распределения. Если же наблюдается больший
разброс, что может быть обусловлено негомогенностью моно-
слоя или погрешностями разведения, то и такие результаты не
следует использовать при расчетах.
2.2.4. Получение очищенного вируса из бляшек
Хорошо обособленные друг от друга бляшки обычно форми-
руются при максимальном разведении вируса. Для выделения
очищенного вируса индивидуальные бляшки извлекают пасте-
ровской пипеткой (каждую бляшку отдельной пипеткой) и по-
мещают в культуральные флаконы (Т-25, Falcon), содержащие
5 мл суспензии только что трипсинизированных клеток ВНК-21.
Бляшки суспендируют энергичным пипетированием. Чтобы кон-
тролировать инфекционный процесс, по 0,5 мл суспензии из
каждого флакона вносят в лунки 4-камерных стекол для куль-
туры клеток (типа Lab-Tek). Флаконы и стекла с зараженными
клетками инкубируют трое суток и идентифицируют на стек-
лах зараженные клетки методом иммунофлуоресценции.
120
Глава 4
2.2.5. Титрование вирусов методом иммунофлуоресценции
Титр вируса можно определить (хотя и менее точно, чем
методом бляшек), заражая клетки последовательными разве-
дениями вируса и определяя число зараженных клеток мето-
дом иммунофлуоресценции. Одно из преимуществ этого метода
состоит в том, что на каждое разведение вируса идет меньшее
количество клеток, поскольку разведения готовят в лунках
планшета для культур клеток (типа Microtest II, Falcon; план-
шет имеет 96 лунок с плоским дном глубиной 6 мм); таким
образом достигается существенная экономия реактивов. После-
довательные 10- или 5-кратные разведения вируса в планшете
готовят следующим образом.
1. Планшет располагают длинной или короткой стороной
к экспериментатору в зависимости от того, сколько разведений
нужно приготовить. В каждую лунку планшета вносят 80 мкл
МЕМ-10; каждый ряд лунок используют для приготовления
разведения определенного образца вируса.
2. С помощью микропипетки, меняя наконечник при каж-
дом переносе, вносят в первую лунку ряда 20 мкл неразведен-
ной суспензии вируса, после чего последовательно переносят
из лунки в лунку по 20 мкл, доходя до конца ряда.
3. В каждую лунку с помощью пастеровской пипетки вносят
по 1 капле (25 мкл) суспензии свежетрипсинизированных кле-
ток ВНК-21 с концентрацией 2-Ю6 кл/мл. Таким образом,
в каждой лунке содержатся 5-104 клеток и вирус в соответст-
вующем разведении в объеме 105 мкл.
4. Для приготовления последовательных 10-кратных разведе-
ний проводят описанные выше операции, но в каждую лунку
добавляют по 90 мкл МЕМ-10 и переносят затем из лунки в
лунку по 10 мкл вируса.
5. Осторожно перемешав содержимое лунок, из каждой лун-
ки отбирают 2 или 3 аликвоты по 10 мкл (4,7-103 клеток в слу-
чае 5-кратного разведения) и переносят их в отдельные лунки
микропланшета Терасаки с 60 или 72 лунками (фирма Nunc).
6. Планшеты закрывают и инкубируют 1—2 сут в СО2-инку-
баторе при 37°C. Если используется суспензия клеток ВНК-21
с концентрацией 1 • 106 кл/мл, то инкубацию проводят 3—4 сут.
Для максимально точного определения титра предпочтительна
более длительная инкубация (3—4 сут).
Примечание. В случае быстро размножающихся рабдови-
русов, например ВВС, удается через 2 сут после заражения
визуально определить предельное разведение, при котором
наблюдается ЦПД, и, исходя из этого, рассчитать титр исход-
ного вируса. Для многих вирусов, которые размножаются мед-
леннее и не обладают ЦПД, после нескольких суток инкубации
титр рассчитывают по тому максимальному разведению, при
Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов 121
котором еще удается выявить иммунофлуоресценцию заражен-
ных клеток.
Вирус обнаруживают в лунках планшета Терасаки после
фиксации клеток и постановки иммунофлуоресценции.
1. Перед фиксацией в планшет вносят 10 мл PBS.
2. Среду перемешивают с PBS, пользуясь пастеровской пи-
петкой.
3. Разведенную PBS среду удаляют} пипеткой и погружают
планшет на 1 мин в охлажденный до 4 °C раствор, состоящий
из 80% ацетона и 20% воды. Затем планшет переносят в другой
сосуд с охлажденным 80%-ным ацетоном и инкубируют 30 мин.
4. После фиксации планшет вынимают из сосуда с ацетоном
и удаляют остатки ацетона встряхиванием.
5. Планшет высушивают полностью 30 мин при 37°C.
6. Использованный ацетон фильтруют через Whatman № 1 и
сохраняют для дальнейшего использования.
7. Для выявления вирусного антигена в зараженных клет-
ках используют флуоресцирующие антитела. В каждую лунку
планшета Терасаки вносят по 5 мкл конъюгированных с флуо-
ресцеином антител против одного из вирусных антигенов (на-
пример, против нуклеокапсидного белка) и инкубируют план-
шет 30—60 мин при 37 °C во влажной камере. Следует убе-
диться в том, что на стенках лунок отсутствуют пузырьки воз-
духа. Альтернативный, непрямой метод идентификации вирус-
ных антигенов предполагает использование моноклональных
противовирусных антител мыши и конъюгированных с флуо-
ресцеином антител против иммуноглобулинов мыши.
8. После окрашивания планшет два раза промывают PBS
и один раз водой.
9. Влажные планшеты исследуют с помощью флуоресцент-
ного микроскопа.
10. Чтобы рассчитать титр исходного вируса, определяют
предельное разведение, при котором в ячейке еще обнаружива-
ются зараженные клетки. Считают, что при этом разведении
в каждую лунку внесено по 1 инфекционной единице.
Инфекционность исходного вируса рассчитывают по форму-
ле Спирмена-Кербера [22], которая позволяет определить
50%-ную конечную точку. При расчете 50 %-ной конечной точ-
ки используют следующую формулу:
50% — (% положительных лунок при минимальном
разведении, дающем менее 50% положительных
______________результатов)___________ логарифм
(% положительных лунок при максимальном раз- фактора раз-
ведении, дающем более 50% положительных ре- ведения,
зультатов) — (% положительных лунок при мини-
мальном разведении, дающем менее 50% положи-
тельных результатов)
122
Глава 4
Затем рассчитывают разность логарифмов разведения, дающего
менее 50% положительных результатов, и 50%-ной конечной
точки. Если число положительных результатов уменьшается
с увеличением разведения, 50%-ная конечная точка оказывает-
ся меньше того разведения, которое дает менее 50% положи-
тельных результатов. И тогда из логарифма величины, обрат-
ной данному разведению, вычитают полученную разность лога-
рифмов. Этот метод расчета известен как метод Рида и Менча
[22].
3. Выделение и очистка вирусов
3.1. Рабдовирусы животных
Рабдовирусы млекопитающих, принадлежащие к родам Ve-
siculovirus и Lissavirus, размножаются в мозге взрослых мы-
шей и крыс после интрацеребрального заражения и могут быть
выделены из природного материала после одного пассажа че-
рез мозг животных. Однако более чувствительной системой для
выявления и размножения этих рабдовирусов являются мыши-
сосунки [23]. В зависимости от продолжительности инкубаци-
онного периода длительность пассажа в мозге мышей может
составлять от 7 до 18 сут, а в случае медленно размножающе-
гося вируса бешенства и больше. Для ВВС инкубационный пе-
риод, как правило, намного короче (2 сут). Вирус обнаружива-
ют методом иммунофлуоресценции.
1. Для выделения вируса готовят 10%-ную суспензию тка-
ни мозга зараженных животных на среде МЕМ-10. Для этого
ткань мозга измельчают в гомогенизаторе (типа Ten Broeck)
или растирают в ступке. Не следует пользоваться гомогениза-
торами, вызывающими образование аэрозолей.
2. Суспензию осветляют центрифугированием (10 мин при
1600 об/мин) на холоду, супернатант собирают и проверяют на
стерильность. Осветленный супернатант хранят при —70 °C.
3. Готовят суспензию только что трипсинизированных кле-
ток ВНК-21 на среде МЕМ-10 с концентрацией 1-Ю6 кл/мл.
Плотный монослой клеток во флаконе типа Т-75 образован
в среднем 20-106 клеток.
4. Для выделения, например, вируса бешенства 1 мл сус-
пензии клеток ВНК-21 смешивают с 0,25 мл суспензии мозго-
вой ткани во флаконе типа Т-25; смесь инкубируют несколько
минут при комнатной температуре.
5. К смеси добавляют 5 мл МЕМ-10, перемешивают и пере-
носят по 0,5 мл суспензии в отдельные ячейки стекла для
культуры тканей типа Lab-Tek.
6. Клетки во флаконе и на стекле инкубируют при 37 °C.
Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов 123
7. После 24 ч инкубации среду меняют для удаления остат-
ков мозговой ткани.
8. После 3 сут инкубации клетки на стекле фиксируют и
определяют процент зараженных клеток методом прямой имму-
нофлуоресценции (см. разд. 2.2.5).
9. Определить число зараженных клеток можно и на план-
шетах Терасаки. В этом случае перед добавлением 5 мл куль-
туральной среды аликвоты клеточной суспензии объемом
10 мкл переносят в лунки планшета Терасаки; затем клетки
фиксируют и определяют вирус методом иммунофлуоресценции,
как описано в разд. 2.2.5.
10. Если заражено менее 50% клеток, среду из культураль-
ного флакона удаляют и хранят при —70°C.
11. Клетки трипсинизируют, ресуспендируют в 2 мл МЕМ-10,
распределяют во флаконы типа Т-25 по 0,5 мл (рассев 1 : 4)
и вносят в каждый флакон по 5 мл МЕМ-10.
12. При необходимости инкубацию клеток повторяют, конт-
ролируя размножение вируса методом прямой иммунофлуорес-
ценции до тех пор, пока все клетки не будут заражены.
13. Рассчитывают титр вируса в первой культуре или после
дополнительного инфицирования. Если при повторном инфици-
ровании вирус не обнаруживается, считают, что он в данной
культуре не размножается, и культивирование прекращают
[24].
3.1.1. Очистка рабдовирусов
Вирионы рабдовирусов имеют весьма характерную структу-
ру; в препаратах, окрашенных методом негативного контрасти-
рования, обнаруживаются частицы вариабельной длины, имею-
щие закругленный и уплощенный концы (так называемые пу-
левидные частицы). Нормальные инфекционные вирионы име-
ют длину 170—180 нм и диаметр 70 нм. Дефектные интерфе-
рирующие частицы (ДИЧ) сохраняют характерную для инфек-
ционных частиц пулевидную форму, но имеют меньшую длину.
Они неинфекционны и накапливаются в возрастающем количе-
стве при пассировании большинства типичных рабдовирусов
без разведения благодаря их способности успешно конкуриро-
вать (интерферировать) с нормальными инфекционными час-
тицами. ДИЧ имеют такой же химический состав, как и стан-
дартные вирионы, но их геномная РНК имеет меньший размер.
ДИЧ и стандартные вирионы данного вируса существенно раз-
личаются по коэффициентам седиментации, что используется
для их разделения методом зонального центрифугирования. Ме-
тод, описанный ниже, эффективен для очистки вируса из куль-
туральной среды. Хотя рабдовирусы высвобождаются из зара-
124
Глава 4
женных клеток почкованием через плазматическую мембрану,
как правило, вирусы, вызывающие слабое ЦПД и накаплива-
ющиеся в культуральной жидкости, мало загрязнены клеточны-
ми компонентами. Ранний сбор вируса облегчает его очистку,
поскольку в культуральной среде не успевает накопиться
клеточный дебрис; в то же время, чтобы избежать связывания
вирионов с некоторыми компонентами сыворотки, для выра-
щивания зараженных клеток используют среду с 0,1—0,3%
БСА.
На первой стадии очистки вирус необходимо отделить от
клеток и клеточного дебриса, содержащегося в культуральной
жидкости. Как правило, для этого используют низкоскоростное
центрифугирование при 600 g. На второй стадии вирус, нахо-
дящийся в осветленном супернатанте, концентрируют и осво-
бождают от большинства низкомолекулярных и высокомолеку-
лярных примесей с помощью любого из известных методов
концентрирования вирусов при низкой температуре (4—10°C),
pH 6,8—8,0 и средних значениях ионной силы. Ниже рассмат-
риваются два метода: осаждение вируса высокоскоростным
центрифугированием и преципитация ацетатом цинка, сульфа-
том аммония или полиэтиленгликолем. Преципитация удобна
для получения вирусов как в малых, так и в больших количе-
ствах и обладает тем преимуществом, что обеспечивает отделе-
ние вируса от большей части посторонних белков.
Наиболее широко используемый метод концентрирования
рабдовирусов — осаждение высокоскоростным центрифугирова-
нием (естественно, для этого в лаборатории должна быть
ультрацентрифуга с подходящим ротором). Коэффициент седи-
ментации стандартных инфекционных частиц ВВС и вируса
бешенства составляет около 600S; длина ДИЧ на 1/3—3/4
меньше длины стандартных вирионов, и соответственно они
имеют меньшие коэффициенты седиментации [25]. В боль-
шинстве лабораторий для выделения вируса из инфицирован-
ных тканей осветленную содержащую вирус культуральную
жидкость в ламинарном боксе переносят в плотно закрываю-
щиеся центрифужные пробирки или стаканы большого объема
(250 мл) от соответствующего углового или бакет-ротора, на-
пример центрифуги Spinco (Beckman) и др.
1. Вирус осаждают центрифугированием 90 мин при 48 000—
50 000 g и 4 °C.
2. По окончании центрифугирования закрытые пробирки
вновь помещают в ламинарный бокс и осторожно сливают
супернатант.
3. Остаток супернатанта тщательно удаляют из пробирок
4. Осадок вируса ресуспендируют в небольшом объеме ра-
створа, содержащего 0,13 М NaCl, 0,05 М трис-HCl и 1 мМ
Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов 125
ЭДТА (буфер NTE, pH 7,8); объем буфера должен составлять
1 % исходного объема культуральной жидкости.
5. Пробирки инкубируют 3—4 ч при 4 °C, периодически
встряхивая, или в течение ночи без встряхивания для размяг-
чения осадка. После этого, чтобы ресуспендировать вирус, до-
статочно осторожного пипетирования.
6. Клеточный дебрис и агрегаты вирионов, которые не уда-
ется ресуспендировать таким образом, удаляют центрифуги-
рованием 20 мин при 1000 g и 4 °C.
В ресуспендированном осадке содержится почти вся инфек-
ционность, имеющаяся в исходном препарате.
1. Для осаждения вирионов ионами Zn2+ смешивают 1 объ-
ем 1 М ацетата цинка (pH 5,0) и 50 объемов вируссодержа-
щей культуральной жидкости [26]. После перемешивания pH
вирусной суспензии снижается приблизительно до 6,8.
2. Смесь инкубируют 20—60 мин при 0—4°C, после этого
осаждают образующийся преципитат центрифугированием
40 мин при 1000 g.
3. Прозрачный супернатант, практически не содержащий
вируса, отбрасывают, а осадок ресуспендируют в насыщенном
растворе Ыа2ЭДТА (этот раствор получают, растворяя 11,7 г
соли в 100 мл воды и доводя pH до 7,8 добавлением сухого
триса). Объем раствора ЭДТА, используемый для ресуспенди-
рования вируса, должен составлять по крайней мере 1,25%
исходного объема вируссодержащей культуральной жидкости.
4. Следует убедиться в том, что полученная суспензия виру-
са прозрачна; оставшиеся частицы растворяют, внося дополни-
тельное количество раствора ЭДТА.
5. Сконцентрированный вирус осветляют центрифугирова-
нием 20 мин при 1000 g; такие препараты могут по-прежнему
содержать небольшое количество бычьего сывороточного аль-
бумина, клеточных белков и низкомолекулярных соединений,
которые часто захватываются формирующимся преципи-
татом.
Альтернативные методы концентрирования рабдовирусов —
преципитация сульфатом аммония или ПЭГ 6000.
1. К осветленной культуральной жидкости, содержащей ви-
рус, добавляют сухой (NH4)2SO4 (300 г на 1 л) или ПЭГ 6000
(30 г на 1 л). Вещества добавляют медленно при постоянном
перемешивании на холоду (4°C), поддерживая pH 7—8 с по-
мощью 1 М раствора трис-НС1 (pH 8,0).
2. Преципитат осаждают центрифугированием 30 мин при
1500 g. Осадок, полученный с помощью сульфата аммония, рас-
творяют в 0,4М (NH4)2SO4, 0,1 М трис и 0,01 М ЭДТА (pH7,4)
и центрифугируют 70 мин при 82 000 g на подушке 100%-ного
глицерина объемом 1 мл в бакет-роторе (Beckman, SW27).
126
Глава 4
3. По окончании центрифугирования раствор над зоной
вируса полностью удаляют и собирают вирус, образующий зону
на поверхности подушки, добавляя буферный раствор, содер-
жащий (NH4)2SO4, трис и ЭДТА, и предельно осторожно пока-
чивая пробирку для растворения вируса.
4. Вирусную суспензию разводят в 3—5 раз для дальней-
шей очистки методом центрифугирования в градиенте концент-
рации сахарозы, как описано ниже.
На третьем (и последнем) этапе очистки рабдовирусов от-
деляют стандартные инфекционные вирионы от ДИЧ, которые
могут присутствовать в составе вирусного потомства. Разделе-
ние достигается центрифугированием вирусного препарата
в линейном градиенте концентрации сахарозы благодаря раз-
личию коэффициентов седиментации инфекционных вирионов
и ДИЧ. Седиментация вируса в градиенте концентрации саха-
розы обычно сопровождается снижением инфекционности в 2—
3 раза, так как значительная часть вирусных частиц разруша-
ется при диализе, который проводят для удаления сахарозы.
Для того чтобы свести инактивацию к минимуму, диализ сле-
дует проводить в несколько стадий против растворов с убы-
вающей концентрацией сахарозы.
1. Для отделения стандартных вирионов от ДИЧ концентри-
рованную суспензию вируса наслаивают на 5—30%-ный (поло-
гий) или 10—60%-ный (крутой) линейный градиент концентра-
ции сахарозы, приготовленный на буфере NTE, и центрифуги-
руют 45 мин при 54 000 g или 60 мин при 61 000 g соответст-
венно.
2. После центрифугирования собирают 20—30 фракций гра-
диента, прокалывая дно пробирки; если в пробирке видны зо-
ны вируса, их отбирают, прокалывая пробирку сбоку.
3. Собранный вирус разводят 3—5 объемами NTE и осаж-
дают центрифугированием 3 ч в бакет-роторе при 189 000 g.
4. Осадок ресуспендируют в NTE для дальнейшего биохими-
ческого анализа.
В отсутствие белка-носителя инфекционность вируса, очи-
щенного описанным методом, достаточно лабильна. Однако пос-
ле добавления бычьего сывороточного альбумина до концентра-
ции 0,5—1% вирус можно хранить в течение нескольких меся-
цев при —70 °C практически без потери инфекционности.
3.2. Рабдовирусы растений
Большинство методов очистки вирусов растений не подходит
для рабдовирусов, поскольку предусматривают осветление гру-
бых растительных экстрактов прогреванием при 55—60 °C или
обработкой органическими растворителями [4]. Неприемле-
мость этих процедур для очистки рабдовирусов обусловлена,
Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов
127
во-первых, возможностью термической инактивации и, во-вто-
рых, разрушением оболочки вирионов органическими раствори-
телями. Поэтому методы очистки рабдовирусов растений были
разработаны на основе методов очистки рабдовирусов живот-
ных. Опубликован прекрасный обзор этих методов, в котором
обсуждаются применение центрифугирования в плотностных
градиентах и электрофореза для отделения вирусов от остатков
тканей, а также дополнительные процедуры для экстракции
рабдовирусов из тканей растений [4].
Описанный ниже метод используется в настоящее время на
кафедре вирусологии Сельскохозяйственного университета
в Вагенингене (Нидерланды) [27]. Вирус получают из листьев
Nicotiana glutinosa или Nicotiana christii через 10—12 сут пос-
ле заражения. Здоровые растения заражают механическим спо-
собом, используя в качестве инокулята гомогенат 1—2 листьев
больного растения, растертых в 0,01 М Na2SO3. Когда механи-
ческое инфицирование растений невозможно, растения заража-
ют с помощью насекомых. На степень очистки и выход вируса
влияют условия культивирования растений; при слишком ин-
тенсивном солнечном освещении возможно снижение выхода
вируса.
На первом этапе выделяют вирус из зараженного растения.
1. Зараженные листья собирают и через 60—80 г листовой
массы под вакуумом пропускают буфер для экстракции, содер-
жащий 0,1 М глицин (или 0,01 М трис), 0,01 М MgCl2 и 0,01 М
KCN (или 0,01 М Na2SO3), pH 8,2—8,4.
2. Обработанные таким образом листья через 1—2 ч из-
мельчают в течение 15 с в гомогенизаторе Уоринга с 3 объема-
ми буфера для экстракции.
3. Необходимо контролировать pH суспензии и при необхо-
димости доводить его до 7,2; при более низких значениях pH
могут возникнуть затруднения при отделении вируса от ком-
понентов тканей растения в процессе очистки. Если почему-ли-
бо используют большее количество ткани листьев (например,
300 г), гомогенизацию можно проводить в равном объеме
(300 мл) холодного глицинового буфера в течение 1 мин при
максимальной скорости вращения ножей гомогенизатора [28].
4. Для удаления пульпы из гомогената через 4 слоя марли
отжимают сок. Следует помнить, что экстрагирующий глицино-
вый буфер (0,1 М глицин, 0,1 М NaH2PO4 и 0,01 М MgCl2, pH
доводят до 7,2 NaOH) можно хранить при 4°C, а затем непо-
средственно перед использованием добавлять Na2SO3. Присут-
ствие восстановителя необходимо для получения вируса [29].
5. Сок центрифугируют 5 мин при 8000 g.
6. Супернатант собирают и осветляют, добавляя целит
(или Hyflo Supercell) до конечной концентрации 10% (вес на
128
Глава 4
объем) и фильтруя полученную смесь через слой целита или
Hyflo Supercell (толщиной 5—7 мм), смоченного экстрагирую-
щим буфером, на воронке Бюхнера. В некоторых случаях при-
ходится создавать в колбе-приемнике вакуум с помощью мощ-
ного насоса. Сок следует пропускать через воронку до тех пор,
пока уровень жидкости не дойдет до поверхности подушки.
Однако при этом поверхность обязательно должна оставаться
влажной (нельзя допускать, чтобы она пересыхала).
7. На поверхность подушки медленно наливают 60 мл гли-
цинового буфера для экстракции и пропускают жидкость че-
рез воронку под вакуумом так, чтобы поверхность подушки ос-
тавалась влажной.
8. Приливают вторую порцию того же буфера и пропуска-
ют через воронку, пока поверхность подушки не станет сухой.
Полученный фильтрат должен иметь желтовато-оранжевый
цвет без зеленого оттенка.
9. В препаратах, содержащих значительное количество ви-
руса, можно зарегистрировать светорассеяние.
Примечание. Правильное приготовление подушки из целита
имеет большое значение и требует определенного навыка. Для
обработки 300 г листьев подушку готовят на воронке Бюхнера
диаметром 19,5 см. Обычно 85 г целита (препарат для анали-
тического фильтрования) размешивают в достаточном объеме
экстрагирующего глицинового буфера для получения гомоген-
ной суспензии, которую затем наслаивают на 2 листа фильтро-
вальной бумаги Whatman ЗММ (диаметр 18,5 см) и осторожно
под вакуумом пропускают раствор через воронку до тех пор,
пока не образуется слой («подушка») толщиной 5—7 мм, слег-
ка влажный сверху. Подушка должна иметь на всех участках
одинаковую толщину; ее следует готовить не более чем за 1 ч
до начала очистки вируса и хранить до употребления при 4°C.
Одной такой подушки хватает для обработки 300 г листьев
[29].
1. Вирус из фильтрата концентрируют добавлением 0,3
объема 30%-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ 8000)
в воде.
2. Смесь размешивают 1 ч при 4°C для формирования пре-
ципитата вируса.
3. Преципитат осаждают центрифугированием 20 мин при
9000 об/мин в роторе с большой емкостью (объем стаканов
250 мл) и растворяют осадок в буфере для хранения (0,1 М
трис-НС1, 0,01 М ацетата Mg, pH 7,5); объем буфера должен
составлять 1/5 объема осветленного фильтрата.
4. Вирусную суспензию вновь фильтруют через более тон-
кую подушку из целита. Ее готовят, как описано выше, но для
приготовления суспензии 30 г целита размешивают в буфере
Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов 129
для хранения и каждую промывку проводят 35 мл того же
буфера.
5. Фильтрат переносят в центрифужные пробирки и осаж-
дают вирус центрифугированием 1 ч при 20 000 g.
6. Осадок ресуспендируют в 1,5 мл буфера для хранения
(этот объем может быть изменен в зависимости от количества
осадка) и наносят полученную суспензию вируса на 15—
30%-ный линейный градиент концентрации сахарозы в буфере
для хранения. Вирус должен образовать зону при центрифуги-
ровании в течение 25 мин при 67 000 g.
7. Видимую простым глазом зону вируса извлекают из гра-
диента, прокалывая пробирку сбоку, и проводят дальнейшую
очистку вируса повторным центрифугированием в более кру-
том градиенте концентрации сахарозы (например, 20—60%,
вес на объем).
8. Из градиента вновь извлекают зону вируса, разводят ее
примерно 5 объемами буфера для хранения и осаждают вирус
высокоскоростным центрифугированием в разбавленном рас-
творе сахарозы.
9. После центрифугирования супернатант осторожно слива-
ют, его остатки тщательно удаляют фильтровальной бумагой
и ресуспендируют осадок вируса в 0,5 мл буфера для хране-
ния. Вирус хранят в замороженном виде при —20 или —70 °C.
Литература
1. Howatson A. F. (1970). Adv. Virus Res., 16, 196.
2. Matsumoto S. (1970). Adv. Virus Res., 16, 257.
3. Knudsen D. L. (1972). J. Gen. Virol., 20, 105.
4. Francki R. I. B. (1973). Adv. Virus Res., 18, 257.
5. EmersonS. U. (1976). Curr. Top. Microbiol. Immunol., 73, 1.
6. Schneider L. G., Diringer H. (1976). Curr. Top. Microbiol. Immunol., 75,
153.
7. Recommendation of the Immunization Practices Advisory Committee (1984)
in Morbidity and Mortality Weekly Report, Vol. 33, published by E. Eng.
J. Med.
8. Clark H. F. (1979). In: Rhabdoviruses, Vol. 1, Bishop D. H. L. (ed.), CRC
Press, Boca Raton, Florida, p. 23.
9. McClain M. E., Hackett A. J. (1958). J. Immunol., 80, 356.
10. Takehara M. (1975). Arch. Virol., 49, 297.
11. Bachrach H. L., Callis J. J., Hess W. R. (1956). Proc. Soc. Exp. Biol. Med.,
91, 177.
12. MacPherson M. M., Stoker M. (1962). Virology, 16, 147.
13. Kaplan M. M., Wiktor T. J., Maes R. F., Campbell J. B., Koprowski H. (1961)
J. Virol., 1, 145.
14. Wanner W. H„ Reagan K. J., Koprowski H. (1984). J. Virol., 50, 691.
15. Dulbecco R. (1952). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 38, 747.
16. Franklin R. M. (1958). Virology, 5, 408.
17. Smith A. L„ Tignor G. H., Mifune K, Motohashi T. (1977). Intervirology,
18. Cooper P. D. (1961). Virology, 13, 153.
9—369
130
Глава 4
19. Sedwick IT. D., Wiktor T. J. (1967). J. Virol., 1, 1224.
20. Vaheri A., Sedwick W. D., Plotkin S. A., Maes R. (1965). Virology, 27, 239;
21. Eagle H. (1955). Science (Wash.), 122, 501.
22. Lorenz R. L., Bogel K- (1973). In: Laboratory Techniques in Rabies, Kap-
lan M. M. and Koprowski H. (eds.), World Health Organization, Geneva,
p. 321.
23. Koprowski H. (1966). In: Laboratory Techniques for Rabies, 2nd edition,
World Health Organization, Geneva, p. 69.
24. Wiktor T. J., Macfarlan R. I., Foggin С. M., Koprowski H. (1984). Develop-
ments in Biological Standartization Joint WHO/IABS Symposium Pro-
ceedings, Vol. 57, in press.
25. Reichmann M. E., Schnitzlein W. M. (1979). Curr. Top. Microbiol. Immunol.,
86, 123.
26. Sokol F., Kuwert E„ Wiktor T. J., Hummler K„ Koprowski H. (1968). J. Vi-
rol., 2, 836.
27. Peters D., personal communication.
28. Jackson A. 0., Christie S. R. (1977). Virology, 77, 344.
29. Jackson A. O., personal communication.
ГЛАВА 5
ПНЕВМОВИРУСЫ
К. Прингл
1. Уникальные особенности пневмовирусов
1.1. Общее введение
В состав группы пневмовирусов входят респираторно-синци-
тиальный вирус человека, респираторно-синцитиальный вирус
крупного рогатого скота и вирус пневмонии мышей. Прототип
этой группы, респираторно-синцитиальный вирус (РСВ),— это
плеоморфный оболочечный вирус, геном которого представлен
несегментированной РНК негативной полярности. РСВ принад-
лежит роду Pneumovirus, который вместе с родами Paramyxo-
virus и Morbillivirus образует семейство Paramyxoviridae [1].
Однозначно доказана этиологическая роль РСВ при ежегодных
вспышках респираторных заболеваний у детей. Уникальность
биологических, биохимических и клинических характеристик
этого вируса не позволяет объединить его с представителями
рода Paramyxovirus. РСВ обнаруживают у сельскохозяйствен-
ных животных (крупный рогатый скот, овцы и козы); РСВ
крупного рогатого скота вызывает у животных респираторное
заболевание. Антитела к РСВ часто присутствуют и в сыворотке
крови других домашних и лабораторных животных, контакти-
рующих с человеком, но выделение вируса от этих животных
не описано. Изоляты РСВ, выделенные от человека и крупного
рогатого скота, имеют антигенное родство; среди человеческих
изолятов не обнаружена связь между антигенной вариабель-
ностью и клиникой заболеваний. Вирус пневмонии мышей
(ВПМ), вызывающий у этих животных респираторное заболе-
вание, не имеет антигенного родства с РСВ, однако в некото-
рой степени сходен с ним; во всяком случае это единственный
вирус, достаточно близкий к РСВ, чтобы быть включенным
в род Pneumovirus. Антитела к ВПМ с высокой частотой обна-
руживаются в сыворотке крови человека; имеются неопубли-
кованные данные, указывающие на то, что в лабораторные ко-
лонии мышей этот вирус попал от человека [2].
Основные свойства РСВ приведены в табл. 5.1. РСВ отли-
чается от других парамиксовирусов большим числом идентифи-
цированных белков (10 по сравнению с 6—7 у других вирусов
данного семейства), порядком генов (имеются два гена не-
структурных белков, один из которых расположен между
З'-концевой лидерной последовательностью и геном нуклеопро-
9*
132
Таблица 5.1. Общие свойства пневмовирусов
Известные представители рода
Нуклеиновая кислота
Белки’>
Вирионные ферменты
Плавучая плотность частиц
Морфология частиц
Морфология нуклеокапсида
Морфология мембранных вы-
ростов
Генетические взаимодействия
Стабильность
Круг хозяев
Патогенность
Цитопатогенность
РСВ человека
РСВ крупного рогатого скота
Вирус пневмонии мышей (ВПМ)
Однонитевая несегментированная РНК
с коэффициентом седиментации 50S;
мол. масса >5-10’
2 гликопротеина оболочки: гликопротеин G
мол. масса 90 кД и связанные между со-
бой дисульфидными связями продукты
расщепления гликопротеина F(?) (мол.
масса предшественника 68 кД, а продук-
тов расщепления 48 и 20 кД)
2 негликозилированных белка оболочки: бе-
лок матрикса мол. масса 26 кД и белок
с неизвестной функцией мол. масса 24 кД
3 белка сердцевины: гипотетическая поли-
мераза (L, 200 кД), нуклеокапсидный бе-
лок (N, 41 кД) и фосфопротеин (Р.
34 кД)
3 неструктурных белка неизвестной функ-
ции (14, 11 и 9,5 кД)
РНК-полимеразная активность
Гемагглютинин (только у ВПМ)
Нейраминидазная активность отсутствует
1,15—1,26 г/см3
Плеоморфные частицы диаметром 80-—
500 нм и нитевидные частицы диаметром
60—ПО нм и длиной до 5 мкм.
Спиральный тип симметрии, диаметр 12—
13 нм
Длина 10—12 нм
8 групп комплементации
Рекомбинация или множественная реакти-
вация не обнаружены
Термолабильны, нестабильны при рН<3,0,
чувствительны к замораживанию и оттаи-
ванию
In vivo, вероятно, ограничен
Ассоциированы преимущественно с респи-
раторными заболеваниями и спорадически
с другими патологическими состояниями
Образуют цитоплазматические, реже ядер-
ные включения, часто формируют синци-
тии (кроме ВПМ). Имеют склонность
к персистенции
) Молекулярные массы белков определены
дят не совсем одинаковые значения.
приблизительно. Разные авторы приво-
Пневмовирусы
133
теина, а другой — между гипотетическими генами гликопротеи-
нов F и G), отсутствием гемагглютинина и нейраминидазы,
а также характерными размерами нуклеокапсида (12—13 нм
в диаметре по сравнению с 17—18 нм у других вирусов) и по-
верхностных выступов (10—12 нм в длину по сравнению с 8 нм).
Эти специфические особенности, а также характерная для
РСВ повышенная лабильность оправдывают посвящение ему
отдельной главы в настоящей книге. Эта глава не является
исчерпывающим обзором всех имеющихся методов; при обсуж-
дении каждой группы методов внимание концентрируется на
немногих наиболее надежных методиках.
1.2. Номенклатура
В англоязычной литературе для обозначения респираторно-
синцитиального вируса имеет смысл использовать сокращение
RS-вирус, а не RSV, чтобы отличать его от вируса саркомы
Рауса, типичного представителя ретровирусов1). Кроме того,
респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота
следует отличать от не родственного ему синцитий-образующе-
го вируса, также относящегося к ретровирусам.
1.3. Выделение вируса
В связи с необычной лабильностью РСВ и низким титром
в секретах и зараженных тканях при выделении этого вируса
требуется особая тщательность. Попытки выделения вируса из
хранившихся образцов редко бывают успешными. Имеет смысл
доставлять чувствительную культуру клеток непосредственно
к месту нахождения пациента или зараженного животного, а не
транспортировать содержащие вирус материалы в лабораторию
для заражения культуры.
Чаще всего для выделения РСВ используют линии клеток
Нер-2 и HeLa (сублиния Bristol), однако описано использование
культуры почек макак-резусов, линий BS-C-1, MRC-5, WI-38
и некоторых других. Лучшим материалом для выделения РСВ
служат смывы слизистой носа или носоглотки больных детей.
Смывы можно перенести в пробирку с небольшим количеством
(2 мл) буферного раствора (например, солевого раствора Хэнк-
са, содержащего 0,5% желатина и антибиотики) или бульона
(например, мясного экстракта с 0,5% БСА и антибиотиками).
Содержимое пробирок перемешивают энергичным встряхивани-
ем. Образцы следует держать в ледяной бане и как можно
11 На русском языке этой проблемы не возникает, поэтому мы пользуемся
сокращением РСВ. — Прим, перев.
134
Глава 5
скорее использовать для заражения чувствительной культуры
клеток. Во всяком случае, промежуток между сбором материа-
ла и заражением культуры не должен превышать нескольких
часов. Из антибиотиков наиболее часто используют пенициллин
'(400 ед./мл), стрептомицин (200 мкг/мл), неомицин (100мкг/мл)
и микостатин (100 ед./мл).
Для успешного выделения РСВ важно избегать заморажи-
вания и оттаивания образцов, при их хранении поддерживать
достаточно низкую температуру, как можно быстрее использо-
вать материал для заражения чувствительной культуры и вклю-
чать в состав культуральной среды ЭТС или БСА. Сыворотка
взрослых домашних животных (коров, овец, свиней, коз, лоша-
дей), обычно используемая для культивирования клеток, как
правило, содержит достаточно высокий титр нейтрализующих
РСВ антител; поэтому ее нельзя использовать при выделении
этого вируса. Зараженную культуру инкубируют при 36—37 °C
и наблюдают за ней не менее 3 нед, регулярно меняя среду.
Для выявления ЦПД могут потребоваться дополнительные сле-
пые пассажи. Для РСВ характерно ЦПД в виде образования
синцития, но этот эффект наблюдается не всегда, и его прояв-
ление зависит от штамма вируса и типа зараженной культуры.
1.4. Хранение вируса
Пневмовирусы следует хранить в интервале температур от
•—70°C (температура твердого СО2) до —198°C (температура
жидкого азота). При —20°C наступает достаточно быстрая по-
теря инфекционности, и в таких условиях вирус нельзя хранить
более 3 мес. Лиофилизация или добавление глицерина позволя-
ют увеличить срок хранения вируса при —20°C. Быстрота па-
дения инфекционности зависит от природы содержащего вирус
материала; так, вирус, связанный с мембранами, более стаби-
лен, чем свободный.
2. Основные методы
2.1. Культивирование респираторно-синцитиального вируса
2.1.1. Чувствительные культуры клеток
Имеется большой набор клеточных линий, чувствительных
к РСВ. В диагностических лабораториях чаще всего использу-
ют линию гетероплоидных клеток человека Нер-2, поскольку
ее легко поддерживать.
Тем не менее для выделения РСВ более подходят диплоид-
ные линии клеток человека, например эмбриональных клеток
Пневмовирусы
135
легких WI-38, HeL-1 [3], L-4, L-49 [4], HLDC-1, -4, -6 и эмб-
риональных клеток мозга НВС-1 и НВС-4 [5].
РСВ размножается и в разнообразных культурах клеток
животных, в частности в клетках почек кошек, норок и кенгу-
ровой крысы [6]. Степень чувствительности разных линий кле-
ток, по-видимому, зависит от схемы пассирования используе-
мого штамма вируса. Например, после трех пассажей через,
индивидуальные бляшки на культуре клеток WI-38 полученный
изолят вируса давал на этих клетках в 50 раз более высокий
титр, чем вирус, пассируемый на клетках BS-C-1 [7].
РСВ может быть адаптирован и к росту в некоторых пер-
вичных культурах клеток холоднокровных животных, например
черепахи Testudo graced [8], но он не размножается в клетках
земноводных (культура клеток Xenopus laevis ХТС-2) и бес-
позвоночных, в частности комаров (К. Р. Прингл, неопублико-
ванные данные). В отличие от многих других парамиксовирусов
РСВ не размножается в куриных эмбрионах и культуре клеток
куриного эмбриона. Кроме того, в отличие от вируса пневмонии
мышей он не размножается в клетках ВНК-21.
При серийном пассировании РСВ (как и большинства дру-
гих вирусов, размножающихся в культуре клеток) с высокой
частотой образуются дефектные интерферирующие частицы
(ДИЧ). Разработан простой колориметрический метод обнару-
жения и количественного определения ДИЧ (см. разд. 3.3.2),
Для размножения РСВ в культуре клеток можно использо-,
вать основную минимальную среду Игла (МЕМ), желательно
с дополнительными аминокислотами. Лучший выход вируса,
как правило, дают активно делящиеся клетки. Можно исполь-
зовать и другие среды, например среду Лейбовича, для поддер-
жания pH которой не требуется газообразная СОг. Темпера-
тура размножения РСВ составляет 25—39 °C; максимальный
выход получают при температуре около 37°C.
2.1.2. Цигопатогенное действие
Характерное для РСВ цитопатогенное действие —это обра-
зование синцития (рис. 5.1). В синцитиях ядра клеток часто
образуют агрегаты, окружающие центральную полость. Однако
формирование синцития наблюдается далеко не всегда; харак-
тер ЦПД определяется многими факторами, в том числе штам-
мом вируса, условиями культивирования и типом клеток. На-
пример, при заражении клеток почек африканской зеленой
мартышки (линия BS-C-1) образуются фокусы агрегированных
клеток. Под агаровым покрытием они выглядят как интенсивно
окрашенные сгустки клеток, напоминающие фокусы трансфор-
мации, индуцируемые онкогенными вирусами. Однако индуци-
136
Глава 5
руемые РСВ фокусы окружены слабо окрашенной областью
(рис. 5.2). Ее образование обусловлено миграцией клеток к фор-
мирующемуся скоплению. Фокусы состоят из увеличившихся
в размерах разбухших клеток, которые затем дают начало син-
цитию. Несмотря на внешнее сходство фокусов, индуцируемых
онкогенными вирусами и РСВ, клетки последних не сохраняют
способность к делению.
2.1.3. Методы повышения инфекционности
Обработка вируса или клеток ДЭАЭ-декстраном повышает
чувствительность клеток к РСВ. При оптимальной концентра-
ции, равной 40 мкг/мл, ДЭАЭ-декстран в 2 раза повышает вы-
ход вируса; имеются данные и о том, что число клеток, зара-
женных РСВ крупного рогатого скота, возрастает в этих
условиях в 11 раз. Нисевич и др. [9] сообщили о 100-кратном
увеличении числа клеток, зараженных РСВ человека, в при-
сутствии 15 мкг/мл ДЭАЭ-декстрана.
2.1.4. Методы стабилизации инфекционности
Инфекционность РСВ стабилизируется в присутствии высо-
ких концентраций сахарозы (около 40%) или ионов магния.
Ферни и Герин [10] сообщили, что в присутствии 1 М MgSO4
стабильность РСВ возросла в 30 раз и период полужизни ин-
фекционного вируса при 4 °C увеличился до 12 нед. Добав-
ление MgSO4 до концентрации 1 М облегчает очистку РСВ
для физико-химических исследований, однако при выделении
вируса и определении его инфекционной активности добавление
MgSO4 нежелательно, поскольку высокая ионная сила оказы-
вает отрицательное воздействие на культуры клеток.
2.2. Методы определения инфекционности
Инфекционность препаратов РСВ можно определить мето-
дом бляшек. Метод, описываемый здесь для клеток BS-C-1,
пригоден и для работы с большинством других клеточных
культур.
1. Высевают по 106 клеток в чашки Петри диаметром 60 мм
(для чашек других размеров делается соответствующий пере-
расчет). Чашки инкубируют в течение ночи при 37 °C и исполь-
зуют клетки сразу же после образования плотного монослоя.
2. Культуральную среду удаляют и вносят в чашки по 0,2 мл
последовательных 10-кратных разведений вирусного препарата.
Для приготовления разведений можно использовать буферный
раствор, например PBS, или, предпочтительно, среду МЕМ.
Рис. 5.1. Характерное для РСВ ЦПД на монослой клеток MRC-5. Хорошо
видны синцитии
Рис. 5.2. ЦПД РСВ на монослой клеток BS-C-1. Хорошо видны фокусы, со-
стоящие из агрегированных клеток
138
Глава 5
В обоих случаях используемый для разведения вируса раствор
должен содержать 0,5% ЭТС и антибиотики (100 ед./мл пени-
циллина и 100 мкг/мл стрептомицина).
3. Культуру инкубируют 1 ч при 31 °C для адсорбции вируса.
4. В каждую чашку вносят по 5 мл покрытия (для чашек
другого размера делается перерасчет). Удаление инокулята не-
обязательно. В качестве покрытия можно использовать среду
МЕМ, содержащую 1—2% ЭТС, антибиотики и 0,9% агара.
Эту среду готовят, смешивая равные объемы нагретой до 37 °C
среды МЕМ в двойной концентрации и расплавленного 1,8%-но-
го агара Нобль. При температуре 43—46 °C агар не застывает,
и покрытие можно наносить на слой клеток без их повреждения.
5. Клетки инкубируют 3—5 сут при 31—39°C; время инку-
бации зависит от температуры: чем выше температура, тем
короче время инкубации. Для приготовления стабильных пре-
паратов, в которых можно подсчитывать бляшки через дли-
тельное время после опыта, в каждую чашку добавляют 2 мл
1%-ного раствора глутарового альдегида в PBS и оставляют
при комнатной температуре по крайней мере на 4 ч для фик-
сации. Фиксирующий раствор и агаровое покрытие удаляют и
добавляют в чашки раствор подходящего красителя (например,
0,075% красителя Гимза, 0,1%-ный кристаллический фиолето-
вый и др.), окрашивают в течение 5 мин, затем тщательно про-
мывают водой и сушат. Для максимально точного подсчета
бляшек необходим бинокулярный микроскоп с небольшим уве-
личением. Для окрашивания можно использовать и 0,01%-йый
раствор нейтрального красного в PBS или в среде, содержащей
0,9% агара. Обычно для усиления контраста из состава агаро-
вого покрытия исключают феноловый красный, но это не имеет
принципиального значения. Окрашивание раствором нейтраль-
ного красного проходит быстрее (видимые бляшки появляются
через 2 ч), однако такие препараты нестабильны и подвержены
фотохимическому повреждению под действием света. Окраши-
вание с помощью твердого нейтрального красного, входящего
в состав агарового покрытия, происходит медленнее (для ви-
зуализации бляшек требуется не менее 4 ч), однако в тех слу-
чаях, когда необходимо выделить инфекционный вирус из ин-
дивидуальных бляшек, данный метод явно предпочтительнее.
2.3. Гемагглютинация
В культуральной жидкости инфицированных РСВ клеток
гемагглютинин не обнаруживается. Гемагглютинация с эритро-
цитами человека (типа 0), африканской зеленой мартышки,
макаки-резуса, морской свинки, крысы, хомячка, мыши, гуся,
овцы, свиньи, курицы и цыпленка не отмечена.
Пневмовирусы
139
С другой стороны, ВПМ агглютинирует эритроциты мыши
и хомячка. Методические аспекты постановки реакции гемаг-
глютинации описаны в работе Компанса и др. [11].
2.4. Гемадсорбция
Адсорбция эритроцитов на клетках, зараженных РСВ, не
описана. Негативные результаты получены с эритроцитами аф-
риканской зеленой мартышки, шимпанзе, обезьяны гелады,
морской свинки, крысы, хомячка, мыши, утки, гуся, голубя,
курицы и цыпленка. Однако клетки, зараженные ВПМ, свя-
зывают эритроциты мыши; технические детали описаны Ком-
пансом и др. [11].
2.5. Иммунофлуоресцентные методы
Иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью поликло-
нальной антисыворотки представляет собой удобный и точный
метод подсчета зараженных клеток и выявления места размно-
жения вируса при анализе фиксированных срезов зараженных
тканей. Используя моноклональные антитела против индивиду-
альных вирусных полипептидов, иммунофлуоресцентным мето-
дом можно изучать и внутриклеточную локализацию вирусных
антигенов.
Иммунофлуоресцентное окрашивание применяется также для
быстрой диагностики вирусных инфекций. Это направление не-
давно рассмотрено в исчерпывающих обзорах [12, 13], а кон-
кретные методы обнаружения РСВ в клиническом материале
описаны в работе Гарднера и др. [14]. Иммунофлуоресценция —
более точный метод выявления РСВ в организме больного, чем
непосредственное выделение вируса, поскольку в период рекон-
валесценции после вызванного РСВ заболевания зараженные
клетки бывают покрыты противовирусными антителами.
Непрямая иммунофлуоресценция более чувствительна, чем
прямая, однако при ее использовании возникает проблема не-
специфической флуоресценции. Ее можно устранить предвари-
тельным истощением антисыворотки и антииммуноглобулиново-
го конъюгата обработанной ацетоном культурой клеток или
гомогенатом печени животных. Обработка клеток ацетоном про-
водится следующим образом:
1. 108—109 клеток снимают со стекла и получают суспензию.
2. Клетки концентрируют центрифугированием и ресуспен-
дируют в 0,01 М PBS; эту процедуру повторяют трижды.
3. Осадок клеток ресуспендируют (5 мин в 10-кратном объеме
ацетона и вновь осаждают клетки.
140
Глава 5
4. Клетки ресуспендируют в 0,01 М PBS и проводят 6 циклов
осаждения для полного удаления ацетона. После этого клетки
можно хранить до употребления в 0,01 М PBS при —20 °C.
Ниже приведена стандартная методика для выявления ан-
тигенов РСВ в зараженных клетках методом непрямой иммуно-
флуоресценции.
1. В пластиковые чашки диаметром 50 мм помещают тща-
тельно вымытые и дегидратированные этанолом покровные
стекла (диаметр 13 мм) и высевают по 1-Ю6 клеток BS-C-1.
Инкубируют клетки 24 ч, промывают и заражают РСВ с мно-
жественностью инфекции около 1 БОЕ/кл.
2. После адсорбции вируса в течение 2 ч покровные стекла
с зараженными клетками тщательно промывают средой МЕМ,
содержащей 2,5% ЭТС, и инкубируют при 31 или 39 °C.
3. Через 40—48 ч после заражения клетки фиксируют на
5 мин в охлажденном до 4 °C ацетоне, высушивают на воздухе
30 мин и хранят при —20 °C.
4. Антивирусную сыворотку истощают обработанными аце-
тоном клетками BS-C-1 при 4 °C и используют в подобранном
оптимальном разведении (в пределах 1:10—1:50). Кроличья
сыворотка против глобулинов нескольких видов животных, конъ-
югированная с изотиоцианатом флуоресцеина, имеется в про-
даже. Конъюгат истощают обработанным ацетоном гомогена-
том печени мыши или клетками BS-C-1 при 4 °C.
5. Покровные стекла инкубируют с антивирусной сывороткой
1 ч при 37 °C, промывают и инкубируют еще 45 мин при 37 °C
с соответствующим конъюгатом. -у
6. После промывки препараты заключают в забуференный
глицерин (pH 8,3) и исследуют под флуоресцентным микроско-
пом. Рис. 5.3 иллюстрирует разрешение, которое может быть
получено при использовании данного метода.
Доказательствами специфичности иммунофлуоресценции мо-
гут служить: 1) отсутствие флуоресценции незараженных кле-
ток BS-C-1; 2) отсутствие флуоресценции при использовании
ЭТС вместо специфической (или сывороток против других ви-
русов) с зараженными РСВ клетками; 3) отсутствие флуорес-
ценции после истощения противовирусной сыворотки заражен-
ными клетками.
Высокой чувствительностью обладает и иммунопероксидаз-
ный метод; его преимущество состоит в том, что он не требует
использования микроскопа с ультрафиолетовой оптикой.
2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)
ELISA — еще один иммунологический метод быстрого обна-
ружения и количественного определения РСВ. Ниже приведена
типичная методика.
Пневмовирусы
141
1. Лунки планшета для иммунологических реакций покры-
вают зараженными или незараженными клетками, или РСВ,
очищенным центрифугированием в градиенте. Это делается од-
ним из следующих методов:
а) клетки выращивают в лунках планшета и через ряд за-
ражают РСВ. Когда в лунках с зараженными клетками прояв-
ляется ЦПД, клетки промывают, фиксируют раствором, содер-
жащим этанол и уксусную кислоту, и хранят при —20°C;
б) в лунки планшета вносят РСВ, очищенный центрифуги-
рованием в градиенте (около 1 мкг на лунку), и высушивают
в течение ночи при 37°C.
Рис. 5.3. Зараженные клетки BS-C-1, окрашенные с помощью анти-РСВ-сыво-
ротки и антител против бычьих глобулинов, конъюгированных с изотиоциана-
том флуоресцеина. Показано характерное для ранней стадии инфекции обра-
зование многочисленных нитевидных выростов. 480х. Фотография предостав-
лена Р. V. Shirodaria
Если имеются клетки, персистентно инфицированные РСВ,
их можно использовать в качестве источника антигена вместо
литически инфицированных клеток.
2. Перед началом анализа все лунки планшета покрывают
5%-ным раствором БСА в PBS. В каждый опыт следует вклю-
чать негативный контроль (преиммунная сыворотка) и пози-
тивный контроль (анти-РСВ сыворотка с известным титром).
В лунки планшета вносят образцы вируса (50 мкл в каждую
лунку) и инкубируют в течение ночи при 4 °C. Планшет промы-
вают и добавляют овечьи антитела [F(ab')2-фрагменты] против
иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой
хрена (препарат фирмы New England Nuclear или аналогич-
ный) в рекомендуемом разведении (1:500). Планшет инкуби-
руют 1 ч при 37 °C, промывают, добавляют субстрат, о-фени-
лендиамин, и инкубируют при 37 °C еще 30 мин. Реакцию
142
Глава 5
останавливают добавлением 4,5 М H2SO4 и учитывают резуль-
таты с помощью ридера «Мультискан» (фирма Flow Labora-
tories).
Хиерхольцер и др. [15] описали методику, позволяющую
с помощью ELISA количественно выявлять белковые полосы
после электрофореза и переноса белков на нитроцеллюлозные
мембраны, так называемый метод «вестерн-блотинга» (см.
разд. 3.7.1). Преимущество этого метода состоит в том, что он
не требует использования радиоактивных изотопов.
3. Аналитические методы
3.1. Радиоактивное мечение, радиоиммуноанализ
и радиоиммунопреципитация
3.1.1. Введение радиоактивной метки в вирусные белки
в зараженных РСВ клетках
1. Оптимальные условия для мечения вирусных белков до-
стигаются при добавлении к зараженным клеткам (1 БОЕ/кл)
через 18 ч после заражения актиномицина D в концентрации
2,5 мкг/мл.
Белки РСВ удается эффективно пометить смесью [3SS]-ме-
тионина и [35S]-цистеина по следующей методике.
2. Через 2 ч после внесения актиномицина D культуральную
среду заменяют на среду, содержащую 50 мкКи/мл L-[35S]-ме-
тионина и 25 мкКи/мл L-[35S]-цистеина.
3. Клетки инкубируют 16 ч при 37 °C или до проявления
выраженного ЦПД.
4. Монослой промывают, солюбилизируют клетки и экстра-
гируют белки лизирующим буфером [10 мМ трис-HCl, pH 7,4;
0,1 мМ ЭДТА; 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF);
0,5%-ный (объем на объем) нонидет Р-40 (NP-40) и 1%-ный
(вес на объем) холат натрия].
5. После инкубации в течение 2 ч при комнатной темпера-
туре лизат используют для электрофореза (предварительно про-
кипятив в течение 2 мин) или хранят при —20 °C.
Рис. 5.4 иллюстрирует результаты разделения меченных
[35S]-метионином белков РСВ в пластине 10%-ного полиакрил-
амидного геля. Вирусные гликопротеины можно пометить ана-
логичным методом, используя в качестве метки 50 мкКи/мл
[1-3Н] -глюкоз а мин а или [3Н] -маннозы.
Альтернативный метод введения метки в гликопротеины
оболочки РСВ заключается в иодировании поверхности зара-
женных вирусом клеток лактопероксидазным методом [16].
Белки очищенного нуклеокапсида РСВ можно иодировать с по-
мощью хлорамина Т [17].
Пневмовирусы
143
Дктучн
RSN V
0544 ЙЯН-2 LONG К ;
П ОК ПХЖ П ОК П ОК
:• I,' и я и им iii' и ii m. VP 41
.• НМШОВЯ'адС VP 38
—- VP 32
8 Я В 8 Я Я ВIЯ В 8 m
VP 21
—— VP 25i
Ж
——VP |Q
Рис. 5.4. Радиоавтограф геля после электрофореза меченных |’35S]-метионином
белков РСВ (штаммы RSN-0544, RSN-2, LONG). Показаны вариации электро-
форетической подвижности белка VP32. ОК — белки из осадка клеток; П —
белки, осаждаемые из культуральной жидкости полиэтиленгликолем
3.1.2. Радиоиммуноанализ (RIA)
Метод прямого RIA с использованием в качестве вторых
антител меченных 1251 гамма-глобулинов сыворотки козы против
глобулинов мыши, а в качестве субстрата — фиксированных ме-
танолом персистентно инфицированных РСВ клеток описан
Коутом и др. [18].
144
Глава 5
3.1.3. Радиоиммунопреципитация (RIP]
Радиоиммунопреципитация (RIP) проводится стандартным
методом, описанным, например, Ферни и Герином [19] и Уор-
дом и др. [20]. Для РСВ применяют следующую методику
(Р. М. Эллиот, личное сообщение).
1. ’Монослойные культуры клеток в чашках Петри диаметром
50 мм заражают РСВ с множественностью инфекции более
1 БОЕ/кл. Через определенные промежутки времени после за-
ражения проводят импульсное мечение. Для этого культураль-
ную среду в чашках заменяют на 1 мл PBS, содержащего
30 мкКи [35S]-метионина и 25 мкКи [35S]-цистеина (или
100 мкКи [3Н]-маннозы для введения метки в гликопротеины),
и инкубируют чашки при 31 °C 1 ч.
2. Радиоактивный раствор сливают и монослой промывают
охлажденным PBS.
3. Клетки снимают со стекла с помощью стерильной рези-
новой палочки и осаждают центрифугированием.
4. Клетки ресуспендируют в 200 мкл лизирующего буфера
(0,15 М NaCl, 1% дезоксихолата Na, 1% тритона Х-100, 0,1%
ДДС-Na, 1 мМ PMSF, 0,01 М трис-НС1, pH 7,4), инкубируют
суспензию 30 мин в ледяной бане, затем интенсивно перемеши-
вают (на миксере типа «Вортекс» 10 с).
5. Ядра и клеточный дебрис удаляют центрифугированием
5 мин при 10 000 g.
6. Лизат осветляют инкубацией с 50 мкл 10%-ной суспензии
фиксированных формалином стафилококков (штамм Cowan)
или с 50 мкл суспензии покрытых белком-А гранул 30 мин
при 0 °C.
7. Стафилококки удаляют центрифугированием. К 50 мкл
лизата добавляют 10 мкл гипериммунной сыворотки (или нор-
мальной сыворотки в качестве контроля), перемешивают и ин-
кубируют 3 ч во льду.
8. Добавляют 100 мкл суспензии стафилококков, перемеши-
вают и инкубируют смесь 30 мин при комнатной температуре.
9. Иммунные комплексы осаждают центрифугированием
20 с при 10 000 g.
10. Осадок 3 раза промывают раствором, содержащим
500 мМ LiCl, 100 мМ трис-НС1, pH 8,5.
11. Осадок после промывки ресуспендируют в 50 мкл смеси
для диссоциации (0,125 М трис-НС1, pH 6,8, 4% ДДС-Na,
10% меркаптоэтанола, 20% глицерина и 0,1% бромфенолового,
синего), кипятят 2 мин и либо немедленно наносят на гель для
электрофореза, либо хранят при —20 °C.
Пневмовирусы
145.
3.2. Метод выявления дефектных интерферирующих частиц
Дефектные интерферирующие частицы и стандартные ви-
рионы РСВ не удается разделить физическими методами, но
проявление устойчивой к ультрафиолетовому облучению и чув-
ствительной к нейтрализующим антителам интерферирующей
активности при пассировании вируса с высокой множествен-
ностью инфекции свидетельствует о накоплении ДИЧ. Разра-
Зотзн колориметрический метод количественного определения
ДИЧ в препаратах РСВ [21]. Он основан на измерении ин-
тенсивности окрашивания, обусловленного поглощением ней-
трального красного клетками, которые выживают при заражении
стандартным вирусом в результате защиты ДИЧ. Приво-
дятся данные о том, что колориметрический метод чувствитель-
нее, чем метод, основанный на определении снижения выхода
вируса. Колориметрический анализ проводят следующим об-
разом.
1. Монослойные культуры клеток Нер-2, выращенные в лун-
ках планшета диаметром 16 мм (1,5-105 клеток в каждой лун-
ке), инкубируют с содержащим ДИЧ материалом 2 ч при 37 °C.
2. Содержащий ДИЧ инокулят удаляют и заражают клетки
стандартным вирусом (1—3 БОЕ/кл), полученным в результате
пассирования с низкой множественностью, и продолжают ад-
сорбцию 2 ч при 37 °C.
3. В каждую лунку вносят по 1 мл культуральной среды и
инкубируют клетки 72 ч при 37 °C.
4. Среду удаляют и вносят в каждую лунку по 0,5 мл ней-
трального красного в растворе Эрла (33 мг/мл); инкубацию
клеток продолжают еще 2 ч при 37 °C.
5. Краситель удаляют и клетки дважды промывают PBS.
6. Краситель экстрагируют из клеток 1 мл 50%-ного этано-
ла, содержащим 0,1 М NaH2PO4, и определяют его количество
спектрофотометрически при 540 нм. Полученные данные срав-
нивают с количеством красителя, экстрагированного из незара-
женных клеток и из клеток, зараженных стандартным вирусом.
Концентрацию ДИЧ можно рассчитать следующим образом,
предполагая, что их распределение по клеткам подчиняется за-
кону Пуассона:
число ДИЧ/мл= 1/разведение, обеспечивающее выживание
63% клетокХобщее число клетокX 1/объем инокулята.
3.3. Электронная микроскопия
Пневмовирусы исключительно многообразны по форме; кро-
ме того, их вирионы и нуклеокапсиды нестабильны и легко по-
вреждаются при обычных процедурах концентрирования виру-
10—369
446
Глава 5
сов. Поэтому точный подсчет вирусных частиц практически
невозможен.
Трансмиссионная электронная микроскопия удобна для иден-
тификации вирусов и изучения морфологии и морфогенеза ви-
рионов. Сканирующая электронная микроскопия используется
для изучения морфологии поверхности зараженных клеток,
а также для количественного определения поверхностных анти-
генов на основе специфического связывания бактериальных кле-
ток (метод SABA/SEM).
