Автор: Ченцов Ю.С.
Теги: биология клетки и субклеточных частиц цитология общая биология биология
ISBN: 5-94628-105-4
Год: 2004
Текст
HJ.C, Ченцов
ВВЕДЕНИЕ 8 КЛЕТОЧНУЮ ЬИОЛОГИЮ
ИКЦ «АКАДЕМКНИГА»
Ю.С. Ченцов
ВВЕДЕНИЕ В КЛЕТОЧНУЮ БИОЛОГИЮ
Издание 4-е переработанное и дополненное
Рекомендовано Министерством образования Российской Федерации в качестве учебника для студентов университетов, обучающихся по направлению 510600 "Биология» и биологическим специальностям
МОСКВА
НКЦ .АКАДЕМКНИГА»
2004
\ IK S76
Ы»К 2Х IIS
Ч 41
Рецензенты:
академик РАН Н.Г Хрутов, академик РАМН R.H. Ярыгин
Чейнов Ю.С.
Введение в клеточную биологию: Учебник для вузов. — 4-е изд., перераб. И доп. / Ю.С. Чейнов. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2004. 495 с.: ил.
ISBN 5-94628-105-4
В книге изложены современные данные о клеточной теории, структуре ядра и хромосом. о функциях мембран (особенно плазматической). о накуолярной системе, митохондриях, клеточном скелете, механизмах деления про и лкарнотнческих клеток, а также о некрозе и апоптозе
Д1я студентов биологических специальностей университетов, пс-д*н отческих. медицинских и сельскохозяйственных высших учебных заве ICHUH.
ISBN S-9462K-1US-4
Ю.С. Чсниов, 2004
'< ИКЦ « Академкнига», 2004
Л 250- кпшю Москош кого муЬрствеиного vnuoepcumemo UM. 1/'.ft. JuM0H</(0f}(t
НРЕЛИСЮВИ1
Данным учебник -Введение в клеточную биологию., является продолжением предыдущей книги под названием «Общая цитология-(М : Изл-во МГУ, 1995).
За последние 50 лет произошло значительное развитиебиологиче-ской науки: гигантский шаг вперед сделали молекулярная биология л молекулярная генетика, клеточная и молекулярная инженерия, что позволило внедрить в практику, в промышленность многие, казалось бы, чисто теоретические разработки в различных областях современной биоло) ии. Резкое расширение интересов исследователей и развитие многих принципиально новых методических подходов привези к какоплению за последние годы множества новых фактов и представлений. касающихся практически всех аспектов биологии клетки, как в изучении ее строения, так и в молекулярной и генетической ее организации. Поэтому чисто структурные, «цитологические» по представлению некоторых авторов, уровни изучения клетки как таковой уже просто невозможны хотя бы потому, что невозможно оторвать структуру от функции. Следовательно, и обучение студентов дан ному предмету должно также строиться на структурно-функциональном подходе в изучении клетки. Все это вызвало необходимость при новом и станин учебника использовать название ' Введение в клеточную биологию». ставя на второе место термин <• цитология• как устаревший или архаичный. Сам термин «• клеточная биология» был применен впервые в названии книг и Ж.-Б. Карнса еше в 1884 г
Учебник является кратким изложением курса «Обшей цитологии-, читаемого автором на биологическом факультете Московского iocj-дарстнснного университета им. МВ. Ломоносова уже более 30чет. По сравнению с предыдущими изданиями содержание данного учебники значительно переработано: обновлена, дополнена и введена новая информация. изменена последовательность изложения материала. Здесь используется системный полхоз в анализе различных клеточных ком
пинен гон. что пиши ihci paceм.прин.пь их нс в сярыне друг oi друга, а к нс нн шоп cobokmihocih, в элсмешарнон с шлипс живою в клег hr limine 1>.во расширен п обновлен материал о клеючном ядре, о мембранной вакуи шрнон системе, о цитоскелете, о клеточном ле ic-нии. ввек-ны новые г швы о регуляции клеточного никла, о формах меточной 1ибели (некроз и анон пн) и многое другое.
Курс «Общая ИИ10 101ПЯ» читается студеным на нервом курсе В \мерном плане с ту кчпов это имссг свои преимущества и своп недостатки. И I не юсгатков тляппым. на наш взгляд, является то, что лать и юсыточно полной мере свечения о строении клеток и о функциях се компонентов очень трудно и сложно без привлечения материалов из смежных шениилнн. таких как биохимия, биофизика, молекулярная ОИОЛО1ИЯ. Сту тенты же на первых курсах по современным учебным и лапам изучают сначала общие дисциплины: зоологию, ботанику, химию. фишку, математику. Конечно, преподавателю бычо бы чепе чп-1,пь курс ннтологин после того, как с|удспты изучат эти общие лиспи и чины, а также биохимию, генетику и др. Но нам представляется невозможным изучение тонких физиологических отправлений оршппз-мов к меток без шакпн элементов их организации. Поэтому было решено идти на компромисс, давая в курсе краткие экскурсы в биохи мню и молекулярную биологию. Эги вводные ознакомления, по нашему мнению, не так трудны для студентов-биологов, так как они в основном укладываются в программу средней школы, кроме того, при сдаче конкурсных экзаменов школьники читают достаточно много до-HOTHHie.ibHoii литературы (во всяком случае многие из них поражают обилием и глубиной знаний на вступительных экзаменах).
Другой особенностью курса является то, что он дает сведения о строении и функционировании клеток разного происхождения: бактерии. растения, животные. Это важно, так как будущие зоо югн. ботаники, микробиологи и вирусологи, не говоря уже о биохимиках п биофизиках, должны знать не только клетку во всех се формах, но и главные закономерное!и. являющиеся общими для клеток вне зависимости от их органного, тканевого пли видового происхождения. Поэтому в учебнике постоя и но делаются сравнения строения разных клеток — прокариотических и эукариотических.
Представляется важным в курсе клеточной биологии не только давать объем конкретных знаний, но и показывать как эти знания были получены. Поэтому часто в описании клеточных структур и их свойств введены описания экспериментов и методических приемов современной науки к основных методов современной клеточной биологии. Это ic кпь необхо шмо потому, что нередко именно новые методические приемы и разработки могут быть основанием для развития новых на правлении в изучении клетки.
4
В материалы пою учебника внесен ряд дополнении по сравнению с предыдущим изданием. За прошедшие годы накопитесь множество новых сведений о хромаю нс и хромосомах, о мембранах клетки о пи тоскелстных структурах и др. Это отражает бурное развитие работ по изучению клетки на самых разных уровнях, начиная с оптическою и кончая молекулярным. Введение в учебник последних достижений на уки Не веет да оправдано, так как часто на основании новых фактов предлагаются ипютезы и теории, которые иногда не оправдываются, а полученные факты приобретают впоследствии иное объяснение Все же ознакомление студентов с новинками науки крайне необходимо для тою, чтобы они знали, чем живет наука в данный момент, какие «горячие точки» в ней привлекают внимание исследователей.
В заключение автор выражает большую благодарность своим коллегам на кафедре клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ и в Институте физико-химической биологии им. АН. Белозерского, а также на других кафе трах и в учреждениях за помощь в работе надданным изданием, советы и критику: профессорам B.IO. Полякову, Г.Е. Онишенко. И.А. Воробьеву и докторам био-лопзчсских паук О. В. Зацепиной, Е.С. Надеждиной.
ЧАСТЬ ПЕРВАЯ
Введение
ПРЕДМЕТ КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ
Цитология (от греч. kytos - ячейка, клетка) - наука о клетке, в сои ременном звучании — биологии клетки — наука довольно молодая. Из среды других биологических наук она выделилась почти сто лет назад. Впервые обобщенные сведения о строении клеток были собраны в книге Ж.-Б. Карнуа «Биология клетки». вышедшей в 1884 г.