3.3.1. Морфология вирионов
Для негативного контрастирования успешно применяют сле-
дующие вещества: фосфорно-вольфрамовая кислота (2%, pH 6,0
или 3%, pH 7,2), фосфовольфрамат натрия (2%, pH 6,0), фос-
фовольфрамат калия (2%, pH 6,5), кремневольфрамат натрия
(2%, pH 7,0) и уранилацетат. Концентрирование вируса необ-
ходимо проводить самым мягким методом, например осажде-
нием полиэтиленгликолем или ультрафильтрацией через филь-
тры «Амикон», избегая высокоскоростного центрифугирования.
Каплю концентрированного раствора вируса наносят на покры-
тую графитом формваровую сеточку. Для фиксации добавляют
равный объем 3%-ного глутарового альдегида в PBS (pH 7,2),
перемешивают и инкубируют 5 мин при комнатной температуре.
Сеточки промывают PBS и проводят негативное контрастирова-
ние. (Стадию фиксации можно опустить.) Для визуализации
нуклеокапсидов зараженные клетки лизируют дистиллирован-
ной водой или гипотоническим буферным раствором. Клеточный
дебрис можно осадить непосредственно на сеточке перед нега-
тивным контрастированием.
3.3.2. Морфогенез вирионов
1. Зараженные клетки фиксируют, добавляя к монослою,
выращенному в чашке Петри диаметром 50 мм, глутаровый
.альдегид до концентрации 2,5%.
2. После фиксации в течение 30 мин монослой дважды про-
мывают PBS и добавляют 10 капель 1%-ного раствора четы-
рехокиси осмия.
3. Через 15 мин монослой еще 2 раза промывают PBS, сни-
мают клетки со стекла и суспендируют их в 2 мл PBS.
4. Клетки осаждают центрифугированием и дегидратируют,
последовательно суспендируя в растворах с возрастающей кон-
центрацией этанола (30—90%); в каждом растворе клетки ин-
кубируют 5 мин; при необходимости их можно выдержать в те-
чение ночи в 70%-ном этаноле. После инкубации в 90%-ном
\ Пневмовирусы 147
1 ’ ~
\
этаноле клетки дважды по 15 мин обрабатывают 100%-ным
этанолом.
5. Этанол заменяют на смесь этанола и окиси пропилена
(1:1).
6. Через 15 мин смесь этанол—окись пропилена заменяют
на свежую, инкубируют суспензию еще 30 мин, после этого
ресуспендируют клетки в смеси этанол—окись пропилена—сре-
да EPON, а затем в среде EPON 1 ч.
7. Компактный осадок клеток наносят на небольшой объем
среды EPON в капсуле ВЕЕМ и, заполнив капсулу средой
EPON, инкубируют их 48 ч при 60 °C для полимеризации. Пос-
ле этого заключенные в капсулу клетки готовы для приготов-
ления срезов стандартным способом на ультрамикротоме.
8. Тонкие срезы располагают на необработанных сеточках
для электронной микроскопии и через 24 ч окрашивают 5 мин,,
помещая сеточки препаратами вниз в каплю насыщенного рас-
твора уранилацетата в метаноле.
9. Сеточки промывают дистиллированной водой и сушат на
листе фильтровальной бумаги.
10. На срез наносят каплю 0,1 М раствора NaOH и поме-
щают сеточку срезом вниз на 5 мин в каплю раствора ацетата
свинца. Сеточки промывают и сушат на листе фильтровальной
бумаги, после этого они готовы к электронно-микроскопическо-
му исследованию.
3.3.3. Сканирующая электронная микроскопия
Для подготовки клеток к сканирующей электронной микро-
скопии применяют следующий метод.
1. Клетки, образующие неплотный монослой на покровных
стеклах, фиксируют 1—2 ч 2,5%-ным раствором глутарового
альдегида в фосфатном буфере.
2. Стекла помещают на 1 ч в 1%-ный раствор четырехокиси
осмия в фосфатном буфере.
3. Клетки дегидратируют, последовательно помещая стекла
в 30, 50, 70, 90 и 100%-ный этанол (на 5 мин в каждый), а за-
тем на 15 мин в смесь этанола с ацетоном (1 : 1).
4. Стекла дважды обрабатывают 100%-ным ацетоном и су-
шат СО2 в критической точке, используя аппарат для сушки
фирмы Polaran Equipment Ltd., Watford, Herts или другой ана-
логичный прибор.
5. Покровные стекла фиксируют на алюминиевых подлож-
ках с помощью клея «Electrocday 915» (Acheson Colloids Com-
pany, Prince Rock, Plymouth) и покрывают золотом с помощью
диодного напылителя Polaron Е5000 или другой аналогичной
системы. Подготовленные таким образом препараты можно ис-
следовать методом сканирующей электронной микроскопии.
10*
Рис. 5.5. Стереоскопические микрофотографии, полученные с помощью скани-
рующего электронного микроскопа, а — незараженные клетки BS-C-1; вид-
'ны микроворсинки (1820Х); б — зараженные РСВ клетки BS-C-1; видны об-
разующиеся нитевидные выросты (1370Х). Фотографии пересняты из журнала
«Journal of Virology» с разрешения редакции
Пневмовирусы
149
На рис. 5.5 представлена фотография зараженных пневмо-
вирусом клеток, выполненная с помощью сканирующей элект-
ронной микроскопии. Обратите внимание на длинные выросты
инфицированных клеток.
3.3.4. Локализация и количественное
определение вирусных антигенов по связыванию стафилококков
Клетки Staphylococcus aureus (штамм Cowan) с помощью
поверхностного А-белка связываются с Fc-фрагментами имму-
ноглобулинов. Этот эффект можно использовать для исследо-
вания пространственной локализации вирусного антигена на
плазматической мембране зараженных клеток после их обра-
ботки противовирусной сывороткой [23]. Стафилококки более
удобны, чем покрытые А-белком шарики латекса, полиметил-
метакрилата или полистирола, в связи с легкостью получения
бактерий и одинаковым диаметром всех бактериальных клеток
(около 1 мкм). На поверхности клеток, зараженных многими
вирусами, стафилококки распределяются равномерно, но в слу-
чае пневмовирусов они специфически связываются с нитевид-
ными выростами, образование которых является уникальной
особенностью зараженных этими вирусами клеток (см. рис. 5.5, б).
Связывание стафилококков высокоспецифично и подтверждает
результаты иммунофлуоресцентного окрашивания, которые сви-
детельствуют о том, что вирусные антигены на поверхности за-
раженных клеток локализованы преимущественно в составе ни-
тевидных структур (см. рис. 5.3).
Связывание стафилококков с поверхностью зараженных кле-
ток проводят по следующей методике.
I. Клетки выращивают на покровных стеклах до образова-
ния монослоя и заражают вирусом. Лучше всего использовать
клетки почки кенгуровой крысы (линия РТК-2), поскольку они
высокочувствительны к пневмовирусам и не имеют поверхност-
ных выростов.
2. Зараженные клетки инкубируют в поддерживающей сре-
де, промывают PBS для полного удаления входящей в состав
среды сыворотки, затем фиксируют 10—15 мин 2,5%-ным рас-
твором глутарового альдегида в PBS при комнатной темпера-
туре.
3. Клетки обрабатывают противовирусной сывороткой 1 ч
при 37 °C.
4. Антисыворотку удаляют, тщательно промывая клетки PBS.
К клеткам добавляют суспензию S. aureus, штамм Cowan, при-
готовленную по методу Прингла и Парри [23], или коммерче-
ский препарат стафилококков и инкубируют 5 мин при 37 °C
(время инкубации на данном этапе имеет решающее значение
и должно быть подобрано экспериментально).
150
Глава 5
5. Несвязавшиеся стафилококки удаляют, быстро промывая
стекла PBS, и клетки фиксируют 60 мин при комнатной тем-
пературе 2%-ным раствором четырехокиси осмия в PBS. После
этого стекла можно подготовить к сканирующей электронной
микроскопии и исследовать, как описано в разд. 3.3.3.
Подсчет числа связавшихся с клетками стафилококков дает
возможность количественно исследовать экспрессию вирусных
антигенов на клеточной мембране при условии постановки со-
ответствующих контролей [24].
3.4. Концентрирование вируса
Предложен простой метод концентрирования РСВ преципи-
тацией полиэтиленгликолем.
1. Готовят 36%-ный раствор (вес на объем) ПЭГ 6000 в ди-
стиллированной воде.
2. Раствор охлаждают и добавляют к содержащей вирус
жидкости до конечной концентрации ПЭГ 6%.
3. Суспензию инкубируют 2 ч при 4 °C.
4. Преципитат собирают центрифугированием (10 мищ
4000 g) при 4 °C.
5. Супернатант сливают, осадок дважды промывают буфер-
ным раствором и ресуспендируют в небольшом объеме (0,5 мл
на 100 мл исходного материала).
J
3.5. Очистка и радиоактивное мечение РСВ
Клинические изоляты РСВ в основном ассоциированы с клет-
ками, однако при культивировании некоторых лабораторных
штаммов в среду выделяется достаточное количество вируса
для успешной очистки. Наиболее удобно использовать для этого
штаммы Лонг и А2.
3.5.1. Градиентное центрифугирование
В литературе можно встретить не одну методику очистки
РСВ градиентным центрифугированием. Представленная ниже
была успешно использована для очистки штамма А2 [25].
1. Монослой клеток Нер-2 заражают РСВ (1 БОЕ/кл). Ад-
сорбцию проводят 2 ч при 37°C, затем добавляют культураль-
ную среду (среда Игла, содержащая 5% ЭТС, инактивирован-
ной нагреванием).
2. Через 10 ч после заражения добавляют актиномицин D
до концентрации 0,3 мкг/мл. Для радиоактивного мечения РНК
через 16—20 ч после заражения заменяют культуральную среду
на свежую, содержащую 20 мкКи/мл [5-3Н]-уридина. Для вве-
Пневмовирусы
151
дения метки в белки в среду добавляют 5 мкКи/мл [3SS]-ме-
тионина.
3. При проявлении ЦПД и образовании синцитиев (через
24—40 ч после заражения) собирают культуральную жидкость.
Клеточный дебрис удаляют центрифугированием 20 мин при
11000 g и концентрируют вирус центрифугированием 90 мин
при 65000 g на холоду.
4. Осадок ресуспендируют в буфере NTE (0,01 М трис-НС1,
pH 7,4, 0,1 М NaCl, 0,001 М ЭДТА) при ультразвуковой об-
работке.
5. Вирус центрифугируют 1 ч при 150 000 g в ГО—50%-ном
градиенте концентрации сахарозы и собирают фракции, содер-
жащие видимую зону вируса (невидимые зоны локализуют по
инфекционности или радиоактивности).
6. Содержащие вирус фракции объединяют, разводят NTE
и обрабатывают ультразвуком. Вирус вновь центрифугируют
2 ч при 150 000 g в 20—60%-ном градиенте концентрации са-
харозы.
7. Вирус концентрируют повторным центрифугированием
90 мин при 65000 g.
Данная методика позволяет получить частично очищенные
препараты радиоактивно меченного РСВ. Для последующей
очистки предложены более сложные методы (см. [10]); инфек-
ционность, которая в обычных условиях очень чувствительна
к центрифугированию, можно стабилизировать добавлением
MgSO4 до концентрации 1 М (см. разд. 2.5.4).
3.5.2. Очистка РСВ методом изрпикнического центрифугирования
Данный метод требует более длительного центрифугирова-
ния в градиенте концентрации сахарозы (16 ч при 73 000 g)
или метризамида (15—45%-ный градиент, 190000 g, 6 ч). Рас-
творы метризамида обладают более низкой вязкостью и осмо-
тическим давлением, чем растворы сахарозы, и поэтому их ис-
пользование для изопикнического центрифугирования предпо-
чтительно. Растворы метризамида всегда следует готовить
непосредственно перед использованием на 10 мМ HEPES,
pH 7,8 [26].
3.6. Радиоактивное мечение вирионной РНК
Интактную вирионную РНК РСВ получить трудно; рекомен-
дуется следующая методика [25].
Очищенный радиоактивно меченный вирус получают, как
описано в разд. 3.5.1 (вирус метят по РНК, используя [3Н]-ури-
дин или 32Р). РНК экстрагируют фенолом и далее из водной
фазы осаждают этанолом.
152
Глава 5
Выделенную РНК очищают центрифугированием в 15—
30%-ном градиенте концентрации сахарозы в присутствии
ДДС-Na в течение 15 ч при 19 000 об/мин.
Альтернативный подход состоит в том, что РНК, экстраги-
рованную из немеченых вирионов, метят по З'-концу с помощью
РНК-лигазы и [32Р]-цитидин-3',5'-бисфосфата, как описано
Вертц и Дэвисом [27]. РНК можно пометить и по 5'-концу
после удаления 5'-концевого фосфата щелочной фосфатазой из
кишечника крупного рогатого скота, которую затем инактиви-
руют протеиназой К. После этого РНК экстрагируют фенолом,
осаждают этанолом и метят в присутствии [^-32Р]-АТР и поли-
нуклеотидкиназы из Е. coli, зараженной бактериофагом Т4. Ме-
ченую РНК затем отделяют от непрореагировавшего АТР хро-
матографией на колонке с сефадексом G50. Методика, удобная
для мечения РНК РСВ, описана Шубертом и др. [28].
3.7. Анализ вирусных РНК и белков методом электрофореза
в полиакриламидном геле
3.7.1. Анализ белков
Синтезированные in vivo или in vitro меченые белки можно
анализировать с помощью электрофореза в 10%-ном или 6—
15%-ном градиентном полиакриламидном геле, как описано
Марсденом и др. [29].
После электрофоретического разделения в полиакриламйд-
ном геле белки можно перенести на нитроцеллюлозный фильтр
(метод «вестерн-блотинга») для биохимического или иммуноло-
гического анализа. Применение этого метода к белкам РСВ
описано Хиерхольцером и др. [15]. Перенос белков из. поли-
акриламидного геля на нитроцеллюлозу осуществляется элект-
рофоретически по нижеследующей методике.
1. После электрофоретического разделения белков полиак-
риламидный гель помещают в камеру прибора для электрофо-
ретического переноса (например, модель 170-3905 фирмы
Bio-Rad Laboratories) вместе с листом нитроцеллюлозы (на-
пример, тип ВА85, диаметр пор 0,45 мкм, фирма Schleicher and
Schuell). В камеру заливают буферный раствор, содержащий
0,025 М трис, 0,193 М глицин и 20% метанола, pH 8,35.
2. Для переноса проводят электрофорез при 60 В по край-
ней мере 4 ч при 4 °C.
3. Лист нитроцеллюлозы разрезают на полоски и помещают
каждую в закрытую пробирку.
4. Полоски инкубируют с анти-РСВ сывороткой (например,
сывороткой реконвалесцентов, разведенной в 100 раз PBS, со-
держащим 0,3% твин 20) 2 ч при комнатной температуре.
Пневмовирусы
153
5. Полоски 3 раза промывают PBS, содержащим твин 80.
6. Полоски инкубируют с конъюгатом (меченные пероксида-
зой IgG из сыворотки козы против иммуноглобулинов челове-
ка), разведенным в 1000 раз, 3 ч при комнатной температуре.
7. Полоски 3 раза промывают тем же раствором.
8. Нитроцеллюлозу проявляют раствором, содержащим 50 мг
З^'-диаминобензидина и 100 мкл 3%-ной перекиси водорода
в 100 мл PBS, pH 7,2.
9. Нитроцеллюлозу промывают водой и сушат на листе филь-
тровальной бумаги (Whatman № 2).
10. Количественный анализ можно провести спектрофотомет-
рически после обработки нитроцеллюлозы веществами, раство-
ряющими пластмассы (37,8%-ный водный раствор диметил-
формамида или 40%-ный водный раствор N-метилпирролидона).
В результате подобной обработки нитроцеллюлоза становится
прозрачной.
3.7.2. Анализ РНК
Радиоактивно меченную РНК из очищенных вирионов или
из цитоплазмы зараженных РСВ клеток можно проанализиро-
вать электрофорезом в 1,5%-ном геле агарозы, содержащем
6 М мочевину, по следующей методике (Коллинз, личное сооб-
щение).
1. Для приготовления геля размером 50X17X0,3 см готовят
отдельно следующие растворы: а) 120 мл 4,5%-ной агарозы
(3-кратный концентрат); для растворения агарозы суспензию
обрабатывают в микроволновой печи или автоклавируют ее;
б) 1,5-кратный концентрат раствора мочевины в цитратном бу-
фере; для этого к 129,6 г мочевины добавляют 9 мл (pH 3)
концентрированного 1 М цитратного буфера и растворяют, до-
водя объем водой до 240 мл. (Необходимо отметить, что при
растворении мочевины объем раствора увеличивается; поэтому
сначала добавляют около 135 мл дистиллированной воды.)
2. 1,5-кратный буфер нагревают и смешивают с 3-кратным
концентратом агарозы.
3. Гель заливают на холоду в горизонтальный аппарат для
электрофореза в 3 стадии, перерывы между стадиями состав-
ляют 45 мин.
4. В гель немедленно вводят гребенку.
5. Гель используют для электрофореза через 2—3 ч после
заливки. Гребенку вынимают, промывают ячейки буфером с мо-
чевиной и заполняют их тем же буфером. В ячейки вносят
образцы, смешанные с буфером для нанесения.
6. Электрофорез проводят на холоду при градиенте напря-
жения 5 В/см в течение 18 ч. Основные растворы готовят сле-
дующим образом.
154
Глава 5
1 М цитратный буфер, pH 3,0: смешивают 1 М растворы
лимонной кислоты и цитрата натрия до достижения pH 3,0.
Буфер для электрофореза: 1 М цитратный буфер разводят
в 40 раз, получая 0,025 М. цитратный буфер, pH 3,0
Буфер для нанесения образцов: 0,025 мл 1 М цитратного
буфера, 3,6 г 6 М мочевины, 2 г 20%-ной сахарозы, 0,1 мл
0,005%-ного бромфенолового синего, объем доводят водой
до 10 мл.
Буфер с 6 М мочевиной: 3,6 г мочевины, 0,25 мл 1 М цит-
рата, pH 3,0; объем доводят до 10 мл дистиллированной
водой.
3.8. Очистка матричной РНК для трансляции
Матричную РНК для трансляции in vitro получают следую-
щим образом.
1. 50-Ю6 клеток заражают РСВ (5 БОЕ/кл или более).
Клетки инкубируют 10—12 ч при 37 °C.
2. Монослой промывают, снимают клетки со стекла и суспен-
дируют в буферном растворе (0,01 М HEPES, pH 7,6, 0,01 М
NaCl, 0,001 М MgCy. Суспензию оставляют на 10 мин при
4 °C для набухания клеток.
3. Клетки разрушают в гомогенизаторе Даунса (15 движе-
ний пестика), затем осаждают клеточный и дебрис центрифу-
гированием при 4 °C. ?
4. Осадок ресуспендируют в 2 мл того же буфера, вновь
гомогенизируют и центрифугируют. Супернатанты, полученные
после первого и второго центрифугирований, объединяют.
5. К супернатанту добавляют CsCl и N-лаурилсаркозин (со-
ответственно 1 и 0,02 г на 1 мл супернатанта). Раствор тща-
тельно перемешивают и прогревают 1—2 мин при 51 °C.
6. 7 мл полученного раствора наслаивают на 2 мл раствора
(5,7 М CsCl, 0,1 М ЭДТА и 2% саркозина) в пробирке для
ротора SW40 и добавляют сверху буфер, чтобы заполнить про-
бирку. Пробирки центрифугируют в роторе SW40 16 ч при
25000 об/мин и 25 °C (или в другом роторе в аналогичном ре-
жиме).
7. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллиро-
ванной воды. РНК дважды переосаждают этанолом, добавляя
1,2 мл этанола, 25 мкл 4 М раствора NaCl и 10 мкл 10%-ного
ДДС-Na.
8. После второго осаждения осадок ресуспендируют в бу-
фере (0,01 М трис-НС1, pH 7,4, 0,1 М NaCl, 0,001 М ЭДТА),
добавляют ДДС-Na до концентрации 0,2% и проводят хрома-
тографию на колонке с олиго(dT)-целлюлозой. Связавшийся
материал элюируют и осаждают РНК этанолом, добавляя в ка-
Пневмовирусы
155
честве носителя тРНК из печени кролика. Осадок ресуспенди-
руют в том же буфере без ДДС-Na и переосаждают РНК дву-
мя объемами этанола в присутствии 0,2 М ацетата калия.
Конечный осадок ресуспендируют в 250—500 мкл 0,01 М
HEPES, pH 7,6.
В качестве бесклеточной системы для синтеза белка можно
использовать зависимый от мРНК лизат ретикулоцитов кроли-
ка, приготовленный, как описано Престоном [30], или коммер-
ческий препарат лизата. Для контроля следует параллельно
получить мРНК из незараженных клеток.
Индивидуальные вирусные мРНК для трансляции в бескле-
точной системе можно выделить методом гибридизационной
селекции с использованием клонов кДНК с известной структу-
рой, как описано Коллинзом и Вертц [31].
3.9. Молекулярное клонирование
и олигонуклеотидное секвенирование
10 генов РСВ были идентифицированы в результате клони-
рования кДНК с последующим картированием и трансляцией
вирусных мРНК- кДНК получали обратной транскрипцией
мРНК из зараженных РСВ клеток Нер-2 и клонировали их
в Е. coll с использованием плазмиды pBR322. Обсуждение этих
методов не представляется возможным в пределах данной гла-
вы. Рекомендуем обратиться к оригинальным работам Коллин-
за и Вертц [31], Коллинза и др. [32] и Венкатесана и др. [33].
Нуклеотидная последовательность гена белка нуклеопротеи-
на РСВ и кодируемая ею аминокислотная последовательность
опубликованы Венкатесаном и Эланго [34], а последователь-
ности гена и белка М.— Сатаке и Венкатесаном [35]. В этих
работах подробно описаны методы олигонуклеотидного секве-
нирования в применении к РСВ.
3.10. Очистка вирусных белков
3.10.1. Вирусные полипептиды
В настоящее время очищенные вирусные белки можно по-
лучать методом аффинной хроматографии с использованием
специфических моноклональных антител. Другой подход состо-
ит в экспрессии клонированных генов в прокариотических (для
продуктов, не подвергающихся процессингу) или в эукариоти-
ческих (для процессируемых продуктов) клетках. Однако не-
посредственно для РСВ такие методики пока не описаны.
156
Глава 5
3.10.2. Очистка капсидного белка
Капсидный белок выделяют из очищенных нуклеокапсидов,
которые в свою очередь можно получить либо из вирионов,
либо из экстракта зараженных клеток. Ниже приведена мето-
дика выделения из клеточных экстрактов, дающая более высо-
кий выход.
1. 50-Ю5 клеток заражают РСВ (1 БОЕ/кл или более).
2. Через 36—48 ч после заражения клетки снимают с по-
верхности флакона раствором, содержащим 10 мМ трис-НС1,
pH 7,4, 0,18 М NaCl, 0,25 мМ ЭДТА и 0,1 мМ PMSF.
3. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 15 мин)
и ресуспендируют в 1мл лизирующего буфера [10 мМтрис-НС1,
pH 7,4; 0,1 мМ ЭДТА; 0,1 мМ PMSF; 0,5% (объем на объем)
NP-40] 20 мин при 4 °C.
4. Клетки разрушают в гомогенизаторе Даунса.
5. К гомогенату добавляют NaCl до концентрации 0,1 М и
удаляют неразрушенные клетки, ядра и дебрис центрифугиро-
ванием 2 мин при 600 g.
6. Нуклеокапсиды осаждают центрифугированием 30 мин
при 100 000 g.
7. Нуклеокапсиды промывают лизирующим буфером, а затем
буфером, содержащим 10 мМ трис-НС1, pH 7,4, и 0,1 мМ ЭДТА
(ТЕ).
8. Осадок нуклеокапсидов ресуспендируют и получают рчи-
щенные нуклеокапсиды изопикническим центрифугированием
в 15—55%-ном градиенте концентрации тартрата калия в бу-
фере ТЕ.
3.10.3. Очистка вирионных гликопротеинов
Предложен метод очистки гликопротеинов РСВ, основанный
на солюбилизации вирионов неионным детергентом в буферном
растворе с низкой ионной силой [36].
1. Очищенные методом градиентного центрифугирования ви-
рионы (см. разд. 3.5) осаждают центрифугированием через слой
30%-ного раствора сахарозы в буфере NTE при 50 000 g 60 мин.
Осадок ресуспендируют в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,2),
содержащем 10% (объем на объем) тритона Х-100.
2. Суспензию перемешивают 30 мин при комнатной темпе-
ратуре и центрифугируют 60 мин при 200 000 g.
3. Супернатант экстрагируют п-бутанолом.
4. Экстрагированные белки суспендируют в 0,01 М фосфат-
ном буфере с 1% тритона Х-100 и фракционируют в 5—25%-ном
линейном градиенте концентрации сахарозы, содержащем 1%
тритона Х-100, 18 ч при 100 000 g. Собирают фракции из верх-
Пневмовирусы
157
ней части градиента и диализуют их против 0,01 М фосфатного,
буфера.
5. Тритон Х-100 удаляют экстракцией п-бутанолом.
6. Фракции, содержащие вирусные гликопротеины, иденти-
фицируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле..
4. Специальные биологические методы
4.1. Получение моноклональных антител
Моноклональные антитела к нескольким белкам РСВ были
получены стандартными методами. Ниже приведен типичный
протокол.
1. Мышам линии Balb/c внутрибрюшинно вводят заражен-
ные РСВ клетки (107 клеток каждой мыши). Через 10 сут ино-
куляцию повторяют.
2. Селезенки иммунизированных мышей суспендируют в сре-
де RPM1 1640, забуференной бикарбонатом натрия и содержа-
щей пенициллин (15 мкг/мл), гентамицин (15 мкг/мл), пируват
натрия (1 мМ), L-глютамин (2 мМ) и ЭТС (15%).
3. Клетки селезенки иммунизированных мышей сливают с
клетками мышиной миеломы, например Balb/c NS 1/1, выращи-
ваемой в той же среде. При этом смешивают 3-107 клеток се-
лезенки с таким же количеством клеток миеломы. Клетки цент-
рифугируют 10 мин при 200 g и 1 мин выдерживают при 37 °C.
Для слияния клеток по каплям добавляют 1 мл 50%-ного
ПЭГ 4000 с 5% ДМСО.
4. Суспензию инкубируют 90 с при 37 °C и останавливают
процесс слияния, добавляя 20 мл среды.
5. Клетки осаждают центрифугированием и промывают сре-
дой. Осадок ресуспендируют в среде ГАТ (обычная культураль-
ная среда с добавкой 100 мкМ гипоксантина, 0,4 мкМ амино-
птерина и 16 мкМ тимидина) и распределяют по плоскодонным
лункам планшета для иммунологических реакций (2-Ю5 клеток
в каждую лунку).
6. Клетки инкубируют на питательном слое из макрофагов,
подготовленном за сутки до слияния; каждая лунка должна
содержать 104 перитонеальных макрофагов здоровой мыши.
7. Через 6 сут после начала инкубации в каждую лунку
вносят по 50 мкл среды ГАТ.
8. Через 9—12 сут после слияния проверяют активность и
специфичность продуцируемых антител методом ELISA с ан-
тигенами РСВ.
9. Гибридомы, продуцирующие специфические антитела, кло-
нируют методом предельного разведения в планшете для имму-
нологических реакций, используя макрофаги или клетки селе>-
158
Глава 5
зенки в качестве фидера. Клонирование проводят дважды.
Гибридомы считают стабильными, если 95% клонов продуци-
руют специфические антитела.
4.2. Выделение температурно-чувствительных мутантов
Для анализа функций генов и биохимических исследований
полезно иметь температурно-чувствительные мутанты вируса.
Их выделяют следующим образом.
1. 106 клеток BS-C-1, выращенных в чашке Петри диамет-
ром 50 мм или во флаконе с завинчивающейся крышкой емко-
•стью 30 мл, заражают РСВ дикого типа (т. е. трижды клони-
рованным через бляшку препаратом вируса, образующим бляш-
ки при 39 °C) с множественностью инфекции 0,01 БОЕ/кл.
Адсорбцию проводят 1 ч при 31 °C.
2. Вирус отмывают двумя сменами среды (по 3 мл) и до-
бавляют 3 мл среды Игла, содержащей 2,5% ЭТС и мутаген
(50 мкг/мл 5-фторурацила, или 2,5 мкг/мл Й-метил-Ы'-нитро-
N-нитрозогуанидина, или 50 мкг/мл 5-азацитидина).
3. Культуру инкубируют при 31 °C до проявления ЦПД в
контрольной зараженной культуре, к которой мутаген не до-
бавляли.
4. Разведения культуральной жидкости из обработанных
мутагеном культур титруют методом бляшек после осветления,
но без замораживания и оттаивания. Для этого на клетди на-
носят необходимые разведения и инкубируют клетки под
0,9%-ным агаровым покрытием 5—7 сут при 31 °C.
5. Вирус из полученных индивидуальных бляшек наращи-
вают, перенося бляшки пастеровской пипеткой на свежие мо-
нослойные культуры.
6. Проводят скрининг полученных изолятов вируса на спо-
собность давать бляшки при 31 и 39 °C. Для этого зараженные
чашки инкубируют параллельно при каждой температуре. Аль-
тернативный метод состоит в прямом скрининге бляшек, обра-
зованных вирусом, обработанным мутагеном. Для этого 2 чашки
с культурой, покрытой слоем 0,9%-ного агара толщиной 2 мм,
делят на секторы и в каждый сектор помещают 1 бляшку.,
После адсорбции в течение 30 мин при 31 °C заливают второй
слой агарового покрытия (5 мл на чашку). После этого одну
чашку инкубируют при 31 °C, а другую при 39°С. Из секторов,
где бляшки образуются при 31 °C, но не при 39 °C, их извлека-
ют для дополнительной проверки.
Температурно-чувствительные мутанты можно подразделить
на функциональные группы с помощью теста комплементации.
Факторы, влияющие на комплементацию, детально изучены
[37, 38].
Пневмовирусы
159-
Как и для остальных вирусов с негативной полярностью
РНК и несегментированным геномом, рекомбинация между
температурно-чувствительными мутантами РСВ, принадлежа-
щими к одной или к разным группам комплементации, не
описана.
4.3. Получение персистентно инфицированных клеточных культур
Персистентной инфекции культур клеток при полном отсут-
ствии ЦПД или минимальном его проявлении можно добиться
несколькими способами. Одним из них является пассирование
вируса с высокой множественностью инфекции и пересев вы-
живающих клеток. Другие методы включают заражение частич-
но устойчивых клеток в присутствии противовирусных антител
или интерферона. Для получения персистентно инфицированных
культур можно инкубировать клетки, зараженные температур-
но-чувствительными мутантами РСВ при частично ограничи-
вающей размножение температуре для подавления ЦПД. Такие
культуры после установления персистенции поддерживают при
той же температуре. Исход опыта зависит от конкретных свойств
используемого мутанта. Температурно-чувствительные мутанты
комплементационной группы В, продуцирующие при неразре-
шающей температуре лишь небольшое количество антигена, не
подходят для данной цели, поскольку дают либо абортивную,
либо литическую инфекцию. С другой стороны, мутанты груп-
пы D, синтезирующие при неразрешающей температуре значи-
тельное количество антигена, воспроизводимо дают персистентно
инфицированные культуры, которые можно пассировать неогра-
ниченное число раз [39]. Персистентно инфицированные куль-
туры служат хорошим источником вирусного антигена для про-
ведения анализа по методу ELISA (см. разд. 2.10).
Литература
1. Kingsbury D. W., Bratt М. A., Choppin Р. W., Hanson R. Р., Нosaka У.»
ter Meulen V., Norrby Е., Plowright W., Rott R., Wunner IV (1978). Inter-
virology, 10, 137.
2. Horsfall F. L., Jr., Curnen E. C. (1946). J. Exp. Med., 83, 43.
3. Anderson J. M., Веет M. 0. (1966). Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 121, 205.
4. Dreizin R. S., Ponomareva T. I., Rapoport R. I., Petrova E. I. (1967). Acta
Virol. (Praha), 11, 533.
5. Larionov A. S., Soloneva A. I. (1968). Vopr. Virusol., 13, 164.
6. Parry J. E„ Shirodaria P. V., Pringle C. R. (1979). J. Gen. Virol., 44, 479.
7. Faulkner G. P., Shirodaria P. V., Follett E. A. C., Pringle C. R. (1976). J.
Virol., 20, 487.
8. Schindarov L., Galabov A., Runerski N., Wassileva IE. (1969). Zentralbl.
Bakteriol., 210, 313.
9. Nisevich L. L., Konstantinova L. A., Stakhanova V. M. (1972). Vopr, Virusol.,.
17, 344.
10. Fernie B. F., Gerin J. L. (1980). Virology, 106, 141.
<60
Глава 5
11. Compans R. W., Harter D. H., ChoppinP. IV. (1967). J. Exp. Med., 126,
267.
12. Gardner P. S„ McQuillin J. (1974). Rapid Virus Diagnosis, published by
Butterworths, London.
13. Gardner P. S. (1977). J. Gen. Virol., 36, 1.
14. Gardner P. S., McQuillin J., McGuckin R. (1970). J. Hyg. Camb., 68, 575.
15. Hierholzer J. C„ Coombs R. A., Anderson L. J. (1984). J. Virol. Methods,
8, 265.
16. Marchalonis J. L, Cone R. E., Santer V. (1971). Biochem. J., 124, 921.
17 Greenwood F. C„ Hunter IV. M„ Glover J. S. (1963). Biochem. J., 89,
114.
18. Cote P. J., Fernie B. F„ Ford E. C„ Shih J. W„ Gerin J. L. (1981). J. Virol.
Methods, 3, 137.
19. Fernie B. F„ Gerin J. L. (1982). Infect. Immun., 37, 243.
20. Ward K. A., Lambden P. R„ Ogilvie M. M„ Watt P. J. (1983). J. Gen. Virol.,
64, 1867.
21. Treuhaft M. W. (1983). J. Gen. Virol., 64, 1301.
22. Parry J. E., Shirodaria P. V., Pringle C. R. (1979). J. Gen. Virol., 44, 479.
23. Pringle C. R., Parry J. E. (1980). J. Virol. Methods, 1, 61.
24. Pringle C. R., Parry J. E. (1982). J. Gen. Virol., 58, 207.
25. Huang У. T„ Wertz G. W. (1982). J. Virol., 43, 150.
26. Wunner IT. H., Buller R. M. L„ Pringle C. R. (1976). In: Biological Separa-
tions in Iodinated Density Gradient Media, Rickwood D. (ed.), IRL Press,
London, p. 159.
27. Wertz G. W., Davis N. L. (1981). Nucleic Acids Res., 9, 6487.
28. Schubert M., Keene J. D., Lazzarini R. A. (1979). Cell, 18, 749.
29. Marsden H. S„ Crombie I. K., Subak-Sharpe /. H. (1976). J. Gen. Virol.,
31, 347.
30. Preston С. M. (1977). J. Virol., 23, 455.
31. Collins P. L„ Wertz G. W. (1983). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80,.3208.
32. Collins P. L., Huang У. T., Wertz G. W. (1984). J. Virol., 49, 572. 4
33. Venkatesan S.t Elango N., Chanock R. M. (1983). Proc. Natl. Acad, j Sci.
USA, 80, 1280. !
34. Elango N., Venkatesan S. (1983). Nucleic Acids Res., 11, 5941.
35. Satake M., Venkatesan S. (1984). J. Virol., 50, 92.
36. Ueba O. (1980). Acta Med. Okayama, 34, 245.
37. Gimenez H. B„ Pringle C. R. (1978). J. Virol., 27, 459.
38. Pringle C. R., Shirodaria P. V., Gimenez H. B., Levine S. (1981). J. Gen.
Virol, 54, 173.
.39. Pringle C. R., Shirodaria P. V, Cash P., Chiswell D. L, Malloy P. (1978).
J. Virol, 28, 199.
ГЛАВА 6
ВЫРАЩИВАНИЕ, ОЧИСТКА
И ТИТРОВАНИЕ ВИРУСОВ ГРИППА
Т. Баррет и С. Инглис
1. Общее введение
Вирусы гриппа — это содержащие однонитевую РНК оболо-
чечные вирусы, вызывающие серьезные эпидемические заболе-
вания человека и многих видов животных, в частности лошадей,
свиней, тюленей и домашней птицы. Известны три типа данных
вирусов, выделенные на основании различий между нуклеокап-
сидами в реакции связывания комплемента; они отличаются
также по биохимическим и биологическим свойствам. Вирусы
типа А, способные к быстрым и резким изменениям антиген-
ных свойств (антигенный дрейф), являются главной причиной
пандемий гриппа человека; поэтому они исследованы наиболее
подробно. Большинство методов выращивания, очистки и титро-
вания вирусов гриппа разработаны именно для вирусов этого
типа. Вирусы типа В, хотя и не способны к антигенному дрейфу,
по всем остальным биохимическим и биологическим свойствам
очень близки к вирусам типа А; поэтому их, как правило, мож-
но выращивать и титровать, пользуясь теми же методами. С дру-
гой стороны, вирусы типа С по своим биохимическим свойствам
весьма далеки от вирусов типов А и В; соответственно они име-
ют и другие ростовые свойства. Поскольку вирусы этого типа
изучены намного хуже, чем другие, в настоящей главе основное
внимание уделено методам, разработанным для вирусов ти-
пов А и В, в особенности тем, с которыми авторы знакомы по
собственному опыту. Тем не менее большинство этих методов
применимы и к вирусам типа С. Данная глава представляет
собой практическое руководство, и соответственно теоретиче-
ские основы методов, как правило, не рассматриваются. При
необходимости упоминаются некоторые биологические особен-
ности вирусов и даются ссылки на соответствующую литерату-
ру; однако полное описание этих свойств можно найти в недав-
но опубликованных подробных обзорах [1—3].
11—369
162
Глава 6
2. Системы для размножения вирусов гриппа
2.1. Куриные эмбрионы
2.1.1. Введение
Куриные эмбрионы —очень дешевая и удобная система
культивирования вирусов гриппа. В эмбрионах в той или иной
степени размножаются почти все штаммы вирусов как челове-
ческого, так и животного происхождения. Наилучшим образом
адаптированные к этой системе лабораторные штаммы дают
в эмбрионах достаточно высокие титры (около 104—105 гемаг-
глютинирующих единиц (ГАЕ), или 109—1010 БОЕ на 1 эмбри-
он). Кроме того, эмбрион изолирован от внешней среды, и по-
этому для размножения в нем вируса не нужно создавать спе-
циальные стерильные условия.
Вирус обычно вводят в заполненную жидкостью аллантоис-
ную полость яйца (рис. 6.1), откуда он может проникнуть в
хорионаллантоисную оболочку и заразить образующие ее клет-
ки. Вирусное потомство выходит в аллантоисную жидкость и
может быть легко извлечено из яйца путем отсасывания этой
жидкости. Некоторые штаммы, в частности новые природные
изоляты, а также вирусы типа С плохо размножаются на хорио-
наллантоисной оболочке, но размножаются при введении непо-
средственно в амниотическую полость; при этом вирус получает
доступ к разнообразным тканям эмбриона, и образующееся по-
томство выходит в амниотическую жидкость, которую можно
извлечь отдельно.
2.1.2. Подготовка эмбрионов к заражению
Вирус лучше всего размножается в 10—12-дневных эмбрио-
нах. Следует закупать свежие оплодотворенные яйца и инку-
бировать их нужное время в лаборатории. Для этого не обяза-
тельно иметь специальное оборудование, однако инкубатор
очень удобен. Тем не менее яйца можно успешно инкубировать
и в обычном термостате во влажной атмосфере при 37 °C, если
их регулярно (несколько раз в день) переворачивать. Сортность
яиц не имеет особого значения, но в отдельных случаях важно
исключить возможность заражения яйца другими микроорганиз-
мами; некоторые поставщики продают специальные незаражен-
ные яйца.
Перед заражением следует убедиться в том, что яйца дейст-
вительно оплодотворены. Для этого достаточно рассмотреть
яйцо вблизи яркого источника света в темной комнате (напри-
мер, над пламенем свечи). Через 4—5 дней после оплодотворе-
ния эмбрион должен быть ясно виден.
Рис. 6.1. Схематический разрез куриного эмбриона на 11—16-й день инкубации. Стрелки на нижней схеме показывают пути
введения вируса в амниотическую или в аллантоисную полость. После стерилизации соответствующего участка яйца спир-
том в скорлупе проделывают отверстие и вводят вирус с помощью тонкой иглы для инъекций
11*
164
Глава 6
2.1.3. Подготовка вирусного инокулята
При стандартном пассировании лабораторных штаммов ви-
русный инокулят обычно представляет собой образец инфици-
рованной аллантоисной или культуральной жидкости. Как пра-
вило, образцы перед использованием разводят солевым раство-
ром Хэнкса до концентрации вируса 103—104 БОЕ/мл (10-2—
10-1 ГАЕ/мл), поскольку введение в яйцо большого количества
вируса способствует образованию ДИЧ [4]. Если перед зара-
жением разведенный вирус приходится хранить, то в раствор-
для разведения следует ввести желатин (0,5%). Естественно,
необходимо обеспечить стерильность вируса, используемого для
заражения; в тех случаях, когда это затруднительно, к инокуля-
ту добавляют антибиотик гентамицин (конечная концентрация
50 мкг/мл).
Детальное описание методов подготовки клинических Образ-
цов для выделения вируса гриппа выходит за рамки настоящей
главы; его можно найти в другом руководстве [5]. Данные ме-
тоды предполагают использование гомогенизации для измель-
чения образцов, низкоскоростного центрифугирования для их
осветления и введение неразведенного супернатанта в амниоти-
ческую полость.
2.1.4. Заражение эмбрионов
I. Введение вируса в аллантоисную полость
1. Яйца кладут на бок и протирают сверху спиртом для сте-
рилизации участка вокруг точки заражения.
2. В скорлупе проделывают небольшое отверстие (см.
рис. 6.1) с помощью зубоврачебного сверла, снабженного ре-
жущим диском. Отверстие должно быть достаточно глубоким,
чтобы в него можно было ввести иглу для инъекций, но жела-
тельно не повреждать внутреннюю мембрану скорлупы.
3. С помощью шприца с иглой № 25 в аллантоисную по-
лость инокулируют 0,1 мл вируса, вводя при этом иглу непо-
средственно под скорлупу.
4. Отверстие в скорлупе запечатывают небольшим количест-
вом расплавленного воска.
5. Зараженные яйца инкубируют в термостате во влажной
атмосфере острым концом вниз. Во время инкубации нет необ-
ходимости переворачивать яйца.
II. Введение вируса в амниотическую полость
1. Тупой конец яйца стерилизуют, протирая спиртом, и про-
делывают небольшое отверстие, как показано на схеме
(рис. 6.1).
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа 165
2. Яйцо располагают вблизи яркого источника света в тем-
ной комнате так, чтобы был виден эмбрион.
3. Иглу № 23 длиной 4 см вводят в проделанное отверстие,
а затем резким движением в направлении эмбриона — в амнио-
тическую полость. При этом вносят 0,1 мл вируса и осторожно
извлекают иглу.
4. Отверстие в скорлупе запечатывают расплавленным вос-
ком и инкубируют яйца, как указано выше.
2.1.5. Время инкубации
Оптимальное время инкубации, необходимое для получения
максимального выхода вируса, зависит от конкретного штамма
и должно быть определено экспериментально. Для некоторых
штаммов вируса гриппа А, например вируса чумы птиц, макси-
мальный выход достигается через 24—26 ч, в то же время
большинство штаммов вируса гриппа А человека, а также ви-
русы типов В и С требуют 48—72 ч инкубации.
2.1.6. Сбор вируса
Прежде чем пытаться извлечь из яйца вируссодержащую
жидкость, рекомендуется охладить яйцо в течение 4—18 ч при
4 °C или в течение 30 мин при —20 °C. При охлаждении эмбри-
он погибает (если это не произошло раньше в результате раз-
множения вируса), а окружающие его кровеносные сосуды су-
жаются. Таким образом, значительно уменьшается возможность
контаминации вируссодержащей жидкости эритроцитами, кото-
рые могут связать часть вируса и тем самым уменьшить его
выход. Если контаминации эритроцитами избежать все же не
удается, потери вируса можно свести к минимуму, инкубируя
материал 30 мин при 37 °C. В этих условиях вирионная нейра-
минидаза разрушает рецепторы эритроцитов, с которыми связы-
вается вирус, и он освобождается.
I. Сбор аллантоисной жидкости
1. Яйца помещают на подставку тупым концом вверх и сте-
рилизуют их поверхность спиртом.
2. Тупой конец яйца вскрывают, пользуясь при этом либо
стерильным пинцетом, либо специальным приспособлением.
Скорлупу вокруг воздушного мешка удаляют, открывая доступ
к аллантоисной полости.
3. С помощью стерильного пинцета с тупыми концами раз-
рывают хорионаллантоисную мембрану и отодвигают ее к краю
яйца.
166
Глава 6
4. Эмбрион и желточный мешок осторожно отодвигают пин-
цетом и отсасывают аллантоисную жидкость пипеткой с широ-
ким концом. Из яйца среднего размера получают 7—10 мл
бледно-желтой жидкости. Примесь желтка в аллантоисной жид-
кости мешает дальнейшей очистке вируса, поэтому при ее от-
боре следует избегать повреждения желточного мешка. Если
вирус предназначен для биохимических исследований, например
для анализа активности вирионных ферментов, аллантоисную
жидкость следует собирать при 0 °C.
5. Аллантоисную жидкость осветляют центрифугированием
10 мин при 10 000 g и хранят супернатант при 4 или —70°C
(о хранении вируса см. разд. 6).
II. Сбор амниотической жидкости
1. Поверхность яйца стерилизуют и вскрывают тупой конец,
как описано выше. Удаляют возможно большую част^ скорлу-
пы, чтобы легко было извлечь содержимое яйца.
2. Хорионаллантоисную мембрану разрывают и выливают
содержимое яйца в стерильную чашку Петри. При этом амнио-
тическая полость должна остаться неповрежденной.
3. С помощью шприца с иглой № 25 из амниотической по-
лости по возможности более полно извлекают содержимое (как
правило, 0,2—0,4 мл).
4. Амниотическую жидкость осветляют и хранят так же,
как и аллантоисную жидкость.
2.1.7. Ожидаемый выход
Интенсивность размножения вируса в эмбрионах зависит от
конкретного штамма. Дикие штаммы первоначально дают очень
низкие титры (около 100 ГАЕ в 1 мл амниотической жидкости),
но после нескольких пассажей на эмбрионах титр значительно
возрастает. Для разных лабораторных штаммов, адаптирован-
ных к размножению на эмбрионах, выход также существенно
варьирует, но в большинстве случаев в аллантоисной жидкости
накапливается 2000—5000, а иногда и до 20000 ГАЕ/мл вируса.
Очевидно, что адаптация к размножению в эмбрионах связана
с селекцией генетических вариантов, поэтому следует иметь
в виду, что результаты детального генетического и биохимиче-
ского исследования штаммов, пассированных на эмбрионах, не
обязательно характеризуют исходный изолят.
2.2. Наращивание вирусов в культурах клеток
2.2.1. Введение
Хотя для наращивания вирусов гриппа в больших масшта-
бах обычно используют куриные эмбрионы, для детального ге-
нетического анализа вируса необходимо размножать вирус
Выращивание очистка и титрование вирусов гриппа 167
в культуре клеток. Наиболее распространенная и надежная
система для размножения вирусов гриппа — монослойная пер-
вичная культура фибробластов куриного эмбриона (ФЭК), од-
нако используют и первичные культуры клеток почек обезьян,
крупного рогатого скота и собак (линии MDBK и MDCK). Хо-
тя к инфекции чувствительны очень многие клеточные культуры,
большинство их не поддерживают размножение вируса. В не-
которых типах клеток проходит только неполный цикл репро-
дукции (абортивная инфекция), при котором не формируются
вирионы. В других клетках вирионы образуются и высвобожда-
ются в среду, но не обладают инфекционностью.
Один из известных факторов, обуславливающих инфекцион-
ность вирионов вируса гриппа, — это протеолитическое расщеп-
ление гемагглютинина (ГА). Расположенные на поверхности
вириона молекулы гемагглютинина расщепляются эндогенными
клеточными протеазами на молекулы меньшего размера, ГА1
и ГА2 [7, 8]. В некоторых типах клеток, не имеющих соответ-
ствующей протеазы, продуктивное размножение вируса гриппа
и образование бляшек могут быть индуцированы включением
в агаровое покрытие трипсина [9]. Разные штаммы вирусов
гриппа отличаются друг от друга по чувствительности к дейст-
вию протеаз, причем недавние исследования показали, что чув-
ствительность к расщеплению определяется первичной структу-
рой белка в районе соединения ГА1—ГА2 [10]. Аминокислот-
ная последовательность в сайте расщепления молекулы ГА
очень сходна с таковой в сайте расщепления белка F вируса
Сендай, и было высказано предположение о том, что механизмы
функционирования этих белков, обеспечивающие проникновение
вирусов в клетку, аналогичны [11]. Хотя расщепление ГА необ-
ходимо для проявления инфекционности, это не единственный
фактор, определяющий патогенность вирусов гриппа. По-види-
мому, данное свойство контролируется несколькими вирусными
генами.
2.2.2. Методы культивирования вируса
Для культивирования вирусов удобно использовать моно-
слойные культуры клеток, выращиваемые в пластиковых чаш-
ках или флаконах; лучшие результаты получают при зараже-
нии плотного монослоя. Сыворотка крови, входящая в состав
культуральных сред, содержит вещества, снижающие инфекци-
онность вируса. Поэтому перед внесением инокулята вируса,
который обычно представляет собой аллантоисную жидкость,
разведенную PBS для обеспечения необходимой множествен-
ности инфекции, с монослоя сливают среду и промывают его
PBS. Адсорбцию вируса на монослое проводят при комнатной
168
Глава 6
температуре в течение 30—60 мин; в этих условиях вирус связы-
вается с клетками, но размножение не начинается. Несвязав-
шийся вирус удаляют и заменяют культуральной средой с по-
ниженным содержанием сыворотки (2%). В тех случаях, когда
особенно важно удалить весь несвязавшийся с клетками вирус,
например для определения эффективности размножения, моно-
слой следует обработать противовирусными антителами. В этом
случае монослой после удаления инокулята 3 раза промывают
теплым PBS, добавляют свежую среду и инкубируют 60 мин
при соответствующей температуре. Затем среду заменяют на
2 мл PBS, содержащего вирусную антисыворотку (60 ед.
ТГА/мл). Через 15 мин монослой опять трижды промывают
теплым PBS, добавляют свежую культуральную среду и инку-
бируют клетки при требуемой температуре. z
В тех случаях, когда для репродукции вируса необходим
трипсин, его обычно добавляют в среду до конечной концентра-
ции 10 мкг/мл. В этом случае подходит трипсин, используемый
при пассировании клеток. Трипсин следует хранить заморо-
женным в виде концентрированного раствора и разводить не-
посредственно перед использованием (концентрация трипсина
должна составлять не более 50% от используемой для пассиро-
вания клеток). Важно контролировать каждый препарат трип-
сина на незараженной культуре клеток, поскольку его актив-
ность может варьировать от партии к партии. Типичное для
вирусов гриппа ЦПД — это округление зараженных клеток с
последующим отделением их от субстрата; то же самое проис-
ходит с незараженными клетками при слишком высокой кон-
центрации трипсина.
Скорость размножения вируса в культуре клеток, естествен-
но, зависит от конкретного штамма вируса и типа клеток, но,
как правило, при продуктивной инфекции выход вируса гриппа
из клеток начинается через 4—6 ч после заражения и достигает
максимума через 16—24 ч. Этот процесс легко контролировать
титрованием гемагглютинирующей активности в образцах куль-
туральной жидкости (см. разд. 3.1). Типичная кинетическая
кривая размножения вируса приведена на рис. 6.2.
2.3. Органные культуры
Показано, что вирус гриппа размножается в органных куль-
турах, тем не менее очевидно, что подобные системы более при-
годны для экспериментальных целей, чем для наращивания
вируса. Детальное описание органных культур не входит в за-
дачи настоящей главы, но следует отметить, что описано эффек-
тивное размножение вируса в тканях взрослых людей, таких
как слизистая оболочка носа, конъюнктива, ткани матки и мо-
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа
169
чевого пузыря, а также в эмбриональных тканях, в частности
в тканях трахеи, пищевода, кишечника, мочевого пузыря, конъ-
юнктивы и легкого. Для размножения вируса были использова-
ны и разнообразные ткани животных, в частности ткани трахеи
и кишечника птиц, а также ткани носовых выростов, матки,
мочевого пузыря, яйцевода, пищевода, коъюнктивы, глотки и
дыхательных путей хорька. Органные культуры для размноже-
ния вирусов гриппа описаны в обзоре Свита и Смита [2].
Рис. 6.2. Размножение вируса гриппа А в первичной культуре фибробластов
куриного эмбриона (ФЭК). Динамику размножения вируса исследовали по
накоплению вирусного гемагглютинина. Чашку с монослоем клеток ФЭК
диаметром 15 см заражали с множественностью инфекции около 50 БОЕ/кл
и в указанные моменты отбирали образцы культуральной жидкости объемом
0,25 мл для непосредственного определения гемагглютинирующей активности
3. Методы титрования вирусов
3.1. Титрование вирусов гриппа в реакции гемагглютинации
3.1.1. Введение
Как и многие другие вирусы животных, вирусы гриппа аг-
глютинируют эритроциты. В основе агллютинации лежит взаи-
модействие гемагглютинина, одного из поверхностных вирусных
белков, с рецепторами, расположенными на поверхности эри-
троцитов. Поскольку каждая вирусная частица содержит не
170
Глава 6
Рис. 6.3. Титрование вируса гриппа в реакции гемагглютинации. Для постановки
реакции готовят серии двукратных разведений исследуемого вируса в планшетах
с круглодонными лунками, как описано в разд. 3.1. Конечной точкой считают
минимальное разведение вируса, при котором наблюдается агглютинация 50%
эритроцитов. В ряду 1 (а) разведения 1/2—1/16 дают полную агглютинацию,
в то время как более высокие разведения не дают агглютинации. Конечной
точкой считают такое разведение вируса, которое содержит 1 гемагглютини-
рующую единицу (ГАЕ), т. е. количество вируса, необходимое для агглютина-
ции стандартного объема 1%-ной суспензии эритроцитов. В ряду 1 (а) конеч-
ная точка лежит посередине между 1/16 и 1/32, т. е. составляет 1/24. Анало-
гично конечные точки для 2-го, 3-го и 4-го рядов составляют 1/768, 1/192,
одну молекулу гемагглютинина, образующего шиповидные
выступы, при достаточно высокой концентрации вируса форми-
руются крупные агрегаты эритроцитов со структурой типа сети.
Образование таких агрегатов легко наблюдать в лунке или про-
бирке с U-образным дном; в этом случае нормальные эритро-
циты образуют компактный осадок (так называемую «бляш-
ку») на дне пробирки, а агглютинированные оседают равномер-
но (рис. 6.3). Эта реакция исключительно удобна для количе-
ственного определения вируса.
Для постановки гемагглютинации определенное количество
эритроцитов смешивают в лунках планшета с равным объемом
исследуемой суспензии вируса в разных разведениях. Планшет
затем инкубируют 30—45 мин при комнатной температуре без
перемешивания. По результатам реакции можно определить,
при каком разведении вирусного препарата утрачивается гемаг-
глютинирующая активность. Количество вируса, агглютинирую-
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа
171
1/384. Это означает, что 0,25 мл (объем раствора вируса, вносимого в каж-
дую лунку) 24-кратного разведения исходного препарата вируса содержит
1 ГАЕ. Отсюда путем умножения на фактор разведения легко рассчитать кон-
центрацию вируса, составляющую в данном случае 96 ГАЕ/мл. В 5-м ряду (а)
титр вируса выше 1024 ГАЕ/мл, т. е. приготовленные разведения не позволяют
точно рассчитать титр. В таких случаях следует повторить титрование, готовя
10-кратные разведения исходного препарата. Обычно конечную точку опреде-
лить очень легко. В некоторых случаях, однако, наблюдается промежуточная
картина агглютинации, показанная на рис. 6.3,6. В 1-м ряду конечная точка
равна 1 /6. Во втором ряду конечная точка отстоит на 1 /3 от разведения 1 /4
и на 2/3 от разведения 1/8, т. е. составляет 1/5. В 3-м ряду конечная точка
равна 1/4. Таким образом, как показано на рис. 6.3, б, титр вируса составля-
ет 24 (1-й ряд), 20 (2-й ряд), 16 (3-й ряд) ГАЕ/мл
щее 50% эритроцитов, определяется как 1 гемагглютинирующая
единица (ГАЕ). Таким образом, зная, какое разведение вируса
соответствует одной ГАЕ, можно вычислить титр вируса
в ГАЕ/мл. Значение ГАЕ зависит от условий анализа, в част-
ности от объема реакционной смеси и концентрации эритроци-
тов; кроме того, постановка реакции в разных лабораториях
может иметь свои особенности. Ниже приведена методика, по-
стоянно используемая в лаборатории авторов.
ГАЕ — удобная единица для сравнения разных препаратов
вируса, однако она не определяет ни общего количества вируса
в препарате, ни количества инфекционных частиц. Тем не менее
для любого конкретного штамма вируса соотношение между
ГАЕ и другими единицами измерения количества вируса может
быть определено эмпирически; затем, если вирус не претерпел
генетических изменений, титр в ГАЕ можно использовать для
расчета других параметров. Для большинства лабораторных
штаммов вируса гриппа выполняется следующее приблизитель-
ное соотношение:
172
Глава 6
1 ГАЕ = 2-106 единиц инфекционности для куриных эмбрио-
нов (ЕИЭ50) =2 105 БОЕ = 107 физических единиц (по данным
электронной микроскопии).
3.1.2. Подготовка эритроцитов
В реакции можно использовать эритроциты различного про-
исхождения, например человека (типа 0) или морской свинки,
но чаще всего используют куриные эритроциты. 1%-ную суспен-
зию готовят следующим образом.
1. Кровь фильтруют через два слоя муслина.
2. Фильтрат центрифугируют 5 мин в настольной центрифуге
при 1500 об/мин.
3. Супернатант и верхний слой осадка, состоящий из лейко-
цитов, удаляют с помощью пастеровской пипетки, присоединен-
ной к водоструйному насосу. Клетки 3 раза промывают физио-
логическим раствором, суспензируя осадок и повторно осаждая
эритроциты при 1500 об/мин.
4. Эритроциты ресуспендируют в физиологическом растворе
и получают плотный осадок центрифугированием при
2500 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают, а оса-
док эритроцитов суспендируют в 100-кратном объеме физиоло-
гического раствора. Суспензию тщательно перемешивают и хра-
нят при 4 °C.
3.1.3. Постановка реакции
1. В лунках планшета готовят последовательные двукратные
разведения вирусной суспензии с неизвестным титром на физио-
логическом растворе; объем суспензии в каждой лунке должен
быть равен 0,25 мл. В опыт включают также и контрольную
лунку с физиологическим раствором.
2. 1%-ную суспензию эритроцитов интенсивно встряхивают
и вносят в каждую лунку в количестве 0,25 мл. Смесь в лунках
перемешивают, поворачивая планшет, и инкубируют планшет
45 мин без дальнейшего перемешивания на листе белой бумаги.
В предельном разведении, обладающем гемагглютинирующей
активностью, наблюдается один из трех типов агглютинации,
что можно использовать для приблизительного расчета титра
вируса (см. подпись к рис. 6.3).
Более экономным методом определения титра является мик-
ровариант этой реакции, в котором используется по 0,05 мл
суспензии вируса и эритроцитов; реакцию можно ставить в мик-
ропланшете для титрования. Следует, однако, иметь в виду, что
в этом случае одна ГАЕ определяется как количество вируса
в объеме 0,05 мл, агглютинирующее 50% эритроцитов в 0,05 мл
1%-ной суспензии.
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа 173
3.1.4. Факторы, влияющие на результат реакции гемагглютинации
Результаты реакции гемагглютинации могут искажаться
под действием ряда факторов.
1. Существенно, чтобы перед использованием кровь не хра-
нилась слишком долго. Через 5—7 дней в ней начинается гемо-
лиз, что делает исследование гемагглютинации сначала неточ-
ным, а затем вообще невозможным.
2. Поскольку при низкой концентрации эритроцитов получа-
ют завышенные значения титра вируса, суспензию эритроцитов
перед использованием необходимо тщательно перемешать.
3. Учет результатов реакции не следует откладывать надолго.
Помимо гемагглютинина на поверхности вирионов вируса грип-
па локализован фермент нейраминидаза (НА), отщепляющий
•от олигосахаридов концевые остатки сиаловой кислоты. По-
скольку гемагглютинин присоединяется к поверхности эритроци-
тов именно через остатки сиаловой кислоты, действие нейрами-
нидазы нарушает связи между вирионами и клетками. Поэтому
через некоторое время слой агглютинированных эритроцитов
начинает разрушаться («коллапсировать»). Некоторые штам-
мы вируса гриппа имеют столь высокую нейраминидазную ак-
тивность, что быстрое удаление клеточных рецепторов препят-
ствует агглютинации при комнатной температуре. В этом случае
рекомендуется ставить реакцию гемагглютинации при 4 °C.
4. Результат реакции может быть искажен, если используе-
мые планшеты недостаточно хорошо вымыты. Сразу же после
окончания работы планшеты следует замочить на 1 ч в 4%-ном
растворе NaOH, а затем тщательно промыть дистиллированной
водой.
5. Вирусная суспензия может содержать вещества, специфи-
чески или неспецифически ингибирующие гемагглютинацию. Эта
проблема особенно серьезна при титровании вируса в культу-
ральной жидкости, поскольку входящая в состав питательных
сред сыворотка крови содержит подобные ингибиторы. Многие
из них могут быть инактивированы прогреванием сыворотки
при 56 °C 30 мин; подробнее этот вопрос обсуждается в работе
Хойла [12]. В некоторых случаях, однако, возникает противо-
положная ситуация: некоторые препараты сывороток содержат
факторы, вызывающие гемагглютинацию в отсутствие вируса.
Поэтому необходимо одновременно с вирусом титровать образец
среды от незараженных клеток.
6. Следует помнить, что и вирусы других семейств агглюти-
нируют эритроциты и могут препятствовать проведению специ-
фической реакции. Природу исследуемого вируса можно, разу-
меется, установить в реакции торможения гемагглютинации с
использованием специфической антисыворотки против интересу-
ющего исследователя вируса (см. разд. 3.1.5).
174
Глава б
3.1.5. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
Способность вируса гриппа связывать и агглютинировать
эритроциты можно использовать и для определения концентра-
ции противовирусных антител в образцах сыворотки. Для этого
проводят реакцию между последовательными разведениями
сыворотки и известным количеством вируса (достаточным для
полной агглютинации эритроцитов в нормальных условиях),
а затем добавляют суспензию эритроцитов; концентрацию анти-
тел определяют, исходя из последнего разведения сыворотки,
еще способного тормозить гемагглютинацию.
1. Готовят последовательные двукратные разведения иссле-
дуемой сыворотки на физиологическом растворе. В зависимо-
сти от того, выполняется анализ в стандартных планшетах или
в микропланшетах, объем каждого разведения должен состав-
лять соответственно 0,25 или 0,05 мл.
2. В каждую лунку вносят по 4 ГАЕ стандартного вируса
(в объеме 0,05 или 0,01 мл в зависимости от типа используемо-
го планшета). Антитела инкубируют с вирусом 30 мин при ком-
натной температуре.
3. В каждую лунку вносят нужное количество 1%-ной сус-
пензии эритроцитов (0,25 или 0,05 мл), перемешивают и продол-
жают инкубацию еще 30 мин.
4. Учитывают результаты и определяют концентрацию анти-
тел, исходя из последнего разведения сыворотки, еще способ-
ного тормозить гемагглютинацию.
Примечание. Следует включать в опыт соответствующие
контроли, чтобы убедиться в правильности определения кон-
центрации вируса, в том, что сыворотка сама по себе не вызы-
вает гемагглютинации и что в отсутствие вируса эритроциты
нормально оседают.
3.2. Титрование путем определения инфекционности
для куриных эмбрионов
3.2.1. Введение
Количество инфекционного вируса в препарате можно опре-
делить по максимальному разведению, вызывающему инфек-
ционный процесс в куриных эмбрионах. Минимальное количест-
во вируса, заражающее 50% эмбрионов, называют единицей
инфекционности для эмбрионов (ЕИЭ50). Этот метод наиболее
чувствителен и позволяет титровать небольшие количества ин-
фекционного вируса, поскольку для многих штаммов 10 ЕИЭ50
приблизительно соответствуют 1 БОЕ. По данным электронной
микроскопии, 1 ЕИЭ5о соответствует примерно 5—10 вирусным
частицам (см. разд. 3.5).
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа 175
3.2.2. Постановка титрования
1. Готовят последовательные 10-кратные разведения иссле-
дуемой суспензии вируса на растворе Хэнкса (см. разд. 8) и
вводят 0,1 мл каждого разведения в аллантоисную (или при
необходимости в амниотическую) полость нескольких 11-днев-
ных куриных эмбрионов (см. разд. 2.1.4). Количество эмбрио-
нов, используемых для заражения каждым разведением, опре-
деляется требуемой точностью титрования, но, как правило, со-
ставляет не менее 10. Эмбрионы инкубируют в течение
необходимого для размножения вируса времени (см.
разд. 2.1.5).
2. Из каждого яйца отбирают аллантоисную жидкость и про-
водят реакцию гемагглютинации. При этом нет необходимости
для каждого образца аллантоисной жидкости готовить последо-
вательные разведения. В этом случае достаточно определить,
размножался ли вирус в данном эмбрионе или нет. Для этого
25 мкл исследуемого образца разводят в 0,25 мл физиологиче-
ского раствора в лунке планшета или в пробирке и добавляют
0,25 мл суспензии эритроцитов.
3.2.3. Расчет титра вируса
Имеется много способов расчета титра вируса в ЕИЭ50. Один
из самых удобных методов описан Томпсоном [13]. В примере,
приведенном в табл. 6.1, по 0,1 мл каждого из последователь-
ных 10-кратных разведений вируса (УЕИЭбо) вводили в 10 эм-
брионов. Для каждого разведения в реакции гемагглютинации
определяли количество эмбрионов, в которых размножался ви-
рус, и вычисляли долю, которую они составляли от общего
числа зараженных эмбрионов (удельная инфекционность). Для
каждого разведения рассчитывали «среднюю удельную инфек-
ционность», представляющую собой среднее арифметическое
удельной инфекционности данного и двух соседних разведений.
Как правило, «подвижные средние» (р) значения инфекцион-
ности образуют монотонно возрастающий ряд (это не всегда
наблюдается при использовании неусредненных значений ин-
фекционности). Полученные средние значения используются
для расчета дозы вируса со средней удельной инфекционно-
стью 0,5. По определению эта доза содержит 1 ЕИЭ50. Точность
результатов, полученных этим методом, можно оценить с по-
мощью статистического анализа, описанного Томпсоном [13].
176
Глава 6
Таблица 6.1. Расчет титра вируса1)
Разведение Доза log(AO3bi) Количество зараженных эмбрионов «Удельная инфекциои- ность» «Средняя удельная ин- фекцион- иость»
10-ю Y-10-" -11+logY 0/10 0
10-9 Y-10-10 —10+logY 0/10 0 О.ЗЗ(Ро)
10-8 Y-10-9 —9 + log Y 1/10 0,1 0,266(рх)
10-7 Y-Ю-8 -8+log Y 7/10 0,7 0,600(р2)
10-8 Y-10-7 - 7+logY 10/10 1,0 0,900(р3)
10-5 Y-10-6 —6+logY ’ 10/10 1,0
) Средние значения подсчитывают следующим образом: для разведений 10~9, 10~а
и 10—т pi = (0+0,l+0,7)/3=0,266, а для разведений 10-8, 10-7 и 10-° р2=(0,1+0,7+1,0)/3«
=0,600. Логарифм дозы которая даст «среднюю удельную инфекционность» 0,5 и по
определению представляет собой 1 ЕИЭбо, можно рассчитать с помощью интерполяции
(очевидно, что в данном случае эта доза лежит между значениями —9+log Y и
—8+log Y). Ее точное значение можно вычислить следующим образом: /
0,500—0,266 0,234 „ „ \
0,600—0,266 0,334
далее
—9+log Y+0,7(log 10)—8,3+log Y-1 ЕИЭбо.
Отсюда logY=8,3; Y-1,99 108.
3.3. Титрование вирусов с использованием
фрагментов эмбрионов
3.3.1. Введение
Использование фрагментов эмбрионов, т. е. кусочков скор-
лупы 11-дневных оплодотворенных яиц с присоединенной к ним
хорионаллантоисной оболочкой, вместо целых эмбрионов лежит
в основе весьма экономичного способа определения инфекцион-
ности препаратов, содержащих вирус гриппа. Данный метод,
предложенный для титрования вируса гриппа еще до введения
в практику культур клеток [14], и теперь весьма полезен для
титрования штаммов вирусов, не размножающихся в культуре
клеток или при отсутствии подходящей культуры.
Использование фрагментов хорионаллантоисной оболочки
вместе со скорлупой существенно, поскольку скорлупа помога-
ет сохранить ткань неповрежденной и действует как мощная
буферная система, поддерживающая pH 7,5.
3.3.2. Получение фрагментов эмбрионов
1. Острые концы оплодотворенных 11-дневных яиц вскры-
вают ножницами и извлекают эмбрион. Если вместе с эмбрио-
ном извлекается хорионаллантоисная оболочка, такое яйцо сле-
дует отбросить.
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа
177
2. Скорлупу с оболочкой 2 раза промывают стандартной сре-
дой, (см. разд. 3.3.6) и нарезают на продольные полоски шири-
ной около 0,6 см. Эти полоски в свою очередь разрезают на
квадратные кусочки.
3. Кусочки скорлупы хранят в чашках Петри со стандартной
средой, Из каждого яйца можно получить до 100 квадратных
кусочкбв площадью 6 мм2.
3.3.3. Заражение фрагментов эмбрионов
1. Титрование можно проводить в небольших реакционных
пробирках (5X1 >25 см) или, что более удобно, в планшетах для
гемагглютинации.
2. Планшеты стерилизуют 95%-ным этанолом. Избыток эта-
нола удаляют и заворачивают каждый планшет отдельно в сте-
рильную бумагу. Планшеты выдерживают в термостате в тече-
ние ночи для полного испарения этанола. После этого планше-
ты готовы к использованию.
3. Фрагменты эмбрионов помещают в планшеты (каждый
кусочек площадью 6 мм2 в индивидуальную лунку) и добавля-
ют в каждую лунку по 0,3 мл стандартной культуральной сре-
ды. Инкубация фрагментов эмбрионов при комнатной темпера-
туре в течение нескольких часов или при 37 °C в течение 24 ч
при перемешивании не влияет на последующее размножение
вируса.
4. Готовят последовательные 10-кратные разведения иссле-
дуемого вируса и вносят в лунки по 0,025 мл каждого разве-
дения.
3.3.4. Инкубация образцов
1. При исследовании большого числа вирусных образцов
планшеты ставят стопкой один на другой, сделав между ними
прокладки толщиной 0,3 см, для обеспечения эффективной аэ-
рации.
2. Стопку планшетов помещают на подходящую подставку
и окружают влажной ватой.
3. Всю конструкцию фиксируют клейкой пленкой или алю-
миниевой фольгой, помещают в термальную комнату и интен-
сивно встряхивают 2—3 сут в зависимости от исследуемого
штамма вируса. Рекомендуется использовать горизонтальный
шейкер (120 колебаний в 1 мин, амплитуда — 8 см). Интенсив-
ное встряхивание позволяет избежать накопления токсичных
метаболитов и обеспечить эффективную аэрацию клеток.
12—369
(78 Глава 6
3.3.5. Учет результатов
По окончании инкубации из лунок планшета пинцетом с тон-
кими концами удаляют фрагменты эмбрионов и вносят в каж-
дую лунку по 0,25 мл стандартной 1%-ной суспензии эритро-
цитов. Планшеты быстро встряхивают и оставляют на 30 мин
на белом фоне. Гемагглютинация свидетельствует о размноже-
нии вируса. Титр вируса определяют так же, как и при исполь-
зовании целых эмбрионов.
3.3.6. Приготовление стандартной среды
Готовят следующие навески:
NaCl —8,0 г
КС1 — 0,6 г
СаС12 — 0,8 г
MgCl2 —0,05 г
Глюкоза — 0,3 г
Желатин (не содержащий кислоты) —2,0 г
Хлорамфеникол — 0,1 г
К навескам добавляют нейтральный красный (25 мл 0,01%-ного
раствора) и воду — до 1 л. pH доводят приблизительно до
7,0, добавляя несколько капель 1 Н NaOH. Нейтральный крас-
ный действует как индикатор; при pH 7,0 раствор должен иметь
желто-оранжевую окраску. Раствор стерилизуют автоклавиро-
ванием 30 мин при 115 °C.
3.4. Титрование вирусов гриппа методом бляшек
3.4.1. Введение
При работе данным методом последовательные 10-кратные
разведения вируса готовят на PBS, содержащем 0,5% желати-
на. Культуру для титрования можно выращивать в любом
культуральном сосуде подходящего объема, но удобнее всего
использовать шестилуночные планшеты (диаметр лунки 4 см).
Это позволяет провести все титрование в одном термостате и
избежать ошибок из-за неправильной нумерации чашек. В тех
случаях, когда необходимо строго контролировать температуру,
например в опытах с температурно-чувствительными (ts) му-
тантами при неразрешающей температуре, планшеты можно
соединить в стопку, запечатать в пластиковом мешке и поме-
стить в термостатированную водяную баню. При этом резко
снижается вероятность искажения результатов из-за падения
температуры при открывании дверцы термостата.
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа
3.4.2. Заражение монослойных культур
179
Существенно, чтобы перед началом титрования монослой
клеток был плотным.
1. С культуры сливают среду и промывают монослой теп-
лым PBS для удаления остатков сыворотки. Чтобы полностью
покрыть монослой в чашке диаметром 4—5 см, вирус вносят в
объеме 0,2 мл.
2. Вирус, начиная с максимального разведения, наносят
в центр чашки по каплям и распределяют по поверхности мо-
нослоя. Если вирус наносят на периферию чашки, силы поверх-
ностного натяжения не дают ему распределиться по поверхно-
сти, и образующиеся бляшки скапливаются на периферии.
3. Адсорбцию вируса проводят 30 мин при комнатной тем-
пературе. Полезно один или два раза во время адсорбции пока-
чать чашки, чтобы обеспечить равномерное распределение ви-
руса по монослою.
3.4.3. Нанесение покрытия
По окончании адсорбции вирус удаляют (хотя это не яв-
ляется строго обязательным) и наносят на монослой 2 мл по-
крытия, состоящего из культуральной среды с 0,7—1,25% ага-
ра. Необходимо следить, чтобы температура покрытия при
заливке не была слишком высокой, в противном случае клетки
погибнут. Однако не менее важно, чтобы агар не был и слиш-
ком холодным и не застыл в пипетке. Для клеток ФЭК опти-
мальная температура покрытия составляет 45 °C. Для приготов-
ления покрытия смешивают равные объемы двукратного кон-
центрата среды, нагретого до 45 °C, и двукратного концентрата
агара, охлажденного до 60 °C. Готовое покрытие охлаждают
до 45 °C.
Для быстрого плавления агара очень удобно использовать
микроволновую печь. Важно избегать образования пузырей,
поскольку они могут исказить конечные результаты, имитируя
бляшки или, наоборот, маскируя их. Если титрование проводят
на клетках, менее устойчивых к высокой температуре, чем
ФЭК, вместо агара рекомендуется использовать агарозу с низ-
кой температурой гелеобразования, застывающую при темпера-
туре ниже 37 °C. Можно использовать в качестве покрытия и
среду с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ) (см. разд. 8). При
этом нет необходимости строго выдерживать температурный
интервал, как при работе с агаром, однако использование КМЦ
может приводить к искажению формы бляшек, если во время
титрования чашки сдвигаются или наклоняются.
12*
180
Глава 6
3.4.4. Окрашивание бляшек
Обычно через 2—3 дня после заражения бляшки достигают
такого размера, что их можно обнаружить при окрашивании.
Если инкубацию клеток проводят под агаровым покрытием,
для окрашивания можно использовать нейтральный красный.
1. Содержащую агар среду для покрытия готовят, как опи-
сано выше, и добавляют нейтральный красный (1%-ный вод-
ный раствор) до конечной концентрации 0,1%.
2. На каждую чашку диаметром 4 см наносят 2 мл этой
среды, как описано выше.
3. Чашки вновь помещают в термостат на 3—4 ч; за это вре-
мя бляшки становятся видимыми.
Если нет возможности подсчитать бляшки сразу же после
окрашивания, следует иметь в виду, что они остаются видимы-
ми по крайней мере в течение 48 ч, причем их размер не уве-
личивается при помещении в герметически закрытый контей-
нер в атмосфере 5%-ного СОг при 4°C. Если необходимо полу-
чить более стабильный препарат, применяют альтернативный
метод окрашивания. В этом случае агаровое покрытие удаляют
и фиксируют клеточный монослой буфером с формальдегидом
[10% 38%-ного формальдегида (объем на объем) в PBSJ
2—3 мин. Затем клетки окрашивают 10 мин, добавляя в каж-
дую чашку несколько миллилитров толуидинового синего
(1%-ный водный раствор). После окрашивания краситель от-
мывают водой и чашки высушивают. Данный метод окрашива-
ния применим и в том случае, если покрытие готовят на осно-
ве кмц.
3.4.5. Получение очищенного вируса из бляшек
Для очистки вируса выбирают чашку с небольшим числом
хорошо отделенных друг от друга бляшек. Выбранные бляшки
извлекают стерильной пастеровской пипеткой; при этом захва-
тывается и столбик агара вместе с некоторым числом заражен-
ных клеток. Каждую бляшку суспендируют в 50—100 мкл
стерильного раствора Хэнкса. Эту суспензию можно непосред-
ственно ввести в куриный эмбрион для наращивания вируса.
Можно использовать суспензию и для заражения новой культу-
ры клеток и получения бляшек (очистка из бляшки в бляшку).
Затем после требуемого числа пассажей из бляшки в бляшку
вирус опять-таки наращивают на куриных эмбрионах. Обычно
для удовлетворительной очистки вируса требуется 3 пассажа из
бляшки в бляшку. Вирус, очищенный из бляшки и размножен-
ный в куриных эмбрионах (1-й эмбриональный пассаж), затем
используют для получения заготовок вируса (см. разд. 6).
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа
181
3.5. Электронная микроскопия вирусов гриппа
В предыдущих разделах настоящей главы рассмотрены ме-
‘ тоды определения количества вируса, основанные на его биоло-
' гических свойствах: способности размножаться в культуре кле-
ток и куриных эмбрионах, а также агглютинировать эритроци-
' ты. Очевидно, что эти методы не пригодны для определения
числа физических частиц вируса. Соотношение между единица-
I ми гемагглютинации или инфекционности и числом вирусных
частиц в очень большой степени зависит от штамма вируса,
* и поэтому часто возникает необходимость определения числа
* вирусных частиц с помощью электронной микроскопии. Наибо-
лее распространенный метод подсчета вирусных частиц состоит
’ в том, что образец исследуемого вируса смешивают с равным
? объемом суспензии шариков латекса с известной концентра-
цией; эти шарики имеют примерно такой же диаметр (около
• 100 нм), что и вирионы вируса гриппа. Полученную смесь после
негативного контрастирования (например, фосфорно-вольфра-
f мовой кислотой) наносят на сеточки для электронной микроско-
пии и сравнивают число шариков латекса и вирусных частиц в
одних и тех же полях (рис. 6.4). Зная концентрацию шариков
I латекса в исходной смеси, нетрудно подсчитать концентрацию
вирусных частиц [15].
4. Очистка вирусов гриппа
4.1. Введение
Разработаны многочисленные методы очистки вирусов грип-
па из аллантоисной жидкости или из культуральной среды. Вы-
бор конкретного метода определяется требуемой степенью чисто-
ты. Чистоту полученного вируса можно установить с помощью
электрофореза вирионных белков в полиакриламидном геле
(рис. 6.5), но, как и в случае всех оболочечных вирусов, поч-
кующихся через плазматическую мембрану, даже при самой
тщательной очистке невозможно избежать контаминации виру-
са клеточными белками. Кроме того, вирус может быть плео-
морфным, что осложняет его очистку центрифугированием в гра-
диентах плотности. Тем не менее при работе с вирусами, даю-
щими высокий титр в культуре клеток или куриных эмбрионах,
удается получить препараты, степень контаминации которых
клеточными белками незначительна. На первой стадии очистки
из содержащей вирус аллантоисной жидкости или культураль-
ной среды удаляют клеточный дебрис с помощью низкоскоро-
стного центрифугирования (10 мин при 2000—10 000 g). Все
стадии следует проводить при 0°С, чтобы свести к минимуму
потери инфекционности и протеолиз вирионных белков.
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа
183
4.2. Концентрирование вируса
Поскольку вирус гриппа обычно содержится в большом
объеме аллантоисной жидкости или культуральной среды,
перед очисткой его необходимо сконцентрировать. Существуют
различные методы концентрирования вирусов, и выбор одного
из них определяется оснащенностью лаборатории.
4.2.1. Центрифугирование
Поскольку обычно работа ведется с большими объемами
жидкости (более I л), для ультрацентрифугирования необ-
ходимо иметь роторы большой емкости. Существуют роторы
емкостью 1—2 л, в которых можно осадить вирус гриппа
при 50 000 g в течение 90 мин; при работе с не-
большими объемами радиоактивно меченного
вируса время центрифугирования можно сокра-
тить до 30 мин и проводить осаждение в роторе
меньшей емкости при 200 000 g. Супернатант по
возможности полностью удаляют и ресуспенди-
руют осадок вируса в малом объеме буфера
NTE с помощью шприца и иглы с широким про-
светом (тип 19G). Для разрушения вирусных
агрегатов полученную супензию пропускают
несколько раз через тонкую иглу (25G) или
обрабатывают ультразвуком 1 мин. Объем NTE,
в котором ресуспендируют осадок вируса, зави-
сит от величины осадка и от того, какой объем
можно использовать на последующих стадиях
очистки. Обычно осадок из 1—2 л содержащей
вирус жидкости ресуспендируют в 2—5 мл
NTE.
4.2.2. Осаждение полиэтиленгликолем
Осаждение ПЭГ широко используется для
получения вируса из аллантоисной жидкости и
культуральной среды при отсутствии подходя-
щего ротора для ультрацентрифугирования. Су-
хой ПЭГ 6000 добавляют к содержащей вирус
жидкости до конечной концентрации 8% (вес
на объем) и перемешивают суспензию 1 ч при
0° или 4 °C. Затем вирус осаждают центрифуги-
рованием 20 мин при 10 000 g и ресуспендируют
в небольшом объеме NTE. Ресуспендирование
Рис. 6.5. Электрофорез структурных белков очищенных
вирионов вируса гриппа А в полиакриламидном геле. Вирус
чумы птиц (штамм Добсон) был очищен зональным цен-
трифугированием, как описано в разд. 4.3.3. Белки анализи-
.иом птпшггшпдмппипм ГРЛЙ
184
Глава 6
осадка при этом затруднено, поскольку он представляет собой
желеобразную массу. Наиболее удобно ресуспендировать оса-
док в гомогенизаторе, а затем либо обработать ультразвуком,
либо пропустить через тонкую иглу (25G). Перед дальнейшей
очисткой любые крупные частицы, которые не удается ресус-
пендировать, следует удалить центрифугированием при 10 000 g
в течение 10 мин.
4.2.3. Механическое концентрирование
В продаже имеются разнообразные приспособления для кон-
центрирования, позволяющие быстро уменьшить объем содер-
жащей вирус жидкости с 1—2 л до 50—100 мл. Использование
таких приспособлений выгодно, поскольку при этом не возника-
ет проблем, связанных с ресуспендированием вирусного осадка.
Однако получаемые при этом конечные объемы все же велики
для дальнейшей очистки некоторыми из рассматриваемых ниже
методов.
4.2.4. Адсорбция на эритроцитах
В основе этого исключительно простого и быстрого метода
концентрирования вируса гриппа лежит его способность связы-
ваться с поверхностью эритроцитов (см. разд. 3.1), что можно
использовать как одностадийный метод очистки вируса (см.
разд. 4.3.4).
4.3. Методы очистки вирусов гриппа
Ниже приведено несколько методов очистки вируса после
концентрирования. Выбор метода определяется наличием соот-
ветствующего оборудования и необходимой степенью конечной
очистки.
4.3.1. Осаждение на сахарозную подушку
Этот быстрый одностадийный метод используют при работе
с малыми объемами содержащей вирус жидкости, например
в случае радиоактивно меченного вируса. Его можно исполь-
зовать и для предварительной очистки вируса, сконцентриро-
ваванного из большого объема жидкости. Содержащую вирус
жидкость, например культуральную среду, наносят на ступен-
чатый градиент, состоящий из 5 мл 15%-ного раствора сахаро-
зы в NTE (верхний слой) и 5 мл 60%-ного раствора сахарозы
(нижний слой, или подушка). Градиент центрифугируют 30 мин
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа 185
при 200 000 g. Вирус собирается в интерфазе между двумя слоя-
ми раствора сахарозы. Интерфазу извлекают, разводят NTE
в 4 раза и затем осаждают вирус (см. разд. 4.2.1).
4.3.2. Хроматография на микропористом стекле
Данный метод позволяет быстро очистить вирус гриппа пос-
ле концентрирования [16].
1. Колонку подходящих размеров заполняют стеклянными
шариками с фиксированным размером пор (CPG 700—120, Sig-
ma Chemical Company). Средний диаметр пор 72,9 нм, а раз-
мер частиц 125—177 мкм (80—100 меш). При хроматографии
на таком стекле частицы размером более 70 нм элюируются в
свободном объеме (средний диаметр вирионов вируса гриппа
около 100 нм); таким образом достигается эффективное отде-
ление вирусных частиц от клеточных контаминантов меньшего
размера. Для хорошего разделения при объеме образца 5 мл
необходимо использовать колонку диаметром 0,9 см и высотой
по крайней мере 100 см. Для разделения образцов больших
объемов (20—50 мл) используют колонки размером 2,5ХЮ0см.
2. Перед заполнением колонки стекло 3 раза промывают
дистиллированной водой и 2 раза буфером для хроматогра-
фии. Чтобы обеспечить равномерное заполнение колонки, при
ее набивке следует непрерывно перемешивать слой стекла.
Удобно поместить штатив с колонкой на круговой шейкер и за-
полнять ее через широкую воронку.
3. Для набивки колонки ее на 4/5 объема заполняют NTE
и удаляют пузырьки воздуха. Затем открывают выходной вен-
тиль колонки и медленно через воронку заполняют ее суспен-
зией стеклянных шариков. После заполнения выходной вентиль
закрывают и дают стеклу осесть при вращении кругового шей-
кера, на котором расположена колонка. После оседания стекла
колонку переносят в холодную комнату и уравновешивают NTE.
4. При хроматографии раствор пропускают через колонку
с помощью перистальтического насоса. Скорость тока жидко-
сти составляет 1—5 мл/мин в зависимости от размеров колонки.
5. Элюцию вируса контролируют с помощью спектрофото-
метра с проточной кюветой.
6. Собирают фракции объемом 2—10 мл в зависимости от
размеров колонки. Вирус элюируется в свободном объеме и лег-
ко может быть идентифицирован по гемагглютинирующей ак-
тивности. Вирус должен давать острый пик, хорошо отделен-
ный от клеточных контаминантов. Вирус разводят в нужном
объеме NTE и концентрируют центрифугированием; выход ге-
магглютинирующей активности в осадке при этом составля-
ет 70—90%.
186
Глава 6
Заполненную стеклом колонку можно использовать неодно-
кратно, каждый раз после хроматографии промывая ее NTE.
После нескольких циклов очистки вируса стекло извлекают из
колонки и перед дальнейшим использованием промывают кис-
лотой.
4.3.3. Очистка вируса центрифугированием
в градиенте плотности
При очистке этим методом сконцентрированный вирус сна-
чала подвергают зональному центрифугированию в 15—
60 %-ном (вес на объем) градиенте концентрации сахарозы
в NTE.
1. В зависимости от объема вирусного препарата использу-
ют градиенты объемом 10 или 30 мл.
2. Градиенты центрифугируют 1 ч при 110 000 g и 4 °C. Если
количество вируса велико, его можно обнаружить визуально
как белую диффузную зону, расположенную примерно посере-
дине градиента.
3. Зону вируса извлекают из градиента с помощью иглы
для инъекций, имеющей загнутый под прямым углом конец.
Если количество вируса невелико, вирусную зону можно лока-
лизовать, освещая пробирку сверху на черном фоне. В этом слу-
чае положение зоны вируса отмечают снаружи на стенке про-
бирки, а затем, уже не освещая пробирку, отбирают эту зону
градиента. Альтернативный подход состоит в том, что раскапы-
вают весь градиент и затем определяют гемагглютинирующую
активность в индивидуальных фракциях.
4. Дальнейшую очистку вируса проводят повторным центри-
фугированием в градиенте. Применяют либо зональное центри-
фугирование в 15—60%-ном градиенте концентрации сахарозы,
либо, предпочтительно, изопикническое центрифугирование в
20—45%-ном (вес на объем) градиенте плотности тартрата
калия.
5. Перед вторым центрифугированием в градиенте плотно-
сти тартрата калия вирус либо разводят в равном объеме NTE,
либо предварительно переосаждают центрифугированием 30 мин
при 200000 g и 4 °C и затем уже разводят в небольшом объе-
ме NTE.
6. Градиенты тартрата калия центрифугируют по крайней
мере 5 ч при 100 000 g; как правило, наиболее удобно прово-
дить центрифугирование в течение ночи.
7. Зону вируса извлекают из градиента, как описано выше,
разводят в 6 раз и осаждают вирус центрифугированием 30 мии
при 100 000 g и 4 °C.
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа
187
8. Осадок вируса суспендируют в буферном растворе, ис-
пользуемом для хранения препаратов (см. разд. 6).
4.3.4. Адсорбция вируса на эритроцитах
Вирус можно сконцентрировать из осветленной аллантоисной
жидкости или культуральной среды, добавляя формалинизиро-
ванные эритроциты до конечной концентрации 5% (объем на
объем). Суспензию, содержащую эритроциты и вирус, инкуби-
руют 1 ч при 4 °C при осторожном перемешивании. После этого
эритроциты с адсорбированным на них вирусом осаждают цент-
рифугированием 10 мин при 2000 g и 2 раза промывают осадок
охлажденным до 0°С физиологическим раствором. Эффектив-
ность адсорбции можно проконтролировать в реакции гемагглю-
тинации с содержащей вирус жидкостью до и после адсорбции
на эритроцитах. Если эффективность адсорбции ниже 90%,
процедуру можно повторить с новой порцией эритроцитов. Ад-
сорбированный вирус элюируют с эритроцитов, перемешивая
суспензию в 10 мл физиологического раствора 30 мин при 37 °C.
Затем эритроциты удаляют центрифугированием 10 мин при
2000 g и собирают супернатант, содержащий вирус. Эффектив-
ность элюции зависит от активности вирусной нейраминидазы,
отщепляющей остатки сиаловой кислоты от клеточных рецеп-
торов, что приводит к высвобождению вируса. Супернатант раз-
водят NTE по крайней мере в 6 раз, вирус осаждают центри-
фугированием 30 мин при 200 000 g и 4 °C, а затем ресуспен-
дируют в подходящем буфере для хранения.
Приготовление формалинизированных эритроцитов
1. Кровь фильтруют через 2 слоя муслина и осаждают клет-
ки в настольной центрифуге 10 мин при 2000 об/мин.
2. Супернатант и состоящий из лейкоцитов верхний слой
осадка отбрасывают, а осадок эритроцитов 3 раза промывают
PBS в объеме, примерно равном исходному объему крови. По
окончании промывки суспензию центрифугируют 20 мин, чтобы
получить плотный осадок.
3. Осадок ресуспендируют в PBS из расчета 200 мл буфер-
ного раствора на 25 см3 осадка и переносят суспензию в боль-
шой мерный цилиндр.
4. 50 мл 38%-ного формальдегида, pH которого предвари-
тельно доведен до 5,5—6,0, заливают в диализную трубку и по-
мещают последнюю в цилиндр с суспензией эритроцитов. Сус-
пензию эритроцитов осторожно, избегая образования пены,
перемешивают на магнитной мешалке 3 ч при комнатной темпе-
ратуре. При этом происходит медленная диффузия формалина
в суспензию эритроцитов.
188
Глава б
5. Через 3 ч в диализной трубке проделывают отверстие, что-
бы формалин смешался с суспензией эритроцитов, и продолжа-
ют перемешивание еще 12 ч.
6. Клеточную суспензию фильтруют через муслин, 5 раз
промывают осадок PBS. Для суспендирования клеток следует
использовать стеклянную палочку.
7. Осадок эритроцитов ресуспендируют в равном объеме
0,2 М трис-глицинового буфера (pH 8,3) и инкубируют суспен-
зию 2 ч при 37 °C, затем добавляют сухой боргидрид натрия
до концентрации 1 мМ (0,038 г/л).
8. Клетки осаждают при 2000 об/мин и по крайней мере
дважды промывают PBS.
9. Эритроциты ресуспендируют в равном объеме PBS. По-
лученную 50%-ную суспензию эритроцитов хранят при 4°C, до-
бавляя 0,01%-ный азид натрия. Такую суспензию можно хра-
нить долгое время.
10. Перед использованием нужное количество эритроцитов
отмывают трис-глициновым буферным раствором.
5. Определение активности вирионных ферментов
5.1. Вирионная транскриптаза
5.1.1. Введение
Геном вируса гриппа представлен РНК негативной поляр-
ности, т. е. для синтеза вирусных белков вирионная РНК долж-
на транскрибироваться с образованием мРНК. Этот процесс
осуществляется вирионной РНК-зависимой РНК-полимеразой.
Вирионная РНК-полимераза способна in vitro транскрибировать
геномную РНК с образованием мРНК нормального размера,
синтез которых терминируется в нужной точке, и затем проис-
ходит их полиаденилирование. Активность фермента возрастает
при внесении в реакционную смесь специфических динуклеоти-
дов [17] или кэпированных мРНК, например глобиновой [18],
функционирующих как затравка при синтезе вирусных мРНК.
При добавлении кэпированных мРНК к бесклеточной системе
транскрипции наблюдается перенос 10—14 б'-концевых нуклео-
тидов этих РНК вместе с кэпом на 5'-конец вирусных транс-
криптов [19]; этот механизм реализуется и при синтезе мРНК
вируса гриппа в зараженной клетке [20, 21].
5.1.2. Бесклеточная система транскрипции
Активность вирионной транскриптазы в составе очищенного
вируса гриппа можно обнаружить, добавляя к вирионам подхо-
дящий буфер, рибонуклеозидтрифосфаты, двухвалентные катио-
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа 189
ны и детергент для пермеабилизации оболочки вириона. Стан-
дартная реакционная смесь (100 мкл) имеет следующий состав:
Трис-НС1, pH 8,2 — 50 мМ
КС1 — 150 мМ
MgCh — 8 мМ
Дитиотреитол — 5 мМ
NP-40 —0,5%
АТР — 2,0 мМ
GTP — 0,2 мМ
СТР —0,4 мМ
[3H]-UTP —0,4 мМ
Очищенный вирус — 0,5—1,0 мг/мл
1. Реакционную смесь готовят при 0°С, а затем инкубиру-
ют пробирки при 31 °C (температура, оптимальная для транс-
крипции).
2. Если используется затравка, ее преинкубируют 10 мин со
всеми компонентами реакционной смеси, кроме MgCb; затем
инициируют транскрипцию, добавляя MgCh-
3. Для исследования кинетики синтеза РНК из реакцион-
ной смеси через определенные промежутки времени отбирают
аликвоты объемом 10 мкл и смешивают с 20 мкл 1н. хлорной
кислоты, содержащей 0,125 М пирофосфата натрия.
4. К пробам добавляют по 10 мкг ДНК тимуса теленка и ин-
кубируют их 10 мин при 0 °C.
5. Осадок РНК собирают на фильтры из стекловолокна
(Whatman GF/С) и промывают их 0,88 М. НС1 и 0,125 М пиро-
фосфатом натрия, а затем этанолом и высушивают.
6. Радиоактивность определяют в толуоловом сцинтилляторе
на жидкостном сцинтилляционном счетчике.
Скорость реакции зависит от исследуемого вируса, а также
от того, включаются в состав реакционной смеси специфиче-
ские динуклеотиды или кэпированная мРНК. Типичные кинети-
ческие кривые транскрипции в присутствии и в отсутствие за-
травки приведены на рис. 6.6.
5.2. Нейраминидаза
5.2.1. Введение
Вирионы вируса гриппа помимо гемагглютинина содержат
фермент нейраминидазу. Молекулы нейраминидазы образуют
на поверхности оболочки грибовидные выступы; каждый выступ
представляет собой тетрамер полипептидных цепей. Фермент
способен отщеплять от углеводных цепей гликопротеинов кон-
цевые остатки N-ацетилнейраминовой кислоты; по-видимому,,
его функция состоит в том, что он предотвращает агрегацию
190
Глава 6
вирионов в процессе их морфогенеза и выхода из зараженной
клетки. Активность нейраминидазы можно определить, инкуби-
руя очищенные вирионы с соответствующим субстратом, напри-
мер фетуином, который получают из ЭТС [23, 24].
Рис. 6.6. Определение активности вирионной РНК-зависимой РНК-полимеразы
вируса гриппа. РНК-полимеразную активность вирионов, очищенных зональ-
ным центрифугированием (разд. 4.3.3.), определяли в присутствии и в отсут-
ствие затравок. Реакции ставили в объеме 100 мкл, как описано в разд. 5.1.2.
Пробы инкубировали при 31 °C, через указанные интервалы времени отбирали
аликвоты по 10 мкл и определяли кислотонерастворимую радиоактивность.
Из этих данных рассчитывали количество |"3Н] -UTP, включившегося в кислото-
нерастворимый материал. Используемый в качестве затравки ApG добавляли
до концентрации 0,3 мМ, а глобиновую мРНК— до концентрации 100 мкг/мл.
Показано, что для данного вируса (вирус чумы птиц, штамм Росток) это
оптимальные концентрации затравок. 1 — реакция в присутствии затравки;
2 —реакция в присутствии мРНК; 3 —реакция в отсутствие ApG
5.2.2. Определение активности нейраминидазы
Приготовление необходимых реагентов описано в разд. 5.2.3.
1. Подготовка образца вируса. Лучше всего использовать
очищенный вирус, однако следует иметь в виду, что глицерин
и сахароза могут препятствовать определению активности ней-
раминидазы. Нейраминидаза некоторых штаммов вируса гриппа
не активна в присутствии ионов Са2+, в то время как нейрами-
нидаза других штаммов, наоборот, требует присутствия этих
ионов. Можно использовать вируссодержащую аллантоисную
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа 19t
жидкость после удаления низкомолекулярных ингибиторов ней-
раминидазы с помощью диализа.
2. Для построения калибровочной кривой готовят ряд про-
бирок, содержащих от 5 до 40 мкг N-ацетилнейраминовой кис-
лоты (в 0,2 мл 0,2 М фосфатного буфера, pH 6,0).
3. Готовят реакционную смесь в объеме 0,2 мл, содержащую
0,1 мл исследуемого препарата (т. е. вируса или растворителя,
используемого в качестве контроля) и 0,1 мл фетуина (10 мг/мл)
в 0,2 М фосфатном буфере с pH 6,0 (оптимальные значения pH
для разных нейраминидаз варьируют, но при pH 6,0, они, как
правило, активны). Смесь тщательно перемешивают и инкуби-
руют 0,5—2 ч при 35 °C в зависимости от активности фермента.
Температурные оптимумы для нейраминидаз разных штаммов
также варьируют (например, фермент штамма N1 при 37 °C
нестабилен), поэтому следует подобрать оптимальную темпера-
туру для исследуемого фермента экспериментально.
4. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температу-
ры, добавляют 0,1 мл перйодатного реагента, тщательно пере-
мешивают и инкубируют 20 мин при комнатной температуре.
5. К смеси добавляют 1,0 мл арсенитного реагента и пере-
мешивают до тех пор, пока выпавший в осадок иод не раство-
рится вновь.
6. К смеси добавляют 2,5 мл тиобарбитуратного реагента,
перемешивают и помещают на 15 мин в кипящую водяную ба-
ню. При этом смесь становится темно-розовой, но при охлаж-
дении бледнеет.
7. К смеси добавляют 4 мл бутанолового реагента (N-бута-
нол, содержащий 5% по объему концентрированной НС1) и ин-
тенсивно встряхивают, чтобы экстрагировать окрашенное веще-
ство. Пробирки центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин в на-
стольной центрифуге при комнатной температуре, отбирают
водную (нижнюю) фазу и определяют на спектрофотометре
величину поглощения при длине волны 549 нм с соответствую-
щим контролем. Оптимальное поглощение составляет около 0,6
оптической единицы; полученный результат сопоставляют с ка-
либровочной кривой.
5.2.3. Реагенты для определения нейраминидазной активности
Перйодатный реагент:
перйодат натрия — 4,28 г
ортофосфорная кислота — 62 мл
Н2О — 38 мл
Перйодат растворяют в воде, затем добавляют кислоту. Реак-
тив хранят в посуде из темного стекла в прохладном (но не при
4 °C) темном месте; реактив стабилен.
192
Глава 6
Арсенитный реагент:
арсенит натрия—10,00 г
сульфат натрия (безводный) —7,10 г
Н2О — 100 мл
концентрированная H2SO4 — 0,28 мл
Реактив фильтруют через бумагу Whatman № 1. Реагент ста-
билен.
Тиобарбитуратный реагент:
тиобарбитуровая кислота— 1,2 г
сульфат натрия (безводный) — 14,2 г
НгО — 200 мл
Компоненты растворяют на кипящей водяной бане. При хране-
нии образуется осадок.
5.3. Слияние вирусной и клеточной мембран
5.3.1. Введение
Гемагглютинин вируса гриппа обеспечивает связывание ви-
рионов клеточными рецепторами и слияние вирусной и клеточ-
ной мембран. Последняя активность гемагглютинина проявля-
ется только в кислой среде. Связанный вирус проникает внутрь
клетки (интернализуется) в составе мембранных пузырьков; за-
тем вирус обнаруживается в более крупных эндосомах и, нако-
нец, в лизосомах, внутренняя среда которых является кислой,
что необходимо для инициации процесса слияния [25]. Точный
механизм слияния вирусных и клеточных мембран остается не-
ясным, однако показано, что для этого необходимо расщепле-
ние молекулы гемагглютинина на ГА1 и ГА2, N-концевая ами-
нокислотная последовательность ГА2 чрезвычайно консерватив-
на у разных вирусов и очень гидрофобна. Предполагается, что
при pH, близких к нейтральному, этот участок молекулы на-
правлен внутрь глобулы. В кислой среде ГА2 претерпевает рез-
кие конформационные изменения; предполагается, что при этом
N-концевой участок ГА2 оказывается экспонированным на по-
верхности глобулы, и инициирует слияние мембран [26]. Эту
активность вируса можно исследовать in vitro в реакции рН-за-
висимого гемолиза [27, 28].
5.3.2. Реакция гемолиза
1. Готовят ряд центрифужных пробирок, содержащих по
20 мкл содержащей вирус аллантоисной жидкости (примерно
1000 ГАЕ/мл) и 400 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов.
Вместо аллантоисной жидкости можно использовать очищен-
ный вирус. Пробирки инкубируют 30 мин при 0 °C; за это вре-
мя происходит связывание вируса с эритроцитами.
Выращивание^ очистка и титрование вирусов гриппа 193
2. По окончании инкубации в пробирки вносят по 40 мкл
0,4 М буферного раствора (pH 5,2—6,2; см. ниже) и продолжа-
ют инкубацию 20—30 мин при 37 °C, периодически перемеши-
вая.
3. Клетки осаждают 10 мин при 2000 g или 30 с при 10 000 g
(в микроцентрифуге) и измеряют поглощение при 540 нм про-
тив воды в качестве контроля. По поглощению можно опреде-
лить значение pH, при котором происходит 50%-ный гемолиз,
и сравнить графики зависимости полноты гемолиза от pH для
разных штаммов вируса гриппа.
При постановке реакции следует ступенчато варьировать pH
по 0,2 единицы и для каждого значения pH ставить по 2 парал-
лельные пробы; следует определить и уровень гемолиза в от-
сутствие вируса, используя в качестве контроля незараженную
аллантоисную жидкость. Для постановки данной реакции можно
использовать эритроциты человека (тип (0,Rh—) или морской
свинки, но не курицы. Удобно ставить реакцию в пробирках для
микроцентрифуги. Выбор буферного раствора определяется тем,
в какой области pH проводится реакция (однако буфер должен
поддерживать pH в пределах 5,2—6,2). Наиболее удобны
2-(п-морфилино)этансульфоновая кислота (MES) и ее соль.
6. Хранение вирусных препаратов
Вирус гриппа следует хранить в концентрированном виде,
поскольку разбавленный вирус нестабилен. При 4 °C инфекцион-
ность вируса сохраняется не более 1 нед. Для длительного хра-
нения содержащую вирус аллантоисную жидкость или куль-
туральную среду разливают порциями по небольшим сосудам
и быстро замораживают с помощью метанола и сухого льда.
Такое мгновенное замораживание практически не влияет на ин-
фекционность. В лиофилизированном виде вирус легко транс-
портировать и можно хранить длительное время при комнат-
ной температуре. Очищенный вирус, предназначенный для био-
химического анализа, можно хранить при —20 °C около 6 мес
без заметной потери ферментативных активностей. В этом слу-
чае для хранения вируса используют буферный раствор, содер-
жащий 60% глицерина, 100мМ NaCl, 10мМ трис-НС1, pH7,4;
концентрация вируса должна составлять примерно 5 мг/мл.
В этом буфере вирус можно хранить до 2 нед при 4 °C. В жид-
ком азоте очищенный вирус хранится неопределенно долго.
При выделении нового изолята или при очистке вируса из
бляшки для максимального снижения риска возникновения ге-
нетических вариантов при многократном пассировании следует
придерживаться следующих рекомендаций.
13-369
194
Глава 6
1. Исходный изолят наращивают в оплодотворенных кури-
ных эмбрионах, получая первичную заготовку («первый эмб-
риональный пассаж») в виде аллантоисной жидкости. Эту «пер-
вичную заготовку» рекомендуется разделить на небольшие
порции и хранить в разных холодильниках на случай повреж-
дения одного из них.
2. «Первичную заготовку» вновь пассируют через куриные
эмбрионы, получая «вторичную заготовку» (второй эмбриональ-
ный пассаж); эту «вторичную заготовку» опять делят на порции
и хранят при —70 °C.
3. Вирус из «вторичной заготовки» вновь пассируют на эм-
брионах, получая при этом «рабочую заготовку» (третий эмб-
риональный пассаж), используемую для дальнейшей работы.
Учитывая изложенные рекомендации, можно иметь практи-
чески неограниченное количество вируса, отделенного от перво-
начального изолята одним и тем же небольшим числом пасса-
жей. Если при пассировании на эмбрионах в результате мута-
ций возникают генетические варианты, всегда есть возможность
вернуться к «первичной заготовке» вируса, что особенно важно
при работе с мутантами, поскольку не всегда удается избежать
их контаминации вирусом дикого типа.
7. Радиоактивное мечение вируса
7.1. Введение метки в РНК
Введение радиоактивной метки в вирусную РНК наиболее
эффективно при наращивании вируса в культуре клеток; в ка-
честве метки используют [32Р]-ортофосфат или [3Н]-уридин.
Можно пометить вирусную РНК [32Р]-ортофосфатом и при
культивировании вируса во фрагментах куриных эмбрионов,
хотя в этом случае метка включается хуже.
1. Чтобы пометить вирус в культуре с помощью 32Р, необ-
ходимо истощить запас фосфата в клетках, инкубируя их в те-
чение ночи в среде, не содержащей фосфатов и сыворотки.
В состав среды должны входить гидролизат лактальбумина
и глюкоза (конечная концентрация 0,05%).
2. Клетки заражают вирусом по стандартной методике, но
для промывания клеток и разведения вируса вместо PBS ис-
пользуют физиологический раствор (0,9% NaCl).
3. После адсорбции вируса к культуре добавляют не содер-
жащую фосфатов среду (примерно 10 мл на чашку диаметром
15 см) и 0,5 мКи/мл [32Р]-ортофосфата.
4. Через 24 ч после заражения среду, содержащую меченый
вирус, собирают и проводят очистку вируса одним из описан-
ных методов (см. разд. 4).
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа
195
Чтобы пометить вирусную РНК [3Н]-уридином, клетки ин-
кубируют в течение ночи со средой без сыворотки, заражают по
стандартной методике, затем добавляют 0,1 мКи/мл [3Н]-ури-
дина в той же среде. Содержащую вирус среду собирают через
24 ч после заражения. Если в используемых клетках вирус раз-
множается до высокого титра, то при очистке градиентным
центрифугированием вирус, полученный, например, с одной
чашки диаметром 10 см, в градиенте объемом 12 мл должен
образовать видимую простым глазом зону. Если же выход ви-
руса низок, в параллельном градиенте центрифугируют боль-
шее количество немеченого вируса и отбирают из градиента,
содержащего радиоактивный материал, соответствующие фрак-
ции. Иногда раскапывают весь градиент и определяют радиоак-
тивность в каждой фракции.
Если необходимо получить меченые вирусоспецифические
РНК из зараженных клеток (а не из вирионов), заражение
клеток и внесение метки осуществляют, как описано выше, и
затем на нужном сроке инфекции из зараженных клеток выде-
ляют РНК. Для разделения сегментов РНК вируса гриппа
удобно использовать 6%-ный полиакриламидный гель с 6 М мо-
чевиной, приготовленный на буфере ТВЕ {30]. В этой системе 3
больших сегмента генома (1—3) комигрируют (см. рис. 6.7).
Для их разделения используют систему электрофореза в геле
с низкой концентрацией акриламида, описанную Ленингом [31].
7.2. Введение метки в белки
Лучший радиоактивный предшественник для введения метки
в белки вируса гриппа — [355]-метионин. Если необходимо полу-
чить меченые вирионы, клетки перед заражением следует в те-
чение ночи инкубировать в среде без метионина, чтобы обеспе-
чить максимально эффективное включение метки. После зара-
жения к клеткам добавляют среду, содержащую 200 мкКи/мл
[355]-метионина, и через 24 ч после заражения собирают мече-
ный вирус.
Однако чаще возникает необходимость в исследовании син-
теза вирусных белков в зараженных клетках, например для
анализа динамики размножения вируса или действия ингибито-
ров репликации. В этом случае нет необходимости в предвари-
тельном истощении внутриклеточного фонда метионина. Клетки
заражают по стандартной методике; через нужный срок среду
удаляют, 2 раза промывают клетки PBS и вносят среду, содер-
жащую 10—20 мкКи/мл [355]-метионина. Обычно для эффектив-
ного мечения всех вирусоспецифических белков достаточно
30 мин инкубации с радиоактивным предшественником. Однако
за это время происходит и протеолитическое расщепление ГА
13*
Кодируемый
БРЛ&К
РЗ
Гемагглютинин (ГА)
Нуклеопротеин(ни)
вИВ|1яИ111ЯМ|
ИМЯ11И1В11вааЯ|и
Неструктурные белки
(N51 и HS?)
iaiiiii
Рис. 6.7. Электрофорез вирусных РНК и белков, меченных радиоактивной мет-
кой, как описано в разд. 7. а—вирус метили [32Р]-ортофосфатом в течение
24 ч и из очищенных вирионов экстрагировали РНК; б — ФЭК метили
[MS]-метионином в течение 30 мин на разных сроках после заражения виру-
сом чумы птиц (штамм 34/Росток). Клетки разрушали кипячением в содержа-
щем ДДС-Na буфере для нанесения проб и анализировали белки электрофо-
резом в 15%-ном полиакриламидном геле. К — белки из незараженных клеток.
Цифры под остальными дорожками обозначают время (в часах) после зара-
жения, когда вносили [35S]-метионин
Выращивание^ очистка и титрование вирусов гриппа
197
с образованием ГА1 и ГА2. Если это нежелательно, мечение
проводят в течение меньшего времени (5—10 мин) и концентра-
цию [355]-метионина соответственно повышают. При кратковре-
менном мечении (менее 30 мин) рекомендуется добавлять ка-
кой-либо сильный буфер (например, HEPES, pH 7,5, до кон-
центрации 20 мМ), поскольку за это время содержащаяся в сре-
де бикарбонатная буферная система не обеспечивает установле-
ния pH 7,5.
Затраты дорогостоящего [355]-метионина можно свести к ми-
нимуму, если выращивать культуру для мечения белков в план-
шетах с 24 или 96 лунками. В такой лунке для введения метки
в вирусные белки достаточно всего 50 или 100 мкл меченой
среды; с использованием небольшого количества [355]-метиони-
на удается поставить одновременно многочисленные экспери-
менты по мечению вирусных белков.
Через определенное время после введения метки зараженные
клетки промывают физиологическим раствором, снимают с по-
верхности культурального сосуда стерильной резиновой палоч-
кой или струей физиологического раствора и осаждают 5 мин
при 2000 g или при 10 000 g (в микроцентрифуге) 30 с. Если
меченые белки необходимо разделить электрофорезом в поли-
акриламидном геле в присутствии ДДС-Na (см. рис. 6.7), оса-
док ресуспендируют в буфере для нанесения образцов, объем
которого равен исходному объему культуральной среды. Аль-
тернативный, упрощенный метод обработки зараженных клеток
состоит в том, что буфер для нанесения образцов добавляют
непосредственно к клеточному монослою (не менее 200 мкл рас-
твора на 106 клеток) и далее извлекают лизат из культураль-
ного сосуда. Если лизат оказывается очень вязким из-за высо-
кой концентрации ДНК, его обрабатывают ультразвуком или
пропускают через тонкую иглу для инъекций. Все вирусоспеци-
фические белки хорошо разделяются в содержащих ДДС-Na
15—17,5%-ных полиакриламидных гелях с помощью диск-элек-
трофореза Лэммли [32].
8. Среды и буферные растворы
8.1. Среды для культуры клеток ФЭК
Стандартные среды и среды, не содержащие какого-либо
компонента, поставляются многими фирмами. В лаборатории
авторов используются среды фирмы Biocult Ltd. (Пейсли, Шот-
ландия).
Ростовая среда:
К среде 199 поставляемой в виде 10-кратного концентрата)
добавляют 10% (объем на объем) сыворотки новорож-
198
Глава 6
денных телят, 1% (весна объем) пенициллина (100ед/мл),
0,01% (вес на объем) стрептомицина, 0,02% (вес на объ-
ем) канамицина, 0,00025% (вес на объем) фунгизона
и 0,06% бикарбоната натрия. Среду доводят до нуж-
ного объема стерильной, дважды дистиллированной
водой.
Поддерживающая среда:
Среда для размножения вируса в культуре клеток ФЭК
готовится так же, как среда для выращивания клеток, но
с 2% (объем на объем) сыворотки.
Среда, не содержащая фосфатов:
В среду без фосфатов добавляют 0,5% (объем на объем)
глюкозы, 0,5% (вес на объем) гидролизата лактальбуми-
на, 2 мМ глутамина и антибиотики, как описано выше, но
не добавляют сыворотки.
Среда без метионина:
В эту среду добавляют глютамин и антибиотики, как
описано выше, а в качестве буфера — HEPES (pH 7,4) до
концентрации 20 мМ.
Среда с КМЦ:
Для приготовления раствора КМЦ 16 г порошка КМЦ
(натриевая соль с низкой вязкостью) размешивают в
300 мл PBS, инкубируют в течение ночи при 4 °C, добав-
ляют еще 200 мл PBS и 20 мин автоклавируют. 50 мл по-
лученного раствора смешивают с 200 мл среды для по-
крытия.
8.2. Буферные растворы
PBS:
Раствор готовят путем растворения имеющихся в продаже
готовых таблеток (таблетки Дюльбекко, тип А, фирма
Oxoid Ltd.) в нужном объеме дважды дистиллированной
воды. После растворения таблеток раствор автоклавируют.
Конечные концентрации солей в растворе следующие:
0,137 М NaCl, 0,027 М КС1, 0,032 М Na2HPO4, 0,015 М
КН2РО4 (pH 7,3).
Физиологический раствор:
0,9% (вес на объем) NaCl.
Буфер NTE:
100 мМ NaCl, 10 мМ трис-НС1 (pH 7,5), 1 мМ ЭДТА.
Солевой раствор Хенкса:
NaCl — 0,8 г
КС1 — 0,4 г
MgSO4-7H2O —0,2 г
СаС12-2Н2О —0,185 г
Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа 199
Na2HPCU (безводный)—0,0475 г
КН2РО4—0,06 г
NaHCO3 —0,35 г
Глюкоза — 1,0 г
Феноловый красный — 0,017 г
Н2О —до 1 л
MgSO4, СаС12, КН2РО4 и Na2HPO4 растворяют отдельно (каж-
дую соль примерно в 100 мл дистиллированной воды) и мед-
ленно, при непрерывном перемешивании добавляют к основно-
му раствору. Феноловый красный добавляют последним, после
этого раствор доводят до нужного объема, делят на порции и
автоклавируют.
9. Благодарности
Авторы признательны многочисленным коллегам по Отделу
вирусологии за множество ценных советов, полученных при на-
писании настоящей главы. В особенности мы благодарим д-ра
К- Р. Пенна за предоставление материала для рисунков 5 и 6,
м-ра Р. К. Паттерсона из Ветеринарной школы Кембриджского
университета за подготовку электронных микрофотографий и
д-ра Ф. Томли за конструктивную критику при прочтении ру-
кописи.
Литература
1. McCauley J., Mahy В. W. J. (1983). Biochem. J., 211, 281.
2. Sweet C., Smith H. (1980). Microbiol. Rev., 44, 303.
3. Palese P., Kingsbury D. W. (1983). Genetic of Influenza Viruses, published
by Springer-Verlag, Wien/New York.
4. Von Magnus P. (1951). Acta Pathol. Microbiol. Scand., 28, 278.
5. Grist N. R„ Bell E. J., Follett E. A. C., Urguhart G. E. D. (1979). Diagnostic
Methods in Clinical Virology, published by Blackwell Scientific Publica-
tions.
6. Kilbourne E. D. (1983). In: Genetics of Influenza Viruses, Springer-Verlag,
Wien/New York, p. 1.
7. Lazarowitz S. G.. Choppin P. IF. (1975). Virology, 68, 440.
8. Klenk H.-D., Rott R., Orlich M., Blodorn J. (1975). Virology, 68, 426.
9. Appleyard G„ Maber H. B. (1974). J. Gen. Virol., 25, 351.
10. Bosch F. X., Garten W., Klenk H.-D., Rott R. (1981). Virology, 113, 725.
11. Gething M.-J., White J. M,.Waterfield M. D. (1978). Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 75, 2737.
12. Hoyle L. (1968). The Influenza Viruses, Virology Monographs, published by
Springer-Verlag, Wien/New York.
13. Thompson W. R. (1947). Bacteriol. Rev., 11, 115.
14. Fazekas de St. Groth S., White D. O. (1958). J. Hyg. (Lond.), 56, 535.
15. Williams R. C., Backus R. C. (1949). J. Am. Chem. Soc., 71, 4052.
16. Heyward J. T., Klimas R. A., Stapp M. D., Obijeski J. F. (1977). Arch. Virol.,
55, 108.
17. McGeoch D. J., Kitron. N. K. (1974). Virology, 15, 686.
200
Глава 6
18. Plotch S. Л, Bouloy M„ Krug R. M. (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,
1618. , .
19. Robertson H. D., Dickson E„ Plotch S. J., Krug R. M. (1980). Nucleic Acids
Res 8 925
20. Krug R. М', Broni B. A., Bouloy M. (1979). Cell, 18, 329.
21. Caton A. J., Robertson J. S. <1980). Nucleic Acids Res., 8, 2591.
22. Palese P„ Tobita K, Ueda M., Compans R. IF. (1974). Virology, 61, 397.
23. Warren L. (1959). J. Biol. Chem., 234, 1971.
24. Aminoff D. (1961). Biochem. J., 81, 384.
25. Marsh M. (1984). Biochem. J, 218, 1.
26 Skehel Baley P., Brown E., Martin S.> Waterfield M., White J., Wilson I.,
Wiley D. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 968.
27. Maeda T., Ohnishi S. (1980). FEBS Lett, 122, 283.
28. Huang R. T. C., Rott R., Klenk H.-D. (1981). Virology, 110, 243.
29. Dimmock N. J., Carver A. S., Kennedy S. I. T., Lee M. R., Luscombe S.
(1977). J. Gen. Virol., 36, 503.
30. Peacock A. C., Dingman C. W. (1967). Biochemistry (Wash.), 6, 1818.
31. Loening U. E. (1968). J. Mol. Biol., 38, 355.
32. Laemmli U. K- (1970). Nature, 227, 680.
ГЛАВА 7
ВИРУСЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ДВУНИТЕВУЮ РНК
М. Мак-Кри
1. Классификация вирусов, содержащих двунитевую РНК
Вирусы, геном которых представлен двунитевой (дн) РНК,
исключительно широко распространены в природе; они зара-
жают животных, растения и бактерии. Большинство этих виру-
сов относятся к одному семейству, Reoviridae [1], состоящему
из 6 родов (табл. 7.1). Кроме того, выделено несколько виру-
Таблица 7.1. Классификация вирусов семейства Reoviridae
Род Хозяева Число сегментов генома Представители
Orthoreovirus Позвоночные 10 Реовирусы млекопитающих и птиц
Orbivirus » 10 и 12 Вирус синего языка Вирус африканской болезни лошадей Вирус колорадской клеще- вой лихорадки
Rotavirus Млекопитающие и птицы 11 Ротавирус крупного рогато- го скота SAU Wa
Cypovirus Насекомые 10 Вирус цитоплазматического полиэдроза
Phytoreovirus Растения и насеко- мые 12 Вирус раневых опухолей Вирус карликовости риса
Fijivirus •к». То же 10 Вирус болезни Фиджи Вирус шершавой карликово- сти кукурузы
сов, например вирус комнатной мухи [2] и вирус кеты [3],
которые пока не отнесены к какому-либо роду реовирусов,
однако обладают определенными свойствами, указывающими
на их принадлежность к семейству Reoviridae. С другой сторо-
ны, описано множество вирусов, содержащих днРНК и отлича-
ющихся от известных представителей семейства Reoviridae
настолько, что их принадлежность к этому семейству кажется
маловероятной; из этих вирусов наиболее детально исследова-
201
!02
Глава 7
иы вирус инфекционной болезни бурсы, вирус инфекционного
некроза поджелудочной железы, бактериофаг 0 6 и киллерные
частицы дрожжей. Высказано предложение объединить некото-
рые из этих вирусов в новое семейство Birnaviridae (П. Добос,
личное сообщение).