За последние 50 лет цитология из описательно-морфологической превратилась в экспериментальную науку, ставящую перед собой задачи изучения физиологии клетки, ее основных жизненных функций и свойств, ее биологии. Другими словами, современная антология — это физиология клетки. Возможность такого переключения интересов исследователей возникла в связи с тем, что цитология тесно сопряжена с научными и методическими достижениями биохимии, биофизики, молекулярной биологии и генетики. Это послужило основанием для углубленного изучения клетки как таковой, для изучения ее общих свойств и функционирования уже с позиций этих наук, что и дало основание для появления некой синтетической науки о клетке, а именно биологии клетки. или, как чаще называют, клеточной биологии. В этой науке плодотворно сочетаются как морфологические, так и мо-гекулярно-бнологичсские подходы; это позволяет в настоящее время считать, что термины цитология и биология клетки совпадают, так как предметом их изучения является клетка, имеющая свои собственные закономерности организации и функционирования.
Дисциплина «Биология клетки» относится к фундаментальным разделам биологии, так как она исследует и описывает единственную единицу всего живою на Земле — клетку. Познание клетки имеет важнейшее значение для развития множества друг их биологических наук, таких, как физиология, гене гика, молекулярная биология и др., ибо лает им как бы субстрат, материал для изучения отдельных свойств именно клеток: все функциональные отправления организмов имеют клеточную основу. Огромное значение современная цитология, или биология клетки. имеет для медицины, гак как любые заболевания че-
6
гания. Длительное и пристальное изучение клети.. " бате'
ло к формулированию важного теоретической
EXXZt— —»~S
Глава 1
КЛЕТОЧНАЯ ТЕОРИЯ
Клеточная теория э го обобщенные представления о строении клеток как единиц живого. об их размножении и роли в формировании многоклеточных организмов. Появлению и формулированию отдельных положении клеточной теории предшествовал довольно длительный (более трехсот лет) период накопления наблюдений над строением различных одноклеточных и многоклеточных Органивмов растений и животных. Этот период был связан с усовершенствованием различных оптических методов исследовании и расширением их применения.
Роберт Гук (I665) первым наблюдал с помощью увеличительных линз подразделение тканей пробки на «ячейки», или «клегки». Его
описания послужил!! голчком для появления систематических исследовании анатомии растений (Мальпиги, 1671; Грю, 1671), которые подтвердили наблюдения Роберта Гука и показали, что разнообразные
части рас гений состоят из тесно расположенных «пузырьков», или «мешочков». Позднее А. Левенгук (1680) открыл мир одноклеточных организмов и впервые увидел клетки животных (эритроциты). Позднее клетки животных были описаны Ф. Фоншна (17SI): но эти и дру-
гие многочисленные исследования не привели в то время к пониманию универсальности клеточного строения, к четким проставлениям о гом, что же являет собой клетка. Прогресс в изучении мпкроанато-мии клетки связан с развитием микроскопирования в XIX в. К этому времени изменились представления о строении клеток главным н организации клетки стала считаться не клеточная стейка, а собственно се содержимое - протоплазма (Пуркиня. 1830). В пр’гогиазмеоыл открыт постоянный компонент клетки - ядро (Браун, многочисленные наблюдения позволили Т. Шванну в г. •4 ряд обобщений. Он показал. чтоклетки растении и лИ,102.нь.,?‘ ...питаю сходны между собой (.омояо.ичны). «Заслуга Т Шва,.га заключалась не в том. что он открыл метки как таковые авом. по о научил исследователей понимать их значение» (Ваньдсиср, >•
7
Дальнейшее развитие эти представления получили в работах Р. Вирхова (1858). Создание клеточной теории стало важнейшим событием в биакнип. одним из решающих доказательств единства всей живой природы Клеточная теория оказала значительное влияние на развитие биологии, послужила главным фундаментом для развития таких лиски пл л и, как эмбриология, гистология и физиология. Она дала основы для понимания жизни, для объяснения родственной взаимосвязи организмов, для понимания индивидуального развития.
Основные положения клеточной теории сохранили свое значение и на сегодняшний лень, хотя за более чем сто пятьдесят лет были получены новые сведения о структуре, жизнедеятельности и развитии клеток. В настоящее время клеточная теория постулирует следующее:
1. Клетка - элементарная единица живого: вне клетки нет жизни.
2. Клетка — единая система, включающая множество закономерно связанных друг с другом элементов, представляющих собой определенное целостное образование, состоящее из сопряженных функциональных единиц - органелч или органоидов.
3. Клетки сходны (гомологичны) по строению и по основным свойствам.
4. Клетки увеличиваю гея в числе путем деления исходной клетки после удвоения ее генетического материала (ДНК): клетка от клетки.