2. Выделение вирусов и культуры клеток
Реовирусы млекопитающих трех серотипов были выделены
в конце 50-х — начале 60-х годов [4]. Благодаря их способно-
сти эффективно размножаться в самых разнообразных куль-
турах клеток млекопитающих изо всех вирусов семейства
Reoviridae они были исследованы наиболее подробно. Поэтому
большинство методов, используемых при работе с вирусами
других родов, представляют собой модификации процедур,
разработанных для реовирусов млекопитающих. Соответственно
в данной главе основное внимание уделяется методам работы
именно с реовирусами млекопитающих, в особенности с наи-
более изученным реовирусом типа 3, штамм Диринг. Методы
работы с другими днРНК-содержащими вирусами приводятся
только в тех случаях, когда они существенно отличаются
от применяемых к реовирусам.
2.1. Поддержание культур клеток
для наращивания реовирусов
Реовирусы эффективно размножаются в большинстве кле-
точных линий млекопитающих. Принимая во внимание столь
широкий круг хозяев, а также высокую стабильность вирусов,
при работе с реовирусами следует соблюдать особую осторож-
ность, чтобы не допустить случайной контаминации культур.
Чаще всего для размножения реовирусов используют L-клетки
мыши; достоинство этих клеток состоит в том, что при правиль-
ном культивировании их можно легко переводить из монослой-
ной культуры в суспензионную и обратно. Для размножения
вирусов удобнее всего поддерживать суспензионную культуру
L-клеток в стерильных плоскодонных колбах при 37 °C. Для
культивирования клеток используют модифицированную
Иокликом основную минимальную среду, содержащую 5%
ЭТС; высокое содержание фосфатов в этой среде обеспечивает
поддержание нужного значения pH без пропускания СОг. Плот-
ность суспензии должна составлять 5-10s—1 • 106 кл/мл, что
достигается при пересеве клеток из каждой колбы в две новые
один раз в сутки. Если L-клетки поддерживаются в суспензи-
онной культуре в течение длительного времени (более 4—
5 нед), они теряют способность прикрепляться к твердому суб-
Вирусы, содержащие двунитевую РНК 203
страту и образовывать монослой на поверхности пластиковых
культуральных сосудов. Однако ценное свойство L-клеток
расти как в суспензии, так и в монослое можно сохранить,
если примерно раз в месяц переносить клетки из суспензионной
культуры в роллерные флаконы. Флаконы инкубируют в тече-
ние ночи при 37°C, неприкрепившиеся клетки отбрасывают, а
прикрепившиеся к субстрату трипсинизируют и вновь переводят
в суспензионную культуру. Важно отметить, что L-клетки очень
чувствительны к трипсину и при их культивировании в моно-
слое трипсинизацию следует проводить с осторожностью. Если
клетки трипсинизируют для перевода в суспензионную куль-
туру, то перед добавлением свежей культуральной среды
остатки трипсина необходимо удалить, осадив клетки центри-
фугированием. Для культивирования в суспензии клетки следу-
ет разбавить средой до концентрации 1-Ю6 кл/мл и после
6—8-часового периода роста пересевать в отношении 1:2.
2.2. Получение вирусного инокулята
При пассировании реовирусов (как и многих других виру-
сов) с высокой множественностью инфекции наблюдается быст-
рое накопление ДИЧ, существенно снижающих выход вируса.
Поэтому для получения инокулята следует размножать вирус
при исходной множественности инфекции не более 0,1 БОЕ/кл.
Кроме того, реовирус проявляет зависимую от температуры
цитотоксичность [4], наблюдаемую при 37°C и еще более
выраженную при 39 °C. Поэтому размножение вируса лучше
проводить при 34 или даже при 31 °C, чтобы была уверенность
в том, что наблюдаемое ЦПД не обусловлено только цитоток-
сичностью вируса. Для получения инокулята вируса два куль-
туральных флакона площадью 150 см2 с плотным монослоем
L-клеток заражают реовирусом (не более 0,1 БОЕ/кл). Флако-
ны инкубируют при 34 °C до полного проявления ЦПД (2—
4 сут). Большая часть вируса (80—90%) остается связанной с
клеточным дебрисом, поэтому из флаконов извлекают все со-
держимое, титруют на L-клетках и хранят при —70°C. Вируса,
собранного из двух флаконов, достаточно для заражения не-
скольких колб, содержащих по 8 л суспензионной культуры.
2.3. Наращивание вирусов в больших масштабах
Обычно большие количества вируса накапливают в колбах,
содержащих по 4 л суспензионной культуры L-клеток. Для
получения максимального выхода вируса Смитом и др. [5]
предложена следующая методика.
204
Глава 7
1. Из суспензионной культуры с плотностью 1-106 кл/мл
осаждают L-клетки 20 мин при 2000 об/мин, ресуспендируют
в '/io исходного объема солевого раствора Пака, вносят вирус
(1—10 БОЕ/мл) и инкубируют при 34°С, непрерывно переме-
шивая, для адсорбции вируса.
2. Адсорбцию ведут 1 ч, затем суспензию разбавляют све-
жей культуральной средой до исходного объема и инкубируют
при 34 °C для снижения цитотоксичности вируса.
Хотя эта методика, безусловно, позволяет значительно по-
высить выход вируса, она достаточно сложна в исполнении,
требует большого количества дорогостоящих сред, и, кроме
того, при работе с большими объемами трудно соблюдать
стерильность. Соответственно предложена упрощенная методи-
ка, согласно которой суспензионную культуру инкубируют при
34°C и заражают при этой температуре без концентрирования.
1. Суспензионную культуру инкубируют 1—2 ч при 34°C
для выравнивания температуры.
2. Вирус разбавляют 10—20 мл среды МЕМ и добавляют
непосредственно к культуре.
3. Культивирование вируса проводят 36—42 ч при 34 °C,
затем при 4 °C дают клеткам осесть. (Во время культивирова-
ния при 34 °C может произойти изменение цвета суспензии с
красного на оранжевый.) Вирус штамма Джонс, типичный
представитель реовирусов второго серотипа, размножается
медленнее, чем реовирусы двух других серотипов, поэтому для
максимального выхода зараженные им клетки инкубируют
48—56 ч при 34 °C.
3 . Очистка вирусов
3.1. Сбор зараженных клеток и первая экстракция вируса
Большая часть (около 90%) вирионов, образующихся при
размножении в культуре, остается связанной с фрагментами
лизированных клеток и не высвобождается в культуральную
среду. Это обстоятельство можно использовать для упрощения
методики получения вируса из больших объемов суспензион-
ной культуры. По окончании размножения вируса заражен-
ную культуру инкубируют по крайней мере 24 ч при 4 °C для
оседания клеточного дебриса (культуру можно оставлять при
4°C не менее чем на 10 сут без существенного снижения выхода
вируса). После этого основную часть культуральной среды
можно отсосать с помощью вакуумного насоса. Хотя большая
часть вирусных частиц остается связанной с клеточным дебри-
сом, тем не менее и в среде содержится существенное количе-
ство инфекционного вируса, и с ней необходимо обращаться
Вирусы, содержащие двунитевую РНК
205
осторожно. После удаления среды клеточный дебрис.извлекают
из культурального сосуда и концентрируют низкоскоростным
центрифугированием (20 мин, 2000 об/мин, 4°C). Осадок ре-
суспендируют в буфере для растворения реовируса (50 мМ
трис-HCl, pH 8,0, 10 мМ NaCl, 1,5 мМ 2-меркаптоэтанол) из
расчета 100 мл буфера на 4 л исходной культуры.
Первая экстракция вируса включает гомогенизацию и раз-
деление фаз и основана на том, что в состав внешнего и внут-
реннего капсидов не входят липиды. Поэтому суспензию дебри-
са зараженных клеток смешивают с 1/4 объема трифтортри-
хлорэтана (это вещество используется в качестве хладоагента
в холодильниках и известно под коммерческими названиями
Арктон ИЗ или Фреон ИЗ). Смесь гомогенизируют 3 мин при
1/2 максимальной скорости вращения в гомогенизаторе типа
Virtis 23.
Следует сделать два замечания по поводу гомогенизации.
Во-первых, можно использовать и другие гомогенизаторы,
например гомогенизатор Уоринга, однако в этом случае необ-
ходимо следить, чтобы в камере гомогенизатора не возникло
избыточное давление паров фреона. Во-вторых, следует иметь
в виду, что при гомогенизации неизбежно образуется значи-
тельное количество вируссодержащего аэрозоля и поэтому
данную стадию очистки вируса следует проводить на доста-
точном удалении от мест, где ведется работа с другими куль-
турами клеток, предпочтительно в хорошо вентилируемом вы-
тяжном шкафу.
После гомогенизации фазы разделяют низкоскоростным
центрифугированием (20мин, 2000об/мин, 4°C). При этом фор-
мируются красновато-оранжевая верхняя водная фаза, которую
необходимо декантировать и хранить при 4°C, и белая желе-
образная нижняя фреоновая фаза, в которой содержатся
клеточные липиды. К фреоновой фазе добавляют около 50 мл
буфера для растворения вируса и повторяют стадии гомогени-
зации и центрифугирования, объединяя обе водные фазы.
Экстракцию фреоновой фазы повторяют до тех пор, пока вод-
ная фаза не перестанет опалесцировать, что свидетельствует о
том, что основная часть материала экстрагирована (как пра-
вило, вполне достаточно 4—5 экстракций). Объединенные
водные фазы вновь экстрагируют 1/8 объема фреона. После
этого вирус из водной фазы концентрируют высокоскоростным
центрифугированием (1 ч, 24 000 об/мин, в роторе SW28,
Beckman). Осадок вируса ресуспендируют в небольшом объе-
ме (3—5 мл) того же буфера и оставляют на ночь при 4 °C.
206
Глава 7
3.2. Очистка вируса центрифугированием в градиенте
Предложено два альтернативных метода очистки вируса.
Стандартный метод Смита и др. [5] включает стадии зональ-
ного центрифугирования вируса в градиенте концентрации
сахарозы и последующего изопикнического центрифугирования
в градиенте плотности CsCl.
1. Суспензию вируса наслаивают на 10—40%-ный градиент
концентрации сахарозы (в буфере с 50 мМ трис-НС1, pH 8.0)
и центрифугируют 1 ч при 25 000 об/мин и 4 °C в роторе SW28,
Beckman. В одном градиенте можно фракционировать мате-
риал из 1 —1,5 л исходной зараженной клеточной суспензии.
Зона вируса должна находиться примерно посередине градиен-
та, и ее легко извлечь, проколов пробирку сбоку.
2. Для снижения концентрации сахарозы вирус разбавляют
буфером и собирают центрифугированием 1 ч при 25 000 об/мин
и 4 °C в роторе SW28, Beckman.
3. Осадок вируса ресуспендируют и наслаивают суспензию
на преформированный градиент CsCl (1,2—1,4 г/мл; градиент
готовят на буфере с 50 мМ трис-НС1, pH 8,0, и создают 5—
10%-ный градиент глицерина, чтобы уменьшить вероятность
перемешивания при формировании градиента). Центрифугиро-
вание ведут 2 ч при 24 000 об/мин и 4°C в роторе SW28,
Beckman. Голубоватая опалесцирующая зона вируса должна
сформироваться в середине пробирки, ее отбирают, как описа-
но выше. В верхней трети пробирки должна быть видна зона,
образованная пустыми (не содержащими РНК) капсидами,
количество которых варьирует от одного цикла размножения к
другому; при необходимости эту зону можно отобрать отдельно.
4. Очищенный вирус из градиента CsCl разбавляют 50 мМ
трис-НС1 (pH 8,0), концентрируют центрифугированием и
ресуспендируют в небольшом объеме (1—2 мл) того же буфе-
ра. На этой стадии необходимо использовать именно раствор
триса, а не исходный буфер для растворения вируса, так как
последний содержит 2-меркаптоэтанол, препятствующий изме-
рению поглощения в ультрафиолете для определения выхода
вируса.
Второй метод очистки вируса центрифугированием в гра-
диенте представляет собой упрощенный вариант метода Сми-
та и др. [5]. В этом случае опускают стадию центрифугирова-
ния в градиенте концентрации сахарозы, на которой не дости-
гается существенной очистки вируса, а вирус фракционируют
непосредственно в преформированном градиенте плотности
CsCl.
Вирусы, содержащие двунитевую РНК
207
3.3. Определение выхода и хранение очищенного вируса
Выход вируса можно определить различными способами;
в одних случаях рассчитывают число физических частиц, а в
других — число единиц инфекционности. Первый параметр
можно определить по формуле Смита и др. [5], которая связы-
вает оптическую плотность суспензии очищенного вируса при
260 нм с концентрацией вирусного белка и с числом физичес-
ких частиц: 5,42 оптической единицы соответствует 1 мг/мл
вируса, что в свою очередь соответствует 1,13-1013 вирусных
частиц в 1 мл. Более точные данные можно, конечно, получить,
подсчитывая частицы под электронным микроскопом, но в
большинстве случаев вполне удовлетворителен способ расче-
та, основанный на оптической плотности.
Число инфекционных вирионов определяют методом бля-
шек. Реовирус формирует бляшки на разнообразных клеточных
культурах, но чаще всего для титрования используют L-клет-
ки или обезьяньи клетки CV-1. Вирусные бляшки под 1%-ным
агаровым покрытием при 37°C образуются на 4—5 сут; их
выявляют прижизненным окрашиванием нейтральным крас-
ным или 0,01%-ным раствором кристаллического фиолетового
после фиксации формалином и удаления агарового покрытия.
Обычно при культивировании реовируса описанными выше ме-
тодами отношение числа физических частиц к числу БОЕ
составляет 20—50:1; заметное увеличение этого отношения
свидетельствует об образовании ДИЧ, что сопровождается сни-
жением выхода инфекционных вирионов. Как уже отмечалось,
реовирус исключительно эффективно размножается в мыши-
ных L-клетках, и в принципе можно получить 25 мг очищенного
вируса из 1 л зараженной суспензионной культуры. На практи-
ке для штаммов первого (например, Ленг) и третьего (напри-
мер, Диринг) серотипов выход составляет 3—10 мг/л, а для
штаммов второго серотипа (например, Джонс) —2—5 мг/л.
Очищенный вирус обычно хранят при —70°C. Однако реови-
рус настолько стабилен, что его можно хранить и при 4°C
(месяцы и даже годы) без существенной потери инфекционно-
сти. Для длительного хранения вируса при 4°C следует добав-
лять азид натрия (0,01 %), чтобы предотвратить бактериальный
рост.
Повременный протокол размножения и очистки реовируса
типа 3 приведен на рис. 7.1.
4 . Культивирование и очистка ротавирусов
В последние годы установлено, что ротавирусы являются
главными этиологическими агентами острых вирусных гастро-
энтеритов у детей и всех основных видов домашних животных
День
1
2
3
4
5
6
7
9
11
12
работы
Процедура
Берут 100 мл суспензии L-клеток (1 -10е кл/мл).
Клетки рассевают в соотношении 1 :2 (среда МЕМ в модифика-
ции Иоклика с 5% ЭТС, 10 мин).
200 мл суспензии разводят до 400 мл (~10 мин).
400 мл суспензии разводят до 800 мл (~ 10 мин).
800 мл суспензии разводят до 1,6 л (~10 мин).
1 ,6 л суспензии разводят до 3,2 л (~10 мин).
3 ,2 л суспензии разводят до 6,4 л (~10 мин).
Из суспензии отбирают 100—400 мл для дальнейшего поддержа-
ния культуры, а остальную часть примерно в 12 ч дня поме-
щают в водяную баню (34°C, 10 мин). Примерно в 16 ч вносят
вирус (5 мин, множественность инфекции 1—10 БОЕ/кл); суспен-
зию инкубируют при 34 °C.
Примерно в 10 ч утра инфицированную суспензию переносят на
4 °C и оставляют для оседания клеток и клеточного дебриса на
2—14 сут.
Большую часть среды отсасывают, клетки концентрируют цент-
рифугированием. Клетки ресуспендируют примерно в 100 мл
буфера и экстрагируют Фреоном 113.
Концентрирование клеток и экстракция фреоном должны занять
около 3 ч, ультрацентрифугирование—1 ч и ресуспендирование
осадка — 10 мин.
Осадок полностью ресуспендируют и наносят на градиент плот-
ности CsCl (1 ч). Проводят равновесное центрифугирование ви-
руса в градиенте плотности CsCl (2 ч). Извлекают зоны вируса
и разбавляют 50 мМ трис-НС1, pH 8,0 (3 мин). Вирус концентри-
руют ультрацентрифугированием, ресуспендируют в трис-буфере
и измеряют Егво (30 мин).
Центрифугирование
Желеобразная Белая
фреоновая фаза|
Водная фаза,-1
хранят при 4’с
Повторная экстракция
буфером для
суспендирования ("-50мл)
и центрифугирование
фреоновая (раза
Водная (раза -
Повторная экстракция
и центрифугирование
фреоновую фазу
отбрасывают
Водные фазы Объединяют
фреоновую
фазу отбрасывают
Повторная экстракция 1/8 объема
фреона и центрифугирование
I
Водная фаза
Концентрирование вируса
ультрацентрифугированием
К осадну добавляют 3-6 мл
вуфера для ресуспендирования,
частично ресуспендируют и
оставляют на ночь при 4°С
Вирусы, содержащие двунитевую РНК 20'
[6, 7]. Соответственно они имеют большое медицинское и сель-
скохозяйственное значение. В отличие от реовирусов млекопи-
тающих ротавирусы плохо размножаются в культуре клеток,
что до сих пор остается серьезным препятствием на пути их
быстрого изучения.
4.1. Адаптация к размножению в культуре клеток
Ротавирусы, поражающие различных животных, до недавне-
го времени не были адаптированы к размножению в культуре
клеток. Все попытки адаптации клинических изолятов ротави-
русов человека в течение нескольких лет оканчивались неуда-
чей. Впервые ротавирус человека был адаптирован к размно-
жению в культуре клеток Уайеттом и др. [8] после многократ-
ного пассирования на поросятах. Однако данный метод
слишком сложен для рутинной работы. Одновременно несколь-
кими группами японских исследователей [9—11], которые
воспользовались описанным ранее явлением повышения инфек-
ционности ротавирусов после обработки протеазами [12, 13],
была разработана методика адаптации ротавирусов к размно-
жению в культуре клеток, применимая ко всем вирусам этой
группы. Методика состоит из двух основных этапов: обработки
вируса, используемого для заражения культуры, трипсином и
проведения нескольких «слепых пассажей» без видимого ЦПД.
Ниже приведен протокол, обеспечивающий высокую эффек-
тивность адаптации (50—80%).
1. Готовят 10%-ную суспензию содержащего вирус образца
фекалий в среде МЕМ и центрифугируют суспензию 30 мин при
4000 об/мин и 4°C для удаления крупных частиц.
2. К супернатанту добавляют равный объем среды, содер-
жащей 20 мкг/мл трипсина, инкубируют 30 мин при 37°C и
затем разводят средой МЕМ в 20 раз.
3. 0,2 мл обработанной трипсином вирусной суспензии на-
носят на плотный монослой клеток МА 104, выращенный в
роллерных пробирках размером 100X10 мм на среде МЕМ,
содержащей 10% ЭТС, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл
стрептомицина. Перед внесением вируса монослой промывают
3 раза средой МЕМ. Перевиваемая линия эпителиальных кле-
ток МА 104 была получена из почек эмбрионов макаки-резуса;
рядом исследователей было установлено, что это одна из луч-
ших клеточных культур для размножения ротавирусов.
4. Адсорбцию ведут 1 ч при 37 °C, затем удаляют инокулят
и вносят в пробирки среду МЕМ, содержащую 0,5 мкг/мл
трипсина и антибиотики. Пробирки инкубируют при 37°C на
роллерной установке и каждые 2 сут сравнивают с незаражен-
ной контрольной культурой для выявления ЦПД. При обнару-
14—369
210
Глава 7
жении явного ЦПД клетки и среду извлекают из пробирок
путем замораживания и оттаивания. Если же, что более типич-
но, ЦПД не наблюдается, зараженные клетки инкубируют еще
в течение 10—12 сут.
5. Культуральную жидкость после первого пассажа обра-
батывают трипсином, как описано выше, и вновь пассируют
на свежем плотном монослое клеток МА 104. Часто приходит-
ся провести 3—10 таких «слепых пассажей», прежде чем через
48—72 ч после заражения культуры обнаружится явное ЦПД.
6. Чтобы избежать размножения смесей вирусов, коадапти-
рующихся к росту в культуре, при первой возможности следу-
ет провести три цикла размножения вируса из одного инфек-
ционного вириона. Оптимальный способ проведения таких
циклов состоит в очистке вируса из индивидуальных бляшек;
однако некоторые изоляты, хотя и размножаются в клетках
МА 104, но не образуют бляшек. В этих случаях очистку
вируса проводят методом предельного разведения. Для этого
готовят последовательные разведения первого пассажа вируса,
дающего выраженное ЦПД, и заражают монослойные культуры
клеток МА 104, выращенные в планшетах с 24 или 48 лунками.
После 1 ч адсорбции при 37 °C инокулят удаляют, в лунки
вносят среду МЕМ с 0,5 мкг/мл трипсина и инкубируют куль-
туру 48—72 ч при 37°C. Собирают урожай из нескольких ин-
дивидуальных лунок, зараженных вирусом в том разведении,
которое дает ЦПД лишь в небольшой части лунок (5—10%).
Вирус из этих лунок разводят и опять высевают на культуру
клеток, как описано выше. Данную процедуру следует повто-
рить по крайней мере три раза, прежде чем наращивать вирус
для биохимических исследований. Если изолят ротавируса дает
бляшки на клетках МА 104, следует провести три цикла раз-
множения из индивидуальных бляшек, что является лучшим
методом очистки вируса перед наращиванием для дальнейшей
работы.
Имеет смысл сделать несколько общих замечаний по пово-
ду описанных методов. Хотя клетки МА 104 хорошо растут на
обычной сыворотке крови крупного рогатого скота или на
сыворотке новорожденных телят, в связи с повсеместным рас-
пространением ротавирусов и соответственно высоким уровнем
антивирусных антител в коммерческих препаратах таких сыво-
роток всю культуральную работу следует проводить только с
эмбриональной сывороткой. Размножение ротавирусов и со-
путствующее ЦПД наблюдается в присутствии 0,5 мкг/мл
трипсина. Необходимо включать в каждый опыт контрольную
незараженную культуру, чтобы убедиться в том, что наблюдае-
мое ЦПД не обусловлено действием трипсина на клетки. Для
того чтобы свести к минимуму вариации в действии самого
Вирусы, содержащие двунитевую РНК
211
трипсина, его следует готовить в виде концентрата (10 мг/мл),
делить на небольшие порции, каждая из которых используется
только в одном эксперименте, и хранить при —20 °C. Не
следует повторно замораживать и оттаивать растворы трипсина.
5. Наращивание и очистка ротавирусов
для биохимических исследований
Несмотря на разработку описанного выше эффективного
метода адаптации ротавирусов к размножению в культуре кле-
ток, лишь немногие вирусные изоляты размножаются доста-
точно эффективно, чтобы обеспечить возможность стандартной
наработки больших количеств вируса для многих биохимиче-
ских исследований (из таких изолятов наиболее детально
изучены вирус SA11 [14] и адаптированные к размножению в
культуре клеток английские изоляты ротавирусов крупного ро-
гатого скота [15]). Последние вирусы лучше всего размножа-
ются в культуре эпителиоидных клеток африканской зеленой
мартышки BSC-1; размножение вируса в большом масштабе
удобно проводить в 20 роллерных флаконах объемом 80 унций
на плотном монослое данной культуры.
1. Готовят инокулят вируса, заражая монослой клеток
BSC-1 в 2 флаконах площадью 150 см2 (0,1 БОЕ/кл). Культу-
ры инкубируют в присутствии 5 мкг/мл трипсина до полного
проявления ЦПД (около 2 сут).
2. Полученный вирус титруют; выход вируса должен со-
ставлять 1—3-Ю9 БОЕ.
3. Вирус разбавляют средой МЕМ до титра 5-Ю6 БОЕ/мл
и используют по 10 мл для внесения в каждый флакон.
4. После адсорбции в течение 1 ч при 37°C в каждый фла-
кон вносят по 15 мл среды МЕМ с 7,5 мкг/мл трипсина и про-
должают инкубацию 72 ч при 37°C.
Примерно через 24 ч после заражения клетки отделяются
от стекла, что облегчает их извлечение из флаконов по окон-
чании размножения вируса. В наших опытах включение трип-
сина в культуральную среду не оказывало какого-либо суще-
ственно положительного или отрицательного влияния на выход
вируса, однако трипсин вызывает отделение клеток от поверх-
ности стекла, что значительно упрощает их сбор. Это важно,
поскольку большая часть вируса в конце цикла размножения
остается ассоциированной с клетками.
5. По окончании цикла размножения вируса суспензию
зараженных клеток переливают из культуральных бутылок в
центрифужные стаканы объемом 250 мл и концентрируют ви-
рус и клеточный дебрис центрифугированием 90 мин при
50 000 g и 4 °C.
14*
212
Глава 7
6. Осадок ресуспендируют в небольшом объеме (20—30 мл)
буфера для суспендирования вируса (50 мМ трис-НС1, pH 8,0,
10 мМ NaCl, 1,5 мМ 2-меркаптоэтанол, 3 мМ СаС12). На этой
стадии суспензию вируса можно хранить при —70°C или не-
медленно использовать для очистки. Очистку проводят по схе-
ме, разработанной для реовируса, с тем исключением, что, как
правило, в случае ротавирусов достаточно двух экстракций
фреоновой фазы. Конечный выход вируса заметно варьирует,
но в среднем сотавляет 200—500 мкг очищенного вируса из
одного флакона объемом 80 унций.
6. Биохимические методы
6.1. Транскрипция вирусных мРНК в бесклеточной системе
Реовирус входит в число первых вирусов, у которых была
обнаружена вирионная транскриптаза, в данном случае РНК-
зависимая РНК-полимераза [16, 17]. Этот фермент легко ак-
тивировать, он чрезвычайно стабилен, и его можно использо-
вать для синтеза больших количеств чистой вирусной мРНК.
Эти свойства транскриптазной системы реовируса, а также
возможность модифицировать ее для синтеза мРНК с разными
типами 5'-концевой кэп-структуры [18] привели к тому, что она
широко используется в функциональных исследованиях мРНК
in vitro. Процесс получения мРНК реовируса состоит из трех
стадий, детали которых описаны ниже.
6.1.1. Удаление внешнего капсида
В интактных вирионах реовирусов транскриптазная актив-
ность не проявляется, но ее можно демаскировать, удаляя
внешний капсид. Такая активация может быть достигнута раз-
ными способами; в последнее время чаще всего используют
протеолиз вирионов с помощью химотрипсина.
1. Суспензию очищенного вируса (конечная концентрация
1 мг/мл) обрабатывают свежеприготовленным химотрипсином
(50 мкг/мл) в буферном растворе, содержащем 20 мМ трис-
НС1, pH 8,0 и 0,12 М КС1.
2. Смесь инкубируют 60—65 мин при 37 °C при осторожном
перемешивании.
3. По окончании протеолиза содержащие ферментативную
активность внутренние капсиды (или сердцевины) осаждают
центрифугированием 20 мин при 30 000 g и 4 °C.
Хотя сердцевины намного более устойчивы к химотрипсину,
чем интактные вирионы, все же возможен избыточный про-
теолиз, приводящий к потере транскриптазной активности.
Вирусы, содержащие двунитевую РНК
213
Поэтому очень важно придерживаться приведенных выше со-
отношений между концентрациями вируса и протеазы, а также
времени инкубации. Количество используемого вируса, естест-
венно, до некоторой степени определяется тем, сколько требу-
ется получить мРНК, однако, как правило, работу начинают
с 5—10 мг очищенных вирионов.
При изучении других днРНК-содержащих вирусов на этом
этапе могут использоваться различные приемы. Так, например,
для активации транскриптазы ротавирусов достаточно 20 мин
инкубации в присутствии 3 мМ ЭДТА перед осаждением в
описанном выше режиме. В то же время для вируса цитоплаз-
матического полиэдроза, как не имеющего внешнего капсида,
активация вообще не нужна.
6.1.2. Синтез вирусных мРНК
Хранение сердцевин после активации приводит к потере
ферментативной активности, поэтому их нужно использовать
немедленно. Осадок, полученный на предыдущей стадии, ре-
суспендируют непосредственно в реакционной смеси для синте-
за РНК так, чтобы конечная концентрация вируса составляла
около 1 мг/мл. Это реакционная смесь должна содержать в
10 мл:
30 мг АТР;
20 мг СТР;
20 мг GTP;
10 мг UTP;
37,5 мг фосфоенолпирувата;
1 мг пируваткиназы из скелетных мышц кролика;
1 мл 1 М трис-НС1, pH 8,0;
0,5 мл 10 мМ S-аденозилметионина;
37,5 мкл 0,4 М ЭДТА;
50 мкл пирофосфатазы (100 ед./мл);
0,1 мл раствора макалоида (30 мг/мл) (макалоид пред-
ставляет собой ингибитор РНКазы, включаемый в реак-
ционную смесь для обеспечения интактности мРНК после
их синтеза. Вместо макалоида можно использовать ряд
других ингибиторов РНКаз, например бентонит в конеч-
ной концентрации 250 мкг/мл или плацентарный ингиби-
тор РНКазы в конечной концентрации 500 ед./мл);
200—500 мкКи [3HJ-UTP
(включение [3H]-UTP в реакционную смесь не обязатель-
но, он служит только для удобного и быстрого контроля
хода реакции. Если метка не используется, включают
20 мг UTP на каждые 10 мл реакционной смеси).
214
Глава 7
После растворения сердцевин (осадок нужно ресуспендиро-
вать осторожно) в соответствующем объеме реакционной сме-
си для инициации синтеза РНК добавляют 1 М MgCl2 до ко-
нечной концентрации 13 мМ. Реакционную смесь инкубируют
при 37°C при осторожном перемешивании. За ходом реакции
можно следить, отбирая через каждый час небольшие аликво-
ты (по 10 мкл) реакционной смеси и измеряя включение [3Н]-
UTP в кислотонерастворимый материал. Через 4—6 ч синтез
РНК прекращается, что обусловлено истощением субстратов,
а не инактивацией вирионной транскриптазы. Поэтому 'после
5 ч синтеза РНК сердцевины осаждают центрифугированием
20 мин при 30 000 g и 4 °C, собирают супернатант, содержащий
мРНК, сердцевины ресуспендируют в свежей реакционной
смеси и проводят синтез РНК еще в течение 5 ч (следует
отметить, что если в качестве ингибитора РНКазы использу-
ют бентонит или макалоид, осаждающиеся при центрифуги-
ровании вместе с вирусными сердцевинами, то их не нужно
вносить в реакционную смесь при повторной постановке реак-
ции).
Можно провести 5—6 циклов синтеза без существенного
снижения выхода мРНК- Удобно обработать вирионы химо-
трипсином утром в первый день работы, провести в этот день
2 первых цикла синтеза мРНК, затем запустить третий цикл
синтеза на ночь (8—10 ч) и на второй день закончить работу,
проведя еще 2 цикла синтеза.
Использование описанной выше реакционной смеси приво-
дит преимущественно к синтезу нормальных кэпированных
и метилированных мРНК- Чтобы получить кэпированные, но не
метилированные мРНК, S-аденозилметионин в реакционной
смеси заменяют на S-аденозилгомоцистеин в той же концент-
рации. Можно модифицировать бесклеточную систему для
получения как некэпированных, так и неметилированных
мРНК. Для этого используют S-аденозилгомоцистеин, умень-
шают количество GTP в реакционной смеси с 20 до 1 мг и вме-
сто пирофосфатазы включают в реакционную смесь 25 мкл
0,2 М пирофосфата натрия.
6.1.3. Выделение вирусных мРНК
Супернатанты, получаемые в конце каждого цикла синтеза,
содержат вирусные мРНК, которые освобождаются из сердце-
вин по мере синтеза. Каждую порцию супернатанта немедлен-
но экстрагируют равным объемом насыщенного водой фенола,
а затем 4 раза эфиром. После удаления остатков эфира в токе
азота к супернатантам добавляют 10 М LiCl до конечной
концентрации 2 М для осаждения РНК и оставляют суспензию
Вирусы, содержащие двунитевую РНК 215
на ночь при 4 °C. В результате образуется преципитат вирус-
ных мРНК, который можно собрать низкоскоростным центри-
фугированием без соосаждения не включившихся в РНК ну-
клеотидтрифосфатов, наблюдаемого при осаждении РНК
этанолом. Осадок мРНК растворяют в буфере, содержащем
5 мМ. трис-НС1, pH 8,0, переосаждают РНК этанолом, чтобы
дополнительно сконцентрировать их, и растворяют в соответ-
ствующем объеме воды (концентрация РНК должна состав-
лять 2—4 мг/мл).
Как уже отмечалось, вирионные транскриптазы днРНК-
содержащих вирусов исключительно стабильны и активны, и
общий выход мРНК при использовании для их синтеза 5 мг
очищенного вируса может достигать 4—6 мг.
6.2. Трансляция вирусных мРНК в бесклеточной системе
Относительная легкость получения большого количества
мРНК реовируса привела к тому, что последние широко ис-
пользовались для изучения функций мРНК вообще и соответ-
ственно транслировались в разнообразных бесклеточных си-
стемах. В большинстве случаев наиболее удобен лизат ретику-
лоцитов кролика, обработанный микрококковой нуклеазой для
подавления эндогенного синтеза белка. Если планируется не-
большая работа по трансляции in vitro, наиболее удобно, по-
видимому, купить компоненты бесклеточной системы у постав-
щика и пользоваться системой в соответствии с его рекоменда-
циями. Исследователи, планирующие работу большего масштаба,
найдут краткое описание метода получения лизата ретику-
лоцитов кролика в приложении к данной главе.
В стандартную смесь для трансляции вирусных мРНК в
бесклеточной системе входят следующие компоненты.
1. 50 мкл обработанного нуклеазой лизата ретикулоцитов
кролика.
2. 4 мкл смеси аминокислот, содержащей все аминокислоты,
кроме метионина, в концентрации 2,5 мМ. Эту смесь можно
приготовить в виде концентрата, растворяя соответствующие
навески всех аминокислот приблизительно в 20 мл воды, а
затем доводя pH раствора до 7,4 с помощью КОН и объем
водой до 25 мл. Раствор делят на порции и хранят при —20 °C.
Следует отметить, что из-за низкой растворимости некоторых
аминокислот, в особенности тирозина, концентрированный
раствор всегда бывает мутным.
3. 5 мкл системы регенерации энергии. Этот 20-кратный
концентрат состоит из следующих компонентов:
129 мг КгАТР (конечная концентрация 20 мМ);
24 мг GTP (конечная концентрация 4 мМ);
216
Глава 7
1 мл 2 М трис-HCl, pH 7,5;
7 мл воды.
Раствор нейтрализуют КОН (до pH 7,5), доводят объем до
10 мл, делят на порции по 2 мл и хранят при —20°С.
К 2 мл такого раствора добавляют 145,2 мг ди-трис-креатин-
фосфата и 2 мг креатинфосфокиназы, проверяют pH и при
необходимости доводят его до 7,5. Полученный раствор можно
вновь разделить на порции и хранить при —20°C в течение
месяца.
4. 1 М КС1. Необходимое количество этого раствора зави-
сит от солевого оптимума конкретной используемой партии
лизата; как правило, следует добавлять в реакционную смесь
5—10 мкл.
5. 50 мМ ацетата магния. Необходимое количество варьи-
рует от одной партии лизата к другой, но обычно требуется
1,5—3,0 мкл.
6. 5—25 мкКи [35S]-метионина.
7. 4 мкл тРНК из печени мыши (2 мг/мл). Этот ингредиент
не обязателен, но его включение усиливает наблюдаемую
стимуляцию синтеза белка (приблизительно вдвое).
8. 5—10 мкг вирусных мРНК (в данной системе насыщение
достигается при концентрации мРНК 50—100 мкг/мл).
9. Буферный раствор (5 мМ трис-НС1, pH 7,4) до конечного
объема 100 мкл.
Реакцию обычно инициируют добавлением лизата ретику-
лоцитов к остальным компонентам. Ход реакции можно конт-
ролировать по включению [35S]-метионина в материал, нераст-
воримый в горячей кислоте. В оптимальных условиях включе-
ние метки должно нарастать линейно в течение 30—60 мин.
6.3. Трансляция вирусных геномных днРНК
для определения их кодирующих функций
Разработка простого метода трансляции в бесклеточной
системе плюс-нити геномной днРНК [20] позволила вплотную
определить кодирующие функции индивидуальных участков
генома днРНК-содержащих вирусов. Метод включает три ста-
дии, детально описанные ниже.
6.3.1. Фракционирование геномной днРНК
На этой стадии обычно используют электрофорез в поли-
акриламидном геле; очевидно, что конкретные условия элект-
рофореза зависят от исследуемого вируса. Так, например, ге-
ном большинства ротавирусов удается фракционировать элект-
рофорезом в пластине 6%-ного полиакриламидного геля раз-
Вирусы, содержащие двунитевую РНК 217
мерой 40X20X0,0015 см в буферной системе для диск-электро-
фореза Лэммли [21] при силе тока 30 мА в течение 24 ч.
При этом используют 100—200 мкг геномной днРНК. После
электрофореза гель окрашивают бромистым этидием и лока-
лизуют разделенные фрагменты днРНК в ультрафиолете.
Можно провести и авторадиографию геля, если в качестве мар-
кера в анализируемый препарат была включена вирусная
РНК, меченная 32Р. Далее из геля вырезают зоны, содержа-
щие индивидуальные фрагменты, и элюируют из них РНК-
Для этого предложено колоссальное число разнообразных
методов, однако наиболее надежен и в наименьшей степени
приводит к повреждению РНК метод электроэлюции [22].
Элюцию проводят в 50 мМ трис-ацетатном буфере (pH 7,4);
затем содержимое диализного мешка 2 раза экстрагируют
насыщенным водой фенолом, 4 раза эфиром и осаждают вы-
деленную РНК этанолом.
6.3.2. Денатурация индивидуальных фрагментов днРНК
перед трансляцией
Простой прием, обеспечивающий возможность трансляции
плюс-нити днРНК, не транслируемой в обычных условиях,—
это денатурация ее при низкой температуре в 90%-ном
ДМСО. Согласно основной методике, осадок днРНК ресус-
пендируют в воде до концентрации около 20 мг/мл, затем
добавляют ДМСО до концентрации 90%. Важно добиться
полного растворения РНК перед внесением ДМСО, а ДМСО
добавлять постепенно, тщательно перемешивая раствор на
каждом этапе. После добавления всего ДМСО смесь прогре-
вают 20 мин при 45°C для полной денатурации и добавляют
к бесклеточной системе трансляции. Если использовать указан-
ную выше концентрацию РНК, то внесение 2,5 мкл в бескле-
точную систему объемом 100 мкл обеспечивает ее насыщение
мРНК и в то же время достаточно низкую концентрацию
ДМСО, не оказывающую ингибирующего действия на синтез
белка [20].
Предложены также 2 альтернативных приема денатурации
днРНК перед трансляцией. Согласно первому из них (Мак-
Кри, неопубл, данные), днРНК денатурируют ДМСО, прогре-
вают при 45°C и сразу же осаждают этанолом. Полученный
осадок растворяют непосредственно в реакционной смеси для
трансляции. Эта модификация облегчает растворение очищен-
ных фрагментов днРНК, поскольку в этом случае концентрация
раствора РНК не имеет особого значения. Некоторые иссле-
дователи в качестве альтернативного денатурирующего агента
используют 10 мМ гидроокись метилртути [23, 24].
218
Глава 7
6.3.3. Трансляция денатурированной днРНК в бесклеточной системе
и характеристика синтезируемых продуктов
Трансляцию денатурированной днРНК в бесклеточной
системе проводят точно так же, как и описанную выше тран-
сляцию мРНК. Продукты трансляции индивидуальных фраг-
ментов РНК с помощью электрофореза в полиакриламидном
геле сравнивают с вирионными белками и белками из заражен-
ных клеток, чтобы установить, какой белок кодируется каж-
дым фрагментом вирусной РНК.
6.4. Молекулярное клонирование
генома днРНК-содержащих вирусов
Для полной структурной характеристики вирусных РНК,
а в некоторых случаях и получения большого количества ви-
русных белков используют методы генной инженерии. Многие
исследователи описали общую стратегию клонирования гено-
мов вирусов данного класса, основанную на использовании
в качестве исходного материала геномной днРНК [25—28].
В этой стратегии можно выделить ряд стадий.
6.4.1. Полиаденилирование геномной РНК
Чтобы использовать oligo (dT) в качестве затравки для
обратной транскрипции вирусных РНК, не содержащих poly(A),
РНК необходимо сначала полиаденилировать с помощью
poly (А)-полимеразы Escherichia coli. 10 мкг нефр акциониро-
ванной геномной днРНК денатурируют 90%-ным ДМСО, как
описано в разд. 6.3, и осаждают этанолом. Стадия денатурации
не обязательна для полиаденилирования, однако, по данным
большинства исследователей, эта реакция все же проходит на
денатурированной матрице более эффективно. Полиаденили-
рование проводят следующим образом.
1. Высушенный осадок денатурированной днРНК ресуспен-
дируют в 96 мкл воды.
2. К раствору РНК добавляют 2 мкл свежеприготовленного
100 мМ МпСЬ.
3. Добавляют 100 мкл двукратного концентрата реакционной
смеси для полиаденилирования (смесь для полиаденилирования:
50 мМ трис-НС1, pH 8,0; 100 мкМ АТР; 40 мкКи/500 мкл
[3Н]-АТР; 10 мМ MgCl2; 50 мкг/мл БСА, не содержащего
нуклеаз; 0,25 М NaCl).
4. Добавляют 2 мкл (10 единиц) poly (А)-полимеразы
Е. coli.
5. Смесь инкубируют 15 мин при 37°C. За это время к
каждой молекуле РНК присоединяется в среднем 20—25 остат-
Вирусы, содержащие двунитевую РНК
219
ков аденина. Реакцию останавливают, экстрагируя реакцион-
ную смесь фенолом.
6. Водную фазу после фенольной экстракции пропускают
через колонку с сефадексом G50 и осаждают элюирующуюся
в свободном объеме полиаденилированную РНК этанолом.
6.4.2. Обратная транскрипция полиаденилированной геномной РНК
Преимущество использования денатурированной геномной
днРНК для обратной транскрипции состоит в том, что при
этом одновременно синтезируются обе нити кДНК и не возни-
кает необходимости в постановке отдельных реакций для син-
теза первой и второй нитей, как при обратной транскрипции
мРНК.
1. Полиаденилированную РНК денатурируют 90%-ным
ДМ.СО и осаждают этанолом.
2. Высушенный осадок РНК растворяют в 40 мкл воды и
добавляют следующие компоненты реакционной смеси для
обратной транскрипции:
40 мкл 5 мМ раствора гидроокиси метилртути; после добав-
ления этого раствора смесь инкубируют 3 мин при 20°C;
120 мкл смеси для обратной транскрипции (75 мМ трис-
HCI, pH 8,3; 15 мМ MgCl2; 180 мМ КС1; 15 мМ дитиотреи-
тол; 1,5 мМ dATP; 1,5 мМ dGTP; 1,5 мМ dTTP; 0,75 мМ
dCTP; 50 мкКи/120 мкл [32P]-dCTP; 100 мкг/мл
oligo (dT) 12-ie);
50 единиц (<5 мкл) обратной транскриптазы.
3. Реакцию проводят 60 мин при 42°C, затем 10 мин при
46°C, после этого останавливают экстракцией фенолом.
4. Синтезированную кДНК отделяют от невключившихся
дезоксирибонуклеотидтрифосфатов гель-фильтрацией на колон-
ке с сефадексом G50 и осаждают этанолом. Из 10 мкг исход-
ной днРНК на этой стадии можно получить 0,75—2,0 мкг
кДНК.
6.4.3. Удаление РНК-матрицы и фракционирование кДНК по размеру
Осадок гибридов кДНК-РНК, образующихся в результате
обратной транскрипции, суспендируют в 100 мкл буферного
раствора, содержащего 5 мМ. трис-НС1, pH 8,0, и 2 мМ ЭДТА,
и обрабатывают 0,3 М NaOH 20 мин при 70°C для гидролиза
РНК-матрицы.
Для многих систем показано, что непосредственное клони-
рование кДНК без предварительного фракционирования по
размеру приводит к избирательному клонированию коротких
молекул. Поэтому для повышения вероятности получения
220
Глава 7
полноразмерных молекул кДНК перед клонированием следует
фракционировать по размеру электрофорезом в денатурирую-
щих условиях. Обработанную щелочью кДНК наносят на
1,5%-ный щелочной гель агарозы [29] и проводят электрофо-
рез при 150 мА в течение 16 ч. Индивидуальные полосы кДНК
локализуют с помощью авторадиографии, вырезают и выделя-
ют кДНК из геля с помощью электроэлюции по методике,
описанной выше для выделения фрагментов геномной днРНК.
6.4.4. Получение двунитевых кДНК, их клонирование
и идентификация клонов
1. Осадок выделенной из геля кДНК растворяют в 100 мкл
2XSSC (SSC = 0,15M NaCl, 0,015М цитрат натрия) и инкуби-
руют 2 ч при 64 °C для гибридизации комплементарных нитей
кДНК.
2. кДНК концентрируют, осаждая этанолом, растворяют и
заполняют имеющиеся недостроенные концы с помощью фраг-
мента Кленова ДНК-полимеразы I Е. coll [30].
3. Двунитевую кДНК с тупыми концами клонируют в под-
ходящем плазмидном векторе (например, рВР322) либо с
помощью G: С-коннекторов [31], либо с помощью содержащих
рестрикционные сайты линкеров [32].
Устойчивые к антибиотикам клоны Е. coli, содержащие
плазмиды с вирусоспецифическими вставками, можно иденти-
фицировать методом гибридизации на фильтрах по Грюнштей-
ну — Хогнессу [33], используя в качестве зонда меченные
32Р нефракционированные вирусные мРНК- После этого плаз-
миды, содержащие копии индивидуальных фрагментов, можно
идентифицировать гибридизацией с меченными 32Р фрагмента-
ми геномной РНК- Описание стандартных методов клонирова-
ния можно найти в руководстве [34].
ПРИЛОЖЕНИЕ
Получение бесклеточной системы
трансляции из ретикулоцитов кролика,
обработанной микрококковой нуклеазой
1. 6 кроликам породы новозеландский белый с массой тела
2,5 кг подкожно в шейные складки вводят 1 мл раствора вита-
минов, содержащего 0,1 мг витамина Bi2 и 1 мг фолиевой кис-
лоты в физиологическом растворе, и 0,6 мл 2,5%-ного (объем
на объем) раствора фенилгидразина в физиологическом раст-
воре.
2. На 2-й — 5-й дни работы инъекцию фенилгидразина пов-
торяют. При этом у животных развивается прогрессирующая
анемия.
3. На 7-й день кроликов анестезируют и берут кровь из
сердца. Все шприцы, иглы и посуду, используемые при полу-
чении лизата, предварительно промывают раствором гепарина
(1000 ед./мл). Собранную кровь хранят при 0°С до тех пор,
пока не обработаны все кролики. Дальнейшие процедуры про-
водят при 4 °C.
4. Ретикулоциты осаждают центрифугированием 15 мин
при 2000 об/мин. Супернатант отбрасывают, а клетки промы-
вают 4 раза буферным раствором, содержащим 0,14 М КО,
50 мМ NaCl и 5 мМ MgCl2; после каждой промывки клетки
осаждают в указанном выше режиме.
5. Определяют объем плотного осадка клеток и лизируют
их, добавляя равный объем ледяной воды. Лизат немедленно
центрифугируют 10 мин при 10 000 g, собирают супернатант,
делят на порции по 2 мл, быстро замораживают и хранят в
жидком азоте.
6. Обработку лизата микрококковой нуклеазой проводят
следующим образом:
а) оттаивают 2 мл лизата;
б) немедленно добавляют 80 мкл 1 мМ раствора гемина,
20 мкл раствора креатинкиназы (5 мг/мл) и 20 мкл
100 мМ СаС12;
в) добавляют 30 мкл микрококковой/ нуклеазы (1 мг/мл)
и инкубируют лизат 12,5 мин при 20°C;
г) добавляют 10 мкл 0,5 М раствора ЭГТА, чтобы связать
ионы Са2+, необходимые для проявления активности
нуклеазы. Лизат делят на порции такого объема, что-
222
Приложение
бы каждую порцию можно было использовать для од-
ного опыта, и хранят в жидком азоте. Следует избегать
повторного замораживания и оттаивания лизата.
Литература
1. Joklik W. К. (1983). The Reoviridae, Joklik W. К. (ed.), Plenum Press, p. 1.
2. Moussa A. Y. (1980). Virology, 106, 173.
3. Winton J. R., Lannan C. N., Frayer J. L„ Kimura T. (1981). Fish Pathol.,
15 155.
4. Rosen L. (1968). Virol. Monogr., 1, 73.
5. Smith R. E„ Zweerink H. J., Joklik W. K. (1969). Virology, 39, 791.
6. Flewett T. H., Woode Q. N. (1978). Arch. Virol., 57, 1.
7. McNulty M. S. (1978). J. Gen. Virol., 40, 1.
8. Wyatt R. G., James W. D., Bohl E. H„ Thiel К W„ Saif L. J., Kalica A. R„
Greenberg H. B., Kapikian A. Z., Chanock R. M. (1980). Science (Wash.),
207, 189.
9. Urusawa T., Urusawa S., Tanaguichi K. (1981). Microbiol. Immunol., 25,
1025.
10. Sato K-, Inaba Y., Shimozaki T., Fujii R„ Matsumoto M. (1981). Arch. Virol.,
69, 155.
11. Kutsuzawa T„ Konno T., Suzuki S., Kapikian A. Z„ Ebina T., Ishida N.
(1982). J. Clin. Microbiol., 16, 727.
12. Matsuno S., Inouye S., Kono R. (1977). J. Clin. Microbiol., 5, 1.
13. Graham D. Y., Estes M. K. (1980). Virology, 101, 432.
14. Malherbe H. H., Strickland-Cholmley M. (1967). Arch. Gesamte Virusforsch.,
22 235
15. Bridger J. C„ Woode G. N. (1975). Br. Vet. J., 131, 528.
16. Borsa J., Graham A. F. (1968). Biochem. Biophys. Res. Commun., 33, 895.
17. Skehel J. J., Joklik W. K. (1969). Virology, 39, 822.
18. Furuichi Y., Shalkin A. J. (1976). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 3448.
19. Pelham H. R. B., Jackson R. J. (1976). Eur. J. Biochem., 67, 247.
20. McCrae M. A., Joklik W. К (1978). Virology, 89, 578.
21. Laemmli U. K. (1970). Nature, 227, 680.
22. Sugden B., De-Troy B., Roberts R. J., Sambrook J. (1975). Anal. Biochem.,
68, 36.
23. Sanger D. V., Mertens P. P. C. (1983). In: ds RNA Viruses, Compans R. W.,
Bishop D. H. (eds.), Elsevier, p. 182.
24. Nagy E., Dobos P. (1984). Virology, 137, 58.
25. McCrae M. A., McCorquodale J. G. (1982). J. Virol., 44, 1076.
26. Both G. W„ Bellamy A. R., Street J. E., Siegman L. J. (1982). Nucleic Acid
Res., 10, 7075.
27. Cashdollar L. W., Esparza J., Hudson G. R., Chmelo R„ Lee P. W. K, Jok-
lik W. K. (1982). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7644.
28. Imai M., Richardson M. A., Ikegami N., Shatkin A. J., Furuichi Y. (1983).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 373.
29. Emtage J. S„ Catlin G. H„ Carey N. H. (1979). Nucleic Acid Res., 6, 1221.
30. Jacobson H., Klenow H., Ovargaard-Hansen К (1974). Eur. J Biochem, 45
623.
31. Bolivar F., Rodriguez R. L„ Greene P. J., Betlach M. C„ Heynecker H. L„
Boyer H. W., Crosa J. H., Falkow S. (1977). Gene, 2, 95.
32. Kurtz D. T., Nicodemus C. F. (1981). Gene, 13, 145.
33. Grunstein M., Hogness D. S. (1974). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72,
3961.
34. Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J. (1982). Molecular Cloning: A Labo-
ratory Manual, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York.
ГЛАВА 8
ОБЕЗЬЯНИЙ ВИРУС (SV40J И ВИРУС ПОЛИОМЫ:
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, ТИТРОВАНИЕ,
ТРАНСФОРМАЦИЯ И ОЧИСТКА ВИРУСНЫХ
КОМПОНЕНТОВ
Г. Тюрлер и П. Берд
1. Введение
Обезьяний вирус (SV40) и вирус полиомы — наиболее из-
вестные представители группы паповавирусов. И тот и другой
интенсивно изучаются, несмотря на то, что у своих природных
хозяев, обезьян и мышей, не вызывают серьезных заболеваний.
Повышенный интерес к этим двум вирусам можно объяснить
по крайней мере двумя причинами. Во-первых, SV40 и вирус
полиомы вызывают опухоли у восприимчивых грызунов и транс-
формируют клетки грызунов в культуре ткани. Трансформирую-
щие свойства вирусов связывают с действием одного или двух
определенных белков. Таким образом, изучение SV40 и вируса
полиомы, возможно, позволит установить механизмы действия
трансформирующих белков в клетке, а также пути образова-
ния опухолей in vivo. Во-вторых, в связи с малыми размерами
данных вирусов и их геномов за счет клетки-хозяина происхо-
дит обеспечение их почти всеми необходимыми ферментами
и факторами, участвующими в репликации, транскрипции и
созревании вирусных мРНК. Кольцевые двухцепочечные ви-
русные ДНК размером 5243 Ьр у SV40 (штамм 776) и 5292 Ьр
у вируса полиомы (штамм А2) упаковываются с помощью кле-
точных гистонов в мини-хромосомы, сходные по структуре с
более крупными и сложными клеточными хромосомами. Таким
образом, SV40 и вирус полиомы являются удобными объектами
для изучения такого важного процесса, как регуляция экспрес-
сии генов в эукариотических клетках. Читателям, интересую-
щимся вопросами структуры, биологии, генетики и организа-
ции генома этих вирусов, следует обратиться к работе [1].
В этой главе мы изложим основные методы получения
вирусных заготовок, идентификации, очистки вирусов, исследо-
вания трансформированных клеток и выделения вирусных
ДНК и нуклеопротеиновых комплексов из инфицированных
клеток.
224
Глава 8
2. Техника безопасности при работе
с вирусом полиомы и SV40
К настоящему времени нет данных, указывающих на то,
что работа с вирусом полиомы и SV40 связана с каким-либо
риском для здоровья исследователя. Тем не менее в целях безо-
пасности следует выполнять перечисленные ниже правила.
Соблюдение их, кроме того, будет способствовать и предотвра-
щению случайной инфекции клеточных линий и первичных
культур, необходимых для работы.
1. Пользуйтесь, если это возможно, отдельными комнатами,
ламинарными боксами и термостатами для работы как с неза-
ряженными культурами, так и с культурами, инфицированными
вирусом.
2. Не пипетируйте ртом. В помещениях, где идет работа с
вирусами, не рекомендуется принимать пищу и курить.
3. При работе с вирусами или инфицированными культура-
ми необходимо пользоваться специальной лабораторной одеж-
дой и перчатками. Перед уходом из комнаты, где работают с
вирусом, необходимо вымыть руки.
4. Всю стеклянную посуду после работы с вирусами или
инфицированными клетками необходимо замачивать в
Clorox или 5%-ном гипохлорите.
5. Стеклянная и пластиковая посуда одноразового исполь-
зования должна быть завернута в алюминиевую фольгу или
упакована в пластиковые коробки и проавтоклавирована.
3. Культуры клеток, среды и буферы
3.1. Культуры клеток
Вирус полиомы и SV40 размножаются в первичных или пе-
ревиваемых культурах клеток. Каждая из этих систем имеет
свои преимущества и недостатки.
Первичные культуры получают из тканей животных. Свой-
ства клеток и процесс взаимодействия между вирусом и клет-
кой будут воспроизводимы при условии стандартного содер-
жания животных. Недостаток первичных культур состоит в
том, что их приготовление оказывается слишком трудоемким,
особенно в тех случаях, когда требуются большие количества
клеток. Методы приготовления первичных культур читатель
может найти в руководстве [2].
Для вируса полиомы и SV40 известно множество как пер-
миссивных, так и непермиссивных клеточных линий. Культи-
вировать их несложно, и, кроме того, они легкодоступны.
Недостаток клеточных линий состоит в том, что при продолжи-
SV40 и вирус полиомы
225
тельном пассировании их свойства могут измениться, и это
в свою очередь скажется на взаимодействиях вирусов с клетка-
ми и приведет к сокращению выхода вируса. Следует добавить,
что клеточные линии могут быть контаминированы микоплаз-
мой [3]. Культивирование и хранение клеточных линий изложе-
но в руководстве [2].
3.2. Клетки-хозяева для SV40 и вируса полиомы
Первичные культуры и клеточные линии, часто используе-
мые для размножения SV40 и вируса полиомы, приведены в
табл. 8.1. В нашей лаборатории для наращивания вируса
Таблица 8.1. Клетки-хозяева для SV40 и вируса полиомы
Для SV40
Продуктивная инфекция (пермиссивные клетки)
первичные культуры клеток почки африканской зеленой мартышки
постоянные клеточные линии, полученные из почки мартышки: CV-1;
BSC-1; VERO
Трансформирующая инфекция (непермиссивные клетки)
первичные культуры клеток почки новорожденных мышат, первичные
или вторичные культуры эмбриональных клеток мыши, хомяка, крысы
перевиваемые линии клеток мышей, хомяков или крыс, например ЗТЗ,
FR ЗТЗ [7]
Для вируса полиомы
Продуктивная инфекция (пермиссивные клетки)
первичные культуры клеток почки новорожденных мышат
первичные или вторичные культуры эмбриональных клеток мыши
постоянные линии клеток мыши, например ЗТ6; ЗТЗ
Трансформирующая инфекция (непермиссивные клетки)
первичные или вторичные культуры эмбриональных клеток хомяков или
крыс
перевиваемые линии клеток хомяков либо крыс, например ВНК-21
(С13), FR3T3
полиомы, изучения механизмов продуктивной инфекции данно-
го вируса и опухолевой трансформации, вызванной SV40 [5],
обычно используют первичные культуры почки мыши [4]. В тех
случаях, когда необходимы большие количества ДНК или РНК
вируса полиомы, мы используем клетки линии ЗТ6 [6]. SV40
хорошо размножается в клетках линии CV-1, прошедших не-
большое число пассажей.
Количество инфицированных клеток после заражения одним
и тем же вирусом варьирует в зависимости от типа клеток.
15—369
226
Глава 8
Для клеточных линий этот показатель может меняться с уве-
личением числа пассажей. Возможно, существует зависимость
и от фазы клеточного цикла. Простейшим способом определе-
ния числа инфицированных клеток является иммунофлуорес-
центное окрашивание культур на внутриядерные опухолевые
антигены вирусов через 1 день после инфицирования (см.
разд. 6.4).
3.3. Среды и сыворотки
Необходимые среды для клеточных культур поставляются
промышленностью. Все клетки, перечисленные в табл. 8.1,
можно культивировать на минимальной среде Дюльбекко
(ДМЕМ). В культуральную среду необходимо добавлять сы-
воротку. Для стабильных клеточных линий рекомендуется ЭТС.
Несмотря на то что авторы большинства клеточных линий ре-
комендуют добавлять 10% ЭТС, мы, за исключением особых
случаев, используем только 5%. Среда для первичных клеток
должна содержать 10% либо телячьей сыворотки (ТС), либо
сыворотки новорожденных телят (СНТ).
3.4. Буферы и растворы
Составы нескольких буферов и растворов, используемых
при работе с клетками и вирусами, указаны в табл. 8.2.
4. Получение заготовок вируса
Препараты SV40 и вируса полиомы, полученные при высо-
кой множественности инфекции, могут содержать различные
формы вирионов (в том числе ДИЧ), которые возникают за
счет перемещений, повторений и делений в вирусной ДНК.
Кроме того, возможен обмен между участками вирусного ге-
нома и ДНК клетки-хозяина. Сохраняя ориджин репликации
(точку инициации репликации), дефектные вирусы способны
нормально реплицироваться в присутствии вируса дикого типа
и формировать дочерние вирионы. Эти дефектные вирусы при
наличии двух и более ориджинов репликации могут иметь даже
некоторые селективные преимущества в процессе репликации
[8]. После 3—5 серийных пассажей инфекционный титр таких
вирусных препаратов падает до 10% и ниже по сравнению с
исходными препаратами без заметного уменьшения числа
вирусных частиц. Для некоторых экспериментов гетерогенность
популяции вирусных частиц не имеет значения; для других
чистота вирусного препарата строго обязательна. В этом
случае вирус должен быть исследован дополнительно (см.
Таблица 8.2. Буферы и растворы
8,0 г
0,38 г
0,1 г
3,0 (трис-основание 2,4 г)
0,1 г
5-105 ед.