5. М hoi ©клеточный организм представляет собой новую систему, сложный ансамбль из множества клеток, объединенных и интегрированных в системы тканей и органов, связанных друг с другом с помощью химических факторов, гуморальных и нервных (молекулярная регуляция).
6. Клетки многоклеточных организмов тотипотентны, т. с. обладают генетическими потенциями всех клеток данного организма, равнозначны по генетической информации, ио отличаются друг от друга разной экспрессией (работой) различных генов, что приводит к их морфозоги-ческо.му и функпиоигшьно.му разнообразию - к дифференцировке.
Клетка - элементарная единица живого
Представление о клетке как о самостоятельной жизнедеятельной единице было дано cine в paGoiax Т. Шванна. Р Вирхов (1858) также считал, что каждая клетка несет в себе полную характеристику жизни: <-Клетка есть последний морфологический элемент всех живых тел. и мы не имеем права искать настоящей жизнедеятельности вне ее».
Современная наука полностью доказала это положение. В популярной литературе клетку часто называют «атомом жизни», «квантом жизни», подчеркивая тем самым, что клетка — это наименьшая единица живою, вне которой нет жизни.
8
(акая общая характеристика клетки должна в свою очередь опираться на определение живого - что такое живое, что так« жи "L Очень трудно дат ь окончательное определение живого, жизни
М.В. Волькенштеин (1965) дает следящее определение жизни « Живые организмы представляют собой открытые (т.е обменивающиеся с окружающей средой веществом и энергией), саморегулирующиеся и самовоспроизволяшнеся системы, важнейшими функционирующими веществами которых являются белки и нуклеиновые кислоты» Живому свойствен ряд совокупных при знаков, таких, как способность к воспроизведению (репродукции), использование и трансформация знер! ин. мстаоолизм, чувствительность, изменчивость. И такую совокупность этих признаков можно обнаружить на клеточном уровне. Нет меньшей единицы живого, чем клетка. Мы можем выделить из
клетки отдельные ее компоненты или даже молекулы и убедиться, что многие из них обладают специфическими функциональными особенностями. Так, выделенные актомиозиновые фибриллы могут сокращаться в отпет на добавление АТФ; вне клетки прекрасно «работают» многие ферменты, участвующие в синтезе или распаде сложных био-органических молекул; выделенные рибосомы в присутствии необходимых факторов могут синтезировать белок. разработаны нсклеточ-иыс системы ферментативного синтеза нуклеиновых кислот и т.д. Можно ди считать вес эти клеточные компоненты, структуры, ферменты. молекулы живыми? Можно ли считать живым актомиозиновый комплекс? Думается, что нет. хотя бы поюму, что он обладает лишь частью набора свойств живою. 1о же относится и к остальным примерам. Только клетка как таковая является наименьшей единицей, обладающей всеми вместе взятыми свойствами, отвечающими опреде
лению «живое».
Чю же такое клетка, какое ей можно дать обшее определение? Из школьного курса известно, что разнообразные клетки имеют совершенно несходную морфологию, их внешний вид и величины значительно расходятся. Действительно, что общего между звездчатой формой некоторых нервных клеток, шаровидной формой лейкоцита и трубкообразпои формой клетки эндотелия. Такое же разноооразис форм встречается И среди микроорганизмов. Поэтому мы должны < ходигь общность живых объектов не и их внешней форме, а в оо i сги их внутренней организации. ™
Среди живых организмов встречаются два типа и -
ток. К наиболее простому типу строения можио отНеХ^инномх -рии и синезеленых водорослей, к более “'-.сокоор а “° клетки всех остальных живых существ, начиная от низших растении кончая человеком. ,.опппоспеи поо-
Принято называть клетки баьгер.шг кариотичсскими (доядерными клетка.
9
и рс вставите чей живою эукариотическими (собственно ядерными), потому Mio у последних обязательной структурой служит клеточное ядро, отделенное от иитоп.1аз.мы ялерной оболочкой.