ТД-буфер (трис-Дюльбекко)
NaCl
КО
Na2HPO4
трис-HCl [7—9]
Стрептомицин
Пенициллин
Растворяют компоненты в 900 мл Н2О, доводят pH до 7,4, доливают Н2О
до 1000 мл1’.
Фосфатный буферный раствор Дюльбекко (PBS)
NaCl 8,0 г
КС1 0,2 г
Na2HPO4 (безводный) 1,15 г
КН2РО4 0,2 г
MgCl2-6H2O 0,1 г
СаС12 (безводный) 0,1 г
NaCl, КО и фосфаты растворяют в 700 мл Н2О, доводят pH до 7,4, затем
•к полученному раствору добавляют растворы MgCl2 в 100 мл Н2О и СаС12
В 100 мл Н2О. Общий объем доводят до 1000 мл1’.
Трипсин
Трипсин 1 : 250 2,0 г
NaCl 8,0 г
КС1 0,3 г
Na2HPO4 0,07 г
КН2РО4 0,02 г
Стрептомицин 0,1 г
Пенициллин 5-105ед.
Феноловый красный (0,5%-ный) 3 мл
Трипсин растворяют в 800 мл Н2О, соли и антибиотики — в 150 мл Н2О,
затем смешивают два раствора и добавляют феноловый красный. Доводят
pH всего раствора до 7,0, а объем до 100 мл1’.
Версен
NaCl 8 г
КС1 0,2 г
Na2HPO4 1,15 г
КН2РО4 0,2 г
Ка2-ЭДТА 0,2 г [двунатриевая соль, или
«Версен» (BDH), или «Titrip-
lex 111» (Merck) 1
Феноловый красный (0,5%-ный) 3 мл
Соли растворяют в 900 мл Н2О, добавляют феноловый красный, pH доводят
до 7,2, а общий объем до 1000 мл1’.
Смесь трипсина с версеном
(1 часть трипсина и 4 части версена)
ИВЕ (буфер для выделения вирусных хромосом)
10 мМ Hepes (натриевая соль, pH 7,8)
5 мМ КС1
I мМ ЭДТА
0,5 мМ дитиотреитол
) После приготовления растворы необходимо простерилизовать фильтрованием.
15
228
Глава 8
разд. 6.3) и при необходимости заменен новой заготовкой, по-
лученной после клонирования.
Описанная ниже методика позволяет получать заготовки
SV40 и вируса полиомы в количестве 150—250 мл. Этого коли-
чества достаточно для инфицирования культур на 300—500
чашках Петри диаметром 9 см. Для наращивания SV40 мы
рекомендуем использовать линию CV-1, а для вируса полио-
мы— первичную культуру почки мыши (в обоих случаях клетки»
должны образовать плотный монослой).
1. Наращивание вируса следует начать с выбора чистой
бляшки, имеющей четкие границы (получение бляшек описа-
но в разд. 6.1). Стерильной пастеровской пипеткой протыкают
центр выбранной бляшки и доводят конец пипетки до дна»
чашки. В пипетку вместе с бляшкой набирают агар и переносят
его в 1 мл среды, содержащей 5% ТС.
2. Полученную суспензию обрабатывают в ультразвуковом
дезинтеграторе, снабженном 3-мм зондом. Для этой цели можно
воспользоваться ультразвуковой баней.
3. Полученным гомогенатом инфицируют 2 монослойные
культуры следующим образом:
а) по 0,5 мл полученной суспензии разливают по двум
чашкам, из которых предварительно отсасывают среду;
б) культуры инкубируют 90 мин при 37°C для адсорб-
ции вируса. Время от времени следует покачивать чаш-
ки для равномерного распределения вирусной суспен-
зии;
в) после адсорбции каждую чашку заливают 10 мл пред-
варительно подогретой среды, содержащей 5 % ТС.
4. Культуры инкубируют 6—8 дней до появления четких
признаков лизиса (рис. 8.1 и 8.2).
5. Остатки монослоя снимают стерильной резиновой палоч-
кой и культуральную среду с остатками клеток собирают в
отдельный флакон.
6. Далее суспензию замораживают и оттаивают, а затем
обрабатывают в ультразвуковом дезинтеграторе. Полученный
таким образом «бляшечный лизат» обычно имеет титр 2-108—
109 БОЕ/мл. При необходимости можно более точно оттитро-
вать вирус методом бляшек. Однако для повседневной работы
это не обязательно. Для работы отбирают аликвоту бляшечного
лизата и разводят ее в 1000 раз (например, к 50 мкл лизата
добавляют 50 мл среды, содержащей 5% ТС). Оставшуюся
часть бляшечного лизата хранят при —20 °C.
7. 15—25 культур в чашках Петри инфицируют 0,5 мл раз-
веденного в 1000 раз бляшечного лизата (0,01—0,05 БОЕ/мл;
на 9-см чашке Петри, как правило, вырастает 5-Ю6—107 кле-
ток).
SV40 и вирус полиомы
229
Рис. 8.1. Заражение клеток CV-1 SV40. К — контрольная культура через
1 день после «ложного» заражения. 1 — культура через 1 день после зараже-
ния. Видимого действия вируса на клетки не обнаруживается; 2 — культура
через 2 дня после заражения. Клетки имеют небольшие вакуоли, увеличенные
ядра и темные включения (отмечены стрелками); 3 — культура через 3 дня
после заражения. Клеточный монослой в основном разрушен, в оставшихся
клетках видны многочисленные вакуоли и, как правило, темные увеличенные
ядра (отмечены стрелками). Открепившиеся клетки выглядят как светлые
округлые пятна
8. Инкубируют культуры 6—8 дней и затем собирают сре-
ду и клеточный дебрис, как указано выше. Лизат заморажива-
ют и оттаивают, клеточный дебрис осаждают центрифугирова-
нием в стерильной пробирке (10 мин, 8000 g, 4'°C). Супернатант
сливают в стерильный флакон, а осадок ресуспендируют, ис-
пользуя 1/20 объема супернатанта. Полученную суспензию
-обрабатывают ультразвуком и центрифугируют 20 мин при
1000 g. Второй супернатант объединяют с первым. Полученная
Суспензия и представляет собой заготовку вируса. Клеточный
осадок, перед тем как выбросить, обрабатывают либо Clorox,
либо 5%-ным гипохлоритом.
9. Полученную заготовку вируса для определения титра и
степени чистоты следует протестировать одним или нескольки-
ми методами, перечисленными ниже:
а) метод бляшек для определения количества БОЕ/мл
(см. разд. 6.1);
230
Глава 8
Рис. 8.2. Заражение клеток первичной культуры почки мыши вирусом полиомы.
К — контрольная культура через 1 день после «ложного» заражения. 1 — куль-
тура через 1 день после заражения. Ядра клеток немного увеличены и более
четко очерчены; 2 — культура через 2 дня после заражения. Ядра, содержащие
вирусные частицы, имеют зернистую внутреннюю структуру (отмечены стрел-
ками). В центре видны распавшиеся ядра; 3 — культура через 3 дня после
заражения. Клеточный монослой разрушен, ядра увеличены и имеют зерни-
стую структуру. Микрофотографии 1 и 2 сделаны с помощью инвертирован-
ного микроскопа Цейс 1СМ 405 в лаборатории д-ра Лэммли. Фазовый кон-
траст. 188Х
б) выделение вирусной ДНК и ее анализ с помощью
электрофореза (см. разд. 6.3);
в) заражение пермиссивных клеток и определение числа
клеток, содержащих Т-антиген, используя метод флуо-
ресцентного окрашивания (см. разд. 6.4).
В большинстве случаев самым удобным для работы явля-
ется титр 5108—1-Ю9 БОЕ/мл. Чаще всего вирусные заготовки,
полученные, как описано выше, имеют подобный титр и могут
быть использованы непосредственно или же после необходимо-
го разведения. В тех случаях, когда требуется более высокий
титр, вирус концентрируют ультрацентрифугированием (3 ч,
80 000 g, 4 °C) и ресуспендируют в соответствующем объеме
среды или буфера, содержащего 5% ТС. С другой стороны,
можно получить необходимую заготовку из очищенного и диа-
лизованного вирусного препарата (см. разд. 5).
SV40 и вирус полиомы
231
10. Как правило, заготовки вируса разливают по стериль-
ным пробиркам (5—10 мл на пробирку) и хранят при —20°С.
Повторные замораживания и оттаивания могут привести к сни-
жению инфекционного титра. Добавление сыворотки увеличи-
вает время хранения вируса.
5. Очистка SV40 и вируса полиомы
SV40 и вирус полиомы не чувствительны к таким липидным
растворителям, как хлороформ, а также к растворам CsCl,
поэтому эти реактивы могут быть использованы при очистке
вирусов.
Метод, описанный ниже, применяют как для очистки SV40,
так и вируса полиомы. Он предполагает использование моно-
слойных культур, выращенных на 20 чашках Петри диаметром
9 см.
1. Из всех чашек Петри удаляют среду и добавляют в
каждую по 0,5 мл заготовки вируса, разведенной до 108 —
109 БОЕ/мл, что соответствует множественности инфекции
2—50 БОЕ/кл. Затем чашки помещают в термостат на 37°C и
покачивают их время от времени для равномерного распреде-
ления вирусной суспензии. Чашки инкубируют 90 мин, затем
добавляют 10 мл предварительно подогретой среды, содержа-
щей 5% ТС, и помещают обратно в термостат.
2. Ход инфекции контролируют, наблюдая культуры под
микроскопом (см. рис. 8.1 и 8.2). Чаще всего клеточный лизис
достигает максимума через 3—4 дня, однако этот срок может
варьировать в зависимости от типа клеток и множественности
инфекции. Вирус содержится как в лизированных клетках, так
и в культуральной среде. Поэтому клетки, снятые с помощью
стерильной резиновой палочки, объединяют со средой в одну
центрифужную пробирку.
3. Для осаждения клеточного дебриса лизат центрифугиру-
ют 10 мин при 8000 g. Собирают супернатант, 1/20 его часть
используют для ресуспендирования клеточного осадка.
4. Вирус высвобождают путем трехкратного заморажива-
ния и оттаивания. Однако более эффективна в данном случае
обработка суспензии ультразвуком. Затем клеточную суспен-
зию осаждают 10 мин при 8000 g и оба супернатанта объеди-
няют. Осадок, перед тем как выбросить, стерилизуют.
5. Объединенные супернатанты центрифугируют 3 ч при
80 000 g и 4 °C. Осадок вируса ресуспендируют в 10 мМ буфе-
ре трис-НС1, pH 7,5, количество которого зависит от типа ис-
пользуемого далее градиента.
232
Глава 8
5.1. Равновесное центрифугирование
в градиенте плотности CsCl
1. Осадок вируса ресуспендируют в 2 мл 10 мМ трис-HCl,
pH 7,5. Полученная суспензия должна быть гомогенной и без
сгустков. Суспензию переносят в ультрацентрифужную про-
бирку (например, от ротора SW60 или SW50.1, Вефопар) и
доводят тем же буфером до веса 2,5 г. В пробирку добавляют
1,2 г CsCl и перемешивают до полной гомогенности пилотиро-
ванием. Плотность раствора должна составлять 1,30—1,33 г/мл.
Ее необходимо контролировать, определяя коэффициент пре-
ломления (см. табл. 8.3). Затем пробирку доверху наполняют
минеральным маслом (можно жидким парафином).
Таблица 8.3. Плотность и коэффициенты
преломления растворов CsCl
wt % г CsCl/100 г раствора') г CsCl/мл Н2О Плотность р28 ° Коэффициенты пре- ломления 1128» (при 25 °C)2)
При очистке вируса 29,84 0,42 1,283 1,361
31,66 0,46 1,294 1,305 1,362 1,363
33,33 0,50 1,315 1,326 1,364 1,365
35,03 0,54 1,337 1,348 1,366 1,367
Градиенты CsCl с бромистым, этидием, для разделения ДНК
47,39 0,90 1,533 1,384
0,92 1,544 1,385
48,67 0,95 1,555 1,386
0,97 1,565 1,387
49,85 0,99 1,576 1,388
1,01 1,587 1,389
51,06 1,04 1,598 1,390
Градиенты CsCl для разделения ДНК
55,53 1,25 1,685 1,398
1,27 1,696 1,399
56,53 1,30 1,707 1,400
1,33 1,717 1,401
57,56 1,36 1,728 1,402
1,39 1,739 1,403
58,56 1,41 1,750 1,404
’) wt % —137,48-138,11 (1/р) [9].
2) р»° =10,86011128» —13,4974 [101.
SV40 и вирус полиомы
233
Рис. 8.3. Приспособление для фракционирования градиента. 1 — держатель
пробирки; 2 — завинчивающаяся крышка; 3 — металлическая трубка; 4 —
центрифужная пробирка (ротора SW60); 5 — кольцо из силиконированной
резины; 6 — кусочек парафильма
2. Пробирки центрифугируют около 20 ч при 35000 об/мин
и 20°C. Вирусные частицы концентрируются в зоне с плотно-
стью 1,33 г/мл, пустые капсиды, которые всегда присутствуют
в препаратах SV40 и вируса полиомы,— в зоне с плотностью
1,29 г/мл. Клеточный дебрис располагается в верхней зоне гра-
диента. Две зоны, соответствующие вирусным частицам и
пустым капсидам, обычно видны невооруженным глазом [11].
3. Градиент раскапывают на 16—20 фракций (по 4—6 ка-
пель каждая). Существует несколько способов фракционирова-
ния градиента (см. гл. 2, рис. 2.3). В своей лаборатории мы
пользуемся простым держателем пробирок с завинчивающейся
крышкой. Дно пробирки прокалывают иглой для подкожных
инъекций; скорость вытекания градиента контролируют ука-
зательным пальцем, лежащим на отверстии в крышке (рис. 8.3).
4. Фракции, содержащие вирус, идентифицируют одним из
следующих методов:
а) объем каждой фракции доводят до 1 мл 10 мМ. трис-
HCl, pH 7,5, и определяют в каждой оптическую плот-
ность при длине волны 260 нм (после этого вирус не-
обходимо опять сконцентрировать центрифугирова-
нием) ;
234
Глава 8
б) в случае хороших вирусных препаратов фракции, со-
держащие вирус, идентифицируют невооруженным гла-
зом по мутности;
в) фракции, содержащие вирус полиомы и пустые капси-
ды этого вируса, можно обнаружить по реакции гемаг-
глютинации (см. разд. 6.2);
г) если вирус содержал радиоактивную метку ([3Н] -тими-
дин или [35S]-метионин), нужные фракции идентифи-
цируют по уровню радиоактивности в аликвотах каж-
дой фракции.
5. Нужные фракции объединяют и удаляют CsCl диализом
на холоду против 10 мМ трис-НС1, pH 7,5, или 1 мМ фосфата
натрия, pH 6,8. Можно осадить вирус центрифугированием,
предварительно разбавив объединенные фракции буфером
(центрифугирование проводят дважды 3 ч при 80 000 g и 4°C).
6. В препаратах вируса, предназначенных для инфицирова-
ния клеточных культур, концентрацию солей необходимо дове-
сти до изотонической. Вирусную суспензию стерилизуют фильт-
рованием через фильтр с диаметром 0,2 мкм (например, «Mil-
lex», Millipore, или «Val-Filt», Van Leer Medical).
5.2. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы
1. Вирусный осадок ресуспендируют в 0,5 мл 10 мМ трис-
НС1, pH 7,5.
2. 10—30%-ный сахарозный градиент (вес на объем) гото-
вят в 10 мМ трис-HCl в пробирке для ультрацентрифугирова-
ния от ротора SW40, а для меньших объемов — от ротора
SW60. Градиент создают либо с помощью двухкамерного сме-
сителя (см. гл. 1, рис. 1.3), либо последовательно наслаивая
друг на друга одинаковые объемы 30, 23, 17 и 10%-ной (вес
на объем) сахарозы до верха пробирки. В последнем случае
градиент необходимо оставить на 2 ч при комнатной темпера-
туре для прохождения частичной диффузии.
3. Суспензию вируса наслаивают на градиент и центрифу-
гируют 50 мин при 30 000 об/мин и 20 °C в роторе SW40 или
30 мин при 35000 об/мин в роторе SW60. Раскапывание гра-
диента и идентификацию фракций, содержащих вирус, прово-
дят, как описано выше (см. разд. 5.1).
4. Препарат вируса освобождают от сахарозы либо диали-
зом, либо центрифугированием после соответствующего раз-
бавления. Эта стадия может быть опущена в тех случаях, когда
присутствие сахарозы не препятствует дальнейшей работе,
например электрофоретическому анализу ДНК или белков.
SV40 и вирус полиомы
23»
5.3. Некоторые особенности методов работы
с вирусом полиомы
Вирус полиомы при кислых pH имеет тенденцию агрегиро-
вать с клеточным дебрисом, присутствующим в грубом лиза-
те. Этим свойством можно воспользоваться при очистке дан-
ного вируса. Для этого в лизате доводят концентрацию фосфа-
та Na (pH 5,6) до 20 мМ, охлаждают до 4°C и центрифугируют,
как описано выше. Супернатант, содержащий в данном случае
небольшое количество вируса, можно выбросить (конечно, пос-
ле стерилизации Clorox или гипохлоритом). Для выделения
вируса осадок суспендируют в 10 мл буфера трис-Дюльбекко
(ТД), содержащего нейраминидазу (1 мл фермента, разруша-
ющего рецепторы, Microbiological Associates) и инкубируют
12—15 ч при 37°C. После инкубации клеточный дебрис удаляют
центрифугированием. Осадок выбрасывают, супернатант очи-
щают, как описано выше (см. разд. 5.1 и 5.2).
6. Определение концентрации вируса
В этом разделе мы рассмотрим ряд методов определения
концентрации вируса в различных препаратах. При необходи-
мости определение инфекционного титра проводят методом
бляшек (см. разд. 6.1), который позволяет наилучшим образом
охарактеризовать вирусный препарат. Недостаток данного ме-
тода состоит в том, что он требует довольно много времени.
Во многих случаях приблизительный титр определяют по про-
центу инфицированных клеток методом иммунофлуоресцентно-
го окрашивания на Т-антиген (для этого сравнивают значения,
полученные при инфицировании культур тестируемым препа-
ратом и препаратом, титр которого известен). С помощью
реакции гемагглютинации (см. разд. 6.2) так же, как и путем
измерения оптической плотности или электронной микроскопии
препаратов, можно определить общее количество вирусных
частиц, в том числе пустых капсидов, псевдовирионов (содер-
жащих вместо вирусной ДНК фрагментированную ДНК клет-
ки-хозяина) и ДИЧ [12]. По соотношению между БОЕ и ГАЕ
можно сделать вывод о наличии дефектных частиц в препа-
ратах вируса. Для хороших заготовок вируса это соотноше-
ние составляет около 5-105—106 [13]. С большей точностью
дефектные и другие нестандартные вирионы можно выявить,
экстрагируя вирусную ДНК из небольшого объема заготовки
(или лизата) и исследуя ее с помощью рестрикционного ана-
лиза или электрофореза (см. разд. 6.3).
236
Глава 8
Рис. 8.4. Титрование вируса полиомы методом бляшек на первичной культуре
клеток почки мыши, а — контрольная культура; б — заражение культуры
107-кратным разведением заготовки вируса приводит к образованию 14 бляшек;
в — заражение культуры 106-кратным разведением заготовки вируса приводит
к образованию 90—100 бляшек; г — заражение культуры 105-кратным разведе-
нием. Титр исходной заготовки вируса 1,2-109 БОЕ/мл. (Фотографии взяты из
статьи 15 и перепечатаны с разрешения авторов)
6.1. Титрование вируса методом бляшек
Принцип метода состоит в том, что для заражения клеточ-
ного монослоя используют разведенные препараты вируса, со-
держащие несколько инфекционных единиц. После заражения
монослой клеток покрывают агаром для предотвращения диф-
фузии вирусного потомства по всей чашке. Вирус, вышедший из
одной лизированной клетки, не имея возможности распростра-
ниться далеко, инфицирует только соседние клетки и таким
образом формирует бляшку [14, 15] (рис. 8.4).
1. Готовят последовательные 10-кратные разведения вируса
на ТД-буфере, содержащем 2% ТС. 0,1 мл соответствующего
разведения заражают монослой клеток в чашках диаметром
5 см (при титровании заготовок вируса, как правило, исполь-
зуют разведения 10-5—10-8). Для каждого разведения необхо-
димо подготовить две чашки. Кроме того, в качестве контроля
на монослой наносят чистый ТД-буфер, содержащий 2% ТС.
Для адсорбции вируса чашки инкубируют 90 мин при 37°,
SV40 и вирус полиомы
237
затем осторожно промывают подогретым ТД-буфером, добав-
ляют в каждую по 5 мл культуральной среды с 2% ТС и по-
мещают в термостат.
2. Примерно через 15 ч инкубации чашки заливают агаром,
приготовленным на культуральной среде. Стерильный 1,8%-
ный раствор агара Нобль (Difco Laboratories) готовят заранее
и хранят при 4°C. Агар расплавляют на водяной бане, затем
•охлаждают до 45°C и смешивают с равным объемом культу-
ральной среды в удвоенной концентрации, содержащей 4%
ТС и подогретой до 45 °C. Затем в каждой чашке культураль-
ную среду заменяют на 5 мл агарового покрытия. Оставляют
чашки при комнатной температуре до затвердения агара (при-
мерно на 15 мин) и далее помещают в термостат на 37 °C.
3. Время от времени проверяют состояние клеток и цвет
агара. Через 5 дней на старый агар наслаивают свежую среду
•с агаром. Как правило, культуры окрашивают для подсчета
бляшек через 8 дней после заражения (этот срок может коле-
баться в пределах 6—10 дней).
4. Клетки окрашивают нейтральным красным (1/100 объема
1%-ного водного раствора нейтрального красного добавляют
к культуральной среде, содержащей 2% ТС). В каждую чаш-
ку вносят по 5 мл красителя и помещают чашки на ночь в
термостат.
5. Отмывают краситель, чашки помещают обратно в тер-
мостат на 1—2 ч и подсчитывают бляшки. Поскольку нейт-
ральный красный окрашивает только живые клетки, бляшки
выглядят как бесцветные пятна на красном монослое (рис.
8.4). Исследование окрашенных контрольных культур позво-
ляет регистрировать неспецифические изменения окраски. Ок-
рашенные культуры можно инкубировать в термостате 1—2
дня, пока не начнется лизис всего монослоя. В течение этого
периода дважды в день подсчитывают количество бляшек,
следят за появлением новых и изменением тех, вирусная приро-
да которых при предыдущих просмотрах вызывала сомнения.
6.2. Идентификация вируса полиомы
в реакции гемагглютинации
Гемагглютинация представляет собой агглютинацию эрит-
роцитов вирусными частицами, имеющими в составе внешней
оболочки специфические белки, узнаваемые поверхностными
рецепторами эритроцитов. Гемагглютинация не позволяет от-
личить инфекционные частицы от неинфекционных. Не все ви-
русы обладают гемагглютинирующей способностью, кроме того,
эритроциты не всех видов животных способны агглютиниро-
ваться тем или иным вирусом. Например, вирус полиомы аг-
238 Глава 8
Рис. 8.5. Идентификация вируса полиомы в реакции гемагглютинации. Титру*
ют три вирусных препарата, разведенных в 100 раз. Препараты D и F имеют
титр 4-Ю5 ГАЕ/мл (максимальное разведение, при котором еще наблюдается
гемагглютинация, составляет 1:4096; ряды D и F, лунки 11). Препарат Е
имеет титр 5 -104 ГАЕ/мл (максимальное разведение, при котором еще наблю-
дается гемагглютинация, составляет 1 : 512; ряд Е, лунка 8)
глютинирует эритроциты морской свинки [16], в то время как
SV40 не способен агглютинировать эритроциты, используемые
в обычной практике. Гемагглютинация может быть блокирова-
на противовирусными антителами. На этом явлении основана
реакция торможения гемагглютинации, с помощью которой
можно обнаружить в исследуемом материале противовирусные
антитела.
При смешивании препаратов вируса с эритроцитами про-
исходит постепенное осаждение клеток. В отсутствие вируса
эритроциты оседают на дно лунки либо плотным кольцом
вдоль стенок, либо в виде «бляшки». Эритроциты, агглютини-
рованные вирусом, распределяются по всему дну равномерно
(рис. 8.5). Смешивая суспензию эритроцитов с последователь-
ными разведениями вируса, можно определить конечную точ-
ку, при которой еще происходит агглютинация.
1. Суспензию эритроцитов морской свинки готовят следую-
щим образом:
а) берут 1—2 мл крови из сердца анестезированного
животного и быстро добавляют к ней 2 мл 0,4%-ного
раствора цитрата натрия в ТД-буфере;
SV40 и вирус полиомы
239
б) эритроциты осаждают центрифугированием (5 мин
1500 об/мин), удаляют супернатант с помощью пипет-
ки, клетки суспендируют в 5 мл ТД-буфера;
в) эритроциты центрифугируют еще раз и суспендируют
в 5 мл ТД-буфера;
г) 0,5 мл полученной суспензии вносят в 100 мл стериль-
ного ТД-буфера и инкубируют по меньшей мере в те-
чение суток при 4°C. При аккуратном обращении и
строгом выполнении требований стерильности суспен-
зия может сохраняться в течение 2 нед;
д) покраснение буфера в суспензии эритроцитов свиде-
тельствует о начале лизиса клеток. В этом случае не-
обходимо приготовить новую суспензию. Готовые
эритроциты морской свинки поставляются рядом фирм
(в частности, Flow).
2. Для постановки реакции наиболее удобны пластиковые
96-луночные планшеты или круглодонные пробирки. Вирус
разводят на ТД-буфере в 102, 103, 104 и т. д. раз в зависимости
от предполагаемой концентрации. Если концентрацию заранее
предсказать невозможно, готовят последовательные разведения
вируса, начиная с 10- и 103-кратного.
3. В каждую лунку вносят по 50 мкл ТД-буфера. Каждое
разведение титруют в двух повторах, поэтому 50 мкл началь-
ного разведения вируса вносят в две лунки первого ряда,
хорошо перемешивают и переносят затем 50 мкл этой смеси в
лунки второго ряда. Таким образом готовят последовательные
разведения. Для облегчения постановки реакции можно приоб-
рести специальное оборудование, в которое входят микропи-
петки на 50 мкл и металлический сэмплер для перемешивания
и переноса 50 мкл образцов из одной лунки в другую (Titer-
tek, Flow либо Microliter, Cooke). При постановке реакции в
пластиковых пробирках объем буфера следует увеличить до
200 мкл.
4. После приготовления необходимых разведений в каждую
лунку добавляют по 50 мкл суспензии эритроцитов (в случае
пробирок — 200 мкл). Осторожно перемешивают содержимое
лунок, покачивая планшет, и оставляют его не менее чем на
6 ч (лучше на ночь) при 4 °C.
5. За конечную точку принимают максимальное разведе-
ние, при котором еще происходит гемагглютинация (см. рис.
8.5). Титр исходной вирусной суспензии, выражаемый в ГАЕ,
и является обратной величиной этого разведения. В 1-й лунке
(см. рис. 8.5) разведение исходного вирусного препарата 4-крат-
ное, в 8-й лунке — 512-кратное, в 12-й — 8000-кратное. Одна
ГАЕ соответствует примерно 107 физическим частицам, наблю-
даемым в электронный микроскоп [11].
240
Глава 8
6.3. Анализ вирусной ДНК электрофорезом
в агарозном мини-геле
Одним из простейших способов примерной оценки количест-
ва вируса или вирусной ДНК является исследование аликво-
ты препарата вируса с помощью электрофореза вирусной ДНК.
Постановка электрофореза ДНК в агарозном геле уже была
подробно изложена в руководствах [17] и [18]. В данном слу-
чае мы рекомендуем пользоваться высокочувствительной моди-
фикацией этого метода для мини-гелей, позволяющей быстро
анализировать до 10 нг ДНК (что соответствует 2-Ю9 вирионов
или 2-Ю7 БОЕ). Оборудование для электрофореза в мини-
гелях можно сделать самим либо приобрести у специальных
фирм (например, Bethesda Research Laboratories).
6.3.1. Агарозные мини-гели
В центральной части пластиковой ячейки с платиновыми
электродами на обоих концах устанавливают пластинку 1%-
ного агарозного геля размером 10X7 см (можно с помощью
пипетки наслоить на стеклянную пластинку 7x5 см 12 мл раст-
вора агарозы). Пластинку геля погружают в буфер для элект-
рофореза таким образом, чтобы над гелем находился слой
жидкости высотой около 1 см, и проводят электрофорез.
6.3.2. Экстракция вирусной ДНК
1. К 0,1 мл заготовки вируса или клеточного лизата, содер-
жащего около 5-Ю8—109 БОЕ/мл, добавляют 5 мкг ДНКазы
1 и 10 мкг РНКазы А и инкубируют 1 ч при 37 °C.
2. После инкубации к образцу добавляют 25 мкл 5%-ного
ДДС-Na и 50 мМ ЭДТА, pH 7,5. Полученную смесь инкубиру-
ют 10 мин при комнатной температуре.
3. ДНК экстрагируют 2 мин интенсивным встряхиванием со
125 мкл смеси фенол: хлороформ в соотношении 1:1 (объем
на объем), насыщенной 0,1 М трис-HCl, pH 8. После центрифу-
гирования суспензии отбирают водную фазу, содержащую
днк.
4. Осаждают ДНК 250 мкл этанола и выдерживают 30 мин
при —20 °C.
5. ДНК осаждают центрифугированием, подсушивают на
воздухе и ресуспендируют в 15 мкл 10 мМ трис-HCl, 1 мМ
ЭДТА, pH 7,5.
6. К аликвоте ресуспендированной ДНК добавляют глице-
рин до конечной концентрации 10% (объем на объем) и бром-
феноловый синий до 0,01% (вес на объем). Образец ДНК
SV40 и вирус полиомы
241
наносят на мини-гель параллельно со стандартными препара-
> тами, содержащими 20 и 100 нг вирусной ДНК. Часть полу-
ченной вирусной ДНК может быть использована для расщеп-
ления рестриктазами (например, HindlH для SV40 и Hpall
для вируса полиомы).
7. Электрофорез ведут при постоянной разности потенциа-
лов 50—100 В, примерно 1 ч до тех пор, пока бромфеноловый
синий не выйдет из геля (разность потенциалов и время про-
ведения электрофореза зависят от размера пластины).
8. После разделения ДНК гель окрашивают бромистым эти-
дием (2 мкг/мл) в буфере для электрофореза 15 мин.
«Нестандартные» вирионы двигаются в электрическом поле
быстрее основной формы I и минорной формы II, и поэтому
их обнаруживают по дополнительным полосам. Кроме того, за-
грязнение вирусного препарата можно выявить по дополни-
тельным рестрикционным фрагментам (рис. 8.6).
6.4. Определение количества зараженных клеток
с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания культур
на внутриядерный опухолевый антиген
Опухолевыми антигенами (Т-антигенами) называют про-
дукты ранних генов SV40 и вируса полиомы. Название анти-
генов объясняется тем, что они впервые были обнаружены в
опухолях, индуцированных вирусом, и в клетках, трансформи-
рованных вирусом. В настоящее время известны два Т-анти-
гена для SV40 и три для вируса полиомы (подробнее см. [1]).
Основные белки — это большие Т-антигены (мол. масса
88 кД для SV40 и 100 кД для вируса полиомы), накапливаю-
щиеся в ядрах инфицированных и трансформированных кле-
ток.
Присутствие внутриядерного Т-антигена можно легко
выявить иммунофлуоресцентным окрашиванием. С помощью
этого метода можно, в частности, определить долю инфициро-
ванных клеток в культуре, которая отражает титр вирусной
заготовки. Данный метод можно использовать и в эксперимен-
тах по трансфекции, в которых переносу подвергается участок
ДНК, содержащий ранние гены вируса, присоединенные к
чужим или мутантным промоторам. В этих случаях экспрес-
сия Т-антигена показывает эффективность функционирования
встроенных промоторов. Фиксированные клетки обрабатыва-
ют вирусоспецифической противоопухолевой сывороткой. Сыво-
ротку получают от хомяков, крыс или мышей, у которых
развились опухоли в результате инъекции вируса или синген-
ных трансформированных клеток. Вместо противоопухолевых
поликлональных сывороток можно использовать моноклональ-
16—369
242
Глава 8
Рис. 8.6. а—электрофорез вирусной ДНК в мини-геле агарозы (0,8%-ная
агароза, 40 мМ трис-ацетатный буфер, 2 мМ ЭДТА, pH 7,5). 1 —ДНК вируса
полиомы (эволюционные варианты, в — выделенная из 0,5 мл лизата; 2 —
ДНК вируса полиомы, выделенная из 0,1 мл заготовки вируса, полученной
после очистки вируса методом бляшек; 3 — ДНК SV40, выделенная из 0,1 мл
заготовки вируса, полученной после очистки вируса методом бляшек. I — фор-
ма I (сверхспирализованная кольцевая ДНК), II — форма II (кольцевая ДНК
с разрывами), пс — псевдовирионная ДНК (фрагменты мышиной ДНК); б —
электрофорез ДНК вируса полиомы, обработанной рестриктазой Hpa.Il
(5%-ный акриламид, 89 мМ трис-борат, 2 мМ ЭДТА, pH 7,8); 4 — ДНК ви-
руса полиомы, выделенная из клеток, инфицированных вирусом, очищенным
методом бляшек (1—8 — фрагменты ДНК, полученные после обработкиHpaU);
5 — ДНК вируса полиомы, выделенная из клеток, инфицированных серийно
пассируемым вирусом. Видны дополнительные фрагменты ДНК (эволюцион-
ные варианты вируса)
SV40 и вирус полиомы
243
Рис. 8.7. Иммунофлуоресцентное окрашивание на Т-антиген вируса полиомы,
а — контрольная культура; б — инфицированная культура клеток почки мыши
ные антитела к большому Т-антигену. Далее клетки обрабаты-
вают сывороткой других животных, реагирующей с иммунными
антителами (сыворотку предварительно конъюгируют с флу-
оресцеином). Под ультрафиолетовым микроскопом можно иден-
тифицировать ядра, содержащие Т-антиген, и ядра незаражен-
ных клеток (рис. 8.7).
Здесь мы подробно остановимся на одном из вариантов
иммунофлуоресцентного анализа.
1. Примерно через 24 ч после заражения клетки, растущие
на покровных стеклах, дважды промывают PBS. Монослой
подсушивают на воздухе 10 мин и фиксируют 10 мин смесью
метанол : ацетон (3:7, объем на объем) при —20 °C. Подсушен-
ные после фиксации стекла можно сразу же исследовать под
микроскопом либо хранить при —20°C в течение нескольких
недель.
2. Покровные стекла нарезают алмазом на кусочки пло-
щадью примерно 0,5—1 см2, затем смачивают их, погружая в
PBS, и, наконец, помещают клетками наверх в чашки Петри
диаметром 3 см, содержащие кусок влажной фильтровальной
бумаги. На клетки наносят 10 мкл противоопухолевой сыворот-
ки или моноклональных антител (при необходимости разве-
16*
244
Глава 8
денных PBS в 5—100 раз). Стекла инкубируют 30 мин при
комнатной температуре, затем трижды (по 2—3 мин) про-
мывают PBS.
3. Затем на клетки наносят 10 мкл флуоресцирующей . сы-
воротки (например, сыворотки кролика против иммуноглобули-
нов хомяка), разведенной в 10—100 раз PBS, содержащим
5% ЭТС. Такие сыворотки поставляются различными фирма-
ми. Однако в любом случае они должны быть предварительно
протестированы для подбора оптимального разведения, поз-
воляющего получить максимальную специфическую флуорес-
ценцию с минимальной фоновой. Стекла инкубируют 30 мин
при комнатной температуре, а излишек сыворотки отмывают в
трех сменах PBS. Для заключения препарата на чистое, об-
работанное спиртом предметное стекло наносят смесь глице-
рина с PBS в соотношении 9:1 (объем на объем). Затем вы-
сушенное с обратной стороны фильтровальной бумагой
покровное стекло накладывают (клетками вниз) на каплю
смеси глицерина с PBS на предметном стекле. Заключенные
препараты можно хранить в темноте несколько дней. Если
препараты не заключают в смесь глицерина с PBS, их необ-
ходимо просматривать немедленно после высушивания.
4. Флуоресценцию наблюдают в темнопольном микроскопе
с флуоресцентной приставкой. Ядра, содержащие Т-антиген,
имеют желто-зеленую окраску и темные ядрышки (рис. 8.7).
Позднее (через 36—48 ч после начала инфекции) Т-антиген
локализуется уже не только в ядрах, но и в цитоплазматиче-
ских включениях. В качестве контроля исследуют неинфициро-
ванные культуры, обработанные флуоресцирующей антисыво-
роткой, для исключения неспецифической флуоресценции. При
подсчете положительных клеток учитываются только те, в
которых четко видны окрашенные ядра. Мертвые клетки обыч-
но дают высокий уровень неспецифической флуоресценции.
7. Опухолевая трансформация клеток
Клетки, трансформированные SV40 или вирусом полиомы,
по многим признакам отличаются от нормальных, однако при
трансформации тех или иных культур не все признаки про-
являются одновременно. Основные свойства трансформирован-
ных клеток — это способность к росту в суспензии (т. е. незави-
симость от субстрата), образование плотных колоний на
пластике с беспорядочно ориентированными клетками, нетре-
бовательность к высокой концентрации сыворотки в культу-
ральной среде и наконец, относительно высокая конечная
плотность роста [19}. В методах идентификации и изоляции
трансформированных клонов, описанных ниже, используются
всего лишь первые два перечисленных свойства.
SV40 и вирус полиомы
245
7.1. Инфицирование непермиссивных клеток
1. Готовят три культуры непермиссивных клеток. В одну из
них помещают по крайней мере одно покровное стекло.
2. Суспензией вируса инфицируют культуру, содержащую
покровные стекла, и одну из двух оставшихся. Третья культура
остается контрольной. К ней вместо вируса добавляют культу-
ральную среду с 5% ЭТС. После адсорбции в течение 90 мин
при 37°C культуры заливают средой, содержащей 5% ЭТС
(эффективность трансформации, как правило, выше для ак-
тивно растущих клеток, чем для находящихся в состоянии
покоя).
3. Через день после заражения клетки на покровных стек-
лах фиксируют для определения числа инфицированных кле-
ток методом иммунофлуоресцентного окрашивания на внутри-
ядерный Т-антиген (см. разд. 6.4). Оставшиеся две культуры
трипсинизируют следующим образом:
а) культуры промывают ТД-буфером, а затем смесью
трипсина с версеном (см. табл. 8.2), причем 0,1—
0,2 мл смеси оставляют в культурах;
б) культуры инкубируют при комнатной температуре
до тех пор, пока клетки не округлятся. Обычно это
занимает 2—5 мин;
в) клетки отделяют от субстрата, постукивая по дну ча-
шек;
г) в каждую чашку добавляют 5 мл среды с 5% ЭТС
и клетки ресуспендируют пипетированием;
д) в обеих культурах определяют количество клеток в мл.
7.2. Получение колоний на пластике в жидкой среде
1. Готовят последовательные разведения (10~l, 10-2, 10~3,
IO-4) исходной клеточной суспензии, перенося 2,5 мл суспен-
зии в 22,5 мл среды, содержащей 5% ЭТС. Каждым разведе-
нием в объеме 5 мл засевают четыре чашки (диаметром 5 см).
Культуры инкубируют в термостате при 37 °C. (Если исходная
культура содержала 5-Ю6 клеток, в приготовленных разведе-
ниях окажется 5-105, 5-104, 5-103 и 5-102 клеток соответ-
ственно.) При большой плотности исходной суспензии необхо-
димо приготовить еще одно разведение; в любом случае в
максимальном .разведении не должно содержаться более чем
50—100 кл/мл.
2. Примерно через две недели инкубации появляются пер-
вые морфологически различимые колонии трансформирован-
ных клеток. В течение этого времени рекомендуется менять
среду не менее двух раз в неделю. Для инфицированных и
246
Глава 8
контрольных культур необходимо использовать отдельные пи-
петки.
3. Через 2—4 нед отбирают одну или две чашки для изоля-
ции одиночных трансформированных колоний. Остальные чаш-
ки используют для подсчета числа колоний:
а) отсасывают среду, промывают клетки PBS, фиксиру-
ют их 5 мл 10%-ного раствора формалина на PBS
30 мин при комнатной температуре;
б) фиксатор отсасывают и чашки высушивают на воздухе;
в) колонии подсчитывают сразу же либо после окраши-
вания клеток по Гимза или гематоксилином;
г) эффективность трансформации выражается числом ко-
лоний на 100 инфицированных клеток. Число инфи-
цированных клеток определяют иммунофлуоресцент-
ным окрашиванием на Т-антиген. В контрольных
культурах не должны образовываться плотные коло-
нии.
4. Для изоляции одиночных колоний трансформированных
клеток, как правило, используют специальный цилиндр для
клонирования, изготовленный из нержавеющей стали или
стекла (внутренний диаметр цилиндра составляет 5 мм). Вы-
сота цилиндра не должна превышать 10 мм. На оба края
цилиндра перед его автоклавированием наносят немного ва-
куумной смазки. Выбирают культуры, отсасывают питатель-
ную среду, клетки промывают ТД-буфером (предварительно
подогретым до 37°C). Затем тщательно удаляют буфер и по-
мещают цилиндр на хорошо изолированную колонию, поль-
зуясь прокаленным пинцетом. В цилиндр вносят каплю смеси
трипсина с версеном, которая не растекается благодаря ваку-
умной смазке. Чашку закрывают и инкубируют в течение
нескольких минут, наблюдая в микроскоп за состоянием кле-
ток. Затем в цилиндр добавляют 3 капли среды, содержащей
5% ЭТС, ресуспендируют клетки пипетированием и переносят
суспензию в новую чашку диаметром 3 см, содержащую 2 мл
той же среды. Аналогичные операции проводят еще с 2—3 дру-
гими колониями.
После того как будет выращено необходимое количество
клеток, с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания их
тестируют на присутствие Т-антигена.
7.3. Получение колоний в полужидком агаре [20]
Готовят 1,2%-ный (вес на объем) агар (бакто-агар или
агарозу) на воде, автоклавируют, разливают по 50 мл и хра-
нят при 4 °C.
SV40 и вирус полиомы
247
7.3.1. Приготовление агаровой подложки
Агаровую подложку (0,6%-ный агар) готовят следую-
щим образом:
1. Расплавляют 100 мл 1,2%-ного агара (в двух колбах по
50 мл) и охлаждают до 45°С. В каждую колбу вносят по
40 мл среды в удвоенной концентрации и по 10 мл ЭТС,
предварительно подогретых до 45°С. Агар оставляют при 45°C.
2. В 20 чашек (диаметром 5 см) разливают по 5 мл приго-
товленной смеси. Возникающие пузыри тут же удаляют при-
косновением горячей пастеровской пипетки.
3. На 8 чашках делают пометки 10-1, каждые 4 чашки по-
мечают 10~2, 10_3, 10-4. Агару дают затвердеть при комнатной
температуре.
7.3.2. Приготовление полужидкого агарового покрытия
Полужидкое агаровое покрытие (0,3%-ные агар или агаро-
за) готовят следующим образом:
1. Подогревают 5 стерильных пробирок, содержащих по
4 мл среды с 10% ЭТС в водяной бане до 45°С.
2. В каждую пробирку добавляют по 5 мл 0,6%-ного агара
(см. разд. 7.3.1). На двух пробирках делают пометки 10-1, на
остальных— 10~2, )0~3 и 10-4.
3. По 1 мл неразведенной суспензии инфицированных кле-
ток (см. выше) и разведений 10“', 10-2, 10-3 вносят в соответст-
вующие пробирки.
4. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и по
2 мл из каждой наносят на одну из четырех соответствующих
чашек с агаром.
5. То же самое проделывают с суспензией клеток из конт-
рольных культур. Однако в данном случае достаточно засеять
клетки в минимальном разведении (10-1), поскольку в полужид-
ком агаре рост ^трансформированных клеток происходить не
будет. Чашки инкубируют при комнатной температуре 15 мин
для затвердения агара, а затем помещают в термостат на 37°C.
6. Через 5 дней инкубации к каждой культуре добавляют
по 2 мл свежего полужидкого агара (0,3%-ный агар, приго-
товленный на культуральной среде с 10% ЭТС, как описано
выше).
7. Через 10 дней к каждой культуре добавляют по 1 мл
свежей среды с 10% ЭТС. Среду меняют каждые 5 дней. Как
правило, колонии трансформированных клеток появляются
через 2—3 нед (а в некоторых случаях значительно позже —
только через 4 нед).
248
Глава 8
8. Колонии подсчитывают, когда они достигают в диамет-
ре 0,5—1 мм. Подсчитав число колоний, определяют эффектив-
ность трансформации.
7.3.3. Выделение клонов трансформированных клеток
1. С помощью стерильной пастеровской пипетки отбирают
четко отграниченную колонию вместе с окружающим агаром.
2. Каждую отобранную колонию переносят в отдельную
чашку (диаметром 3 см), содержащую 2 мл ТД-буфера, подо-
гретого до 37 °C.
3. Пипеткой либо острой иглой освобождаются от большей
части агара.
4. Колонии промывают 2 мл ТД-буфера.
5. Добавляют 0,1 мл трипсина с версеном и механически
разрушают колонии пастеровской пипеткой или иглой. Полное
разрушение колоний необязательно, поскольку небольшие
агрегаты клеток хорошо прикрепляются ко дну чашки, и
трансформированные клетки «сквозь них» прорастают.
6. В каждую чашку добавляют 0,5 мл среды с 10% ЭТС
и клетки ресуспендируют пипетированием.
7. В каждую чашку добавляют по 1,5 мл среды с 10% ЭТС
и помещают их в термостат. Трансформированные клетки
окрашивают на присутствие Т-антигена.
8. Выделение вирусной ДНК и вирусных мини-хромосом
из инфицированных клеток
8.1. Экстракция вирусной ДНК
Большинство методов выделения вирусной ДНК из зара-
женных клеток начинается с селективной экстракции, описан-
ной Хиртом [21]. Экстракция по Хирту основана на том, что
высокомолекулярная клеточная ДНК выпадает в осадок вме-
сте с ДДС-Na в присутствии 1 М NaCl из охлажденного лиза-
та. После центрифугирования такого лизата в супернатанте
остаются вирусные ДНК, низкомолекулярные клеточные ДНК,
РНК и белки (примеси затем последовательно удаляют). Коль-
цевые ДНК можно выделить равновесным центрифугирова-
нием в градиенте CsCl с бромистым этидием [22]. Этот метод
хорошо известен и используется повсеместно [6, 23]. Здесь
мы приведем альтернативный метод, который занимает
меньше времени, дешевле и надежен во многих случаях. Он
основан на том, что ковалентно связанные кольцевые ДНК в
определенных условиях" спонтанно отжигаются после тепловой
денатурации. Кольцевые ДНК, имеющие разрывы, и линейные
SV40 и вирус полиомы
249
молекулы (например, фрагменты клеточной ДНК) в этих усло-
виях не ренатурируют. Такие одноцепочечные ДНК могут
быть затем отделены от кольцевых форм экстракцией фенолом
в присутствии 0,5 М NaCl [24]. В этих условиях одноцепочеч-
ная ДНК переходит в интерфазу. Для получения максималь-
ного выхода вирусной ДНК инфицированные культуры лизи-
руют, не дожидаясь массовой гибели клеток. Наш опыт пока-
зывает, что лизис следует проводить: примерно через 40 ч
после заражения клеток почки мыши вирусом полиомы, через
50 ч после заражения клеток линии ЗТ6 вирусом полиомы и
через 55—60 ч после заражения клеток линии CV-1 вирусом
SV40. Методика, подробно описанная ниже, рассчитана на 10
чашек Петри диаметром 9 см.
1. Культуральную среду удаляют, клетки промывают 5 мл
PBS. Затем в каждую чашку вносят по 1 мл 0,6%-ного ДДС-
Na, 10 мМ трис-HCl и 10 мМ ЭДТА (pH 7,5). Клетки инкуби-
руют 15 мин при комнатной температуре. Частично лизирован-
ный монослой собирают резиновой палочкой в центрифужную
пробирку (не рекомендуется пользоваться пипеткой, посколь-
ку важно сохранить нативную ДНК).
2. Центрифужную пробирку на четверть заполняют 5 М
NaCl, осторожно перемешивают содержимое, переворачивая
закрытую пробирку 10 раз, а затем инкубируют ее по крайней
мере 6 ч (лучше ночью) при 4 °C.
3. Полученную суспензию центрифугируют при 25000 g
в течение 15 мин. Собирают супернатант, содержащий вирус-
ную ДНК. Если после центрифугирования желатинообразный
осадок будет занимать более четверти объема пробирки, сле-
дует провести реэкстракцию осадка 1 М NaCl в течение ночи
и повторное центрифугирование. Для избежания повторной
экстракции следует использовать большой объем ДДС-Na для
лизиса клеток (например, 1,6 мл на чашку).
4. Полученные экстракты объединяют и депротеинизируют
равным объемом смеси фенола с хлороформом (1:1, объем на
объем), насыщенной 0,1 М трис-HCl, pH 8. Тщательно переме-
шивают в течение 3 мин, центрифугируют 10 мин при 10 000 g
и отбирают верхнюю водную фазу. Повторную экстракцию про-
водят смесью хлороформа и изоамилового спирта (24:1,
объем на объем) и центрифугируют, как описано выше.
5. Водные фазы объединяют, добавляют 2,5 объема этано-
ла и инкубируют ночь при —20 °C. Выпавшую ДНК осаждают
10 мин при 10 000 g. Осадок высушивают под вакуумом. (На
этой стадии вирусная ДНК может быть очищена центрифуги-
рованием в градиенте плотности CsCl в присутствии этидия
бромида.)
6. Осадок ДНК растворяют в 0,5 мл 50 мМ трис-HCl о
250
Глава 8
5 мМ ЭДТА, pH 8. Для удаления примеси РНК к раствору
добавляют РНКазу А до конечной концентрации 50 мкг/мл и
оставляют при 37 °C на 1 ч (РНКазу необходимо предваритель-
но прогреть 10 мин в 10 мМ ацетате натрия, pH 5,2, при 80°С
для ингибирования ДНКазы). Затем пробы прогревают 5 мин
в кипящей водяной бане, быстро охлаждают во льду и добав-
ляют к ним 5 М NaCl до конечной концентрации 0,5 М. ДНК
экстрагируют 3 мин равным объемом фенола, насыщенного
0,5 М NaCl, и центрифугируют 10 мин при 10000 g. При
отборе верхней водной фазы следует по возможности избегать
контаминации интерфазой. Экстракцию повторяют по крайней
мере еще раз. На этой стадии препарат очищают от денатури-
рованной линейной и имеющей разрывы кольцевой ДНК, а
также от внесенной в препарат РНКазы.
7. Из полученного экстракта ДНК осаждают в течение
ночи при —20 °C 2,5 объемами этанола. Центрифугируют
10 мин при 10 000g. Осадок ресуспендируют в 70%-ном водном
растворе этанола, охлажденном до —20°C, и повторно центри-
фугируют. Осадок высушивают под вакуумом и растворяют в
нужном объеме 10 мМ трис-HCl с 1 мМ ЭДТА, pH 7,8. Кон-
центрацию ДНК определяют путем измерения оптической
плотности полученного раствора при длине волны 260 нм
(1 OD26o = 50 мкг/мл). Из клеток CV-1, инфицированных SV40,
можно выделить 10—25 мкг вирусной ДНК на чашку Петри
диаметром 9 см. Из клеток ЗТ6, инфицированных вирусом по-
лиомы,— 5 мкг ДНК на чашку.
8.2. Выделение мини-хромосом SV40
В зараженных клетках и в вирусных частицах ДНК SV40
и вируса полиомы ассоциирована с клеточными гистонами.
Вирусную хромосому, таким образом, можно рассматривать
как упрощенную модель более сложных клеточных хромосом.
Такая модель чрезвычайно удобна для изучения механизмов
репликации и транскрипции эукариотических генов.
Предложено множество методов выделения хромосом SV40
из инфицированных клеток. Здесь мы изложим только два из
них, проверенные в нашей лаборатории. Первый, основанный
на использовании буфера с низкой ионной силой (НВЕ, см.
табл. 8.2), удобен для изучения транскрипции хромосом SV4O
in vitro [25]. Второй, основанный на использовании изотони-
ческого буфера с неионным детергентом NP-40 [26], обычно
применяют для изучения структуры хромосом SV40 и проме-
жуточных форм, возникающих при сборке вируса. Основная
проблема, с которой обычно сталкиваются при выделении хро-
SV40 и вирус полиомы 251
мосом SV40 из зараженных клеток, связана с диссоциацией
хромосом и промежуточных форм во время экстракции. Вто-
рой метод благодаря своей быстроте сводит диссоциацию
к минимуму. Первый метод, напротив, не исключает диссоциа-
ции, и проблема решается таким образом, что лизис клеток
проводят всего через 30 ч после начала инфекции, когда еще
не началась сборка вирусных частиц и поэтому отсутствуют
промежуточные формы.
8.2.1. Выделение хромосом SV40
при помощи изотонического буфера
Описанная ниже методика рассчитана на две чашки Петри
диаметром 9 см.
1. Удаляют культуральную среду, промывают клетки ТД-
буфером и собирают их резиновой палочкой. Клетки суспен-
дируют в 2 мл ТД-буфера и центрифугируют 5 мин при 1000 g.
Осадок вновь ресуспендируют в 2 мл ТД-буфера.
2. К полученной суспензии добавляют 100 мкл 10%-ного
NP-40 (Sigma Chemical Со.) и аккуратно перемешивают ее с
помощью миксера типа «Вортекс». Ядра лизированных клеток
осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1200 g
и затем ресуспендируют в 0,5 мл ТД-буфера. Полученную
суспензию ядер энергично гомогенизируют в гомогенизаторе
Даунса, используя 30—40 движений пестика. Во время этой
процедуры большая часть вирусных хромосом экстрагируется
из ядер. Последние осаждают центрифугированием в течение
5 мин при 1200 g и собирают супернатант, содержащий вирус-
ные хромосомы.
3. Вирусные хромосомы очищают скоростным центрифуги-
рованием в 5—20%-ном (вес на объем) градиенте сахарозы,
приготовленном на ТД-буфере при 4 °C. При использовании ро-
тора SW60 Beckman, в котором происходит хорошее разделе-
ние при малых объемах, время центрифугирования — 60—
80 мин при 40 000 об/мин. Для роторов больших объемов
(SV40, Beckman) время центрифугирования увеличивают. Фрак-
ции, содержащие хромосомы SV40, обнаруживают путем изме-
рения оптической плотности при длине волны 260 нм, радио-
активного мечения или электрофорезом в агарозе в присутст-
вии ДДС-Na.
8.2.2. Выделение хромосом SV40 при помощи буфера
с низкой ионной силой
Описанная ниже методика рассчитана на 10 чашек Петри
диаметром 9 см (используют клетки линии CV-1, инфицирован-
ные SV40).
252
Глава 8
1. Через 30 ч после заражения удаляют среду и клетки
трижды промывают 5 мл ледяного НВЕ-буфера (см. табл. 8.2,
чашки при этом держат на льду). Отсасывают НВЕ-буфер, а
клетки собирают резиновой палочкой и переносят в гомогени-
затор Даунса, погруженный в лед.
2. Клетки разрушают при помощи 10 ударов пестика. Го-
могенат переносят в пластиковую пробирку и центрифугируют
2 мин при 1000 g для осаждения ядер. Супернатант осторож-
но отсасывают пипеткой, поскольку осадок ядер неплотный.
Ядра ресуспендируют в НВЕ-буфере, объем которого может
варьировать. Однако, если в дальнейшем предполагается по-
становка транскрипции, ядра должны быть сконцентрированы,
а осадок следует ресуспендировать в 150 мкл НВЕ-буфера.
3. Пипеткой с широким носиком суспензию переносят в
пластиковую пробирку типа «Эппендорф», помещенную в лед.
Ядра набухают, и вирусные хромосомы диффундируют из них.
Время, необходимое для максимального выхода хромосом
SV40, устанавливают эмпирически. Мы считаем, что для этого
необходимо по крайней мере 4 ч (иногда мы оставляем про-
бирки на ночь). Другие исследователи, работающие этим
методом с различными клеточными линиями, считают, что до-
статочно 1 ч.
4. Для осаждения лизированных ядер суспензию центрифу-
гируют 15 мин при 25 000 g; супернатант, содержащий вирусные
хромосомы, переносят в другую пробирку. Полученный грубый
препарат хромосом SV40 можно хранить в течение нескольких
дней во льду. Далее его можно очистить скоростным центри-
фугированием в 5—20%-ном градиенте сахарозы, как описано
выше.
9. Благодарности
Мы благодарны Беатрис Бентель и Консуэло Саломон за
помощь в постановке и проверке этих методов в наших лабо-
раториях. Мы признательны Р. Вейлу за разрешение воспроиз-
вести микрофотографии (рис. 8.4 и 8.7), которые были получе-
ны в его лаборатории; М. Бенсман — за приготовление клеточ-
ных культур; Монике Визини — за подготовку рукописи;
О. Дженни — за оформление рисунков и фотографий.
Литература
1. Тооге J. (ed.) (1980). DNA Tumour Viruses, published by Cold Spring Har-
bor Laboratory Press, New York.
2. Freshney R. I. (ed.) (1985). Animal Cell Culture. A Practical Approach, IRL
Press, Oxford and Washington, D. C., in press.
SV40 и вирус полиомы
25Э
3. McGarrity G. J., Murphy D. G., Nichols W. W. (1978). Mycoplasma Infection,
of Cell Cultures, published by Plenum Press, New York and London.
4. Winocour E. (1963). Virology, 19, 158.
5. Weil R. (1978). Biochim. Biophys. Acta, 516, 301.
6. Favaloro J., Treisman R., Ramen R. (1980). In: Methods in Enzymology,
Vol. 65, Grossman L., Moldave K. (eds.), Academic Press, New York,
p. 718.
7. Seif R„ Cusin F. (1977). J. Virol., 24, 721.
8. Griffin В. E. (1980). In: DNA Tumour Viruses, Tooze J. (ed.), Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York, p. 61.
9. Vinograd J., Hearst J. (1964). In: Progress in the Chemistry of Organic
Natural Products, Vol. 20, Springer, Vienna, p. 372.
10. Thomas C. A., Jr., Berns К. I. (1961). J. Mol. Biol., 3, 277.
11. Crawford L. (1969). In: Fundamental Techniques in Virology, Habel K. and
Salzman N. P. (eds.), Academic Press, New York and London, p. 75.
12. Aposhian H. V. (1975). In: Comprehensive Virology, Vol. 5, Fraenkel-Con-
rat H. and Wagner R. R. (eds.), Plenum Press, New York and London,
p. 155.
13. Fried M. (1974). J. Virol., 13, 939.
14. Dulbecco R. (1966). In: Phage and the Origins of Molecular Biology,
Cairns J., Stent G. S., and Watson J. D. (eds.), Cold Spring Harbor Labo-
ratory Press, New York, p. 287.
15. Consigli R. A., Zabielski J., Weil R. (1973). Appl. Microbiol., 26, 627.
16. Eddy В. E., Rowe W. P., Hartley J. W„ Stewart S. E., Huebner R. J. (1958).
Virology, 6, 290.
17. Sealey P. G., Southern E. M. (1982). In: Gel Electrophoresis of Nucleic
Acids, A Practical Approach, Rickwood D. and Hames B. D. (eds.), IRL
Press, Oxford and Washington, D. C., p. 39.
18. Southern E. M. (1979). In: Methods in Enzymology, Vol. 68, Wu R. (ed.),
Academic Press, New York, p. 152.
19. Topp IF. C., Lane D., Pollack R. (1980). In: DNA Tumour Viruses, Tooze J.
(ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, p. 205.
20. MacPherson I., Montagnier L. (1964). Virology, 23, 291.
21. Hirt B. (1967). J. Mol. Biol., 26, 365.
22. Radloff R„ Bauer W., Vinograd J. (1967). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 57,
1514.
23. Pagano J. S., Hutchison C. A. (1971). In: Methods in Virology, Vol. 5, Mara-
morosch K. and Roprowski H. (ed.), Academic Press, New York and London,
p. 79.
24. McMaster G„ Beard P., Engers H. D., Hirt B. (1981). J. Virol., 38, 317.
25. Beard P., Nyfeler K. (1982). EMBO J., 1, 9.
26. Fernandez-Munoz R., Coca-Prados M., Hsu M. T. (1979). J. Virol., 29, 612;
ГЛАВА 9
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, ОЧИСТКА
И ТИТРОВАНИЕ АДЕНОВИРУСОВ
Б. Прешиос и В. Рассел
1. Введение
Аденовирусы — это вирусы среднего размера, лишенные обо-
лочки и содержащие линейную двуцепочечную ДНК с мол. мас-
сой (20—30)-10s. Их частицы диаметром 70—90 нм, состоящие
из 252 капсомеров, имеют икосаэдрический тип симметрии. На
12 капсомерах, расположенных в вершинах икосаэдра, распо-
лагаются нитевидные выросты (рис. 9.1). Семейство Adenovi-
ridae состоит из двух родов — Mastadenovirus и Aviadenovirus.
Вирусы в пределах каждого рода имеют общий группоспеци-
фический антиген. Изолированные от человека и различных
видов животных, аденовирусы были разделены на более мелкие
группы и типы (виды) на основе количественной реакции нейт-
рализации с соответствующими антисыворотками животных.
В табл. 9.1 приведены последние данные о количестве адено-
вирусов различных видов животных [1]. Аденовирусы человека
связаны главным образом с респираторными и глазными забо-
леваниями. Тем не менее большинство аденовирусов не вызы-
вает заболеваний. Некоторые аденовирусы были выделены из
фекалий при диаррее.