Содержимое прокариотической клетки одето плазматической мембраной. играющей роль активного барьера между собственно цитоплазмой клетки и внешней средой (рис. 1 и 2). Обычно снаружи от Плазматической мембраны расположена клеточная стенка, или оболочка, - продукт клеточной активности. У прокариотических клеток
Рис. 1. Ультратонкии срез пропионовой бактерии (фото Л.И. Воробьевой) i клеточная слснка; 2 - юна пчклсои ы; 3 - мезосома: 4 образование сеты при доении Ktei ки
I0
Рис. 2. Комбинированная схема прокариотической клетки
/ клеточная стены; 2 - п.1а)ман<чесыя мембрана; 3 - ДНК нуклеинла; 4 -по. ni рибосомы цитон измы; 5- мезосома: 6- ламеллярные структуры; 7- виячяяакня п 1аз.м;ысммы; 8 - скопления хроматофороп; V намоли с включениями; 10 -G.IKTсри.-Ы|>цне жгутики; 77 пллегимчагые тилакои.ты
нет морфологически выраженного ядра, но присутствует в визе так называемою нуклеоида зона, заполненная ДН К
В основном веществе (или матриксе) цитоплазмы прокариотических клеток располагаются многочисленные рибосомы, цитоплазматические же .мембраны обычно выражены не так сильно, каку эукариотических клеток, хотя некоторые вилы бактерий (например, фото-трофпые пурпурные бактерии) богаты внутриклеточными мембранными системами. Очень сильно цитоплазматические мембраны развиты у синезе юных водорослей. Обычно все внутри клеточные мембранные системы прокариот развиваются за счет плазматической мембраны.
Но нс только ирису гствие морфологически выраженного ядра является отличительным признаком эукариотических клеток. У клеток
И
Рис. 3. Комбинированная схема строения эукариотической клетки
<т - клетка жинтяното происхождения; б- рас тигельная клетка. / ядро с хроматином и ядрышком; 2- та магическая мембрана;.?-клеточная стенка; 3 илазмолеехта; 5— гранулярный эндоплазмах ический ретикулум; б тал ткни ретикулум; 7 -пинонитозная вакуоль; 8 - аппарат Гольджи; У лизосома; 10 жировые включения в гладком ретикулуме; II - нентриоаь тт микротрубочки центросферы; 12 -митохондрии; 13 - потирибосомы тиалонлазмы; /а - нейтральная вакуоль; 15 -хлоропласт
высшего пита (эукариот ических) кроме ядра и цитоплазме существует целый набор специальных обязательных структур органелл. выиол 11Я1ОЩИХ отдельные специфические функции (рис. .1 и 4) К числу органелл относят мембранные структуры: систему эндоплазматической сети (ретикулума), аппарат Гольджи, литосомы, миюхондрии. иласти-
12
Рис. 4. Микрофотография жииои j\кариотичсской клетки, полученная с помощью фазово-контрастного микроскопа
Я ядро; ЯК ячрьпико; ЯО граница ядра. М - митохонtpni»; ПМ - 1ранкиа К.1С1КИ
лы (для клеток растений). Кроме того, для эукариотических клеток характерно наличие не.ме.мбранны.х структур. таких, как микротрубочки, микрофиламенты, центриоли (лля клеток животных) и др.
Эукариотические клетки обычно намного крупнее прокариотических. 1ак, палочковидные бактерии имеют ляпнуло 5 .мкм. а толщину — около 1 мкм, в то время как эукариотические клетки в поперечнике мо-ьт достгпагь деечнков микрометров.
Несмотря па четкие морфологические отличия, и прокариотические и эукариотические клетки имеют .много общего, что и позволяет отнесгн их к одной, клеточной, системе организации живого. И тс и другие одеты плазматической мембраной, обладающей сходной функцией активного переноса веществ из клетки и внутрь ее; синтез белка у них происходит на рибосомах; сходны и другие процессы, такие, как синтез РНК и репликация ДНК, похожи и биоэнергетические процессы. Исходя из вышесказанного, клетке можно дать общее определение. Клетка — это ограниченная активной мембраной, упорядоченная структурированная система биополимеров (белков, нуклеиновых кислот) и их макромолекулярных комплексов, участвующих в единой совокупности метаболических и энергетических процессов, осуществляющих поддержание и воспроизведение всей системы в целом.