Аденовирусы представляют собой удачную модель для изу-
чения биохимии и генетики эукариот. Особенно часто в лите-
ратуре встречаются работы, выполненные на аденовирусах че-
ловека типов 2 и 5. Эти вирусы хорошо размножаются в куль-
туре ткани и дают высокие выходы вирионов, а также
избыточных структурных антигенов. Интенсивно изучаются и
аденовирусы человека типов 7 и 12, вызывающие с различной
эффективностью опухоли у новорожденных хомяков.
На сегодняшний день существует довольно много обзоров,
в которых обсуждаются различные аспекты биологии аденови-
русов [2, 3].
2. Клеточные системы для культивирования аденовирусов
Как правило, аденовирусы лучше всего размножаются в эпи-
телиальных клетках тех видов животных, которые являются их
природными хозяевами. Выход вируса существенно зависит от
природы клеток. Так, аденовирусы человека типов 2 и 5 очень
Культивирование, очистка и титрование аденовирусов
255
Рис. 9.1. Электронная микрофотография очищенного аденовируса человек»
типа 5. Замораживание — высушивание, негативное контрастирование при по-
мощи кремневолъфрамата натрия (4%, pH 6,5). 150 000Х. (С любезного разре-
шения д-ра М. Нермута, N.I.M.R., Mill Hill, London)
эффективно размножаются в эпителиальных клетках линий
HeLa или КВ и относительно слабо в фибробластах человека
линий WI-38 или MRC-5. Аденовирусы человека, вызывающие
образование опухолей, более «прихотливы». Для получения вы-
соких выходов этих вирусов требуются первичные или вторич-
ные культуры почки человеческого эмбриона. Неодинаковую’
чувствительность клеток к аденовирусной инфекции нельзя
объяснить только различной степенью доступности клеточных
рецепторов, поскольку большинство клеток способно захваты-
вать вирус. Однако далее возможна как литическая, так и абор-
тивная инфекция. В последнем случае в зараженных клетках
образуются вирусная ДНК и структурные компоненты, однако-
эффективность сборки вирусных частиц сильно уменьшена.
В некоторых случаях в инфицированных клетках происходит
экспрессия только нескольких «ранних» генов, что приводит
к опухолевой трансформации клеток. Литическая и большин-
ство абортивных инфекций ведут к гибели клеток. Роль ком-
понентов клетки, необходимых для определенных стадий ре-
пликации и сборки аденовирусов, исследована пока недоста-
точно. Поэтому сейчас невозможно, за исключением клеток
линии 293 (см. ниже), искусственно повышать выход вируса.
256
Глава 9
Таблица 9.1. Аденовирусы, обнаруженные у человека
и животных
Роды Хозяева Количество представите- лей')
Mastadenovirus Человек 37
Обезьяна 24
Крупный рогатый скот 9
Свинья 4
Овца 5
Лошадь 1
Собака 1
Мышь 1
Тупайя 1
Aviadenovirus Куриные 9
Индейка 2
!) В таблицу внесены только хорошо изученные аденовирусы. Кроме того, кандида-
тами в даннее семейство являются еще около 20 вирусов различных хозяев.
2.1. Аденовирусы человека, легко адаптируемые
к культуре клеток
Как указывалось выше, наиболее изученными являются
аденовирусы человека типов 2 и 5. Они одинаково хорошо
растут как в монослойных, так и в суспензионных культурах
клеток HeLa и КВ в пластиковой и стеклянной посуде. Суспен-
зионные культуры более удобны, особенно для получения боль-
ших количеств вируса. Метод получения таких культур деталь-
но описан ниже.
2.1.1. Аппаратура для суспензионных культур
На рис. 9.2 изображен аппарат с несколькими магнитными
мешалками для суспензионного культивирования клеток. Такой
или подобный ему аппарат, приспособленный для сосудов раз-
ного размера и любой формы, легко изготовить в лабораторных
мастерских. Двигатель, снабженный по возможности реостатом
для регулирования частоты вращения, должен обеспечивать
постоянное вращение магнитной мешалки с частотой 150 об/мин
в течение довольно долгого времени при 37 °C. Другая модель
аппарата, не требующая теплой комнаты или термостата, пред-
ставляет собой вибрирующую платформу, помещенную в водя-
ную баню. Такие приборы выпускаются рядом фирм. Культи-
вирование клеток можно проводить в различных сосудах. На
первом этапе мы рекомендуем использовать сосуды емкостью
500 мл, предназначенные для сбора крови. Далее культивиро-
Культивирование^ очистка и титрование аденовирусов
257
Рис. 9.2. Простейший аппарат для перемешивания шести суспензионных куль-
тур, изготовленный из мягкой стали и плексигласа (600x400x60 см)
вание можно продолжать в 5-л флаконах с плоским дном, ис-
пользуя магнитную мешалку (длина магнита ~3—5 см). К та-
ким флаконам следует подобрать соответствующие пробки,
обернуть их алюминиевой фольгой, закрыть флаконы и поме-
стить в автоклав.
2.1.2. Среды и сыворотки
Среды для роста клеток в суспензии выпускаются в виде
сухих порошков и жидких концентратов или же готовыми к
употреблению. В табл. 9.2 перечислены основные поставщики
сред, сывороток и оборудования, необходимых для культивиро-
вания клеток. Следует отметить, что между средами для куль-
тивирования клеток в суспензии и монослое существуют значи-
тельные различия (например, в концентрации Са2+). При пе-
реводе культур из монослоя в суспензию необходимо по
возможности заботиться о сходстве используемых сред.
При работе с суспензионными культурами особенно важно
следить за чистотой воды для приготовления сред. Воду необ-
ходимой чистоты получают после дополнительной очистки ди-
стиллята деионизацией или обратным осмосом. Для суспензи-
17—369
258
Глава 9
Таблица 9.2. Список фирм, поставляющих реактивы
и оборудование для клеточных культур
1) Среды и сыворотка
Gibco (Europe) Ltd.
Flow Laboratories Ltd.
Imperial Laboratories (Serum)
2) Тестирование микоплазмы
«Mycospec», B.R.L (U.K) Ltd.
3) Приспособление для очистки воды
«Fistream» Fisons pic
«Vaponics»
The Elga Group
Millipore Ltd.
4) Перистальтические насосы
LKB Instruments Ltd.
P.O. Box 35, Renfrew Road, Paisley
РАЗ 4EF, UK
P.O. Box 17, 2nd Avenue, Irvine KAI2
8NB, UK
Ashley Road, Salisbury, Wiltshire SR2
7DD, UK
P.O. Box 145, Science Park, Cambrid-
ge CB4 3BE, UK
Bishops Meadow Road, Loughborough
LE11 ORG, UK
20 Park Street, Princes Risborough
NP17 9AN, UK
Lane End, High Wycombe NP14 3JN,
UK
Millipore House, 11—15
Peterborough Road, Harrow HA1 2YH,
UK
LKB House, 232 Addington Road,
S. Croydon CR2 9APX, UK
онных культур, как правило, пригодна телячья сыворотка
(предпочтительно использовать сыворотку новорожденных жи-
вотных) либо лошадиная сыворотка. Новую партию сыворотки
перед употреблением рекомендуется проверять на способность
инициировать рост клеток, например, с помощью определения
коэффициента клонирования.
2.1.3. Клетки
В работе необходимо использовать клеточные линии, при-
способленные к росту в суспензии, например HeLa S3 (АТСС
No. CCL 2.2) или КВ (АТСС No. CCL 17). Как правило, клетки
вначале культивируют в монослое по стандартной методике в
подходящей среде с 7,5% СНТ. Через определенное время го-
товят 200 мл суспензии (в среде для суспензионных культур,
содержащей 7,5% СНТ) с концентрацией клеток 3-105/мл. Надо
отметить, что используемые клетки, как правило, плохо обра-
зуют плотный монослой. Приготовленную суспензию переносят
в 500-мл флакон, который помещают в описанный выше аппа-
рат и культивируют два дня при 37 °C. Затем подсчитывают
число клеток. При достижении плотности 6-Ю5 кл/мл суспен-
зию клеток вдвое разводят свежей средой, содержащей ТС.
Культивирование, очистка и титрование аденовирусов 259
«Здоровые» культуры должны иметь время удвоения около
42—48 ч. Получив 1—2 л клеточной суспензии, культивирова-
ние можно продолжить в сосудах большего объема. Оптималь-
ные условия роста клеток достигаются при заполнении полови-
ны сосуда и поддержании оптимального pH в СО2-инкубаторе.
Естественно, необходимо сохранять стерильность сосуда.
Суспензионные культуры чувствительны к флуктуациям тем-
пературы; поэтому она не должна превышать 38,5 °C. Кроме
того, нельзя исключить возможной гибели основной культуры
из-за поломки аппарата. Поэтому следует вести дублирующую
культуру и обязательно заморозить часть клеток. Эти предосто-
рожности особенно важны при работе с суспензионными куль-
турами, поскольку их приготовление занимает слишком много
времени.
2.1.4. Тестирование микоплазмы
Используемые клетки необходимо постоянно тестировать на
отсутствие микоплазмы, поскольку выход вируса существенно
зависит от контаминации культуры этим агентом [4]. Наиболее
быстро и эффективно микоплазмы тестируют с помощью флуо-
ресцирующих красителей [5].
1. Клетки выращивают на покровных стеклах до состояния
монослоя и промывают небольшим объемом PBS.
2. Клетки инкубируют 3'0 мин при 37 °C в небольшом объеме
PBS, содержащем 0,1 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола
(ДАФИ). (Вместо него можно использовать производное
бензимидола — Hoechst 33258.) Инкубацию проводят во влаж-
ной атмосфере (например, в пластиковой камере с влажной
фильтровальной бумагой).
3. Стекла промывают и помещают на предметное стекло.
Препараты исследуют под флуоресцентным микроскопом с
фильтром возбуждения примерно 365 нм и фильтром эмиссии
примерно 450 нм.
Используемые красители, связываясь с ДНК, начинают
флуоресцировать (свободный краситель не флуоресцирует) и,
таким образом, хорошо окрашивают ядра. Микоплазма обнару-
живается в виде характерных флуоресцирующих гранул в ци-
топлазме и на плазматических мембранах зараженных клеток.
Кроме того, для тестирования микоплазмы могут быть исполь-
зованы стандартные культуры с PPLO-агаром:
PPLO-агар (Difco) 35 г/л
2% лошадиной сыворотки (проверенной на отсутствие ми-
коплазмы)
10% дрожжевого экстракта (свежеполученпого, см. [6])
260
Глава 9
Поверхность агара прокалывают пастеровской пипеткой и
в лунку помещают каплю клеточной суспензии. Чашку инкуби-
руют 3—5 дней в анаэробных условиях при 37 °C. При наличии
микоплазмы в области укола образуются характерные колонии,
напоминающие яичницу «глазунью». В некоторых случаях для
образования характерных колоний необходимо дополнительное
пятидневное культивирование.
В последнее время для тестирования микоплазмы исполь-
зуют коммерческие моноклональные антитела.
2.1.5. Инфицирование клеток
1. Из суспензии клетки осаждают центрифугированием
(5 мин, 500 g), удаляют культуральную среду и ресуспендируют
осадок в среде без сыворотки (в 1/20 первоначального объема).
2. К полученной суспензии клеток добавляют вирус из рас-
чета 1—10 БОЕ/кл. Зараженные культуры инкубируют, слабо
перемешивая, 1 ч при 37 °C.
3. Суспензию разводят теплой средой с 2% СНТ до концент-
рации (3—4)-105 кл/мл. Клетки инкубируют 48—60ч при 37°С.
4. Клетки, растущие в монослое, инфицируют в малом объ-
еме бессывороточной среды после удаления культуральной
(множественность инфекции в этом случае должна составлять
1—10 БОЕ/кл).
5. Зараженные культуры инкубируют 1 ч при 37°C, а затем
добавляют среду, содержащую 0,5% СНТ (при использовании
флаконов объемом 20 унций добавляют 20 мл среды). Инкуба-
цию культур (при 37 °C) продолжают до обнаружения явных
признаков ЦПД.
В течение 2—3 дней большинство клеток, инфицированных
аденовирусами типов 2 и 5, округляются и отрываются от стек-
ла. В случае других вирусов максимальный выход может быть
достигнут при более длительном культивировании.
2.1.6. Заготовки вируса
При культивировании аденовирусов необходимо избегать
накопления дефектных вирусов, количество которых возрастает
по мере пассирования вируса в культуре клеток. Для поддер-
жания гомогенности вирусной популяции лучше всего получать
посевной материал из одной исходной заготовки высеянного
вируса, которая в свою очередь может быть получена из заго-
товки клонированного вируса. Последний следует получить не-
посредственно из изолированной вирусной бляшки. Заготовки
удобно хранить небольшими порциями при —70°C; они хорошо
Культивирование, очистка и титрование аденовирусов 261
QAQ
сохраняются и в виде фторуглеродных экстрактов (см. ниже)
с титрами (в случае аденовирусов типов 2 и 5) в пределах
2—5-Ю9 БОЕ/мл.
2.2. Аденовирусы человека, трудно адаптируемые
к культуре клеток
Не все аденовирусы человека хорошо размножаются в клет-
ках HeLa или КВ и в отдельных случаях (например, для аде-
новируса типа 12) дают более высокие титры в первичных или
вторичных культурах клеток почки эмбриона человека. Неко-
торые аденовирусы кишечника человека не удается размножить
ни в одной из перечисленных выше культур. В этом случае ис-
пользуют клетки человека 293, трансформированные аденови-
русом типа 5 [7]. Методы приготовления культуры почки эмб-
: риона человека и клеток 293 описаны ниже.
| 2.2.1. Культура клеток почки эмбриона человека
Почки человеческих эмбрионов получают в стерильных ус-
ловиях из абортного материала.
1. В стерильной чашке Петри удаляют почечную капсулу,
а затем ткань измельчают скальпелем. Полученный гомогенат
переносят в небольшие конические флаконы с 10 мл среды, со-
держащей 1,25 ед./мл диспазы (нейтральной протеазы).
2. Во флаконы помещают маленький тефлоновый магнит и
осторожно перемешивают материал 20 мин при 37 °C.
3. Крупные кусочки ткани удаляют фильтрованием через
Стерильный муслин. Фильтрат, содержащий главным образом
одиночные клетки, центрифугируют 5 мин при 500 g.
4. Осадок клеток для удаления излишков протеазы аккурат-
но промывают 10 мл культуральной среды с 5% ЭТС. Клетки,
суспендированные в культуральной среде, рассевают в стеклян-
ные или пластиковые флаконы либо в роллерные сосуды (200 мл
суспензии на роллерный сосуд емкостью 80 унций). Примерная
концентрация клеток при посеве должна составлять 1-10s кл/мл.
5. Клетки, образовавшие плотный монослой, можно пересе-
ять для получения вторичной культуры. Кроме этого, монослой
можно инфицировать вирусом в небольшом объеме (0,1—
1 БОЕ/кл).
Явные признаки ЦПД, как правило, обнаруживаются через
2—3 дня культивирования при 37 °C. Инфицированные клетки
собирают и экстрагируют по методике, описанной ниже.
2. 2.2. Культивирование клеток 293
Данная линия была получена из клеток почки человеческого
эмбриона после трансфекции их ДНК аденовируса типа 5, об-
работанной ультразвуком. Как выяснилось, в клетках 293 до-
18—369
262
Глава 9
вольно хорошо размножаются кишечные аденовирусы, которые
не удается культивировать в других известных клеточных ли-
ниях человека [8]. Клетки 293 растят в монослойной культуре,
в обычной культуральной среде, содержащей 10% СНТ. Куль-
туры рассевают (1:3) по стандартной методике, используя
смесь трипсина с версеном. Клетки 293, как правило, не обра-
зуют плотного монослоя, довольно гетерогенны по своей морфо-
логии и имеют ряд характерных свойств, присущих трансфор-
мированным клеткам. Добавляя в культуральную среду ЭТС,
удается получить относительно плотный монослой клеток, ко-
торый необходим при тестировании вируса методом бляшек.
Клетки 293, как правило, лучше растут на посуде из пластика.
2.3. Вирусы других видов
Первичные или вторичные культуры эмбриональных клеток
или клеток почки соответствующих видов животных наиболее
удобны при культивировании аденовирусов (необходимую ли-
тературу можно найти в обзоре [2]).
2.3.1. Аденовирусы обезьян
Наиболее чувствительны к аденовирусам обезьян первичные
или вторичные культуры клеток почки зеленой мартышки Сег-
copithecus aethiops. Кроме того, имеются сообщения об успеш-
ном размножении этих вирусов в клетках некоторых линий
человека, например Нер-2.
2.3.2. Аденовирусы мышей
Для размножения этих вирусов широко используют культу-
ры ткани мышиных эмбрионов. Имеются сведения об эффек-
тивном размножении мышиных аденовирусов в клетках ли-
нии ЗТЗ (перевиваемая линия мышиных эпителиальных кле-
ток) [9].
2.3.3. Аденовирусы крупного рогатого скота
Для выращивания этих вирусов используют клеточные линии
почки и яичника коров.
2.34. Аденовирусы птиц
Данные вирусы хорошо размножаются в тканевых культу-
рах куриной печени, почки и селезенки [10].
Культивирование, очистка и титрование аденовирусов 263
3. Очистка
Созревание аденовирусов происходит в ядрах зараженных
клеток. Вирусы этой группы выходят в цитоплазму и культу-
ральную среду, разрушая клетки. Таким образом, как правило,
большая часть вируса (до 90%) ассоциирована с клеткой,
и эффективность высвобождения вируса из ядерного и клеточ-
ного материала зависит от степени разрушения ядерных мемб-
ран. В клетках, зараженных вирусом, ядерные мембраны до-
вольно хрупкие, поэтому на поздних стадиях инфекции вирус
легко переходит в цитоплазму. Существует множество методов
разрушения клеток. Выбор того или иного метода для каждого
конкретного случая зависит от количества и природы клеток,
подлежащих экстракции. Предлагаемый нами метод удобен для
очистки аденовируса 5 типа [11].
3.1. Экстракция инфицированных клеток
1. Инфицированные клетки осаждают центрифугированием
(5 мин, 500 g) и ресуспендируют в небольшом объеме фосфат-
ного буфера (10 мМ фосфат, pH 6,8). На 2-107 клеток исполь-
зуют 1 мл буфера. Суспензию инфицированных клеток, полу-
ченную на этой стадии, удобно хранить при —70 °C.
2. Суспензию клеток гомогенизируют в высокооборотном
смесителе (например, Waring Blender) на ледяной бане при-
мерно 1 мин в равном объеме фтористого углерода (Arklone
PICI Ltd.). При этом происходят разрушение клеток и денату-
рация многих клеточных белков, хотя вирусные частицы оста-
ются неповрежденными. Могут быть использованы и другие
методы разрушения клеток (замораживание и оттаивание, об-
работка ультразвуком). Выбор того или иного метода гомоге-
низации определяется многими факторами, например такими,
как объем клеточной суспензии.
3. Экстракт центрифугируют 5 мин при 500 g. В дальнейшей
работе используют водную фракцию, которая в случае хороше-
го выхода вируса должна опалесцировать. Фракцию фтористого
углерода и интерфазу, содержащую разрушенный клеточный
материал, можно повторно экстрагировать равным объемом
свежего буфера. Обе водные фракции затем объединяют. Про-
водить экстракцию более чем два раза, как правило, не имеет
смысла.
3.2. Очистка вируса из экстрактов
инфицированных клеток
Водную фракцию, полученную после экстракции клеток
фтористым углеродом, аккуратно наслаивают на ступенчатый
градиент хлорида цезия, приготовленный в 5-мл центрифужных
18*
264
Глава 9
Рис. 9.3. Цент-
рифугирование
в градиенте
плотности экс-
тракта клеток,
инфицирован-
ных аденовиру-
сом. Полоса, со-
держащая ви-
рус, указана
стрелкой
пробирках (0,8 мл раствора плотностью 1,45 г/мл
и 1,5 мл раствора плотностью 1,33 г/мл в 5 мМ
трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,8). Градиент цент-
рифугируют 90 мин при 90 000 g. При больших
объемах вируссодержащего экстракта градиент
готовят в 15-мл пробирках (1,5 мл раствора
плотностью 1,45 г/мл и 2,5 мл раствора плотно-
стью 1,33 г/мл). Центрифугирование в этом слу-
чае продолжают 2 ч при 90 000 g. Плотность
растворов CsCl можно определить, измеряя их
коэффициенты преломления рефрактометром
Аббе и пользуясь следующим соотношением:
р25= 10,8661 nD—13,4974, где рг5 — плотность при
25 °C, a tin — коэффициент преломления.
При скоростном центрифугировании в ука-
занном выше режиме вирус собирается в ин-
терфазе между двумя растворами разной плот-
ности и может быть обнаружен визуально по
опалесценции. Другие полосы, расположенные
выше, соответствуют «растворимым» антиге-
нам— избытку структурных компонентов вируса
(рис. 9.3). При центрифугировании некоторых
образцов непосредственно над вирусной полосой
обнаруживается полоса (полосы) дефектного,
или «пустого», вируса. Зону, содержащую вирус,
можно отобрать несколькими методами, напри-
мер прокалывая пробирку сбоку или снизу. Наи-
более удобно и экономично фракционирование
градиента с помощью перистальтического насоса
(гл. 2, рис. 2.3). Фракцию, содержащую вирус,
идентифицируют по опалесценции.
Вирус, полученный этим методом, загрязнен
клеточными компонентами [12]. Для освобож-
дения от них необходима дополнительная очист-
ка равновесным центрифугированием.
Фракцию, содержащую вирус, разводят в соотношении 2: 1
трис-ЭДТА буфером. Разведенную фракцию наслаивают на пре-
формированный ступенчатый градиент CsCl, состоящий из
1,5 мл раствора плотностью 1,33 г/мл и 1 мл раствора плотно-
стью 1,45 г/мл. Градиент готовят в 5-мл пробирке. Центрифуги-
руют 18 ч при 100 000 g. Опалесцирующая полоса, содержащая
вирус, формируется в зоне плотностью 1,34—1,35 г/мл. «Раство-
римые» антигены уравновешиваются при более низкой плотно-
сти— примерно при 1,3 г/мл.
Культивиоование, очистка и титрование аденовирусов 265
3.3. Свойства очищенного вируса
Очищенный вирус, находящийся в суспензии, опалесцирует.
Он может храниться в гипертоническом растворе CsCl при 4 °C
около 4—5 дней. Не рекомендуется проводить диализ против
гипотонических буферов, поскольку при этом возможны агре-
гация и распад вирусных частиц. Замену буфера следует про-
водить при помощи гель-фильтрации только что очищенного
вируса, используя сефадекс марки G-25 или G-50 и соответст-
вующий буфер. В изотоническом или гипотоническом буфере
вирус практически нестабилен. Некоторого увеличения стабиль-
ности можно добиться добавлением сахарозы (до 1%) или гли-
церина (до 10%).
4. Титрование вируса
Из множества методов, применяемых для титрования адено-
вирусов, мы опишем три следующих: титрование вируса мето-
дом бляшек, титрование вируса по ЦПД определением конечной
точки и метод флуоресцирующих фокусов.
4.1. Титрование вируса методом бляшек
1. Для получения монослоя за день до постановки экспери-
мента высевают примерно по 2-Ю6 клеток HeLa на чашки Петри
диаметром 50 мм.
2. Готовят последовательные логарифмические разведения
вируса на бессывороточной среде. Аликвоты каждого разведе-
ния вносят в три чашки, предварительно удалив из них куль-
туральную среду.
3. Клетки инкубируют с вирусом около 90 мин при 37°C.
После окончания инкубации супернатант удаляют и монослой
заливают средой с агаром, приготовленной по следующей про-
писи:
На 100 мл среды:
20 мл 2,5%-ного водного раствора агара Нобль
20 мл пятикратной среды (без глутамина) ;
10 мл триптозофосфатного бульона (2,95 г на 100 мл)
9 мл бикарбоната натрия (2,25 г на 100 мл)
2 мл СНТ
2 мл 1 М MgCl2
По 100 ед. пенициллина и стрептомицина
2 мл глутамина (2,9 г на 100 мл)
Воды до 100 мл
Расплавляют агар, а затем охлаждают его до 50°C. Осталь-
ные компоненты среды перемешивают друг с другом, подогре-
266
Глава 9
вают до 42 °C и добавляют к агару, устанавливая температуру
45 °C. В каждую чашку наливают по 5 мл приготовленной сре-
ды и охлаждают до затвердения агара. Чашки инкубируют при
37°C в течение 4 дней в атмосфере 5%-ного СО2.
4. Через 4 дня добавляют еще 5 мл среды с агаром и про-
должают инкубацию еще в течение 4—5 дней. Как правило,
бляшки формируются к концу этого срока. Они становятся ви-
димыми после фиксации и окрашивания (рис. 9.4). Для титро-
Рис. 9.4. Бляшки аденовируса. На чашке, расположенной слева, можно насчи-
тать 20 бляшек (по краям чашки заметно разрушение монослоя). На чашке
справа — контрольная, незараженная культура
вания аденовирусов методом бляшек клеточный монослой дол-
жен оставаться интактным на протяжении 8—10 дней культи-
вирования; поэтому в данном случае особое значение имеет со-
стояние используемых клеток. Например, клетки, зараженные
микоплазмой, не образуют стабильного монослоя и поэтому не
пригодны для данного метода. Точность подсчета зависит от
количества бляшек; идеальные результаты получают, если на
каждой чашке Петри сформировалось 20—50 бляшек.
5. Клетки фиксируют 10 мин раствором формалина (4%-ный
формалин в 0,15 М NaCl), а затем окрашивают 5 мин кристал-
лическим фиолетовым (0,1% в 2 %-ном водном этаноле). При
необходимости монослой может быть окрашен витальным кра-
сителем нейтральным красным (при этом на клетки наносят
2 мл агарового покрытия с 0,01% красителя на 6—7 день куль-
тивирования). В этом случае на четвертый день необходимо
нанести только 3 мл агарового покрытия [13].
Культивирование очистка и титрование аденовирусов
267
Рис. 9.5. Титрование аденовируса по ЦПД (каждое разведение титруют 3 ра-
за). Лунки D12, Е12 и F12 — контрольные незараженные культуры. В лунки
1—6 рядов А, В и С внесены десятикратные разведения вируса до конечного
разведения 10~6, далее — двукратные разведения (оставшиеся лунки рядов А,
В, С и ряды D, Е, F). Конечная точка в данном случае находится между
лунками 4 и 5 рядов D, Е, F, что соответствует титру 2-Ю9 ЦПД ед./мл
4.2. Титрование вируса по ЦПД определением
конечной точки
1. В лунки 96-луночного планшета для микротитрования
разливают по 100 мкл среды с 0,5% ТС. Аликвоты каждого
разведения вируса вносят в три лунки.
2. В каждую лунку добавляют по 100 мкл суспензии клеток
HeLa, снятых с монослоя (3-ГО5 кл/мл), в той же среде с ТС.
Планшеты инкубируют 3—4 дня при 37°C в атмосфере 5%-но-
го СО2.
3. Для выявления ЦПД планшет просматривают под микро-
скопом. Зная кратность разведений, определяют титр вируса
по тому разведению, которое вызывает 50% ЦПД. Увеличивая
время инкубации, можно повысить и чувствительность метода.
Для достижения максимальной чувствительности следует уве-
личить время титрования до нескольких недель, добавляя све-
жие порции среды и при необходимости полностью заменяя
среду. Во всех случаях необходимо просматривать неинфици-
рованные (контрольные) культуры под микроскопом. Клетки
фиксируют, окрашивают, как описано выше, и определяют титр
визуально (рис. 9.5). В литературе описан автоматический ме-
тод определения ЦПД [14].
268
Глава 9
4.3. Метод флуоресцирующих фокусов
1. В 96-луночном планшете для культивирования клеток го-
товят разведения вируса на среде с 0,5% СНТ. Конечный объем
каждого разведения должен составлять 100 мкл. Аликвоты каж-
дого разведения вируса вносят в три лунки.
2. В каждую лунку добавляют равный объем суспензии сня-
тых с монослоя клеток HeLa (3-105 кл/мл) в той же среде с ТС.
Планшет инкубируют в атмосфере 5%-ного СО2 при 37°C около
30 ч. (Время инкубации зависит от особенностей используемых
клеток и вируса.)
3. Закончив инкубацию, среду из лунок аккуратно отсасы-
вают, клетки фиксируют 5 мин в ледяном 1%-ном формалине
с 2% сахарозы.
4. Клетки осторожно промывают PBS, а затем в каждую
лунку добавляют по 10 мкл антивирусных антител, разведен-
ных в PBS до нужной концентрации. В работе можно исполь-
зовать мышиные моноклональные антитела [15] или поликло-
нальные антитела к очищенным вирусным компонентам, на-
пример гексонам. В последнем случае необходима предвари-
тельная адсорбция сыворотки клетками HeLa (см. ниже).
5. Планшет инкубируют 30 мин при 37°C во влажной ат-
мосфере, а затем из каждой лунки осторожно отсасывают ан-
титела. Каждую лунку трижды промывают PBS (250 мкл на
1 лунку) и добавляют в них по 10 мкл разбавленных, конъюги-
рованных с флуоресцеином антител против мышиных иммуно-
глобулинов (кроличьих либо других в зависимости от исполь-
зуемых первых антител). Флуоресцирующая сыворотка должна
быть предварительно адсорбирована клетками HeLa. Для этого
отмытую суспензию клеток HeLa инкубируют 18 ч на холоду
с флуоресцирующими антителами в присутствии ингибиторов
протеаз. Готовые для работы антитела, не дающие фоновой
флуоресценции, получают центрифугированием (500 g, 5 мин)
инкубационной смеси и фильтрацией супернатанта через нитро-
целлюлозный фильтр с диаметром пор 300 мкм.
6. Планшет повторно инкубируют 30 мин во влажной атмо-
сфере при 37 °C. Затем флуоресцирующие антитела удаляют и
трижды промывают каждую лунку PBS.
7. Лунки исследуют под инвертированным флуоресцирующим
микроскопом. Титр вируса можно определить, если правильно
выбрано время фиксации культур. В оптимальном случае в
культуре должны наблюдаться одиночные фокусы флуоресцен-
ции при отсутствии выраженной вторичной инфекции. Основы
этого метода предложены Филипсоном [16].
Культивирование, очистка и титрование аденовирусов 269
4.4. Общие замечания
Наиболее точным методом титрования, несомненно, является
метод бляшек. Однако он предполагает сохранение стабильного
монослоя клеток при длительном культивировании. Метод тит-
рования вируса по ЦПД определением конечной точки, веро-
ятно, наиболее прост в исполнении и достаточно чувствителен.
В большинстве случаев можно ограничиться использованием
этого метода. Метод флуоресцирующих фокусов, хотя и зани-
мает меньше всего времени, однако требует большого количе-
ства реактивов и предварительного определения оптимального
срока для подсчета фокусов первичной инфекции.
Литература
1. Wigand R., Bartha A., Dreijin R. S., Esche H., Ginsberg H. S., Green M„
Hierholzer J. C., Kalter S. S., McFerran J. B., Pettersson U„ Russel W. C.,
Wadell G. (1982). Intervirology, 18, 169.
2. Andrewes С. H., Pereira H. G., Wildy P. (1978). In: Viruses of Vertebrates,.
Balliere and Tindall, 4th Edition.
3. Tooze J., ed. (1980). DNA Tumor Viruses, published by Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York.
4. Rouse H. C., Bonifas V. H., Schlesinger R. IV'. (1963). Virology, 20, 357.
5. Russell W. C., Newman C., Williamson D. H. (1975). Nature, 253, 461.
6. Lemcke R. M. (1965). Lab. Pract., 14, 712.
7. Graham F. L., Smiley J., Russell W. C., Nairn R. C. (1977). J. Gen. Virol.,
36, 59.
8. Takiff H. E., Straus S. E„ Garon C. F. (1981). Lancet, 832.
9. Larsen S. H„ Nathans D. (1977). Virology, 82, 182.
10. Gelderblom H., Maichle-Laupe I. (1982). Arch. Virol., 72, 289.
II. Winters W. D., Russell W. C. (1971). J. Gen. Virol., 10, 181.
12. McIntosh K., Payne S., Russell W. C. (1971). J. Gen. Virol., 10, 251.
13. Williams J. F. (1970). J. Gen. Virol., 9, 251.
14. McAleer W. J., Miller W. I., Hurni W. M., Machlowitz R. A., Hilleman M. R..
(1983). J. Biol. Stand., 11, 241.
15. Russell W. C., Patel G., Precious B., Sharp I., Gardner P. S. (1981). J. Gem.
Virol., 56, 393.
16. Philipson L. (1961). Virology, 15, 263.
ГЛАВА 10
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ
И ОЧИСТКА ГЕРПЕСВИРУСОВ
Р. Киллингтон и К. Пауэлл
1. Введение
В группу герпесвирусов входят, вероятно, более 70 вирусов,
имеющих широкий круг хозяев (например, устриц, рыб, грибов
и человека). Характеристика и классификация вирусов этой
труппы детально рассмотрены Мэтьюсом [1]. Герпесвирусы
подразделяют на три подсемейства: а-герпесвирусы (в него
входят вирус простого герпеса типов 1 и 2, вирус псевдобешен-
•ства, вирус аборта лошадей, вирус инфекционного ринотрахеита
крупного рогатого скота и, вероятно, вирус герпеса кошек);
^-герпесвирусы (цитомегаловирусы человека и мышей); у-гер-
песвирусы (вирус Эпштейна — Барр и герпесвирус саймири).
Разделение на подсемейства основано на нескольких критериях,
в частности на характере репликации вирусов, круге хозяев,
белковом составе и структуре генома.
В этой главе мы обсудим культивирование, очистку и титро-
вание герпесвирусов, взяв в качестве примера по одному пред-
ставителю каждого из подсемейств, указанных выше. Особое
внимание, однако, будет уделено вирусам простого герпеса —
наиболее интенсивно изучаемым вирусам этой группы. Коротко
•будут рассмотрены цитомегаловирус человека и герпесвирус
саймири.
2. Вирусы простого герпеса типов 1 и 2
Эти два вируса входят в а-подгруппу герпесвирусов. Они
вызывают разнообразные заболевания человека, такие, как вос-
паление десен, стоматит, менингит, энцефалит и венерическую
форму воспаления гениталиев. Эти вирусы вызывают заболева-
ния в ослабленных организмах. Некоторые факты указывают на
связь вируса простого герпеса типа 2 (ВПГ-2) с раком шейки
матки [2], а вируса простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) с неко-
торыми другими злокачественными новообразованиями [3].
Именно поэтому данным герпесвирусам, в особенности послед-
ние 10 лет, уделяют пристальное внимание. За последнее время
были разработаны высокоэффективные методы наращивания,
очистки и титрования этих вирусов. Методы изучения ВПГ-1
и ВПГ-2 сходны между собой, и поэтому они изложены в одном
^разделе.
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов 271
2.1. Получение заготовок вируса
2.1.1. Клетки
Широкий круг хозяев ВПГ-1 и ВПГ-2 позволяет получать
заготовки вирусов на различных клетках. Тем не менее выбор
чувствительной культуры не прост из-за того, что выход виру-
сов в различных клеточных линиях широко варьирует. На прак-
тике для получения заготовок вируса часто используют клетки
линии Нер-2 [4] или ВШ< с13 [5]. Работы, проведенные с
ВПГ-1 и ВПГ-2 в нашей лаборатории, показывают, что выход
различных штаммов отличается примерно в ГО раз для данных
клеточных линий. Хотя из этих двух линий клетки ВНК менее
требовательны к условиям культивирования, клетки обеих ли-
ний достигают высокой плотности в роллерных сосудах как из
стекла Winchester, так и из пластика. В сосудах такого боль-
шого объема особенно важно поддерживать оптимальный pH.
При использовании бикарбонатного буфера культуральную сре-
ду необходимо насыщать СО2 еще до стерилизации. В против-
ном случае клетки следует выращивать в атмосфере с высоким
содержанием СО2. Аппаратуру для одновременного культиви-
рования большого количества роллерных сосудов можно купить
или изготовить в мастерских. Например, на рис. ГО. 1 сфотогра-
фирован аппарат, изготовленный из рамы Dexion, колес Mecca-
no и моторов Parvalux в тропическом исполнении.
Клетки указанных выше линий способны расти в различных
питательных средах. Обычно мы используем автоклавируемую
среду Игла в модификации Глазго с 10% ТС. Для клеток ли-
нии ВНК в среду следует добавить 10% триптозофосфатного
бульона. Окончательный выбор клеточной линии зависит от ря-
да факторов, в частности от характера эксперимента (см. ниже).
Естественно, что используемые для приготовления вирусных за-
готовок клеточные линии должны быть предварительно прове-
рены на отсутствие микоплазмы.
2.1.2. Методы заражения
Основной метод заражения описан Ватсоном и др. [5]. Це-
лесообразно перед началом работы получить первичную и вто-
ричную (один пассаж из первичной) заготовки вируса, которые
по возможности следует разместить в нескольких холодильни-
ках на —70 °C. Как правило, рабочие заготовки получают из
вторичных и таким образом исключают длительное пассирова-
ние вируса. При этом сводится к минимуму возможность полу-
чения вирусных заготовок, сильно отличающихся по номеру
пассажа, что создает трудности в прямом сравнении данных,
полученных в разных экспериментах. В большинстве случаев
для получения вирусных заготовок мы используем роллерные
272
Глава 10
Рис. 10.1. Устройство для крупномасштабного выращивания клеточных куль-
тур. Такое оборудование можно изготовить в мастерских
культуры, почти достигшие монослоя. Во флаконах обычно со-
держится 5-108 клеток ВНК или 3108 клеток Нер-2. Высокая
концентрация клеток позволяет получить и высокий титр вирус-
ной заготовки. Клеточный монослой промывают для удаления
слабо прикрепленных клеток (особенно тщательно это делают
при использовании клеток Нер-2) и затем из вторичной заго-
товки вносят разведенный вирус. Чаще всего мы предпочитаем
заражать клетки при множественности инфекции 0,001—-
0,01 БОЕ/кл, что предотвращает накопление дефектных вирио-
нов [6, 7].
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
273
2.1.3. Наращивание вируса
Любая стандартная среда для культивирования клеток мо-
жет быть использована для получения вирусных заготовок.
Обычно для выращивания клеток мы используем среду с 10%
ТС. Уменьшение концентрации сыворотки приводит к некото-
рому снижению выхода вируса, однако при этом экономится
дорогостоящая сыворотка. Заготовки вируса получают, исполь-
зуя следующую методику:
1. Вирус адсорбируют 1 ч в небольшом объеме среды, до-
статочном для покрытия монослоя (в случае роллерного сосу-
да— примерно 20 мл). Множественность инфекции при этом
составляет 0,001—0,01 БОЕ/кл.
2. Добавляют необходимое количество среды для культиви-
рования клеток (примерно 200 мл для роллерного сосуда).
3. Клетки инкубируют 2—3 дня при соответствующей тем-
пературе (32 или 37°C). Однако продолжительное наращивание
вируса при низкой температуре (32 °C) может привести к полу-
чению материала, содержащего большой процент температур-
но-чувствительных мутантов или по крайней мере вируса, луч-
ше растущего при 32 °C, чем при 37 °C. По этой причине мы
предпочитаем инкубацию при 37 °C.
4. Через 2 дня инкубации при 37 °C начинают появляться
признаки ЦПД, однако сроки их появления могут варьировать
в зависимости от штамма вируса и линии клеток. Как правило,
ВПГ-2 размножается заметно быстрее, чем ВПГ-1. Как извест-
но, существует два вида ЦПД: синцитиальное (например, вы-
зываемое штаммом HFEM вируса ВПГ-1) и несинцитиальное
(например, вызываемое штаммом МР17 вируса ВПГ-1). Мор-
фологическая картина ЦПД, вызванного этими двумя штамма-
ми, показана на рис. 10.2.
5. Клетки собирают после максимального проявления при-
знаков ЦПД. Методика сбора клеток зависит от штамма вируса
и линии клеток. Так, в случае штамма HFEM и клеток линии
ВНК основную массу среды можно удалить из культурального
сосуда без потери вируса (поскольку лизируется и отрывается
от подложки небольшое число клеток). Затем клетки собирают
в оставшуюся среду стерильной резиновой палочкой и центри-
фугируют при малой скорости. При работе с другими штаммами
вируса, например штаммом 186 (ВПГ-2), инфицированные
клетки удается собрать только центрифугированием культу-
ральной среды, поскольку большая часть клеток отрывается
от поверхности сосуда. Если лизис клеток уже произошел, не-
обходимо использовать среду как составную часть заготовки
вируса. Клетки собирают центрифугированием, а затем ресу-
спендируют в выбранной среде, например стерильной дистилли-
274
Глава 10
Рис. 10.2. ЦПД ВПГ-1 на клеточный монослой. А — синцитиальный штамм,
Б — несинцитиальный штамм. (Дь Д; А2, Б2—100 и 400 X соответственно);
рованной воде или же обычной культуральной среде. Заготовки
можно ресуспендировать в среде с криопротектором (например,,
глицерином), хотя это и не является строго обязательным..
6. Одной из серьезных проблем, возникающих по мере по-
лучения заготовок вирусов герпеса, является их очистка от
клеточного материала, поскольку большая часть вируса тесно
связана с клетками. Клетки разрушают, проводя ряд циклов
замораживания и оттаивания, однако это может привести и
к снижению титра вируса. Обработка клеток ультразвуком
небезопасна из-за возможного образования аэрозолей, содер-
жащих инфекционный вирус. Поэтому лучше всего проводить
дезинтеграцию в ультразвуковой бане в закрытом сосуде. К со-
жалению, мы не можем рекомендовать какую-либо определен-
ную марку ультразвукового дезинтегратора. Необходимо про-
верять эффективность каждого из них. Вирусные заготовки
обрабатывают ультразвуком до полного разрушения клеток.
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
275'
Процедуру проводят в ледяной воде, чтобы не допустить силь-
ного нагревания!
7. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием, готовые
заготовки разливают в ампулы и хранят, как описано ниже.
Заготовки вируса герпеса длительное время лучше всего
хранить при —70 °C. Ни при каких обстоятельствах не следует
хранить вирусы герпеса при —20°C, поскольку это приводит
к значительному снижению инфекционного титра. В течение
нескольких дней штамм HFEM (ВПГ-1) можно хранить при
4 °C, однако этот срок варьирует для разных штаммов. Оттаи-
вание вируса необходимо проводить быстро, по возможности
следует избегать повторного замораживания и оттаивания. Тем
не менее мы показали, что штамм HFEM (ВПГ-1), имеющий
высокий титр в культуральной среде, теряет всего лишь 0,51og
инфекционного титра при пятикратном замораживании и оттаи-
вании. Мы обнаружили, что и при быстром оттаивании вирус-
ных заготовок, хранящихся при —70 °C даже в течение 5 лет,
не происходит снижения титра вируса. Перед использованием
каждую заготовку необходимо проверить на стерильность как
на твердой, так и в обогащенной жидкой бактериальных средах.
Лучше всего проверять заготовки под электронным микроско-
пом, чтобы исключить использование тех заготовок, в которых
велико соотношение физических и инфекционных частиц. Ме-
тоды подсчета вирусных частиц изложены в разд. 2.2. Однако
на практике мы установили, что с помощью описанных выше
методов удается получать заготовки с титрами около 109—
1010 БОЕ/мл и низкими соотношениями физических и инфек-
ционных частиц.
2.2. Электронная микроскопия (подсчет частиц)
Подсчет частиц по методу «loop drop» (нанесение капли на
сетку с помощью петли) предложен Ватсоном [8]. Вирус раз-
водят в воде или в растворе, содержащем 0,2 мг ВСА/мл в слу-
чае вирусных препаратов с концентрацией белка ниже 0,2 мг/мл.
В любом случае вирус разводят до концентрации 109—1010 час-
тиц/мл. Суспензию смешивают с равным объемом (0,1 мл) ка-
либровочного материала. Мы рекомендуем использовать поли-
стироловый латекс «DOW», содержащий (3,0—3,5)-109 латекс-
ных частиц/мл. К полученной смеси добавляют 0,12 мл нейт-
рального 2%-ного (вес на объем) раствора фосфовольфрамата
натрия. Одну каплю полученного материала наносят, а затем
высушивают на формваровых сетках с ячейками размером:
400 меш. Сетки просматривают под электронным микроскопом
при увеличении 40 000. Частицы, видимые под микроскопом,
классифицируют как «голые», «покрытые оболочкой» (прони-
276
Глава 10
цаемые) и «покрытые оболочкой» (непроницаемые). Эти части-
цы представлены на рис. 10.5. Непроницаемые, покрытые обо-
лочкой частицы выглядят как плотные белые шарики, однако
можно показать их способность количественно превращаться
в проницаемые, покрытые оболочкой частицы. Как правило,
для характеристики каждого образца вируса просчитывают
пять групп из 20 латексных частик.
2.3. Определение инфекционного титра
Вирусы простого герпеса относительно легко титруются раз-
личными методами. Мы обычно используем суспензионный ме-
тод [9] либо метод монослойных культур.
2.3.1. Титрование в суспензионной культуре
1. Готовят разведения вируса на культуральной среде. К 2 мл
каждого разведения добавляют 8-106 клеток ВНК.
2. Суспензию при постоянном перемешивании инкубируют
30 мин при 37°C. Затем добавляют 8 мл 2%-ной КМЦ в куль-
туральной среде и перемешивают с вирусом и клетками. Для
данного метода содержание ТС в среде может составлять не
более 5%.
3. Приготовленные суспензии разливают на две чашки Петри
диаметром 60 мм и инкубируют 2—3 дня при 37 °C в атмосфере
5%-ного СО2.
4. Монослой клеток фиксируют при помощи обычных фик-
саторов и окрашивают генциан-виолетом или метиленовым си-
ним (1%-ные водные растворы).
Вирусные бляшки можно обнаружить и невооруженным гла-
зом, однако для их подсчета следует воспользоваться стерео-
микроскопом. Бляшки вирусов простого герпеса различаются
по морфологии. Некоторые штаммы вызывают слияние клеток,
что приводит к образованию больших синцитиальных бляшек
(например, штамм HFEM), в то время как другие штаммы
(например, МР17) вызывают округление клеток. На рис. 10.3
для сравнения показана морфология описанных выше бляшек.
Однако во многих случаях продолжительная инкубация клеток
с вирусом, вызывающим образование синцитиев, приводит к из-
менению картины ЦПД. Бляшки при этом приобретают несин-
цитиальный характер.
2.3.2. Титрование на монослойной культуре
При использовании данного метода особенно важен выбор
соответствующей клеточной линии. Как правило, инфицирова-
ние монослоя клеток ВНК приводит к образованию мелких
бляшек. Кроме того, частота их возникновения, как свидетель-
ствует наш опыт, также небольшая. При титровании вируса на
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
277
Рис. 10.3. Морфология бляшек, образованных ВПГ-1. Слева — бляшка синци-
тиального типа (клетки слились). Справа — бляшка несинцитиального типа
(клетки округлились, но не слились)
монослойных культурах мы обычно используем клетки Veto
[10], на которых эффективность бляшкообразования такая же,
а для некоторых штаммов даже выше, чем на ВНК, находя-
щихся в суспензии.
1. Клетки Vero рассевают в количестве 2-Ю6 клеток на чаш-
ку за 18—24 ч до заражения.
2. Из чашек отсасывают среду и клетки инфицируют 0,1 мл
соответствующего разведения вируса (вирус разводят на куль-
туральной среде). Для адсорбции вируса чашки инкубируют
1 ч при 37 °C.
3. В каждую чашку добавляют по 5 мл 2 %-ной КМЦ, при-
готовленной на культуральной среде (в данном случае концент-
рация ТС может составлять 5%), и культуры инкубируют при
37 °C. Время инкубации сильно варьирует в зависимости от
штамма вируса. Быстрорастущий ВПГ-2 формирует хорошо
различимые бляшки всего за 2 дня, в случае других вирусов
требуется 4 дня.
4. Клетки фиксируют и окрашивают, как описано выше.
2.3.3. Среды для титрования
Существует множество разнообразных сред, используемых
при титровании суспензионных и монослойных культур (напри-
мер, гепарин, смешанные сыворотки человека и различные ви-
278
Глава 10
ды агара). Тем не менее мы предпочитаем среду, содержащую
КМЦ, поскольку она удобна в работе и не ограничивает рост
бляшек. Однако во время культивирования чашки должны на-
ходиться на ровной поверхности, и работать с ними следует
осторожно, поскольку любое повреждение слоя КМЦ может
привести к искажению картины бляшек.
2.3.4. Метод «оспин»
ВПГ-1 и ВПГ-2 формируют «оспины» на хорионаллантоис-
ной мембране куриных эмбрионов. Существует предположение,
что с помощью этого метода можно различить ВПГ-1 и ВПГ-2
[11].
2.4. Приготовление экстрактов клеток,
инфицированных вирусом
Тотальные гомогенаты клеток, инфицированных вирусом,
или детергентные экстракты таких клеток обычно используются
в качестве антигенов в различных иммунологических реакциях,
таких, как ELISA и RIA. Кроме того, их применяют для имму-
низации при получении гипериммунных антисывороток или мо-
ноклональных антител к белкам ВПГ. Поэтому выбор инфи-
цируемой клеточной линии зависит от дальнейшего использо-
вания антигена.
1. Для радиоиммунологических методов используют клетки
Vero или ВНК, которые заражают при множественности ин-
фекции 10 БОЕ/мл.
2. Клетки вместе с культуральной средой собирают через
18—24 ч после заражения и центрифугируют при малой ско-
рости.
3. Клеточный осадок дважды промывают PBS, а затем ре-
суспендируют в дистиллированной воде таким образом, чтобы
концентрация клеток по возможности составляла 1-108 кл/мл.
4. Суспензию инфицированных клеток разрушают в ультра-
звуковой бане и хранят при —70 °C. На рис. 10.6 показаны
полипептиды, присутствующие в такой фракции.
Для некоторых методов, например иммунопреципитации,
требуется фракция растворимого антигена. Такую фракцию
получают центрифугированием (38 000 об/мин, 1 ч в роторе
Sorvall АН627) суспензии разрушенных инфицированных кле-
ток. С целью увеличения количества мембранных белков в этой
фракции можно использовать детергенты [12]. Свойства полу-
ченного антигена необходимо проверить при помощи ELISA
или диффузией в геле по методу Оухтерлони, используя кро-
личью гипериммунную сыворотку к зараженным вирусом гер-
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов 279
песа клеткам. Антиген для иммунизации получают, как описано
выше, однако выбору клеток уделяют особое внимание. Напри-
мер, для иммунизации животных с целью получения монокло-
нальных антител используют антиген, выделенный из инфици-
рованных L-клеток мыши, в то время как для получения кро-
личьих сывороток — антиген, выделенный из инфицированных
клеток почки кролика RK13 [5, 14], растущих в присутствии
5% кроличьей сыворотки.
2.5. Получение очищенного вируса
Методы выделения вирусов простого герпеса довольно слож-
ны по сравнению с другими вирусами. Более того, метод, хоро-
шо зарекомендовавший себя при работе с одним штаммом ви-
руса на определенной клеточной линии, может оказаться не-
приемлемым для других штаммов на той же линии или того же
штамма вируса на других клетках. Поэтому мы опишем два
метода. Мы показали, что первый метод можно успешно при-
менять для получения штамма HFEM и некоторых других при
условии, что для выращивания вируса используют клетки Нер-2.
Данный метод прост и позволяет получать вирусные препараты
высокой степени чистоты. Второй метод позволяет достигнуть
удовлетворительных результатов со всеми штаммами вируса и
различными типами клеток. Для выбора оптимальных условий
получения высокого выхода вируса и качественного исходного
материала для дальнейшей очистки следует вначале изучить
кривую роста исследуемого вирусного штамма на различных
линиях клеток. На рис. 10.4 показана кривая роста штамма
HFEM на клетках Нер-2 при высокой множественности инфек-
ции и культивировании клеток при 32 °C. Оптимальные условия,
которые требуются для приготовления исходного материала,
в общих чертах описаны в разд. 2.5.1.
2.5.1. Метод 1 [15]
1. Культуры Нер-2 в состоянии монослоя (в роллерных со-
судах) заражают при множественности инфекции 20—25 БОЕ/кл,
как описано в разд. 2.1.2.
2. После адсорбции вируса зараженные клетки промывают,
добавляют свежую среду и культивируют 2—3 дня при 32 °C.
3. При необходимости радиоактивного мечения вирусоспеци-
фических белков (например, [35S]-метионином или [14С]-ами-
нокислотами) в культуральную среду вносят изотопы через 4 ч
после начала культивирования. (Культуральная среда в этом
случае должна содержать 1/Г0 обычной концентрации метиони-
на и 2% ТС.)
280
Глава 10
4. По окончании культивирования культуральную среду цент-
рифугируют при низкой скорости для удаления клеточного де-
бриса.
5. Вирус осаждают ПЭГ (мол. масса 6000; 8%, вес на
объем) в присутствии 0,5 М. NaCl или центрифугированием
(12 000 об/мин, 2 ч) в роторе GSA в центрифуге Sorvall RCS-5B.
6. Вирус ресуспендируют в трис-буфере низкой молярности,
pH 7,8, содержащем 50 мМ NaCl. Полученную суспензию по
возможности лучше оставить на ночь.
Время, ч
Рис. 10.4. Кривая размножения ВПГ-1 (штамм HFEM) в монослое клеток
Нер-2 при 32 °C. Вирус адсорбирован при множественности инфекции
20 БОЕ/кл. Образцы клеточных лизатов (1) и культуральной среды (2) тит-
ровали методом бляшек. Кривая размножения ВПГ-2 при этих условиях не
показана, однако титр ВПГ-2 в культуральной среде более высокий, что обус-
ловлено лизисом клеток
7. Вирусную суспензию наслаивают на 30 мл 5—45%-ного
градиента сахарозы (техника приготовления градиентов саха-
розы описана в гл. 1) в указанном выше буфере и центрифуги-
руют 1 ч при 12 500 об/мин (Sorvall, ротор АН627). После
центрифугирования в центре градиента четко видна рыхлая бе-
лая полоса очищенного вируса. Эта видимая невооруженным
глазом полоса и есть единственная в градиенте фракция инфек-
ционного вируса.
Полученный вирус уже достаточно очищен (примерно 50 мкг
белка на 1'010 вирусных частиц), и его можно использовать в
различных целях, в частности для выделения вирусной ДНК.
Из фракции вирус легко осадить обычным центрифугированием.
Для получения вирусных препаратов высокой степени чистоты
может быть использован ряд других методов, включая повтор-
ное центрифугирование в градиенте сахарозы или CsCl. Эти
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов 281
методы позволяют получать препараты вируса, в которых от-
ношение белка к числу частиц составляет менее чем 20 мкг
на 1010 частиц.
2.5.2. Метод 2
Данный метод был разработан Спир и Ройзманом [16]
и Хейном и др. [17].
1. Заражение клеток проводят по методу 1.
2. Клетки инкубируют 18—24 ч при 37 °C, затем их снимают
с подложки и центрифугируют при малой скорости.
3. Полученный таким образом клеточный осадок ресуспен-
дируют в стандартном буфере для ретикулоцитов (РСБ) и в те-
чение 10 мин дают клеткам набухнуть. Цитоплазматическую
фракцию клеток получают в гомогенизаторе Даунса.
4. Клеточный гомогенат центрифугируют при малой скорости
для удаления ядер и клеточного дебриса.
5. Супернатант, содержащий большую часть инфекционного
вируса, наслаивают на 5—40%-ный градиент декстрана, при-
готовленный на трис-буфере [17], и центрифугируют 1 ч при
12500 об/мин (Sorvall, ротор АН 627). Фракция вируса видна
невооруженным глазом в центре градиента.
6. Вирус из фракции осаждают центрифугированием в тече-
ние 1 ч при 20 000 об/мин (Sorvall, ротор АН 627).
Полученный вирус уже достаточно очищен и может быть
использован в различных целях. Кроме того, степень чистоты
вируса можно повысить, как описано выше. Очищенный вирус,
полученный любым методом, ресуспендируют в дистиллирован-
ной воде или в соответствующем буфере. Аликвоты суспензии
можно использовать для заражения клеток, подсчета общего
числа частиц и определения концентрации белка. Вирус хранят
при —70 °C, однако следует учитывать, что оттаивание ведет
к частичному разрушению вирусной оболочки. На рис. 10.5 по-
казаны различные вирусные частицы, обнаруженные в препа-
ратах очищенного вируса.
2.5.3. Анализ структурных вирусных полипептидов
В этой главе нам кажется нецелесообразным детальное об-
суждение методов анализа структурных полипептидов очищен-
ных вирусов. В большинстве случаев мы проводим электрофо-
рез в пластинах полиакриламидного геля в присутствии ДДС-Na,
как было описано впервые Даймэком и Ватсоном [18]. Моди-
фикация данного метода изложена в работе [19]. Гели окра-
шивают кумасси бриллиантовым синим, а для авторадиогра-
фического анализа экспонируют с рентгеновской пленкой. На
рис. 10.6 представлены спектры структурных полипептидов
; 19—369
Рис. 10.5. Морфологические типы частиц в очищенных препаратах ВПГ. С по-
мощью изложенных методов установлено, что более 90% частиц имеют морфо-
логию 2а или 26. 1 — «голые» частицы (а — «непроницаемые», б — «проницае-
мые»; 2—частицы, покрытые оболочкой (а — «непроницаемые», б — «прони-
цаемые»); 3 — две частицы под одной оболочкой (а—«проницаемые», б — ве-
роятно, непроницаемый эквивалент а). Микрофотографии сделаны при разных
увеличениях
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
283
ВПГ-1 и ВПГ-2, полученные гель-электрофорезом. Другие ха-
рактеристики этих полипептидов приведены в табл. 10.1.
Таблица 10.1. Свойства и номенклатура некоторых
белков ВПГ-1 и ВПГ-2
ВПГ-2 Свойства ВПГ-1
номер1) белка структур- ный2) ВИ- русный бе- лок молекуляр- ная ' масса (xio-8) молекуляр- иая масса (X 10~3) структур- ный2^ ви- русный белок номер4) белка
ICSP 5—8 NS 182—186 Предранний фос- фопротеин 175 NS ICP 4
ICSP 9 VP5 157 Основной белок капсида 155 VP5 ICP 5
ICSP 10 NS 153 Рибонуклеотидре- дуктаза 149 NS ICP 6
ICSP 11 ICSP 12 NS 146 143 Основной ДНК- связывающий бе- лок 132 NS ICP 8
ICSP 13-15 VP7—8,5 126—140 Гликопротеины gA, gB (для ВПГ-1 —gC) 112—126 VP7—8,5 ICP 9—14
ICSP 22 NS 85—90 Щелочная нуклеа- за (фосфопроте- ин) 85—90 NS ICP 19
NN NN 92 Гликопротеин gE (FC-связываю- щий белок) 80 NN NN
ISP 34—35 NS 54 Белок, ассоцииро- ванный с ДНК- полимеразой 48 NS ICP 29
NN NS 42 4 Тимидинкиназа 44 NS NN
NN NN 53 Гликопротеин gD, ответственный за перекрестную нейтрализацию между ВПГ-2 и ВПГ-1 59 VP18 ICP 31
ICSP 46—47 VP22—23 28—30 Белок капсида 30—33 VP22-23 ICP 39- 40
‘) Номенклатура Пауэл и Картни [19].
2) Номенклатура Спир и Ройзман [16].
•) Молекулярная масса может варьировать от штамма к штамму.
*) Хонес и Ройзман [20].
NS — неструктурный белок;
NN — белок не назван, в ряде случаев идентифицирован неоднозначно.
2.6. Другие а-герпесвирусы
В нашей лаборатории выращены и очищены и многие другие
а-герпесвирусы, включая: вирус мамиллита крупного рогато-
го скота (bovine mammillitis virus — BM.V); вирус псевдобешен-
19*
ВПГ-2 ВПМ
Целые Вадгаые Водные Целые
клетки частицы частицы . клетки
Рис. 10.6. Спектры белков, специфичных для ВПГ-2 и ВПГ-1, полученные
электрофорезом в полиакриламидном геле. Дорожки А и D—экстракты кле-
ток инфицированных ВПГ-2 (А) и ВПГ-1 (D). Дорожки В и С —очищенные
препараты ВПГ-2 (В) и ВПГ-1 (С). Слева числами обозначены белки инфи-
цированных ВПГ-2 клеток, справа —мол. масса-10~3 этих же белков
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
285
ства (вирус болезни Ауески, pseudorabies virus — PRV); вирус
герпеса лошадей типа 1 (equine herpesvirus type 1—EHV-1);
вирус ринотрахеита кошек (feline rhinotracheitis virus — Fetr);
вирус кошачьего сомика (channel catfish virus — CCV). С этими
вирусами работают практически так же, как и с вирусами про-
стого герпеса. Поэтому ниже мы отметим только особенности
работы с каждым из перечисленных выше вирусов.
2.6.1. Вирус мамиллита крупного рогатого скота
и вирус псевдобешенства
Эти вирусы дают на клетках ВНК высокие титры, которые
легко определить суспензионным методом, предложенным Рас-
селом [9]. Для очистки вирусов клетки ВНК заражают с вы-
сокой множественностью инфекции и культивируют при 37 °C
24 ч (PRV) или 48 ч (BMV). На этой стадии вирусы могут
быть очищены, как описано в разд. 2.5.1 и 2.5.2. Таким образом,
получают качественные препараты оболочечных вирусов, бел-
ковый спектр которых представлен на рис. 10.7.
2.6.2. Вирус герпеса лошадей типа 1
Рестрикционный анализ показывает, что разные штаммы
EHV-1 могут принадлежать как субтипу 1, так и субтипу 2.
Первый связан с выкидышами у кобыл, хотя выделяют его и
из респираторного тракта. Второй относится к вирусам «респи-
раторного типа» и не связан с выкидышами [21—23]. Вирусы
субтипа 1 размножаются во многих культурах. В нашей лабо-
ратории мы обычно используем клетки линии RK13, хотя в дру-
гих лабораториях предпочитают использовать клетки лошадей
(например, эмбриональные фибробласты кожи лошадей). Кро-
ме того, вирусы субтипа 1 успешно размножаются в культурах
клеток L-M [24]. Некоторые штаммы субтипа 1 были адапти-
рованы к росту на хомяках [25]. Вирусные изоляты субтипа 2
растут только в клетках лошадей. Используя метод 1, описан-
ный в разд. 2.5.1, можно проводить очистку вирусов обоих суб-
типов. На рис. 10.7 показаны спектры полипептидов EHV-1
(субтипа 1), BMV, PRV, ВПГ-1 и ВПГ-2.
2.6.3. Вирус ринотрахеита кошек
Этот вирус специфичен для клеток кошачьего происхожде-
ния. Культивируют его так же, как и ВПГ-1. Очистку данного
вируса мы проводили по методу, описанному в разд. 2.5.1. Для
наращивания вируса мы используем, как правило, линию кле-
ток кошки, представленную д-ром П. Тэлботом (Wellcome La-
286
Глава 10
Рис. 10.7. Спектры белков очищенных препаратов оболочечных частиц: Е —
EHV-1; В — BMV; Р — PRV. Белки разделены электрофорезом в пластинах 6,
9 и 15%-ного полиакриламидного геля в присутствии DDC-Na. Гели, за
исключением левой половины 15%-ного геля, окрашены кумасси бриллианто-
вым синим. Левая часть 15%-ного геля — авторадиография меченных f35S]-Me-
тионином белков. Черными (для EHV-1) и белой (для PRV) стрелками отме-
чены белки с чрезвычайно низким отношением [35S]-метионина к общему
количеству белка. Числами справа от 9%-ного геля и слева от 15%-ного геля
отмечены белки ВПГ-1 и ВПГ-2
boratories, Beckenham), однако можно использовать эмбрио-
нальные клетки легкого кошки, полученные доктором О. Джар-
ретом и поставляемые фирмой Flow Laboratories, Irvine,
Scotland. Доктор P. Мэйес (Department of Microbiology, Michi-
gan State University) в градиенте тартрата калия успешно вы-
делил вирус из культуральной среды инфицированных клеток
почки кошек Crandell-Rees.
2.6.4. Вирус кошачьего сомика
Данный вирус имеет ограниченный круг хозяев и лучше все-
го размножается в клетках американского сомика-кошки (Brown
Bullhead — ВВ) [26]. Методы культивирования и очистки этого
вируса такие же, как и для ВПГ-1, за исключением того, что
ВВ-клетки и вирус культивируют при 28 °C.
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
28Г
3. Цитомегаловирус человека
p-субгруппа герпесвирусов включает в себя цитомегалови-
русы различных животных. Цитомегаловирусы человека вызы-
вают различные заболевания, особенно у людей с ослабленной
иммунной системой, а также в период беременности. Инфекция
этими вирусами довольно часто приводит к смертельному исхо-
ду либо вызывает сильнейшее истощение больных с естественной
или искусственной иммунной супрессией (например, у больных
лейкемией либо после трансплантации органов). Во время
беременности этот вирус может вызвать уродства плода, выки-
дыши и повышенную чувствительность новорожденных к тяже-
лым инфекциям после родов. Именно по этим причинам в по-
следние 10 лет резко возросла интенсивность изучения цитоме-
галовируса (cytomegalovirus — CM.V). Тем не менее в этой
области в отличие от вирусов простого герпеса не достигнуто
значительного прогресса.
3.1. Получение заготовок вируса
, Репликативный цикл цитомегаловируса человека продолжи-
тельнее, чем штаммов ВПГ. Кроме того, данный вирус прочно
ассоциирован с клеткой и имеет высокую клеточную специфич-
ность. Хотя во многих лабораториях для наращивания этого
вируса используют клетки M.RC-5, Flow 5000 или Нер-2, В. Гиб-
сон (личное сообщение) рекомендует ранние пассажи на фиб-
робластах крайней плоти человека или клетках легкого эмбрио-
на человека. Гибсон культивирует перечисленные клетки в среде
DMEM, содержащей 4500 мг/л глюкозы и 10% ЭТС. В нашей
лаборатории используют клетки MRC-5, культивируемые в сре-
де Игла в модификации Glasgow с 10% ЭТС. Заготовки вируса
получают следующим образом:
1. Не дожидаясь образования плотного монослоя, добавляют
CMV (менее 0,1 БОЕ/кл) в минимальном объеме среды. Ад-
сорбцию вируса проводят 1—2 ч при 37 °C.
2. После адсорбции к клеткам добавляют необходимый объ-
ем культуральной среды и инкубируют их при 37 °C.
3. Через 7—10 дней после заражения старую культуральную
среду заменяют на свежую (с 2% ЭТС). Клетки продолжают
инкубировать при 37 °C до выявления признаков ЦПД (обычно
2—3 нед).
4. Культуры ежедневно просматривают. Когда ЦПД достиг-
нет своего максимума, клетки собирают в культуральную среду
и центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. Собирают супер-
натант.
288
Глава 10
5. Осадок ресуспендируют в небольшом объеме культураль-
ной среды, разрушают в ультразвуковой бане и хранят при
—70 °C.
6. Большая часть вируса содержится в культуральной среде,
поэтому супернатант, полученный на стадии 4, центрифугируют
2 ч при 12000 об/мин в роторе GSA (центрифуга Sorvall
RCS-5B).
7. Полученный осадок ресуспендируют в небольшом объеме
культуральной среды, осторожно разрушают в ультразвуковой
бане и хранят при —70 °C. Данный вирус не так стабилен при
—70 °C, как ВПГ. Поэтому его не следует подвергать частым
замораживаниям и оттаиваниям. Оттаивание CMV, как и ВПГ,
следует проводить быстро в теплой воде.
Рис. 10.8. Сравнение кривых одиночного цикла размножения ВПГ и CMV на
фибробластах человека, a — титр инфекционного штамма ВПГ в культураль-
ной среде; б — титр в культуральной среде (1) и ассоциированного с клеткой
(2) инфекционного штамма CMV. В обоих случаях множественность инфекций
составляет 10 БОЕ/кл. По данным Смита и Де Харвена [27]
3.2. Цикл размножения
Смит и Де Харвен [27] сравнили кривые роста ВПГ и CMV
и определили время наступления тех или иных фаз инфекции.
Результаты этих исследований приведены на рис. 10.8 и в
табл. 10.2. Однако остается непонятным, насколько точно отра-
жают данные кривые последовательность событий в заражен-
ной клетке (см. далее раздел о герпесвирусе саймири). Как
уже отмечалось выше, цикл размножения CMV значительно
длиннее, чем ВПГ.
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
289
Таблица 10.2. Время наступления основных
этапов инфекции CMV и ВПГ. Сравнительные данные,
полученные при помощи электронной микроскопии1)
Этапы Начало события
CMV (дни) ВПГ (часы)
Слияние клеток и округление 0,5 6
Изменения аппарата Гольджи 1 8
Скрытый период 2 2
Появление большого количества гра- 2 3
нул, напоминающих перихроматин Конденсация хроматина Не наблюдается 3
Сборка в ядрах первых капсидов 3 4
Появление первых капсидов, имею- 3,5 5
щих плотную сердцевину «Одевание» ядерной мембраной 3,5 6
Появление «голых» капсидов в цито- 4 6
плазме Появление плотных цитоплаз матиче- 4 Не наблюдается
ских агрегатов Первые высвободившиеся из клетки 4 8
частицы Удвоение ядерной мембраны 4 8
«Одевание» цитоплазматической 4 8
мембраной Лизис клетки 7—8 24—48
’) Таблица составлена по данным Смита и Де Харвена [27].
3.3. Идентификация вируса
Множество попыток было предпринято для разработки удоб-
ных методов титрования медленно растущих вирусов. В боль-
шинстве лабораторий остановились на методе определения ко-
нечной точки TCIDgo. Сложность данной проблемы заключается
в сохранении клеточного монослоя в течение времени, необхо-
димого для формирования бляшек. В нашей лаборатории ис-
пользуют следующую модификацию метода бляшек, рекомен-
дованную Вентвесом и Френчем [28]:
1. Клетки линии MRC-5 высевают в 24-луночные планшеты
или в чашки Петри диаметром 30 мм для культивирования
клеток. Культуры, достигшие состояния монослоя, инфицируют
вирусом, разведенным в 200 мкл культуральной среды.
2. По истечении первого часа адсорбции среду заменяют
на 1%-ную агарозу, приготовленную на культуральной среде
с 2% ЭТС. Клетки инкубируют при 37 °C.
3. Через неделю еще раз добавляют необходимое количество
агарозы (в среде, содержащей 2% ЭТС) и продолжают инку-
бацию при 37 °C.
290
Глава 10
4. Через 2—3 нед с момента заражения под микроскопом
удается обнаружить небольшие очаги инфицированных клеток.
Незадолго до того, как разрушится монослой неинфицирован-
ных клеток, культуры фиксируют в забуференном формалине,
осторожно удаляют агарозу и окрашивают 1%-ным генциан-
виолетом. Небольшие очаги инфекции (или бляшки) можно
подсчитать под стереомикроскопом. Вместо генциан-виолета
культуры можно окрашивать 1%-ным нейтральным красным.
Кроме того, нам удалось получить бляшки CMV, используя
КМЦ (0,8% в среде с 2% ЭТС) вместо агарозы.
3.4. Метод черных бляшек
Этот метод может быть использован для идентификации
любых вирусов. Однако особенно удобен он оказался для CMV,
образующего бляшки малого размера.
1. Культуры, достигшие монослоя, инфицируют обычным
способом.
2. Через 6—7 дней после заражения удаляют КМЦ и клетки
трижды промывают PBS. Затем в течение 5 мин клетки фик-
сируют 0,25%-ным раствором глутарового альдегида в PBS.
3. Отмыв фиксатор с помощью PBS, добавляют соответст-
венно разведенную антисыворотку или моноклональные анти-
тела против CMV. Клетки оставляют при комнатной темпера-
туре на 2 ч.
4. Клетки отмывают от антител PBS и инкубируют 3 ч при
комнатной температуре со вторыми, обычно конъюгированными
с пероксидазой хрена антителами против первых антител (на-
пример, против кроличьих или мышиных иммуноглобулинов).
5. После трехкратной промывки в PBS в каждую культуру
добавляют субстрат Hanker-Yates [75 мг Hanker-Yates reagent
(Polysciences (U.K.) Ltd., Northampton], 50 мл 0,1 M трис-HCl,
pH 7,5, и 0,5 мл 1%-ной H2O2). Окраска проявляется в течение
5—30 мин.
6. Чашки промывают дистиллированной водой, переворачи-
вают и дают им высохнуть в темноте. Темноокрашенные бляшки
вируса идентифицируют и подсчитывают.
3.5. Культивирование и очистка CMV
1. Не дожидаясь образования плотного монослоя, культуры
заражают вирусом (5—20 БОЕ/кл).
2. По окончании адсорбции (через 60 мин) культуральную
среду заменяют свежей, содержащей 2% ЭТС. Инфицирован-
ные клетки культивируют при 37 °C.
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
291
3. При необходимости через 48 ч после заражения культу-
ральную среду заменяют средой, содержащей радиоактивную
метку. Например, средой с 2% ЭТС и 1 мкКи/мл [35S]-метио-
нина (т. е. 1/10 необходимой концентрации метионина) или же
средой с 2% ЭТС и 2 мкКи/мл [14С]-аминокислот (т. е. 1/10 не-
обходимой концентрации аминокислот).
i 4. Первые признаки ЦПД проявляются через 3 дня после
инфекции (клетки разбухают и округляются). Затем ЦПД ста-
/ новится более явным, и на 7—10 день после инфекции клетки
- открепляются от субстрата. Вирус следует собирать именно на
этой стадии. Для получения нуклеокапсидов клетки собирают
А несколько раньше.
Обычно для иммунологических исследований (например,
? ELISA) или иммунизации животных мы выделяем CMV из
• культуральной среды, как описано выше для ВПГ. Однако для
анализа спектров вирусных белков и т. д. специалисты реко-
/ мендуют использовать метод доктора В. Гибсона, который при-
водится ниже. Исходным материалом для получения вирусных
препаратов максимальной инфекционности и наибольшей чисто-
ты должна быть культуральная среда. Для сохранения высокой
инфекционности препарата и целостности вирусных частиц сле-
дует избегать осаждения вируса. Впервые центрифугирование
в отрицательном градиенте вязкости и положительном градиен-
те плотности, предложенное Барзилаи и др. [29] для выделения
CMV, было применено Тэлботом и Алмейдиа [30]. Метод на-
дежен и гарантирует высокую эффективность. Его осуществляют
следующим образом:
1. Клетки собирают в культуральную среду, центрифугируют
10 мин при 1500 g и 4 °C, затем наслаивают 3 мл супернатанта
на 9 мл градиента 30% глицерина — 35% тартрата. Градиенты
готовят согласно [30].
2. Градиент центрифугируют 20 мин при 40 000 об/мин и 4 °C
в роторе SW41 (Beckman). После центрифугирования по свето-
рассеянию, как правило, обнаруживают три фракции (в порядке
возрастания плотности): неинфекционные оболочечные частицы
(НОЧ), вирионы и плотные частицы (рис. 10.9) [32]. Вирусные
частицы каждой фракции могут быть суспендированы в буфере
и при необходимости повторно очищены в таком же градиенте.
Гибсон предлагает ряд модификаций этого метода, которые
успешно применяются в его лаборатории.
1. Градиенты общим объемом 18 мл готовят в 38-мл про-
бирках для ротора SW27. На градиент наслаивают 20 мл освет-
ленной культуральной среды и центрифугируют 40 мин при
25 000 об/мин и 4 °C в роторе SW27.
2. При необходимости обычно используемый буфер трис-HCl
заменяют на 0,04 М фосфатный буфер, pH 7,4.
292
Глава 10
Рис. 10.9. Разделение центрифугированием внеклеточных частиц цитомегало-
вируса человека, а — очищенную среду фибробластов крайней плоти человека,
инфицированных штаммом AD 169, наслаивали на глицерин-тартратный гра-
диент и центрифугировали в роторе SW41 (Beckman). Освещая пробирку
сверху, можно обнаружить три фракции: неинфекционные оболочечные части-
цы, вирионы и плотные частицы, б — фракция, содержащая плотные частицы,
извлечена из первого градиента, разведена TN-буфером и сконцентрирована
равновесным центрифугированием в аналогичном градиенте (40 000 об/мин,
4 °C, 18 ч). Освещая пробирку сверху, можно обнаружить одну узкую, неод-
нородно окрашенную полосу (цвет ее меняется с красного на коричневый).
По данным Аймайера и Гибсона [31]
3. Заменяют тартрат калия на тартрат натрия, если соль
калия мешает последующему анализу (например, в случае пря-
мого анализа фракций градиента электрофорезом в полиакрил-
амидном геле в присутствии ДДС-Na). Натриевая соль менее
растворима при 4 °C, чем калиевая.
4. При необходимости вместо тартрата можно использовать
градиенты сахарозы [15—50% (вес на объем) в 0,04 М фос-
фатном буфере, 0,15 М NaCl, pH 7,4]. Условия центрифугиро-
вания те же.
3.6. Типы частиц CMV
На рис. 10.10 представлены электронные микрофотографии
частиц CMV различной морфологии, полученные методом нега-
тивного контрастирования. Спектры структурных полипептидов
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
293
Рис. 10.10. Негативно окрашенные внеклеточные частицы цитомегаловируса
человека, выделенные из глицерин-тартратного градиента: а—неинфекцион-
ные оболочечные частицы; б — вирионы; в — плотные частицы. Образцы полу-
чают фракционированием градиента, осаждают, ресуспендируют в буфере TN
(0,05 М трис-НС1, pH 7,4, 0,10 М NaCl), адсорбируют на электронномикро-
скопических сетках и окрашивают 1%-ным уранилформиатом. Частицы, рас-
положенные в левых нижних углах снимков а и б, «непроницаемые». Стрел-
ками указаны наружные мембранные структуры; черта внизу снимков —
100 нм. По данным Аймайера и Гибсона [31]
этих частиц, полученные электрофорезом в полиакриламидном
геле, показаны на рис. 10.11.
3.6. J. Неинфекционные оболочечные частицы
Аймайер и Гибсон [31] провели детальный анализ харак-
терных признаков данных частиц. Несмотря на их сходство по
внешнему виду и белковому составу со стандартными вириона-
ми, они не содержат ДНК и, следовательно, неинфекционны.
294
Глава 10
a b с de
Рис. 10.11. Флюорограммы радиоактивно
меченных белков цитомегаловируса челове-
ка. Клетки, инфицированные CMV, метили
либо [32Р]-ортофосфатом, либо [35S]-метио-
нином. Внеклеточные частицы, очищенные
в глицерин-тартратном градиенте, солюбили-
зируют и проводят электрофорез белков в
10%-ном полиакриламидном геле (при вы-
сокой концентрации бис-акриламида). Вре-
мя экспозиции для дорожек а, b и е раз-
лично. а, b — белки НОЧ и вирионов, ме-
ченные ,[32Р]-ортофосфатом; с, d и е — бел-
ки НОЧ, вирионов и плотных частиц, мечен-
ные [355]-метионином. HMWP— 212 кД (вы-
сокомолекулярный белок); МСР — 153 кД
(мажорный белок капсида); ВРР—149 кД
(щелочной фосфопротеин); МР — 74 и 69 кД
(матриксные белки); DGPi и DGPj — 62 и
54 кД (гликопротеины); 36 кД — белок, спе-
цифичный для НОЧ; тСР — 34 кД (минор-
ный белок капсида); см. Гибсон [35]. Стрел-
кой обозначена граница концентрирующего
и разделяющего гелей. На границе и в кон-
центрирующем геле видна вирусная ДНК,
которой лишены НОЧ. По данным Аймайера
и Гибсона [31].
3.6.2, Частицы высокой плотности
Структура и состав подобных частиц проще, чем неинфекци-
онных оболочечных и стандартных вирионов. Эти частицы пред-
ставляют собой большие плотные сферы, заполненные гомоген-
ным материалом и окруженные внешней мембраной [31—34].
Они не содержат ДНК, и 90% всего их белка приходится на
матриксный белок, имеющий мол. массу 69 кД.
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
295
3.6.3. Вирионы
Гибсон [35] опубликовал подробные спектры структурных
белков многих штаммов CM.V человека и сравнил их с CMV
обезьян. Эти данные представлены на рис. 10.12 и в табл. 10.3.
4. Герпесвирус саймири (НVSJ
Герпесвирус саймири можно выделить из крови и культуры
клеток большинства здоровых обезьян саймири (Saimiri sci-
ureus). Для своих природных хозяев этот вирус не патогенен.
Однако он стал предметом пристального внимания ученых после
того, как была продемонстрирована его высокая онкогенность
для тканей других приматов, в особенности мармозеток
из рода Saguinus [36]. У последних в течение 2 мес после за-
ражения развиваются злокачественные опухоли лимфатической
системы. Показано, что герпесвирус саймири относится к у-суб-
группе герпесвирусов.
4.1. Получение заготовок вируса
Из большого количества проанализированных клеточных
культур для литической инфекции и роста различных штаммов
HVS наиболее пригодной оказалась линия клеток почки обезьян
дурукули (Owl Monkey kidney — ОМ.К; в данном случае —
ОМК-210) [37, 38]. Кроме того, за небольшим исключением,
для получения заготовок HVS можно использовать и клетки
линии Vero. Клетки ОМК можно выращивать на большинстве
культуральных сред с добавлением ТС.
Для получения заготовок вируса клетки ОМК, растущие
в роллерных флаконах (-2-108), заражают вирусом (менее
0,1 БОЕ/мл) и культивируют 4—5 дней при 37°C. Оптимальная
температура культивирования — 34 °C. Однако культивирование
при этой температуре может привести к возникновению темпе-
ратурно-чувствительных мутантов. ЦПД (по крайней мере вы-
зываемое штаммом HVS 11) проявляется в образовании шаро-
образных агрегатов клеток, не являющихся истинными синци-
тиями.
Как правило, ЦПД удается обнаружить на 4—5 день после
заражения, хотя эти сроки могут варьировать для различных
штаммов. Дочерние вирусы высвобождаются в культуральную
среду, при этом в 50 мл среды одного роллерного флакона
содержится примерно 2-Ю6—2-Ю7 БОЕ/мл. Вирусную суспен-
зию с таким титром следует хранить при —70 °C, кроме того,
вирус можно предварительно сконцентрировать осаждением.
Осажденный вирус обычно характеризуют отношением числа
физических частиц к инфекционным. Для штамма HVS И дан-
296
Глава 10
Рис. 10.12. Сравнение белков
цитомегаловирусов человека и
обезьяны. Радиоактивно мечен-
ные вирионы выделяют, солю-
билизируют и проводят элект-
рофорез белков в 10 %-ном по-
лиакриламидном геле. Числа
слева и справа от геля обозна-
чают мол. массы соответствую-
щих белков (Х10-3). По дан-
ным Гибсона [35]
Таблица 10.3. Характерные особенности белков CMV
Сходные белки различных штаммов CMV (мол. массах Природа белков Характеристики
Colburn xio-i'l
CSG RCMV HCMV 751
205 205 207 212 Высокомолекуляр- ный белок (HMWP) Самый большой белок вириона
163 263 — 145 Кислый гликопро- теин (AGP) Кислый гликозилирован- ный белок
145 143 150 153 Основной белок капсида (МСР) Главный, структурный белок капсида
129 129 129 140 Белок отсутствует в ви- рионе
119 114 100 149 Щелочной фосфо- протеин (ВРР) Мажорный фосфорили- рованный, щелочной белок
119 Н. О. Н. О. — GP119 Гликозилированный, кис- лый
112 112 112 115 Белок вириона
100 98 Н. О. Н. О. 1 1 GP100 Гликозилированный, кис- лый
94 90 92 79 Предранний (IE) Отсутствует в вирионе, кислый, фосфорилиро- ван
78 82 75 80 Содержится в вирионе, фосфорилирован
69 69 69 74 Белок внешнего матрикса (МР) Мажорный белок, фос- форилирован
66 66 66 69 Белок внутреннего матрикса (МР) Мажорный, фосфорили- рован, локализуется в плотных частицах
65 64 65 62 Гликопротеин (DGP0 Мажорный, гликозилиро- ванный
61 Н. О. Н. О. 54 Гликопротеин (DGP2) GP59, 57 Гликозилированный
59 59 — 57 Гликозилированный
51 50 51 52 ДНК-связывающий белок (DBP) Фосфорилированный, ма- жорный, ядерный, от- сутствует в вирионе
40 41 39 42 Белок вириоиа
38 37 39 39 » »
37 37 38 35 Белок сборки Мажорный, фосфори- лированный, локализу- ется в В-капсидах и неинфекционных обо- лочечных частицах
34 34 34 34 Минорный белок капсида (тСР) Белок капсида, слабоще- лочной
32 32 — 32 Минорный белок вирио- на
27 27 26 — Мажорный белок вири- она
“ ') Colburn, CSG и RCMV — выделены от обезьян; HCMV 751 — выделен от человека.
Гибсон [35].
20—369
298
I лава 10
Рис. 10.13. Морфология бляшек, образовавшихся на 6-й и 9-й дни после
заражения клеток HVS. (С любезного разрешения Р. Ранделла и В. Хонеса)
ное отношение составляет 200—500, этот штамм на редкость
стабилен при 4 °C. Он теряет за месяц при хранении в культу-
ральной среде всего лишь 0,51g инфекционности.
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов 299
Рис. 10.14. Кривая размножения
HVS на клетках ОМК при 37 °C.
1 — накопление вируса в культу-
ральной среде; 2 — вирус, ассоци-
ированный с клетками. Множест-
венность инфекции составляет
5 БОЕ/кл. (С любезного разре-
шения Р. Ранделла, Р. Хонеса и
П. О’Хары)
4.2. Титрование вируса
HVS в соответствующих
разведениях обычно титруют
на монослое клеток Vero
или ОМК, растущих в 25 см2
пластиковых флаконах с пло-
ским дном. Вирус титруют
методом бляшек. Необходи-
мо отметить, что некоторые
партии телячьей сыворотки
ингибируют формирование
бляшек в культурах ОМК.
Во избежание этого сыво-
ротку выдерживают 30 мин при 56 °C.
1. Адсорбируют аликвоты соответствующих разведений ви-
руса объемом 1 мл 1—2 ч при 37 °C.
2. Аликвоты заменяют на культуральную среду, содержащую
2% ТС и 0,5 % КМЦ.
3. Через 7—10 дней инкубации при 37°C начинают форми-
роваться мелкие бляшки. Через 14 дней диаметр бляшек до-
стигает 2—3 мм, хотя, конечно же, данный признак специфичен
для каждого штамма.
Немного раньше бляшки формируются в монослойных пер-
вичных культурах мармозеток. На рис. 10.13 показана морфо-
логия бляшек HVS через 6 и 9 дней после начала инфекции.
4.3. Цикл размножения
Обычно для получения кривых роста в культуры вносят ви-
рус с высокой множественностью инфекции, а затем через ко-
роткие промежутки времени собирают вирус. Таким образом
получают кривую роста HVS (рис. 10.14). Однако интерпрети-
ровать полученные результаты следует с осторожностью. Рэн-
делл и Хонес (личное сообщение) показали, что в этих условиях
во многих клетках задерживается инициация вирусной репли-
кации. Если это действительно так, то цикл размножения HVS
в одной инфицированной клетке может завершиться за 18 ч.
20*
Рис. 10.15. Заражение HVS клеток ОМК со множественностью инфекции
5 БОЕ/кл. Клетки фиксируют через 15 ч после заражения и исследуют мето-
дом непрямой иммунофлуоресценции с помощью моноклональных антител
(МКА) к основному раннему белку HVS и родамина (Р. Ранделл и др. [31]).
Те же клетки контрастируют 2 мМ 4',6-диамидин-2-фенилиндолом (ДАФИ),
который связывает ДНК и таким образом окрашивает ядра [40]. Флуорес-
ценцию препаратов исследуют с помощью фильтров. При освещении ультра-
фиолетом ДАФИ дает голубую флуоресценцию, а родамин при освещении зе-
леным — красную. Видно, что только в незначительной части всех клеток син-
тезируются вирусные белки. (С любезного разрешения Р. Ранделла и Р. Хо-
неса)
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
301
Возможно, что репликация виру-
са зависит и от клеточного цикла.
Эти сложные исследования ве-
лись с помощью иммунофлуорес-
ценции на основе моноклональ-
ных антител к антигенам зара-
женных клеток (рис. 10.15).
4.4. Получение очищенного
вируса
1. Монослойные культуры, вы-
ращиваемые в роллерных флако-
нах, инфицируют с низкой мно-
жественностью инфекции, как
описано выше (см. разд. 4.1). Че-
рез 4—5 дней вирус осаждают из
культуральной среды центрифу-
гированием при 25000 об/мин
30 мин в роторе SW27 (Beckman).
При необходимости через 2 дня
после заражения вносят радиоак-
тивную метку.
2. Осадок ресуспендируют в
соответствующем буфере (трис-
HCl с 50 мМ ЭДТА и 50 мМ со-
ли) . Полученную суспензию по
возможности следует оставить на
ночь при 4 °C.
3. Суспендированный осадок
Рис. 10.16. Электрофорез в поли-
акриламидном геле: 1 — клетки
ОМК, инфицированные HVS
(окрашивание кумасси); 2 — очи-
щенный препарат HVS (окрашива-
ние кумасси); 3 — очищенный пре-
парат HVS, меченный 32Р. (С лю-
безного разрешения Р. Ранделла
и Р. Хонеса)
наслаивают на градиент глицери-
на или сахарозы (20—40%) и
центрифугируют при 19 000 об/мин
20—30 мин в роторе SW27 (Beck-
man). После центрифугирования
при просмотре пробирок в рассе-
янном свете обнаруживается од-
на полоса в центре градиента.
4. Фракцию, состоящую более
чем на 90% из вирусных частиц, имеющих оболочку, отбирают,
центрифугируют 1 ч при 25000 об/мин и ресуспендируют в со-
ответствующем буфере.
В результате первого градиентного центрифугирования по-
лучают осадок, содержащий большое количество вируса. Оса-
док можно ресуспендировать и дополнительно очистить вторым
градиентным центрифугированием. Фракции очищенного вируса
могут быть использованы для определения концентрации белка,
302
Глава 10
количества физических частиц и инфекционного титра. Для
исследования вирусных частиц электрофорезом в полиакрил-
амидном геле вирус разрушают, как описано выше для ВПГ.
Спектр структурных полипептидов HVS штамма И показан
на рис. 10.16.
5. Благодарности
Мы благодарны коллегам, представившим данные для этой
главы, независимо от того, были ли они нами использованы:
Гретхен Каугхмен, Бернарду Флекенштейну, Иану Халлибер-
тону, Эллиоту Киефру, Роджеру Мэйесу, Георгу Миллеру, До-
роти Пурифоу и Норману Россу. Мы особенно признательны
за обширные сведения Вейду Гибсону, Рику Рэнделлу и Бобу
Хонесу. И наконец, но не в последнюю очередь мы благодарим
нашу терпеливую машинистку Крис Морхаус.
Литература
1. Matthews R. Е. F. (1982). Intervirology, 17, Nos. 1—3.
2. Rawls IF. E„ Bacchetti S., Graham F. L. (1977). Curr. Top. Microbiol. Immu-
nol., 77, 71.
3. Scully C. (1983). Oral Surg., 56, 285.
4. Spear P. G., Raizman B. (1968). Virology, 36, 545.
5. Watson D. H., Shedden IF. I. H., Elliot A., Tetsuka T., Wildy P., Bourgaux-
Ramoisy D., Gold E. (1966). Immunology, 11, 399.
6. Bronson D. L., Dreesman G. R., Biswal N., Benyesh-Melnick M. (1973). Inter-
virology, 1, 141.
7. Frenkel N., Jacob R. J., Honess R. IF., Hayward G. S., Locker H., Roizman B.
(1975). J. Virol., 16, 153.
8. Watson D. H. (1962). Biochim. Biophys. Acta, 61, 321.
9. Russell IF. C. (1962). Nature, 195, 1028.
10. Yasamura T., Kawakita Y. (1963). Nippon Rinsho, 21, 1201.
11. Plummer G., Goodheart C. R., Miyagi M., Skinner G. R. B., Thouless M. E„
Wildy P. (1976). Virology, 60, 206.
12. Spear P. G. (1975). In: Oncogenesis and Herpesviruses, Vol. II, part I,
Epstein M. A. and Zur Hausen H. (eds.), I ARC, Lyon, p. 49.
13. Killington R. A., Newhook L., Balachandran N., Rawls IF. £., Bachetti S.
(1981). J. Virol. Methods, 2, 223.
14. Beale A. J., Christofinis E. C„ Furminger I. G. S. (1963). Lancet, 11, 640.
15. Powell K- L„ Watson D. H. (1975). J. Gen. Virol., 29, 167.
16. Spear P. G., Roizman B. (1972). J. Virol., 9, 143.
17. Heine J. W., Honess R. W., Cassai E„ Roizman B. (1974). J. Virol., 14,
640.
18. Dimmock N. J., Watson D. H. (1969). J. Gen. Virol., 5, 499.
19. Powell K. L., Courtney R. J. (1975). Virology, 66, 217.
20. Honess R. IF., Roizman B. (1973). J. Virol., 12, 1347.
21. Sabine M., Robertson G., Whalley J. (1981). Aust. Vet. J., 57, 148.
22. Studdert M., Simpson T., Roizman B. (1981). Science (Wash.), 214, 562.
23. Allen G. P., Year gen M. R., Turtinen L. IF., Bryans J. T., McCollum W. H.
(1983). Aust. J. Vet. Res., 44, 263.
24. O’Callaghan D. J., Cheevers IF. P., Gentry G. A., Randall С. C. (1968). Viro-
logy, 36, 104.
Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов
303
25. Darlington R. W., Randall С. С. (1963). Virology, 19, 332.
26. Wolf К., Darlington R. W. (1971). J. Virol., 8, 525.
27. Smith J. D., DeHarven E. (1973). J. Virol., 12, 919.
28. Wentworth В. B., French L. (1970). Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 135, 253.
29. Barzilai R„ Lazarus L. H., Goldblum N. (1972). Arch, gesamte Virusforsch.,
36, 141.
30. Talbot P„ Almeida J. D. (1977). J. Gen. Virol., 36, 345.
31. Irmiere A., Gibson W. (1983). Virology, 130, 118.
32. Craighead J. E., Ranich R., Almeida J. D. (1972). J. Virol., 10, 766.
33. Sarov I., Abady I. (1975). Virology, 66, 464.
34. Stinski M. F. (1976). J. Virol, 19, 594.
35. Gibson IV (1983). Virology, 128, 391.
36. Melendez L. V., Hunt R. D„ Daniel M. D., Garcia F. G., Fraser С. E. O.
(1969). Lab. Anim. Care, 19, 378.
37. Daniel M. D„ Silva D., Ma N. (1976). In Vitro, 12, 290.
38. Todaro G. J., Scherr C. J., Sen A., King-N., Daniel M. D., Fleckenstein B.
(1978). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1004.
39. Randall R. E., Newman C., Honess R. W. (1984). J. Gen. Virol, in press.
40. Russell IV C, Newman C., Williamson D. M. (1975). Nature, 253, 461.
ГЛАВА 11
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ вирусологии
П. Морган-Капнер и Дж. Паттисон
1. Введение
Лабораторную диагностику вирусных инфекций проводят
в основном с помощью электронной микроскопии, чувствитель-
ных культур клеток и иммунологическими методами. Как пра-
вило, для постановки диагноза выбирают какой-либо один ме-
тод в зависимости от стадии вирусной инфекции. Так, например,
все три подхода могут оказаться полезными при диагностике
ветряной оспы, однако успешное применение микроскопии и ме-
тода культуры клеток зависит от возможности сбора удовлетво-
рительных образцов на относительно раннем этапе заболевания.
В большой степени успех вирусной диагностики зависит и
от качества полученных образцов. По этой причине сами со-
трудники лаборатории должны принимать непосредственное
участие в сборе необходимых образцов. Характеристики образ-
цов, а также способы их доставки в лабораторию описаны Лен-
нетом и Шмидтом [1] и Кристом и др. [2].
Большинство реактивов и инструментов, используемых в ла-
бораторной диагностике, можно приобрести у различных фирм
(надо отметить, что происходит постоянное увеличение количе-
ства выпускаемых диагностических наборов). В большинстве
случаев один и тот же реактив выпускается одновременно не-
сколькими фирмами. По этой причине мы не указывали от-
дельные фирмы, кроме тех случаев, когда реактив поставляется
только одной фирмой. Во всех остальных случаях следует обра-
титься к общему перечню поставщиков, указанных в табл. 11.1.
Мы не ставили своей целью всестороннее описание всех
имеющихся в настоящее время методов диагностики вирусных
инфекций человека. Прежде всего мы охарактеризовали основ-
ные методы. Данная глава, таким образом, может быть хоро-
шим пособием для начинающих исследователей. По мере на-
копления опыта самостоятельной работы эти основные методы
можно будет использовать для решения более сложных задач.
2. Электронная микроскопия
Для электронно-микроскопической диагностики вирусных ин-
фекций можно использовать тонкие срезы пораженной ткани.
Чаще всего материалом для электронной микроскопии служат
Методы клинической вирусологии
305
Таблица 11.1. Список фирм, поставляющих реактивы
и оборудование
Flow Laboratories: Woodcock Hill, Harefield Road, Rickmansworth, Hertfordshire WD3 1PQ, UK
Gibco Europe: Tissue Culture Services: Wellcome Diagnostics: Northumbria Biologicals: Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge, Middlesex UB8 2YG, UK 10 Henry Road, Slough, Berkshire SL1 2QL, UK Temple Hill, Dartford^ Kent DA1 5BR, UK South Nelson Industrial Estate, Cramlington, Nor-
thumberland NE23 9HL, UK
Oxoid: Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG24 OPW, UK
Dynatech Laboratories Ltd.: Daux Road, Ballingshurst, Sussex RH14 9SJ, UK
Sterilin Ltd.: 43/45 Broad Street, Teddington, Middlesex TW11 8QZ, UK
Abbott Laboratories Ltd.: Brighton Hill Parade, Basingstoke, Hampshire RG22 4EH, UK
фекалии или жидкость везикул, характеризующих некоторые
болезни, например ветряную оспу. При анализе такого мате-
риала вирусы можно обнаружить с помощью негативного окра-
шивания, приводящего к очерчиванию компонентов вириона
электронно-плотным материалом. Метод эффективен при высо-
кой концентрации вируса в исследуемых образцах (около
106 частиц на 1 мл), как, например, в фекалиях или везикуляр-
ной жидкости. В тех случаях, когда содержание вирусных час-
тиц в образцах невелико, вероятность обнаружения вируса
можно увеличить, концентрируя вирус ультрацентрифугирова-
нием или агрегируя его специфическими антителами (иммуно-
электронная микроскопия). Последний метод удобен и для иден-
тификации вирусов. Здесь мы опишем электронно-микроскопи-
ческий метод диагностики ротавирусной инфекции и метод
иммуноэлектронной микроскопии на примере обнаружения спе-
цифических антител к парвовирусам. Более подробно методы
электронной микроскопии изложены Филдом [3].
2.1. Прямое электронно-микроскопическое
исследование фекалий
1. Конец пастеровской пипетки погружают в фекалии и на-
бирают достаточное количество материала для получения мазка
размером 1 см.
2. Ресуспендируют фекальный мазок в электронно-микроско-
пической краске для негативного контрастирования до получе-
ния полупрозрачной суспензии. Краска для негативного контра-
стирования представляет собой 2%-ный раствор фосфорно-воль-
306
Глава 11
Рис. 11.1. Электронная микрофотография ротавируса
фрамовой кислоты в дистиллированной воде (при помощи
концентрированного КОН pH краски доводят до 7,2).
3. Для получения электронно-микроскопического препарата
капельку суспензии 'Помещают на сетку для электронного мик-
роскопирования, покрытую углеродно-формваровой пленкой
(Agar Aids, 66а Cambridge Road, Stansted, Essex). Во время
этой операции сетку держат парой тонких пинцетов.
4. Препарат оставляют на воздухе на 30 с.
5. Излишки жидкости удаляют, прикасаясь к краю стекла
фильтровальной бумагой.
6. Препарат высушивают на воздухе.
7. В случае необходимости жизнеспособный вирус инактиви-
руют, облучая обе стороны сетки ультрафиолетом с интенсив-
ностью 440 000 мкВт-с/см2. При этом используют .^коротковолно-
вую ультрафиолетовую лампу с фильтром (Ultra-Violet Products
Ltd., Science Park, Milton Road, Cambridge, UK). Лампа долж-
на находиться на расстоянии 15 см от сетки; время облучения
каждой стороны — 5 мин.
8. Вирионы ротавирусов можно охарактеризовать под транс-
миссионным электронным микроскопом с увеличением от 30 000
до 50 000 (рис. 11.1).
Методы клинической вирусологии
307
2.2. Иммуноэлектронная микроскопия
Описанный ниже метод иммуноэлектронной микроскопии
представляет собой только один из множества подобных имму-
нологических методов. Для исследования вирусоспецифических
антител, кроме того, используют метод, предполагающий свя-
зывание с микроскопической сеткой белка А [3]. Рабочую кон-
центрацию антивирусных антител определяют методом проб и
ошибок в диапазоне от 1/10 до 1/1000. Указанная нами кон-
центрация, как правило, используется в рутинной работе. Для
получения оптимальных результатов взаимодействия антител
с вирусом таким же образом титруют сыворотку (используют
разведения от 1/10 до 1/100), содержащую парвовирус.
1. 10 мкл антисыворотки к парвовирусу человека в 100 раз
разводят PBS. Раствор нагревают в водяной бане до 56°C.
2. Обычным способом расплавляют 10 мл 2 %-ной агарозы
в PBS и охлаждают до 56 °C в водяной бане.
3. При 56 °C смешивают 1 мл разведенной антисыворотки
с 1 мл 2 %-ной агарозы.
4. Переносят по 200 мкл полученной смеси в две лунки
96-луночного планшета для микротитрования.
5. Агарозе дают застыть при комнатной температуре. План-
шет можно хранить при 4 °C в течение нескольких недель, если
заклеить его клейкой лентой.
6. В лунку, содержащую смесь агарозы с антисывороткой,
вносят 10 мкл сыворотки, содержащей парвовирус (сыворотку
в 10 раз разводят PBS).
7. Сетку для электронной микроскопии с заранее приготов-
ленным углеродно-формваровым покрытием кладут менее бле-
стящей стороной на каплю сыворотки.
8. Сетку выдерживают 2 ч при 37 °C во влажной камере.
9. Тонким пинцетом достают сетку и наносят каплю 2 %-ной
фосфорно-вольфрамовой кислоты (см. разд. 2.1.2) на ту поверх-
ность сетки, которая находилась в контакте с сывороткой.
10. Через 30 с отмывают избыток краски, высушивают пре-
парат и инактивируют вирус, как описано в разд. 2.1.4—2.1.7.
11. Агрегированные вирусные частицы исследуют под транс-
миссионным электронным микроскопом при увеличении от
30 000 до 50 000 (рис. 11.2).
3. Идентификация вирусных антигенов
Вирусы, находящиеся в тканях или тканевых жидкостях,
можно идентифицировать по вирусоспецифическим белкам (на-
пример, белку капсида) с помощью реакции антиген — антитело.
Продукт реакции антиген — антитело тестируют по метке, ко-
308
Глава 11
Рис. 11.2. Электронная микрофотография парвовируса. Агрегация вирус-
ных частиц вызвана специфическими антителами
торую вводят либо непосредственно в антивирусные антитела
(прямой метод), либо в антитела, направленные против вирусо-
специфических антител (непрямой метод). Антитела можно по-
метить флуоресцеином, радиоактивным иодом или ферментом,
расщепляющим субстрат с изменением окраски. Кроме того,
для идентификации вируса используют реакцию гемагглютина-
ции. В повседневной практике описанные методы применяют
главным образом для обнаружения в крови антигенов вируса
гепатита В и поиска антигенов разных вирусов, вызывающих
различные респираторные заболевания.
В настоящее время многими фирмами выпускаются эритро-
цитарные, радиоактивные и ферментативные диагностикумы,
в том числе для обнаружения вируса гепатита В (например,
диагностикумы Abbot Laboratories, Ltd., UK). Мы не считаем
целесообразным излагать методы работы с указанными диагно-
стикумами: вполне достаточно следовать прилагаемым инструк-
циям. Ниже мы остановимся на иммунофлуоресцентном методе
идентификации респираторно-синцитиального вируса в носогло-
точных выделениях.
Методы клинической вирусологии 309
3.1. Идентификация респираторно-синцитиального вируса
в носоглоточных выделениях методом иммунофлуоресценции
Метод получения препаратов носоглоточных выделений опи-
сан Гарднером и Мак-Квилином [4]. В лабораторных условиях
эта операция выполняется в два этапа. Сначала готовят мазок
из носоглоточной слизи на предметном стекле. Полученные маз-
ки можно хранить в фиксированном состоянии при —20 °C в те-
чение многих месяцев. На втором этапе окрашивают мазки
для выявления антигена респираторно-синцитиального вируса.
Для этой цели используют метод непрямой иммунофлуорес-
ценции.
3.1.1. Приготовление препаратов носоглоточных выделений
1. Слизь со специальных щипцов смывают 1—2 мл PBS и
переносят в центрифужную пробирку.
2. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин (~500 g) в на-
стольной центрифуге.
3. Надосадочную жидкость сливают (ее можно использовать
для выделения вируса).
4. Осадок клеток осторожно ресуспендируют в 2—3 мл PBS
до получения гомогенной суспензии. Для этого используют ши-
рокогорлую пастеровскую пипетку.
5. Полученную суспензию переносят в пробирку.
6. К суспензии добавляют еще 2—4 мл PBS и перемешивают
пипетированием. Крупные сгустки слизи удаляют.
7. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин (~500 g) в на-
стольной центрифуге.
8. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют в таком
объеме PBS, чтобы полученная суспензия легко отделялась от
стенок пробирки.
9. Полученную суспензию наносят на размеченное предмет-
ное стекло.
10. Стекло подсушивают на воздухе.
И. Фиксируют в ацетоне 10 мин при 4°C.
12. После фиксации стекло опять подсушивают на воздухе.
13. Полученные препараты окрашивают немедленно либо
хранят при —20 °C.
3.1.2. Методика окрашивания
1. Распечатывают и разводят в PBS коммерческую антисы-
воротку против РСВ до рекомендованной рабочей концентрации.
2. Пастеровской пипеткой наносят одну каплю антисыворот-
ки на приготовленный препарат.
310
Глава 11
3. Препарат помещают во влажную камеру (закрытый ре-
зервуар или чашку Петри, содержащую влажную фильтроваль-
ную бумагу).
4. Препарат инкубируют 30 мин при 37 °C.
5. Образцы осторожно отмывают PBS от избытка антител
в специальном резервуаре.
6. Отмывку образцов проводят в трех сменах PBS по 10 мин
в каждой.
7. Образцы высушивают, удаляют избыток PBS фильтро-
вальной бумагой (стараясь не повредить при этом сам препа-
рат) и высушивают на воздухе.
8. Распечатывают и разводят конъюгированные с флуорес-
цеином антитела до нужной концентрации.
9. На препарат наносят каплю разведенных флуоресцирую-
щих антител.
10. Препарат инкубируют 30 мин при 37 °C.
И. Препарат трижды промывают PBS (см. стадию 6).
12. Промывают 2 мин в дистиллированной воде.
13. Осторожно удаляют избыток дистиллированной воды и
высушивают на воздухе.
14. Используя иммерсионное масло, препараты исследуют
под флуоресцентным микроскопом. Покровное стекло и заклю-
чение препарата не требуются.
3.1.3. Интерпретация результатов
О присутствии антигенов РСВ свидетельствует флуоресцен-
ция цитоплазмы отдельных клеток. Необходимо сравнивать ис-
следуемые препараты с контрольными, как заведомо положи-
тельными, так и заведомо отрицательными.
4. Культуры клеток
С появлением метода культуры тканей, позволяющего выра-
щивать вирус в монослое клеток на стекле или пластике, кли-
ническая вирусология достигла значительных успехов. Откры-
тие антибиотиков, подавляющих рост бактерий и грибов, позво-
лило ввести метод культуры ткани в повседневную практику.
В этой главе мы не будем останавливаться на всех тонкостях
получения и культивирования клеток в монослое. По этим во-
просам читателю следует обратиться к Паулю [5]. Специаль-
ные вопросы культивирования клеток для целей клинической
вирусологии изложены Леннетом и Шмидтом [1].
В одной диагностической лаборатории нецелесообразно
культивировать сразу большое количество клеточных линий,
необходимых для выделения всех известных вирусов человека.
Методы клинической вирусологии
311
Количество клеточных линий, ведущихся в одной лаборатории,
зависит от ряда факторов, прежде всего от степени доступности
эмбриональной ткани, от интереса к определенным вирусам
и т. д. Как правило, в оптимальное число необходимых клеточ-
ных линий должны входить: эпителиальные клеточные линии,
используемые в качестве первичных или вторичных культур
(например, почки эмбриона человека или почки павиана); пе-
ревиваемые или полуперевиваемые линии фибробластов легко-
го эмбриона человека или клеток линии MRC 5); перевиваемые
линии эпителиальных клеток, как, например, НЕр-2 или HeLa.
Клиническую диагностику вирусов, как правило, проводят
в два этапа: на первом — убеждаются в вирусной природе за-
болевания, на втором — идентифицируют вирус. Чаще всего
вирус обнаруживают по ЦПД. При некоторых заболеваниях для
постановки предварительного диагноза достаточно располагать
сведениями о ЦПД и клинической картине заболевания. Так,
например, во многих лабораториях, где проводят заражение
фибробластов материалом, полученным с генитального мазка,
указывают, что «обнаружены признаки ЦПД, характерные для
вируса простого герпеса». При этом последующую формальную
идентификацию вируса не проводят. В других случаях признаки
ЦПД характеризуют большую группу вирусов, например энте-
ровирусов 67 типов. Здесь постановка более точного диагноза
будет зависеть от результатов реакции нейтрализации вируса
специфическими антисыворотками (нейтрализационный тест).
Последняя процедура требует много времени, поэтому возмож-
ны промежуточные сообщения, например «выделены энтерови-
русы, необходима дальнейшая идентификация».
Некоторые вирусы, например миксо- и парамиксовирусы,
обычно не вызывают заметного ЦПД, однако изменяют поверх-
ность культивируемых клеток таким образом, что последние
начинают связывать эритроциты. Клинический материал инку-
бируют с клетками монослойной культуры, на которую затем
наносят суспензию эритроцитов (морской свинки или человека
с нулевой группой крови). После инкубации с эритроцитами
культуры тщательно промывают и учитывают результаты.
Дальнейшую идентификацию проводят с помощью реакции тор-
можения гемадсорбции специфическими антисыворотками. Не-
которые из указанных выше вирусов продуцируют растворимый
гемагглютинин, поэтому их идентифицируют методом торможе-
ния гемагглютинации.
Другие вирусы идентифицируют методом непрямой иммуно-
флуоресценции. Подобным образом определяют и РСВ (см.
разд. 3.1.2). Однако в тех случаях, когда клинические симпто-
мы и характер ЦПД не позволяют отнести вирус к той или
иной группе, необходимо исследовать клеточный гомогенат под
312
Глава 11
Таблица 11.2. Чувствительные клеточные линии, способы выявления
и идентификации наиболее распространенных вирусов,
вызывающих заболевания человека
Вирусы Чувствительная клеточная линия Выявление и иден- тификация
Аденовирусы пэч ЦПД, НТ
Вирус Коксаки А ПП» ЦПД, нт
Вирус Коксаки В ПП ЦПД, НТ
Цитомегаловирус ФЛЭЧ ЦПД,
Эховирусы ПП ЦПД, нт
Вирус простого герпеса ФЛЭЧ ЦПД, НТ, ИФ
Вирус гриппа А и В 1111 ГА, ТГА, ИФ
Вирус кори ПП, пэч ЦПД, НТ, ИФ
Вирус свинки ПП ГА, ТГА
Вирус парагриппа ПП ГА, ТГА, ИФ
Полиовирусы ПП ЦПД, НТ
Респираторно-синцитиальный вирус Нер-2 ЦПД, НТ, ИФ
Риновирусы ФЛЭЧ ЦПД, НТ
Вирус краснухи RK-13 ЦПД, НТ, ИФ
Вирус ветрянки ФЛЭЧ ЦПД
]) Только некоторые типы.
Сокращения: ФЛЭЧ — фибробласты легкого эмбриона человека; ПП —почки павиа-
на; ПЭЧ— клетки почки эмбриона человека; ПК — почки кролика; Нер-2 — эпителиаль-
ная линия клеток человека; ЦПД — цитопатический эффект; НТ — нейтрализационный
тест; ИФ — иммунофлуоресценция; ГА — гемадсорбция; ТГА— торможение гемадсорбцин.
электронным микроскопом (см. разд. 2). Подобным образом
время от времени следует исследовать и клеточные культуры,
используемые в рутинной работе, для исключения случайной
вирусной инфекции.
В табл. 11.2 представлены основные группы болезнетворных
вирусов, клеточные линии для их выделения, а также способы
выявления и идентификации. О постановке перечисленных
в таблице реакций можно прочитать в монографии Леннета и
Шмидта [1].
5. Иммунологические методы
Существует множество методов качественного и количест-
венного определения вирусоспецифических антител. С помощью
этих методов можно обнаружить как IgM и IgG одновременно
(реакция торможения гемагглютинации), так и отдельно имму-
ноглобулины каждого класса (IgG — радиальным гемолизом,
a IgM — методом «захвата» IgM антител). Как правило, в реак-
ции связывания комплемента выявляются только вирусоспеци-
фические IgG. Однако при тестировании этим методом
микробиологических антигенов возможно одновременное опре-
деление специфических IgM и IgG.
Методы клинической вирусологии
313
Иммунологические методы используются главным образом
в двух целях: во-первых, для диагностики текущей, завершив-
шейся или врожденной вирусной инфекции и, во-вторых, для
обнаружения специфических антител, присутствие которых ука-
зывает на прошедшую инфекцию и, следовательно, на иммуни-
тет к возможной повторной инфекции. По силе иммунного от-
вета на вирусную инфекцию люди сильно отличаются друг от
друга. На рис. 11.3 показана типичная кривая нарастания титра
Контакт
Рис. 11.3. Динамика иммунного ответа на первичную инфекцию краснухи
антител в ответ на первичную инфекцию краснухи. Легко заме-
тить, что установление диагноза краснухи возможно по нара-
станию титра специфических IgG (сероконверсии) и выявлению
специфических IgM (при этом суммарный титр специфических
антител обоих классов возрастает в 4 раза). Присутствие спе-
цифических IgM в крови новорожденного свидетельствует о
внутриматочном инфицировании, поскольку материнские IgM
в отличие от IgG задерживаются плацентой. Специфические
IgG, образовавшиеся в результате первичной инфекции, обычно
сохраняются в течение всей жизни. Поэтому присутствие анти-
тел этого класса в сыворотке крови свидетельствует об иммуни-
тете к соответствующей повторной инфекции.
Ниже приведены иммунологические методы обнаружения
специфических антител к вирусу краснухи, особенно эффектив-
ные для диагностики заболевания плода и определения титра
21—369
314
Глава 11
специфических антител в сыворотке крови. Подробные описания
методов, используемых для диагностики краснухи, можно найти
в обзорах Паттисона [6] и Моргана-Капнера [7].
5.1. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
Вирус краснухи вызывает гемагглютинацию эритроцитов
многих видов животных. Чаще всего в РТГА используют эрит-
роциты однодневных цыплят. Гемагглютинирующим (ГА) анти-
геном вируса краснухи при постановке этой реакции служит
выращенный в культуре и обработанный Твин 80 и эфиром ви-
рус. Предварительная обработка увеличивает ГА-титр вируса.
5.1.1. Стандартизация ГА-антигена вируса краснухи
1. 1 мл 50%-ной суспензии эритроцитов цыплят трижды про-
мывают в вероналовом буфере с декстраном и желатином (бу-
фер DGV табл. 11.3) центрифугированием и ресуспендирова-
нием осадка в 15-мл градуированной центрифужной пробирке.
Отмытые клетки ресуспендируют в DGV-буфере для получения
30 %-ной суспензии.
Таблица 11.3. Приготовление вероналового буфера с декстраном
и желатином (DGV-буфер)
DGV-буферный раствор Таблетки буфера для реакции 20
связывания комплемента
Веронал натрия 400 мг
Желатин 1200 мг
Дистиллированная вода 2000 мл
Растворяют таблетки в дистиллированной воде. Добавляют веронал нат-
рия и желатин. Помещают в водяную баню при 56 °C до полного раство-
рения желатина. Разливают во флаконы по 100 мл. Автоклавируют и
хранят при 4 °C
2. 25%-ный БСА
БСА, фракция 5 25 г
Стерильная дистиллированная 100 мл
вода
Стерилизуют фильтрованием, разливают по 1 мл в стерильные ампулы.
Хранят при —20 °C
3. 10%-ная глюкоза
Глюкоза Дистиллированная вода Разливают по 1 мл. Автоклавирую' 10 г 100 мл г и хранят при 4 °C
4. Для использования DGV-буферный раствор 100 мл
25%-ный БСА 0,8 мл
10%-ная глюкоза 1,0 мл
Хранят при 4 °C
Методы клинической вирусологии
315
2. Разводят лиофилизированный препарат ГА-антигена ви-
руса краснухи в требуемом по инструкции объеме дистиллиро-
ванной воды.
3. В каждую из восьми лунок двух соседних рядов 96-луноч-
иого полистиролового планшета для микротитрования с U-об-
разными лунками вносят по 1 объему (0,025 мл) DGV (рис. 11.4,
ряды 1 и 2, лунки 1—8).
1 2 3 4 Номера 5 6 лунок 7 8 9 10 11 12
1 е • • • 9 9 9 9 • • 9 9
2 • • 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9
3 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
Ряды 4 • 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9
5 • • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
6 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
7 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
S • 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9
Рис. 11.4. Полистироловый 96-луночный планшет для микротитрования
4. В первые лунки двух рядов вносят по одному объему
ГА-антигена вируса краснухи.
5. Готовят последовательные двукратные разведения ГА-ан-
тигена вируса краснухи, начиная от 1 :2 и до 1 :256, используя
0,025-мл микротитратор. Перед употреблением головку микро-
титратора следует прокалить в пламени докрасна, затем осту-
дить в течение нескольких секунд, поместить в дистиллирован-
ную воду и промакнуть фильтровальной бумагой.
6. В каждую из заполненных лунок дополнительно вносят
по одному объему DGV-буфера. В качестве контроля в лунки 12
первых двух рядов вносят по два объема DGV-буфера.
7. Суспензию отмытых эритроцитов цыплят разводят в 100 раз
DGV-буфером, получая таким образом 0,03 %-ную суспензию.
8. Во все 18 лунок добавляют по два объема 0,03%-ной
суспензии эритроцитов, готовый планшет закрывают другим,
неиспользованным планшетом и инкубируют 1 ч при 4 °C.
21*
316
Глава 11
9. На дне контрольных лунок образуется плотная «бляшка»
неагглютинированных эритроцитов. Агглютинированные эритро-
циты оседают равномерно. ГА-титром считают обратную вели-
чину наибольшего разведения ГА-антигена вируса краснухи,
при котором еще происходит полная агглютинация. Такое раз-
ведение содержит 1 гемагглютинирующую единицу.
Для тестирования сывороток используют 4 ГА-единицы ан-
тигена вируса краснухи. Таким образом, если ГА-титр антигена
равняется 32, то для обнаружения антител к вирусу краснухи
его разводят DGV в восемь раз. Разведенный антиген стабилен
в течение 25—48 ч при 4 °C.
5.1.2. Предварительная обработка сыворотки
Все сыворотки содержат неспецифические ингибиторы гемаг-
глютинации, которые следует удалить. Неспецифические инги-
биторы ГА в основном представляют собой липопротеины, от
которых освобождаются, обрабатывая сыворотку каолином (см.
ниже). В сыворотках человека, кроме того, могут присутство-
вать неспецифические агглютинины куриных эритроцитов. Одна-
ко предварительная адсорбция тестируемых сывороток эритро-
цитами не является обязательной, поскольку все неспецифиче-
ские гемагглютинины, присутствующие в сыворотках, обнару-
живаются в контролях.
1. В стеклянные пронумерованные пробирки (75X12 мм)
вносят по 0,2 мл сыворотки. Кроме исследуемых сывороток в
каждом опыте необходимы положительные и отрицательные
контроли.
2. В каждую пробирку добавляют по 0,8 мл 25%-ного као-
лина на боратно-солевом буфере (каолин предварительно про-
мывают кислотой).
3. Содержимое пробирок взбалтывают и оставляют при ком-
натной температуре на 20 мин.
4. Отработанный каолин осаждают центрифугированием в
настольной центрифуге при 2000 об/мин (примерно 800 g)
20 мин.
5. Супернатант переносят в чистые пронумерованные пробир-
ки. В результате очистки получают сыворотки, разбавленные
в четыре раза. Их используют для постановки реакции тормо-
жения гемагглютинации. Сыворотки можно хранить при 4 °C
в течение ночи.
5.1.3. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА]
1. Для тестирования одного образца сыворотки вносят по
одному объему DGV в один ряд лунок (лунки 1 —10 и 12).
Методы клинической вирусологии
317
2. В первую и последнюю лунки добавляют по одному объе-
му сыворотки, разведенной в четыре раза.
3. С помощью микротитратора готовят последовательные
двукратные разведения сыворотки (в первой лунке 1 :8, в деся-
той 1 :4096).
4. В лунки 1—10 вносят по одному объему ГА-антигена
краснухи, содержащего 4 ГАЕ. В лунку 12 (контроль сыворот-
ки) ГА-антиген краснухи не добавляют.
5. В лунки 1—8 (рядов 1 и 2) другого планшета вносят по
одному объему рабочего разведения ГА-антигена краснухи, и
затем в восьми лунках готовят последовательные двукратные
разведения ГА-антигена. В эти 16 лунок добавляют по одному
объему DGV. Это титрование является проверочным для ГА-ан-
тигена краснухи. Для контроля в лунки 12 первого и второго
рядов вносят по два объема DGV.
6. Закрытые планшеты оставляют на 1 ч при комнатной тем-
пературе или на ночь при 4 °C.
7. Во все заполненные лунки вносят по два объема 0,03 %-ной
суспензии эритроцитов цыплят и планшеты оставляют на 1—
1,5 ч (или на ночь) при 4 °C.
8. Просматривая планшеты, определяют титр ГА-антигена
краснухи (он должен составлять 2—8 ГАЕ). В контрольных
лунках агглютинация не должна произойти.