Короче: клетка — самоподдерживаюшаяся н самовоспроизводяша-яся система биополимеров. Это определение даст описание основных свойств «живого» — воспроизведение подобного себе нз неподобного себе.
У многоклеточных организмов часть клеток утрачивает свойство размножаться, но они остаются клетками до тех пор, пока способны осуществлять синтетические процессы, регулировать транспорт веществ между клеткой и средой, использовать для этих процессов энергию. Есть примеры безъядерных клеток (эритроциты и тромбоциты млекопитающих, некоторые мышечные клетки моллюсков), это скорее не собственно клетки, а их остатки — одетые мембраной участки цитоплазмы с ограниченными функциональными потенциями.
Одно время первый постулат клеточной теории подвергался многочисленным нападкам и критике. Некоторые авторы указывали, что в многоклеточных организмах, особенно у животных, кроме клеток существуют и межклеточные, промежуточные вещества, которые тоже, казалось бы, обладали свойствами живого. Однако было показано, что межклеточные вещества (основное вещество и волокна соединительной ткани) представляют собой не самостоятельные образования, а продукты активности отдельных групп клеток.
Другие возражения касались того, что часто у животных кроме отдельных клеток встречаются так называемые снмпласты и синцитии (соклетия), а у растительных клеток плазмодии. По морфологическому описанию - это крупные цитоплазматические образования со множеством ядер, нс разделенные на отдельные клеточные территории. Примерами таких симпластов могут быть мышечные волокна позвоночных или эпидермис у ленточных червей, а также плазмодии у низших грибов миксом и истов. Однако если проследить за развитием таких «неклеточных» форм, то легко убедиться в том, что они возникают вторично, та счет слияния отдельных клеток, или же в результате деления одних ядер без разделения цитоплазмы, те. без питотомин.
14
Клетка - единая система сопряженных Функциональных единиц
В начале нашего изложения в согласии с клеточной теорией мы обсуждали первый ее постулат: цветка - наименьшая единица живого Однако мы знаем о сложности строения этой «единицы., которая со держит в себе множество типов внутриклеточных стрте™ выпотня-юших разнообразные функции. При этом каждый компонент «специализирован» на выполнение отпой собственной группы функций другие компоненты не могут работать «по совместительству», не мост принять на себя основные функции других внутриклеточных структур. Важно отмстить, что каждая из функций является обязательной, без выполнения которой клетка не может существовать. Все это в значи-тельной степени напоминает многоклеточный организм, который также является особой живой системой, обеспечивающей свое собственное существование и воспроизведение. Все тело организма может быть подразделено на ряд подсистем иди систем; пищеварительную, выделительную. мышечную, нервную, половую ияр.. обеспечивающих отправление целого ряда организменных функций. Эти функции выполняются отдельными органами пли группой органов: кишечник, почки, мозги т.л. И в данном примере эти системы в основном монофункциональны и незаменимы. В обшей системе организма как целого все они играют главные, а нс подчиненные роли. Жизнь организма становится невозможной при выключении любой из этих систем.
Формально любую клетку* можно «разложить» на ряд как бы независимых структурных и функциональных компонентов, выполняющих свои специфические функции. Так, эукариотические клетки принято разделять на ядра н цитоплазму. В цитоплазме, в свою очередь, выделяют гиалоплаз.му, или основную плазму клетки (цитозоль - растворимый компонент цитопла змы по терминологии биохимиков), а также целый ряд структур - органелл, выполняющих сноп отдельные специфические функции Мембранные органеллы подразделяются на одномембранные (вакуолярная система, включающая в себя эндоплазматический рстксдум. аппарат Гольджи, энло- и эгеошпозные вакуоли лизосомы, пероксисомы) и лвумембраниые (митохондрии и пластиды) К немембранным органеллам нужно отнесли рибосомы и систему цнто-скеяегных фибрилл. Кроме того, вся поверхность клетки покрыта лла зматической мембраной. тесло фу икнноналыю связанно! _ куолярной системой, с элементами цитоскелета, гак н с ги <i . *_•
Но каждая из утих морфодо...чески собой новую систему или подсистему функштош ро«в точное ядро является системой хранения, военрои осяовнио
пик генетической информации. Гиаюплазма ..q™.,1Iblc маши-промежугочного обмена; рибосомы - элементарные клеточные маши
15
кы спи re за белка: цитоскелет - опорно-двигательная система клетки-вакуо.тярная система — система синтеза и внутриклеточного транспорта белковых биополимеров н генезиса многих клеточных мембран; ми-гохонлрин — органеллы энергообеспечения клетки за счет синтеза АТФ; пластиды растительных клеток - система синтеза АТФ и фотосинтеза: плазматическая мембрана барьсрно-рсаепторно-транспорг-ная система клетки.