9. Если же сыворотка агглютинировала эритроциты в отсут-
ствие ГА-антигена краснухи, необходимо провести повторное
тестирование исходного (четырехкратного) разведения сыво-
ротки. Перед этим сыворотку адсорбируют одной каплей
30%-ной суспензии эритроцитов цыплят 1 ч при комнатной тем-
пературе, а затем эритроциты осаждают центрифугированием.
10. Титром специфических антител в исследуемой сыворотке
считают обратную величину разведения, при котором полностью
подавляется гемагглютинация.
5.1.4. Интерпретация результатов
При невысоком титре (а именно титре 8) интерпретировать
результаты сложно, так как при небольшом разведении возмож-
но остаточное присутствие неспецифических ингибиторов. На-
личие вирусоспецифических антител считается доказанным при
титре 16 или выше.
5.2. Реакция связывания комплемента (РСК)
Принцип реакции связывания комплемента (РСК) основан
на том, что взаимодействие антител с вирусными антигенами
приводит к активации, а следовательно, к связыванию компле-
318
Глава 11
мента. Остающийся комплемент можно обнаружить, используя
эритроциты барана, сенсибилизированные антиэритроцитарными
антителами. Эти антитела обычно называют гемолизинами и
получают из сыворотки кролика, иммунизированного эритроци-
тами барана. Несвязавшийся (после первой реакции) компле-
мент вызывает лизис эритроцитов. В случае связывания компле-
мента в первой реакции лизиса эритроцитов барана (во второй
реакции) не происходит.
Таким образом, количество специфических антител в сыво-
ротке можно определить при тестировании ее последователь-
ных разведений с известным микробиологическим антигеном
в присутствии комплемента и с последующим добавлением сен-
сибилизированных эритроцитов барана.
Для получения достоверных воспроизводимых результатов
необходимо строго соблюдать пропорции используемых реаген-
тов. Поэтому перед постановкой реакции необходимо опреде-
лить соответствующие концентрации комплемента, гемолитиче-
ской сыворотки и антигена. Ниже мы приводим пример опре-
деления специфических антител к вирусу краснухи в РСК.
5.2.1. Титрование комплемента и гемолитической сыворотки
Здесь так же, как и в РТГА, используют полистироловые
96-луночные планшеты с U-образным дном и микротитратор
(позволяющий работать с объемами 0,025 мл)
Постановка реакции
1. Растворяют в требуемом по инструкции объеме дистилли-
рованной воды лиофилизированный препарат комплемента.
2. Нумеруют (от 1 до 8) восемь стеклянных пробирок (75 X
Х12 мм).
3. Готовят 60-кратное разведение комплемента в первой про-
бирке. Для этого 0,1 мл комплемента разводят 0,7 мл дистил-
лированной воды и 4,0 мл вероналового буферного раствора
(VBS) (20 таблеток буфера для РСК растворяют в 2000 мл ди-
стиллированной воды). Лиофилизированный комплемент содер-
жит криопротектор, поэтому добавление 0,7 мл дистиллирован-
ной воды к 0,1 мл растворенного комплемента дает 10-кратное
разведение.
4. В оставшиеся семь пробирок (2—8) вносят по 0,4 мл VBS.
5. 1,6 мл содержимого первой пробирки переносят во вто-
рую, перемешивают, затем из второй переносят 1,6 мл в третью
и т. д. до восьмой пробирки. Перед каждым переносом пипетку
промывают в VBS. Таким образом получают последовательные
разведения комплемента с 20%-ной разницей между ними, т. е.
1:60, 1:75, 1:94, 1:118, 1:148, 1:184, 1:230, 1:288.
Методы клинической вирусологии 3 19
6. Размечают 96-луночный планшет, как указано на
рис. 11.5.
7. В лунки 1—8 рядов 1—7 вносят по два объема VBS.
8. В лунки 9 рядов 1—6 вносят по три объема VBS (конт-
роль гемолитической сыворотки).
9. В лунки 1—8 рядов 1—7 добавляют по одному объему
приготовленных разведений комплемента.
10. Планшет закрывают и оставляют на ночь при 4 °C.
„ Контроли
Комплемент гемолизина
60 75 94 118 148 184 230 288
25 0 0 0 0 2 4 4 4 4 • 9 9
50 0 0 0 0 1 3 4 4 4 • 9 •
100 0 0 0 0 0 2 4 4 4 • 9 •
Гемолизин 200 0 0 0 0 2 4 4 4 4 • 9 •
400 0 0 0 4 4 4 4 4 4 9 9 •
800 4 4 4 4 4 4 4 4 4 9 9 •
Контроли комплемента 4 4 4 4 4 4 4 4 4 9 9 •
• • • • • 4 • 4 9 9 9 9
Рис. 11.5. Титрование комплемента и гемолитической сыворотки: 0 — полный
лизис; 1—лизировано 75% кл; 2 — лизировано 50% кл; 3 — лизировано 25%
кл; 4 — лизиса не происходит
И. На следующее утро готовят последовательные двукрат-
ные разведения гемолитической сыворотки от 1 :25 до 1 : 800;
в особую пробирку вносят 1 мл VBS (контроль комплемента).
В пробирку 1 вносят 2,4 мл VBS и 0,1 мл гемолитической
сыворотки. По 1 мл VBS добавляют в пробирки 2—6. Из пер-
вой пробирки переносят 1 мл во вторую пробирку и т. д. до ше-
стой пробирки, промывая пипетку после каждого переноса.
Удаляют 0,5 мл из первой пробирки и 1 мл из шестой пробир-
ки для того, чтобы объем жидкости в каждой пробирке соста-
вил 1 мл.
12. Эритроциты барана трижды промывают в VBS.
13. Затем супернатант сливают и эритроциты суспендируют
в оставшемся объеме жидкости.
14. Определяют объем полученной суспензии эритроцитов
и разводят ее VBS до получения 4%-ной суспензии.
320
Глава 11
15. По 1 мл суспензии эритроцитов добавляют в семь соот-
ветственно помеченных пробирок, следуемых за рядом проби-
рок с разведенной гемолитической сывороткой, а также в конт-
рольную пробирку.
16. Суспензии эритроцитов смешивают с соответствующими
разведениями гемолизина, закрывают пробирки и инкубируют
20 мин на водяной бане при 37 °C.
17. В то же время в термостате или термальной комнате ра-
зогревают приготовленный накануне планшет для микротитро-
вания.
18. Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и
по одному объему каждого разведения вносят в соответствую-
щий ряд лунок.
19. Ресуспендируют содержимое лунок, постукивая по план-
шету, и оставляют его на 30 мин при 37 °C. Через 15 мин инку-
бирования необходимо повторно суспендировать клетки встря-
хиванием планшета.
20. Для получения окончательного результата планшет вы-
держивают примерно 90 мин при 4 °C.
Интерпретация полученных результатов. На рис. 11.5 показан
типичный результат тестирования. Отсутствие гемолиза в конт-
рольных лунках с комплементом и гемолизирующей сывороткой
(гемолизином) свидетельствует об отсутствии неспецифическо-
го лизиса.
Оптимальной сенсибилизирующей концентрацией (ОСК) ге-
молитической сыворотки считают ее разведение, обеспечиваю-
щее наибольший лизис при максимальном разведении компле-
мента. На рис. 11.5 ОСК составляет 1 : 100. В описанных ниже
опытах гемолитическую сыворотку используют именно в этом
разведении.
Разведение комплемента, обеспечивающее 50%-ный лизис
при ОСК гемолитической сыворотки содержит одну единицу
комплемента (ЕКьо)- На рис. 11.5 EKso содержится в разведе-
нии 1 :184, поэтому для тестирования следует использовать
комплемент в разведении 1:60.
5.2.2. Титрование связывающего комплемент (СК}
антигена вируса краснухи
с положительной контрольной сывороткой
Постановка титрования. 1. Разводят лиофилизированный СК-ан-
тиген вируса краснухи дистиллированной водой до указанной
в инструкции концентрации.
2. Нумеруют шесть пробирок (75X12 мм).
3. В пробирку 1 вносят 0,2 мл антигена вируса краснухи
и 0,8 мл VBS.
Методы клинической вирусологии 321
4. В пробирки 2—6 добавляют по 0,5 мл VBS.
5. Из первой пробирки во вторую переносят 0,5 мл и т. д.
до шестой пробирки, получая таким образом последовательные
разведения антигена 1:5, 1:10, 1:20, 1 :40, 1 :80, 1 : 160.
6. Разводят лиофилизированный препарат заведомо положи-
тельной антисыворотки дистиллированной водой.
7. К 0,1 мл сыворотки добавляют 3,9 мл VBS (сыворотку
разводят в 40 раз).
8. Готовят последовательные двукратные разведения анти-
сыворотки на VBS (1 : 40, 1 : 80, 1 : 160, 1 : 320, 1 : 640).
9. Размечают полистироловый 96-луночный планшет, как
показано на рис. 11.6.
10. В каждую лунку, содержащую контрольную антисыво-
ротку (лунки 7 рядов 1—6), и в каждую лунку, содержащую
контрольный антиген (лунки 1—7 ряда 6), вносят по одному
объему VBS.
11. В лунки 1—6 рядов 1—5 добавляют по одному объему
соответствующего разведения сыворотки.
12. В лунки 1—6 рядов 1—5 добавляют по одному объему
соответствующего разведения антигена.
13. В каждую лунку вносят по одному объему разведения,
содержащего ЗЕКбо-
14. Для проверки правильности выбора концентрации ком-
племента в четыре контрольные лунки вносят 6, 3, 1,5 и
0,75 ЕКбо соответственно (ряды 1—4, лунки 12). Далее прово-
дят следующие операции:
а) в лунки рядов 1, 3, 4 добавляют по одному объему
VBS; в лунки ряда 2 — два объема VBS;
б) в лунки ряда 1 добавляют два объема комплемента,
а в лунки рядов 2 и 3 — по одному объему комплемента;
в) с помощью микротитратора переносят 0,025 мл из лунок
ряда 3 в лунку ряда 4;
г) из лунок ряда 4 микротитратором удаляют 0,025 мл;
д) в лунки рядов 3 и 4 вносят по два объема VBS.
14. Планшет оставляют на ночь при 4 °C.
16. Утром планшет выдерживают 30 мин при 37 °C.
17. Готовят 4%-ную суспензию эритроцитов барана; 2,5 мл
этой суспензии смешивают с равным объемом гемолизина, раз-
веденного в VBS до ОСК. Гемолизин добавляют при постоян-
ном перемешивании, переворачивая пробирки 10—12 раз. Сен-
сибилизированные эритроциты инкубируют в водяной бане
30 мин при 37 °C.
18. В каждую использованную лунку планшета добавляют по
одному объему сенсибилизированных эритроцитов.
19. Для перемешивания планшет покачивают, затем накры-
вают крышкой и инкубируют 15 мин при 37°C. Затем содер-
322
Глава 11
жимое лунок еще раз перемешивают, покачивая планшет, и
продолжают инкубацию еще 15 мин.
20. Для получения окончательного результата планшет вы-
держивают около 90 мин при 4 °C.
Интерпретация полученных результатов. На рис. 11.6 показан
типичный результат тестирования. Контроль комплемента сви-
детельствует о правильности выбора концентрации комплемен-
та. Контроль антигена и антисыворотки (полный гемолиз в этих
лунках) свидетельствует о том, что для связывания комплемен-
та необходимо образование комплекса антигел — антитело.
Оптимальным разведением СК-антигена вируса краснухи
считают разведение, обеспечивающее максимальное связывание
комплемента при наибольшем разведении сыворотки. В нашем
примере (рис. 11.6) таким разведением является разведение
Антиген Контроли
5 10 20 40 80 160 антисыворотки
40
80
160
Антисыворотка
320
640
Контроли
антигена
4 4 4 4 1 0 0 • 9 9 9 0
4 4 4 3 0 0 0 9 9 9 9 0 Контроли . номплемента
0 1 2 1 0 0 0 • 9 9 9 2
0 0 0 0 0 0 0 • 9 9 9 4
0 0 0 0 0 0 0 9 9 9 9 9
0 0 0 0 0 0 0 9 9 9 • 9
Рис. 11.6. Титрование антигена и специфических антител
1 :20. Его и следует использовать при тестировании неизвестной
сыворотки.
В рассматриваемом случае титр положительной сыворотки
равен 160, т. е. обратной величине разведения, позволяющего
различить два произвольных разведения СК-антигена вируса
краснухи.
5.2.3. Тестирование неизвестной сыворотки
Титрование сыворотки. 1. В стеклянных пробирках готовят че-
тырехкратные разведения исследуемой, контрольной положи-
тельной и контрольной отрицательной сывороток, смешивая
0,1 мл каждой сыворотки с 0,3 мл VBS.
Методы клинической вирусологии
323
2. Для инактивации присутствующего в сыворотке компле-
мента пробирки инкубируют на водяной бане 30 мин при 56 °C.
3. 96-луночный планшет для микротитрования размечают,
как указано на рис. 11.7.
4. В лунки 1—8 и 10 вносят по одному объему VBS. Коли-
чество заполненных рядов должно соответствовать числу тести-
руемых сывороток.
5. В лунки 1 и 10 добавляют по одному объему разведен-
ной в четыре раза сыворотки.
Разведения сывороток Контроли
8 16 32 64 128 256 512 1024 сывороток
А
В
С
Сыворотки
D
Отр.
Положит.
00 000000*0» о
44 44 4400*0» О
44 000000*0» 2
44 440000*0» 4
00 0000 00*0*»
44 444000*0» »
• • ••••••••*4
• • •••••••«•о
Контроля
комплемента
Клеточные
контроли
Контроли
антигена
Рис. 11.7. Титрование неизвестной сыворотки в реакции связывания комп-
лемента
6. С помощью микротитратора готовят последовательные
двукратные разведения сыворотки в первых восьми лунках. Та-
ким образом получают последовательные двукратные разведе-
ния от 1 :8 до 1:1024. Из лунок 8 микротитратором удаляют
по 0,025 мл.
7. В лунку с контролем антигена добавляют один объем
VBS, а в лунку с контролем клеток — три объема VBS.
8. По одному объему КС-антигена вируса краснухи добав-
ляют в каждую лунку, за исключением тех, где содержатся
контроли сывороток (лунки 10), клеток и комплемента.
9. Один объем разведения, содержащего ЗЕКбо, добавляют
во все лунки, кроме лунок с контролем комплемента и контро-
лем клеток.
10. Контроль комплемента готовят, как описано выше.
11. Планшет закрывают и оставляют на ночь при 4 °C.
324
Глава 11
12. Планшет выдерживают 30 мин при 37 °C, а затем в каж-
дую лунку добавляют сенсибилизированные эритроциты, как
описано выше.
13. Планшет инкубируют при 37 °C, как описано выше. Пе-
ред учетом результатов планшет выдерживают 90 мин при 4°
для осаждения клеток.
Учет полученных результатов. На рис. 11.7 показан результат
тестирования четырех неизвестных сывороток. Контроль ком-
племента подтверждает, что разведение комплемента действи-
тельно содержит ЗЕКбо- Контроль клеток свидетельствует об
отсутствии спонтанного лизиса сенсибилизированных эритроци-
тов. Полный лизис в лунках, содержащих контроли антигена и
сывороток, свидетельствует о том, что для связывания компле-
мента необходимо образование комплекса антиген — антитело.
Поэтому, если сыворотки содержат иммунные комплексы и ин-
фицированы бактериями, результат реакции может быть иска-
жен. Контроль с заведомо отрицательной сывороткой свиде-
тельствует об отсутствии иммунных антител. Контроль заведо-
мо положительной сыворотки показывает, что она содержит
антитела в разведении 1 : 128. В 256-кратном разведении антите-
ла обнаружить не удалось. Таким образом, титр контрольной
положительной сыворотки равен 128. Титры тестируемых сыво-
роток от А до D составляют соответственно 8, 256, 16 и 64.
5.3. Радиальный гемолиз
Радиальный гемолиз — прекрасный метод для обнаружения
IgG к вирусу краснухи [8], поскольку этим чувствительным и
специфичным методом можно одновременно тестировать боль-
шое число сывороток (рис. 11.8).
IgG, специфичные к вирусу краснухи, обнаруживают по ли-
зису эритроцитов, связанных с антигеном вируса краснухи и
суспендированных в агарозном геле в присутствии комплемента.
Содержащиеся в сыворотке IgG к антигену вируса красну-
хи, связанному с эритроцитами, выявляют при одновременном
тестировании контрольных гелей, содержащих комплемент и
эритроциты, свободные от антигенов краснухи.
5.3.1. Приготовление гелей для радиального гемолиза
1. Расплавляют обычным образом два объема (по 15 мл)
1%-ной агарозы на буфере для постановки РСК и охлаждают
до 43 °C в водяной бане.
2. Эритроциты барана трижды промывают центрифугирова-
нием и ресуспендированием в том же буфере.
Методы клинической вирусологии
325
Рис. 11.8. Радиальный гемолиз, вызванный антителами к вирусу краснухи.
Положительный контроль с низким содержанием специфических антител
(15 международных единиц)—лунки 3 и 5 ряда 5, отрицательный конт-
роль — между ними
3. Трижды промытые клетки опять ресуспендируют в том же
буфере, получая 15%-ную суспензию. В две пробирки, обозна-
ченные «опыт» и «контроль», вносят по 0,3 мл полученной сус-
пензии.
4. Растворяют ГА-антиген вируса краснухи и смешивают с
0,3 мл суспензии эритроцитов в пробирке, обозначенной «опыт».
5. Смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре.
6. Обе пробирки заполняют буфером для постановки РСК
и центрифугируют для осаждения эритроцитов.
7. Супернатанты удаляют, а эритроциты ресуспендируют
в 0,5 мл того же буфера с канамицином (100 мкг/мл).
8. Растворяют лиофилизированный препарат комплемента.
В опытную пробирку добавляют 0,5 мл неразведенного компле-
мента.
326
Глава 11
9. Пробирку выдерживают 10 с в водяной бане при 43 °C,
затем ее содержимое смешивают с 15 мл расплавленной (ох-
лажденной до 43 °C) агарозой. Пробирку быстро закрывают
пробкой и перемешивают содержимое для равномерного рас-
пределения эритроцитов, несколько раз переворачивая про-
бирку.
10. Сразу же после перемешивания смесь агарозы с эритро-
цитами выливают в горизонтально установленную квадратную
пластиковую чашку Петри (100X100 мм). Чашку обозначают
«опыт».
И. Осторожным покачиванием равномерно распределяют
агарозу по чашке Петри.
12. Для контрольной суспензии повторяют этапы 7—9. На
соответствующей чашке делают надпись «контроль».
13. Чашки оставляют на 20 мин для затвердения агарозы.
Результат учитывают сразу же, либо сохраняют чашки в тече-
ние четырех дней при 4 °C.
5.3.2. Тестирование сывороток
1. Тестируемые сыворотки прогревают 20 мин на водяной
бане (60 °C) для инактивации комплемента.
2. В залитых гелях «опыта» и «контроля» по матрице с по-
мощью узкой стальной трубки, присоединенной к водоструйно-
му насосу, проделывают лунки диаметром 3 мм (рис. 11.9).
3. Соответствующие лунки опытного и контрольного гелей
заполняют сыворотками. В каждую постановку следует вклю-
чить как заведомо отрицательную, так и слабо положительную
сыворотку (при диагностировании используют сыворотку, со-
держащую 15 международных единиц антител, специфичных к
вирусу краснухи).
4. Гели помещают на ночь во влажную камеру при 37 °C.
5.3.3. Интерпретация полученных результатов
На пластинах с гелем против темного фона выявляют зоны
гемолиза вокруг лунок. Сыворотки, вызывающие образование
больших по сравнению с контролем зон гемолиза, содержат
специфические антитела к вирусу краснухи. Сыворотки, не вы-
зывающие гемолиза вообще или вызывающие образование зон
гемолиза такого же диаметра, как и контрольных, не содержат
специфических антител. Донор такой сыворотки восприимчив
к первичной инфекции.
Методы клинической вирусологии
327
Рис. 11.9. Матрица для тестирования 63 сывороток (включая контроли) мето-
дом радиального гемолиза
5.4. Обнаружение специфических IgM
к вирусу краснухи методом «захвата» антител
(antibody-capture technique)
Обнаружение специфических IgM к вирусу краснухи имеет
важное значение при постановке диагноза первичной и врож-
денной инфекций. Существует множество методов определения
и идентификации таких антител. В основе ранее применяемых
методов лежит разделение сывороточных IgG и IgM гель-филь-
трацией или центрифугированием в градиенте плотности саха-
розы. Полученные фракции тестируют в РТГА на присутствие
специфических иммуноглобулинов. В последнее время эти ме-
тоды заменены чисто иммунологическими методами, которые
не требуют фракционирования сыворотки. Существуют два ос-
новных варианта этих методов. Первый предполагает идентифи-
кацию иммобилизованного антигена. При этом антиген вируса
краснухи связывают с поверхностью пластика (например, дном
лунки 96-луночного планшета), инкубируют его с сывороткой
пациентов, а затем с меченными антителами против IgM чело-
века, содержащихся в исследуемой сыворотке. Если после
328
Глава 11
каждой стадии проводить тщательную отмывку, то оставшаяся
метка укажет на присутствие специфических IgM.
Альтернативным методом является метод «захвата» антител,
при котором твердую фазу вначале связывают с антителами
к IgM человека. Промывают и инкубируют с тестируемой сыво-
роткой, что приводит к «захвату» содержащихся в ней IgM.
Последующая инкубация с антигеном краснухи позволяет ото-
брать все специфические IgM. После очередной промывки свя-
завшийся с твердой фазой антиген вируса краснухи выявляют
в реакции с меченными антителами к вирусу краснухи.
Последние антитела — антитела-детекторы — могут быть по-
мечены радиоактивным 1251 или связаны с ферментом, расщеп-
ляющим субстрат с изменением окраски. Ниже мы опишем ме-
тод, основанный на использовании радиоактивных изотопов,
поскольку он хорошо разработан и применяется в большинстве
лабораторий. В качестве меченых антител в настоящее время
широко используют мышиные моноклональные антитела, одна-
ко, к сожалению, они не всегда доступны. При необходимости
мы советуем связаться с местной вирусологической лаборато-
рией, которая смогла бы обеспечить вас моноспецифической
сывороткой высокого титра. В противном случае сыворотка
может быть получена стандартными методами (например, от
кролика, иммунизированного вирусом краснухи, выращенным
в клетках RK13) или с помощью гибридомной технологии (см.
Теддер и др., [8]). Полученные антитела легко пометить иодом,
как описано ранее {6]. Однако в последнее время все более по-
пулярным становится иммуноферментный метод. В частности,
фирмой Rubenz-M производится коммерческий набор реагентов
(Northumbria Biologicals) для метода «захвата» IgM, специфич-
ных к вирусу краснухи. Кроме того, можно отдельно заказать
моноклональные антитела к вирусу краснухи, конъюгированные
с ферментом.
5.4.1. Подготовка полистироловых гранул
1. В контейнер помещают полистироловые гранулы (Nort-
humbria Biologicals Ltd.), которые заливают кроличьей антисы-
вороткой к ц-цепям IgM человека (Dako Ltd.), разведенной
в 500 раз в 1 н. НС1.
2. Гранулы встряхивают в течение 1 ч при комнатной темпе-
ратуре. Перед употреблением гранулы должны быть выдержаны
на холоду (4 °C) не менее 48 ч.
3. Для мелкомасштабных экспериментов гранулы разливают
по 12-мм (в диаметре) пробиркам из полистирола. Гранулы
промывают в специальном сосуде, удаляя жидкость пастеров-
ской пипеткой, присоединенной с помощью вакуумного шланга
___________________Методы клинической вирусологии 329
К водоструйному насосу. Описанные выше процедуры могут
быть значительно упрощены при использовании специальных
систем фирмы Abbott Diagnostics Ltd.
5.4.2. Тестирование
1. Отбирают требуемое количество гранул, отсасывают НС1
и покрывают гранулы PBSA с 1% БСА. Суспензию инкубируют
3 ч при комнатной температуре.
2. В лунки или пробирки, используемые для тестирования,
разливают по 200 мкл PBSA с 0,05% твин 20 (PBST), затем
в них добавляют по 5 мкл исследуемых и контрольных сыворо-
ток (каждая проба должна быть поставлена в двух паралле-
лях). Смешанный препарат сывороток от 4—8 недавно выздо-
ровевших больных принимают за 100 условных единиц IgM,
специфичных к вирусу краснухи. Положительные контроли, со-
держащие 40, 10, 3,3 и 1 условных единиц, получают, разводя
смешанную сыворотку заведомо отрицательной человеческой
сывороткой. Они используются в каждом тестировании для
построения стандартной калибровочной кривой. Кроме того,
в каждый опыт необходимо включать отрицательный контроль.
3. В каждую лунку или пробирку с приготовленным 40-крат-
ным разведением тестируемых и контрольных сывороток добав-
ляют гранулы, покрытые сывороткой кролика против ц-цепей
IgM человека. Образцы инкубируют 3 ч при 37 °C.
4. Гранулы трижды промывают PBST, а затем инкубируют
с 200 мкл ГА-антигена вируса краснухи (титр 128), разведен-
ного в 10 раз в PBST. Образцы инкубируют 18—24 ч при 4 °C.
После инкубации гранулы трижды промывают в PBST.
5. В каждый образец добавляют по 200 мкл антител-детекто-
ров, меченных 1251 и разведенных до 50 000 имп/мин на 200 мкл.
Для разведения используют PBS с 2% твин 20, 20% кроличьей
сыворотки и 10% заведомо отрицательной человеческой сыво-
ротки (обе сыворотки инактивируют прогреванием при 37 °C
в течение 3—4 часов).
6. Гранулы промывают четыре раза PBST и определяют ра-
диоактивность с помощью у-счетчика. Далее усредняют резуль-
таты параллелей, вычитают счет фона и строят калибровочную
кривую. Данные по контрольным сывороткам (счет за 100 с)
наносят на логарифмическую бумагу (рис. 11.10). Количество
относительных единиц в исследуемых сыворотках определяют,
сравнивая построенную калибровочную кривую со стандартной
калибровочной кривой.
22—369
330
Глава 11
Рис. 11.10. Стандартная кривая для определения специфичных к вирусу крас-
нухи IgM методом «захвата» антител
5.4.3. Интерпретация полученных результатов
Сыворотка, содержащая 3,3 условной единицы и более 3,3,
считается положительной. Данный результат свидетельствует о
недавно перенесенной или врожденной инфекции. Сыворотка,
содержащая менее 1 условной единицы, считается отрицатель-
ной. Сыворотка, содержащая от 1 до 3,3 условной единицы, не
может считаться ни положительной, ни отрицательной. В этом
случае диагноз ставится с учетом клинической картины заболе-
вания. Как правило, такие сыворотки все же рассматриваются
как отрицательные. Тем не менее они могут свидетельствовать
об инфекции, перенесенной ранее.
6. Благодарности
Мы благодарны Джулиан Ходгсон и сотрудникам отдела
вирусологии Kings College Hospital за помощь в отработке из-
ложенных методов. Кроме того, мы благодарим Филлис Ловетт
за подготовку текста к печати.
Методы клинической вирусологии
331
Литература
1. Lennette Е. Н„ Schmidt N. !.. eds. (1979). Diagnostic Procedures for Viral,
Rickettsial and Chlamydial Infections, 5th Edition, published by American
Public Health Association, Washington.
2. Grist N. R., Bell E. J., Follett E. A. C., Urquhart G. E. D. (1979). Diagnostic
Methods in Clinical Virology, 3rd Edition, published by Blackwell Scientific
Publications, Oxford, London, Edinburgh and Melbourne.
3. Field A. M. (1982). Adv. Virus Res., 27, 1.
4. Gardner P. S., McQuillian J. (1980). Rapid Virus Diagnosis, 2nd Edition,,
published by Butterworths, London.
5. Paul J. (1975). Cell and Tissue Culture, 5th Edition, published by Churchill
Livingstone Edinburgh, London and New York.
6. Pattison J. R., ed. (1982). Laboratory Investigation of Rubella Public Health
Laboratory Service Monograph Series, No. 16, Her Majesty’s Stationery
Office, London.
7. Morgan-Capner P. (1983). Public Health Lab. Serv. Microbiol. Digest, 1, 6.
8. Tedder R. S., Yao J. L., Anderson M. J. (1982). J. Hyg., 88, 335.
22
предметный указатель
Абортивная инфекция 167
Агароза в методе бляшек 87
— мини-гель для анализа ДНК 240
Агглютинация эритроцитов 93
Аденовирус(ы) 259—269, 312
— крупного рогатого скота 262
— культивирование 254
— мышиный 262
— обезьяний 262
— очистка и титрование 263—269
---метод бляшек 265—266
— птиц 254, 256, 262
— человека и животных 256, 261
Аллантоисная жидкость, сбор 165
— введение вируса 164
Альфавирусы 66, 73, 75, 80, 105
— белки, анализ 104
Амниотическая жидкость, сбор 166
— полость, введение вируса 164
Антигенный дрейф 161
Антигены Т (опухолевые) 241
Антитела нейтрализующие, определе-
ние 88—89
Арбовирусы 66
Асцитные клетки 47
Афтовирусы 45
Белки вируса гриппа 181, 183
— вирусные 155
— мечение 97, 195
Бляшки метод см. Метод бляшек
— синцитиальные и несинцитиальные
277
Бромовирусы, очистка 14, 17
Буфер боратно-фосфатный (BBS) 92
— глюкозо-желатиновый 109
— диссоциирующий 41
— трис-Дюльбекко 227
— GTNE 98
— НВЕ 227
— HEPES 107
Вакцина Солка
Вакцинные штаммы полиовируса 48
Версена раствор ПО
Вестерн-блоттинг 142, 152
Вирус (ы), антигенные свойства, опре-
деление 54—57
— африканской болезни лошадей 201
— биофизическая характеристика
22—23
— биохимический анализ 33—42
— болезни бурсы 202
----Фиджи 201
— везикулярного стоматита 113, 116
— ветрянки 312
— герпеса простого (ВГП) 270, 312.
См. также Герпесвирусы
—------белки 283
-------морфология 282
-------наращивание 273
------- номенклатура белков 283
------- определение инфекционного
титра 276
—------электронная микроскопия
277
----Саймири 295—302
-------морфология бляшек 298
— Гепатита А 44—45
— гриппа 161—199
---- активация трипсином 168
----антигенный дрейф 161
----белки, анализ 181, 183
— — единица инфекционности для
эмбриона (ЕИЭ60) 174—175
---- клеточные линии для роста 312
----культура для размножения
167
----метод бляшек 178
----нейраминидаза 189—192
---- очистка 181, 186
----размножение в эмбрионах 162—
166
---- расчет титра 175
---- слияние вирусной и клеточной
мембран 192
---- титрование 169—181
---- транскриптаза вириона 188
---- ферменты вириона 188
Предметный указатель
333
---- хранение препаратов 193
---- электронная микроскопия 181
— денге 77, 81
— изометрические 14—15
— инфекционного некроза поджелу-
дочной железы 202
— карликовости риса 201
— картофеля (Х-вирус, ХВК) 21—
24
— кеты 201
— Коксаки 45, 46, 312
— колорадской клещевой лихорадки
201
— кольцевой пятнистости табака,
очистка 14
— комнатной мухи 201
— концентрирование 15, 58, 97—99
— кори 312
— кошачьего сомика 286
— коэффициент диффузии 26
----седиментации 24—26
— краснухи 312—330
----иммунологические методы 312
— леса Семлики 80
— мамиллита крупного рогатого ско-
та 285
— Менго 45
— меры предосторожности при рабо-
те 45—46, 67, 223—224
— мозаики костра 17, 20, 24
----люцерны, очистка 17, 24
---------- методика 20
— молекулярная масса, определение
26—27
— нуклеиновые кислоты, содержание
37____эд
— обезьяний (SV40) 223—252
— огурцов, очистка 17
— определение чистоты 104
— осаждение 98—99
— очистка, извлечение из градиента
16, 18
— палочковидные, очистка 13—14
— парагриппа 312
— повышение инфекционности 89—90
— полиомы 223—252
---- идентификация 236
---- очистка 231
---- получение заготовок 231
— — титрование 236
— псевдобешенства 285
— раневых опухолей 201
— растений, очистка 17
---- рабдовирусы 126
----растения-хозяева 12—13
---- экстракция из растений 13
— респираторно-синцитиальные, обоз-
начения 133—136, 309, 312
— ринотрахеита кошек 285
— РНК-содержащие 202—212
— саркомы Рауса 133
— сбор 49—50
— свинки 312
— семейства Reoviridae 201
— Сендай, белок F 167
— Синдбис 80
— синего языка 201
— содержащие двунитевую РНК
201—222
----------классификация 201
— табачной мозаики 14, 17, 21, 24
— трансформирующая активность
223
— ультрафиолетовый спектр 22—24
— фракционирование 102
— хранение препаратов 19
— цитоплазматического полиэдроза
201
— чистота препарата 19
— шершавой карликовости кукурузы
201
— Эпштейна-Барр 270
— южной мозаики бобов 17
— • ящура 45
— ECHO (эховирус)
— РЗ/Ьеоп/США (1937) 45
—• RS см. Вирус респираторно-син-
цитиальный
— SA11 201, 211
— SV40, выделение хромосомы 228,
231, 251
— Wa 201
Вирусные частицы 42
Гель-фильтрация, очистка вирусов
59
Гель-электрофорез 41—42, 152, 196,
284, 290
— вирусных частиц 42
— нуклеиновых кислот 30, 39, 153,
197, 216
Гемагглютинация, определение вируса
гриппа 169, 174
--------полиомы 237
— — тогавируса 91
— пневмовирусами 138
— торможение (РТГА) 109, 174
Гемагглютинин вируса гриппа 167,
169
— получение 91—93
Гемагглютинирующая единица (ГАЕ)
171—172
Гемадсорбция 138
Гемолиз радиальный 324
334
Предметный указатель
Гемоцитометр, использование 74
Герпесвирусы 270—302. См. также
Вирус герпеса простого
— радиоиммунологические методы
278
а-герпевирусы 270, 283
8-гидроксихинолин 34—35
Гликопротеины, мечение 97
Глиоксаль, денатурация нуклеиновых
кислот 39—40
Глюкозо-желатиновый буфер 92, 109
Градиентное центрифугирование 17,
61—62, 232, 264
Градиенты, фракционирование 62—65
Грюнштейна — Хогнесса метод 220
Дебрис клеточный, удаление 97—98
Денатурация двухцепочечных РНК
218
— нуклеиновых кислот 39—42
Диагностические тесты 304
Диметилсульфоксид (ДМСО) 217
Дифенилаланиновая реакция 38
ДНК, ник-трансляция 30
— экстрагирование из вирусов 240,
248
— электрофорез 240
ДНКаза, определение типа нуклеино-
вой кислоты 37
Додецилсульфат натрия, экстрагиро-
вание нуклеиновой кислоты 36
Дот-блот-гибридизация 29—33
ДЭАЭ-декстран; повышение инфекци-
онности вируса 114, 136
Дюлъбекко таблетки 198
Единица инфекционности для эм-
бриона (ЕИЭ5о) 174—175
Зонды нуклеиновых кислот 30—31
Изопикническое равновесное центри-
фугирование 17—19, 27, 101—102,
151, 232
Иммунодиффузия одиночная ради-
альная 55—56
Иммуноферментный анализ (ELISA)
140
Иммунофлуоресценция непрямая 76—
77, 139
----- определение Т-антигенов 241—
244
-------респираторно-синцити-
ального вируса 309
— обнаружение вируса в комаре 82
— титрование 120—122
Иммуноэлектронная микроскопия
Инфекционность, метод определения
и стабилизации 66, 136
— определение вируса гриппа 179
--- герпесвируса 276
— — полиовируса 53
--- тогавируса 85
Карбоксиметилцеллюлоза в методе
бляшек 86
— среда для куриного эмбриона 198
Кардиовирусы 45
Каулимовирусы 14
Клетки крысиной гепатомы Новикова
47
— почек 135, 149, 230, 261
— черепахи 135
— АР61 75, 108
— ВНК 47, 77, 113, 225, 271
— BSC-1 211
— CER 117
— CV-1, инфицированные вирусом
SV40 228—229
Клетки FRhK-6 49
— FRMK-6 47
— НВС 135
— HeLa 47, 51, 133, 255, 311
— HL-1 135
— Нер-2 47, 48, 133, 271
— HLDC-1 135
— КВ 47, 255, 135
— L-49 135
— LLCMK2 47, 77
— MDBK и MDCK 167
— MRC-5 47, 255, 311
— P388D1 89
— РК-15 77
— RD 47
— Vero 77, 80, 88
— WI-38 135, 255
— ЗТЗ и ЗТ6 225
Клетки-293, культивирование 261
Киллерные частицы дрожжей 202
Клеточная суспензия, заражение ви-
русом 79
Клонирование ДНК-генома 155
— трансформированных клеток 248
Клостеровирусы 13
Колонии клеток, приготовление 245—
246
Комар, заражение вирусом 81—82
— культуры клеток, чувствительность
к вирусам 73—74
— личинка, наращивание вируса 81
— наращивание тогавируса 66, 81
— обнаружение вируса в нем 82
Комплемент, реакция связывания
317—324
Предметный указатель
335
Конечная точка, определение 267
Концентрирование пикорнавирусов,
58—59
— тогавирусов 97
Конъюнктивит геморрагический 45
л-крезол 34
Культивирование клеток, аппаратура
217—272
Культуры клеток
----для размножения вирусов 47
-------тогавирусов 77—79
------- микроносители 96
----первичные и вторичные 225
---- пересев 78
----персистентно инфицированные
159
Куриные эмбрионы 162
----подготовка к заражению 162—
163
---- сбор аллантоисной и амниоти-
ческой жидкости 165—166
---- среда стандартная 178
----титрование вируса 174, 176—
177
ЛД50 58
Леишмана краситель 54
Лютеовирус, очистка 13
Макрофаги и определение вируса
89—90
Метиониновая метка 50, 142, 143, 195
Метка радиоактивная 142—143
Метод бляшек, определение аденови-
руса 265, 266
— -----вируса везикулярного сто-
матита 117,
---------- гриппа 178, 180
----------дыхательного синцити-
ального 136
----------полиомы 236
.-----нейтрализующих антител
88—89
—------полиовируса 53
— рабдовирусов 116—119
----покрытия 86—87
----модифицированный 118
----окрашивание бляшек 180
----черных 290
— «захвата» антител 327
— «оспин» 278
— флуоресцирующих фокусов 268
Методы клинической вирусологии
304—330
Микоплазма 225, 258—260
Мини-гели 240
Мини-хромосомы 223, 250
Моноклональные антитела, получение
157—158
Мульгофен BCV-720 56
Мышь, заражение тогавирусом 67—•
68
------- методика 69
Нафталиновый черный 109
— — окрашивание бляшек 54
Негативное контрастирование 146
Нейраминидаза 173
— тест 189—192
Непермиссивные клетки 245
Ник-трансляция 30—31
Нитроцеллюлоза при гибридизации
нуклеиновых кислот 29—32
Нуклеаза микрококков, обработка
лизата ретикулоцитов 221
Нуклеиновые кислоты, выделение
33 — 36, 153, 240
--- гибридизация, использование
нитроцеллюлозы 29—32
--- зонды, приготовление 30—31
---определение типа и содержа-
ния 36—38
---содержание в вирусных части-
цах 37—39
Опухолевые антигены см. Антигены
Т
Опухоли, индукция паповавирусами
223
Органная культура для вируса грип-
па 168
Орциноловая реакция 38
Острое респираторное заболевание 47
Паповавирусы, индукция опухолей
223
— определение концентрации 235
— очистка 234
— предосторожности при работе 224
— электронная микрофотография
308
ПД50 (протективная доза) 85
Пикорнавирусы, 44—65
— антигенные свойства 54—57
— выявление 52, 57
— классификация и представители 45
— концентрирование 58—59
— культивирование 46—50
— меры предосторожности при рабо-
те с ними 45—46
— очистка 59—65
— ультрацентрифугирование 59
— чувствительность к протеиназам
48
Плавучая плотность 27—28
336
Предметный указатель
Пневмовирусы 131—159
— белки, очистка 155
— выделение и хранение 133—134
— гемадсорбция и гемагглютинация
138—139
— дефектные интерферирующие ча-
стицы 145
— морфология и морфогенез 146
• — номенклатура 133
— общие свойства 132
— особенности 131—133
Полиаденилирование РНК 218—219
Полиовирусы 44—45
— антигенные свойства 54—57
— вакцина 46
— вакцинные свойства 48
•— ДНК, электрофорез 240
— ингибиторы и культивирование 48
— мечение, получение 50
— определение методом бляшек 53
---TCIDjo 52
— цитопатическое действие (ЦПД)
49
Полифенолоксидаза 12, 14
Полиэтиленгликоль 15, 58, 99, 150
— концентрирование вируса 99
— очистка вируса гриппа 183
— при экстракции нуклеиновых кис-
лот 35
Потивирусы 13
Проназа 36
Протаминсульфат 114
Протеаза К 36
Псевдовирионы 235
Рабдовирусы 112—159
— наращивание в культуре клеток
ИЗ
— очистка 122—128
— растений 126
— титрование 116—122
Радиальный гемолиз 324
Радиоактивное мечение 96—97
Радиоиммунопреципитация 144
Радиоиммунный анализ вируса по-
лиомиелита 55
Растения, вирусы 126
Реовирусы, биохимические методы
202, 212—220
— млекопитающих 201
— наращивание 202
— очистка и культивирование 207—
208
— получение мРНК 212, 214
Ретикулоциты кролика 221
Рецепторы Fc 89
Рибонуклеаза, определение типа ну-
клеиновой кислоты 36
— вириона 49
Рибосомы 14—15
Рибулозобисфосфат-карбоксилаза 14,
17
Риновирусы 312
— классификация 44—45
— культивирование 48
— сбор 49
— титры 46—47
— человека 45
— чувствительные клеточные линии
312
РНК вирусная, полиаденилирование
218—219
— мечение 96—97, 151, 194
— обратная транскрипция 31
— трансляция 154
днРНК, трансляция in vitro 216, 218
мРНК вирусная, синтез in vitro 213
— трансляция 215
РНКаза см. Рибонуклеаза
Роллерные сосуды 271
Ростовая среда для фибробластов
197
Ротавирусы крупного рогатого скота
201
— культивирование и очистка 207
— наращивание 211
— электронная микроскопия 306
Сахарозный градиент, очистка виру-
сов 61, 186, 206, 234
— — приготовление 16, 17
--- ступенчатый 100—102
Сведберга уравнение 26
Синцитиальный и несинцитиальный
штаммы 273—274, 277
«Слепой пассаж» в культуре ткани
210
---у мышат 67—68
Смола Ag501-X8 39
Собемовирусы, очистка 14
Спирмена — Кербера формула 121
Среда безметиониновая 198
— бесфосфатная 198
— культуры тканей 107—108
— Игла 107
---модификация Глазго и Дюль-
бекко 107, 114
— Лейбовича 53, 77, 107, 135
— CaS2MEM 51
— MM/VP12 107—108
— RPMI-1640 107
Стафилококки 149
Стоксовский радиус 26
Предметный указатель
337
Сульфат аммония, концентрирование
пикорнавирусов 58
Сыворотка крупного рогатого скота,
ингибитор вируса 48
Тартратный градиент, очистка виру-
са 186
Температурно-чувствительные мутан-
ты, выделение 158
Терасаки пластины 79
Титрование аденовирусов 265
— антител 94
— вируса гриппа 169—181, 276
— вирусов, понятие 58
— гемолизина 93
— герпесвирусов 276—278
— комплемента 318—320
— рабдовирусов 116—132
— тогавирусов 83—95
Транскриптаза вируса гриппа 188
— реовируса 212
Трансформация 244—248
Трансформированные клетки, клони-
рование 248
Трансформирующая активность ви-
русов 223
Трипсин, активация вируса гриппа
168
Трипсин-версеновый буфер ПО, 227
Тогавирусы 66—106
— вариабельность 105
— заражение мышат, методика 69
— концентрирование и культивиро-
вание 95—99
— наращивание 74, 77—81
— очистка 95—105
— предосторожности при работе 67
— титрование 83—95
- — — гемолизина 93—94
• — центрифугирование 98—99
Ультрацентрифугирование, осажде-
ние вирусов 59, 98—99. См. также
Центрифугирование градиентное
Уранилацетат в электронной микро-
скопии 28
Фенол, экстрагирование нуклеино-
вых кислот 34—35
— меры безопасности при работе с
ним 34
Фергюсона графики 41
Фибробласты куриного эмбриона 113,
167
Фирмы, поставляющие реактивы 305
•Фитоферритин 14—15
Флавивирусы 66, 73, 75
— анализ белков 104
Флуоресцеинизотиоцианат 76
Формальдегид (формалин), денату-
рация нуклеиновых кислот 40—41
— обработка эритроцитов 187
Фосфатный буферный физиологиче-
ский раствор ПО, 198, 227
Фосфор, содержание в вирусах 37—
38
Хенкса солевой раствор 198
Хлорбутанол при очистке вирусов 19
Хлористый цезий, градиентное цен-
трифугирование 61
Хроматография на микропористом
стекле 185
Хромосомы вирусные, буфер для вы-
деления 227
Цезия растворы, центрифугирование
при очистке вирусов 17—19
Целлюлоза, иммобилизация вирусной
нуклеиновой кислоты 29
Центрифугирование градиентное ви-
руса гриппа 186
----- паповавирусов 232—234
-----пикорнавирусов 59—65
----- реовирусов 206
— •—• тогавирусов 100
— зональное 16, 17, 101—102
—изопикническое 101—102
Цитодекс гранулы 96
Цитомегаловирус 287, 297, 312
Электронная микроскопия 28, 145—
150, 227
— — вируса гриппа 181
-------герпеса 274, 277
----- контроль увеличения 28
— — негативное окрашивание 28
----- пневмовирусов 145—150
— — подсчет частиц 181, 275
— — ротавирусов 306
----- фекалий 305
— — цитомегаловируса 292
Электрофорез в мини-геле 240
ЭМК 45
Энтеровирусы, классификация 44—49
Эритроциты в формалине, приготов-
ление 187
— для очистки вируса гриппа 184,
187
— подготовка к гемагглютинации 172
Этидиумбромид (бромид этидия) 232
Ящур 44
УКАЗАТЕЛЬ ЛАТИНСКИХ НАЗВАНИИ
Adenoviridae 254
Aedes pseudoscutellaris 108
Aviadenovirus 254, 256
Birnaviridae 202
Cercopithecus aethiops 262
Cypovirus 201
Escherichia coli 30, 152, 218, 220
Fijivirus 201
Lissavirus 122
Mastadenovirus 254, 256
Morbillivirus 131
Orbivirus 201
Orthoreovirus 201
Paramyxovirus 131
Phytoreovirus 201
Pneumovirus 131
Rabdoviridae 112
Reoviridae 201
Rotavirus 201
Saguinus 295
Saimiri sciureus 295
Staphylococcus aureus 149
— aureus 149
Testudo gracea 135
Togaviridae 66
Vesiculovirus 122
Xenopus laevis 135
ОГЛАВЛЕНИЕ
От переводчика ..................................................... 5
Предисловие к английскому изданию................................... 7
Список авторов ..................................................... 9
Список сокращений.....................................................10
Глава 1. Очистка, биофизическая и биохимическая характеристика ви-
русов (преимущественно вирусов растений). Р. Халл ... 12
1. Введение.....................................................12
2. Очистка вирусов растений.....................................12
2.1. Растения-хозяева.........................................12
2.2. Экстракция вирусов из растений...........................13
2.3. Осветление экстрактов....................................14
2.4. Концентрирование вирусов.................................15
2.5. Дальнейшая очистка.......................................16
2.6. Что такое «чистота»?.....................................19
2.7. Хранение вирусных препаратов.............................19
2.8. Конкретные методики очистки..............................20
3. Биофизическая характеристика.................................22
3.1. Необходимость биофизической характеристики .... 22
3.2. Ультрафиолетовые спектры.................................22
3.3. , Седиментационные свойства..............................24
3.4. Коэффициенты диффузии....................................26
3.5. Определение молекулярной массы...........................26
3.6. Плавучая плотность.......................................27
3.7. Электронная микроскопия..................................28
3.8. Обнаружение вирусов методом дот-блот гибридизации . . 29
4. Биохимический анализ.........................................33
4.1. Выделение нуклеиновых кислот.............................33
4.2. Определение типа нуклеиновой кислоты.....................36
4.3. Определение содержания нуклеиновой кислоты .... 37
4.4. Гель-электрофорез нуклеиновых кислот.....................39
4.5. Гель-электрофорез белков.................................41
4.6. Гель-электрофорез вирусных частиц........................42
Литература....................................................42
Глава 2. Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов.
П. Майонор..............................................
1. Введение..................................................
2. Меры безопасности..............................................45
3. Культивирование пикорнавирусов ............................... 46
3.1. Выбор клеток...............................................46
340
Оглавление
3.2. Условия культивирования.................................48
3.3. Сбор вирусов ...........................................49
3.4. Наращивание полиовируса типа 3 для заражения клеток 50*
3.5. Получение меченного [35S]-метионином полиовируса типа 3
на монослойных клеточных культурах в химических пробир-
ках .........................................................50
3.6. Получение вируса в суспензионной культуре клеток HeLa 51
4. Идентификация вирусов.......................................52
4.1. Методы определения инфекционности......................52
4.2. Методы определения антигенных свойств..................54
4.3. Другие методы идентификации пикорнавирусов .... 57
5. Очистка вирусов.............................................57
5.1. Общие замечания.........................................57
5.2. Концентрирование пикорнавирусов.........................58
5.3. Очистка пикорнавирусов..................................59
5.4. Фракционирование градиентов............................62
Литература...................................................65
Глава 3. Культивирование, титрование и очистка тогавирусов. Е. Гулд
и Дж. Клегг...................................................66
1. Введение.................................................. 66
2. Культивирование тогавирусов.................................67
2.1. Заражение новорожденных мышат..........................67
2.2. Выделение и наращивание тогавирусов в культуре клеток ко-
маров .......................................................73
2.3. Наращивание вирусов в культуре клеток млекопитающих 77
2.4. Выращивание вирусов на комарах и их личинках ... 81
3. Титрование тогавирусов......................................83
3.1. Титрование путем интрацеребрального заражения новорож-
денных мышат.................................................83
3.2. Титрование в культуре клеток............................85
3.3. Титрование методом гемагглютинации......................91
4. Очистка тогавирусов.........................................95
4.1. Культивирование тогавирусов.............................95
4.2. Концентрирование вирусов................................97
4.3. Очистка вирусов градиентным центрифугированием . . 106
5. Общие выводы...............................................105
6. Благодарности . 106
Приложение........................................................107
1. Среды для культур тканей...................................107
2. Среды для поддержания культур клеток.......................108
3. Растворитель для природного материала......................108
4. Приготовление суспензии природного материала...............109
5. Обработка сывороток, используемых в РТГА.................109
6. Реактивы и буферные растворы...............................109
Литература..................................................111
Глава 4. Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов. В. Бун-
нер ..............................................................112
1. Введение.................................................
2. Наращивание рабдовирусов в культурах клеток.................113
2.1. Кривая нарастания титра в одиночном цикле размножения 113
2.2. Титрование вирусов.....................................116
3. Выделение и очистка вирусов.................................122
3.1. Рабдовирусы животных...................................122
Оглавление
341
3.2. Рабдовирусы растений....................................126
Литература...................................................129
Глава 5. Пневмовирусы. К. Прингл............................. . 131
1. Уникальные особенности пневмовирусов........................131
1.1. Общее введение..........................................131
1.2. Номенклатура............................................133
1.3. Выделение вируса........................................133
1.4. Хранение вируса.........................................134
2. Основные методы.............................................134
2.1. Культивирование респираторно-синцитиального вируса . . 134
2.2. Методы определения инфекционности.......................136
2.3. Гемагглютинация.........................................138
2.4. Гемадсорбция............................................139
2.5. Иммунофлуоресцентные методы . . ................139
2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) . . 140
3. Аналитические методы........................................142
3.1. Радиоактивное мечение, радиоиммуноанализ и радиоимму-
нопреципитация ............................................142
3.2. Метод выявления дефектных интерферирующих частиц 145
3.3. Электронная микроскопия.................................145
3.4. Концентрирование вируса..............................150:
3.5. Очистка и радиоактивное мечение РСВ....................150'
3.6. Радиоактивное мечение вирионной РНК.....................151
3.7. Анализ вирусных РНК и белков методом электрофореза в
полиакриламидном геле......................................152
3.8. Очистка матричной РНК для трансляции....................154
3.9. Молекулярное клонирование и олигонуклеотидное секвени-
рование ...................................................155
3.10. Очистка вирусных белков................................155
4. Специальные биологические методы............................157
4.1. Получение моноклональных антител........................157
4.2. Выделение температурно-чувствительных мутантов . • . 158
4.3. Получение персистентно инфицированных клеточных культур 159
Литература..........................................159'
Глава 6. Выращивание, очистка и титрование вирусов гриппа. Т. Бар-
рет и С. Инглис...................................161
1. Общее введение.....................................161
2. Системы для размножения вирусов гриппа.............162’
2.1. Куриные эмбрионы................................162'
2.2. Наращивание вирусов в культурах клеток..........166
2.3. Органные культуры...............................168
3. Методы титрования вирусов...........................169
3.1. Титрование вирусов гриппа в реакции гемагглютинации 169'
3.2. Титрование путем определения инфекционности для куриных
эмбрионов............................................174
3.3. Титрование вирусов с использованием фрагментов-эмбрионов 176
3.4. Титрование вирусов гриппа методом бляшек . . . . 178
3.5. Электронная микроскопия вирусов гриппа..........181
4. Очистка вирусов гриппа.............................181
4.1. Введение........................................131
4.2. Концентрирование вируса.........................183
4.3. Методы очистки вирусов гриппа................. ... 184
5. Определение активности вирионных ферментов ...... 188
5.1. Вирионная транскриптаза...............................188
342
Оглавление
5.2. Нейраминидаза..........................................189
5.3. Слияние вирусной и клеточной мембран...................192
6. Хранение вирусных препаратов...............................193
7. Радиоактивное мечение вируса...............................194
7.1. Введение метки в РНК...................................194
7.2. Введение метки в белки.................................195
8. Среды и буферные растворы..................................197
8.1. Среды для культуры клеток ФЭК..........................197
8.2. Буферные растворы......................................198
9. Благодарности..............................................199
Литература................................................. 199
Глава 7. Вирусы, содержащие двунитевую РНК. М. Мак-Кри . . . 201
1. Классификация вирусов, содержащих двунитевую РНК . . 201
2. Выделение вирусов и культуры клеток........................202
2.1. Поддержание культур клеток для наращивания реовирусов 202
2.2. Получение вирусного инокулята..........................203
2.3. Наращивание вирусов в больших масштабах .... 203
3. Очистка вирусов............................................204
3.1. Сбор зараженных клеток и первая экстракция вируса . . 204
32. Очистка вируса центрифугированием в градиенте . . . 206
3.3. Определение выхода и хранение очищенного вируса . . 207
4. Культивирование и очистка ротавирусов .................... 207
4.1. Адаптация к размножению в культуре клеток .... 209
5. Наращивание и очистка ротавирусов для биохимических иссле-
дований ......................................................211
6. Биохимические методы.......................................212
6.1. Транскрипция вирусных мРНК в бесклеточной системе . . 212
6.2. Трансляция вирусных мРНК в бесклеточной системе . . 215
6.3. Трансляция вирусных геномных днРНК Для определения их
кодирующих функций.........................................216
6.4. Молекулярное клонирование генома днРНК-содержащих ви-
русов .....................................................218
Приложение........................................................221
Литература..................................................222
Глава 8. Обезьяний вирус (SV40) и вирус полиомы: культивирование,
титрование, трансформация и очистка вирусных компонентов.
Г. Тюрлер и П. Берд...............................................223
1. Введение...................................................223
2. Техника безопасности при работе с вирусом полиомы и SV40 224
3. Культуры клеток, среды и буферы............................224
3.1. Культуры клеток........................................224
3.2. Клетки-хозяева для SV40 и вируса полиомы .... 225
3.3. Среды и сыворотки......................................226
3.4. Буферы и растворы......................................226
4. Получение заготовок вируса.................................226
5. Очистка SV40 и вируса полиомы..............................231
5.1. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности CsCl 232
5.2. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы . . 234
5.3. Некоторые особенности методов работы с вирусом полиомы 235
6. Определение концентрации вируса ...........................235
6.1. Титрование вируса методом бляшек.......................236
6.2. Идентификация вируса полиомы в реакции гемагглютинации 237
Оглавление
343
6.3. Анализ вирусной ДНК электрофорезом в агарозном мини-геле
6.4. Определение количества зараженных клеток с помощью им-
мунофлуоресцентного окрашивания культур на внутриядер-
ный опухолевый антиген ..........
7. Опухолевая трансформация клеток..........................
7.1. Инфицирование непермиссивных клеток...................
7.2. Получение колоний на пластике в жидкой среде
7.3. Получение колоний в полужидком агаре [20] . . . .
8. Выделение вирусной ДНК и вирусных мини-хромосом из инфи-
цированных клеток ...........................................
8.1. Экстракция вирусной ДНК...............................
8.2. Выделение мини-хромосом SV40..........................
9. Благодарности............................................
Литература.................................................
Глава 9. Культивирование, очистка и титрование аденовирусов. Б. Пре-
шиос и В. Рассел................................................
1. Введение............................................ . ,
2. Клеточные системы для культивирования аденовирусов
2.1. Аденовирусы человека, легко адаптируемые к культуре клеток
2.2. Аденовирусы человека, трудно адаптируемые к культуре кле-
ток ......................................................
2.3 Вирусы других видов...................................
3. Очистка..................................................
3.1. Экстракция инфицированных клеток......................
3.2. Очистка вируса из экстрактов инфицированных клеток
3.3. Свойства очищенного вируса............................
4. Титрование вируса .......................................
4.1. Титрование вируса методом бляшек......................
4.2. Титрование вируса по ЦПД определением конечной точки
4.3. Метод флуоресцирующих фокусов......................- .
4.4. Общие замечания.......................................
Литература.................................................
Глава 10. Культивирование, идентификация и очистка герпесвирусов.
Р. Киллингтон и К. Пауэлл................................
1. Введение.................................................
2. Вирусы простого герпеса типов 1 и 2......................
2.1. Получение заготовок вируса............................
2.2. Электронная микроскопия (подсчет частиц)..............
2.3. Определение инфекционного титра.......................
2.4. Приготовление экстрактов клеток, инфицированных вирусом
2.5. Получение очищенного вируса...........................
2.6. Другие а-герпесвирусы.................................
3. Цитомегаловирус человека.................................
3.1. Получение заготовок вируса............................
3.2. Цикл размножения......................................
3.3. Идентификация вируса..................................
3.4. Метод черных бляшек...................................
3.5. Культивирование и очистка CMV.........................
3.6. Типы частиц CMV.......................................
4. Герпесвирус саймири (HVS)................................
4.1. Получение заготовок вируса............................
4.2. Титрование вируса.....................................
4.3. Цикл размножения......................................
4.4. Получение очищенного вируса...........................
240
241
244
245
245-
246
248
248
250
252
252
254
254
254
256
261
262
263
263'
263
265
265
265
267
268
269
269
270
270
270-
271
275
276
278
279
283'-
287
287
288
289
290'
290
292
295
295
299’
299’
301
Оглавление
5. Благодарности............................................ 302
Литература..................................................302
Глава 11. Методы клинической вирусологии П. Морган-Капнер и
Дою. Паттисон............................................304
1. Введение...................................................304
2. Электронная микроскопия....................................304
2.1. Прямое электронно-микроскопическое исследование фекалий 305
2.2. Иммуноэлектронная микроскопия..........................307
3. Идентификация вирусных антигенов...........................307
3.1. Идентификация респираторно-синцитиального вируса в носо-
глоточных выделениях методом иммунофлуоресценции . . 309
4. Культуры клеток....................................310
5. Иммунологические методы............................312
5.1. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) .... 314
5.2. Реакция связывания комплемента (РСК)...........317
5.3. Радиальный гемолиз.............................324
5.4. Обнаружение специфических IgM к вирусу краснухи методом
«захвата» антител (antibody-capture technique) .... 327
6. Благодарности......................................330
Литература...................-..............................331
Предметный указатель...............................................332
Указатель латинских названий ..................................... 338
Учебное издание
’Роджер Халл, Томас Баррет, Стефан К. Инглис и др.
ВИРУСОЛОГИЯ. МЕТОДЫ
Под редакцией Б. Мейхи
Заведующий редакцией чл.-корр. АН СССР Т. М. Турпаев. Зам. зав. редакцией
М. Д. Гроздова. Научный редактор М. А. Серова. Мл. редактор И. А. Деменцова.
Художник А. А. Захаров. Художественный редактор А. Я- Мусин. Технический редактор
Л. В. Козлова. Корректор Т. А. Пашковская
ИБ № 6433
Сдано в набор 29.06.88. Подписано к печати 17.10.88. Формат 60X90716. Бумага книжно-
журнальная. Печать высокая. Гарнитура латинская. Объем 10,75 бум. л. Усл. печ. л.
21,50. Усл. кр.-отт. 2’1,50. Уч.-изд. л. 21,83. Изд. Яа 4/5405. Тираж 6000. Зак. 369.
Цена 2 р. 30 к.
Издательство «Мир» В/О «Совэкспорткиига» Государственного комитета по делам из-
дательств, полиграфии и книжной торговли. 129820, ГСП, Москва, И-110, 1-й Рижский
пер., 2.
Московская типография № 11 Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР
по делам издательств, полиграфии и книжной торговли. 113105, Москва, Нагатинская
ул., д. 1.