Аналоги этих систем есть и у прокариот: это - плазматическая мембрана. которая кроме пограничной роли участвует в процессах синтеза АТФ к фотосинтеза, цитозоль, рибосомы и даже элементы цитоскелета.
Важно подчеркнуть, что все эти подсистемы клетки, образуя некое сопряженное единство, находятся во взаимозависимости. Например, нарушение функций ядра сразу сказывается на синтезе клеточных белков, нарушение работы митохондрий прекращает все синтетические и обменные процессы в клетке, разрушение элементов цитоскелета прекращает внутриклеточный транспорт и т.д. Клетку можно сравнить с часовым механизмом, в котором повреждение любой его части приводит к остановке всей системы в целом.
Гомологичность клеток
'Гермин «гомологичносты> означает сходство по коренным свойствам и отличие по второстепенным. Например, руки человека, крыло птицы, передняя нога лошади гомологичны не только по плану ci роения, но и по своему происхождению. Подобно этому можно говорить, что разные клетки организмов растительного пли животного происхождения СХОДНЫ. ГОМОДО1ИЧИЫ.
Это обобщение, сделанное cine Т. Шванном, нашло свое полтвер ждение и развитие в современной цитологии, использующей новые достижения техники, такие, как электронный микроскоп. Гомологичность строения клеток наблюдается внутри каждого из типов клеток: прокариотическом я эукариотическом. Хорошо известно разнообразие клеток как бактериальных, так и высших организмов. Такое одновременное сходство строения и разнообразие форм определяются тем. что клеточные функции можно грубо подразделить на две группы: обязательные и факультативные. Обязательные функции, и ан |мз пленные на поддержание жизнеспособности самих клеток, осуществляются специальными внузриклеточными структурами.
Так, у всех прокариотических клеток плазматическая мембрана не только ограничивает собственно цитоплазму, но и функционирует как структура, обеспечивающая активный транспорт веществ и клеточных продуктов, как система окисли тельного фосфорилирования, как источник образования клеточных бактериальных стенок. ДПК иуклео-
16
„да бактерии и синезеленых недорослей обеспечивает генетические свойства клеток „ т.д. Рибосомы цитоплазмы - единственные аппа™ ты синтеза „олнвептндпых цепей - также обязательный компонент цитоплазмы прокариотической клетки. Разнообразие же прокариотических клеток - это результат приспособленности отделы,ых бактериальных одноклеточных организмов к условиям среды обвгаиия Прокариотические клетки могут отличаться друг от друга толщиной и устройством клеточной стенки, складчатостью плазматической мембраны. количеством и структурой цитоплазматических выростов згой мембраны, количеством и свойствами внутриклеточных вакуолей и мембранных скоплений и гр Но «общий план» строения прокариот-ческих клеток остается постоянным.
Та же картина наблюдается и для эукариотических клеток. При изучении клеток растений и животных бросается в глаза разительное сходство нс только в микроскопическом строении этих клеток, ио и в деталях строения их отдельных компонентов. У эукариот, как и у прокариот, клетки отделены друг от друга или от внешней среды активной плазматической .мембраной, которая может принимать участие в выделении веществ из клетки и построении внеклеточных структур, что особенно выражено у растений. У всех эукариотических клеток от низших грибов до позвоночных всегда имеется ядро, принципиально сходное по построению у разных организмов. Строение и функции внутри клеточных структур также в принципе определяются гомоло-гичностью обще клеточных функций, связанных с поддержанием самой живой системы (синтез нуклеиновых кислот и белков, биоэнергетика клетки и т.д.).
О (повременно мы видим и разнообразие клеток даже в пределах одного многоклеточного организма. Например, по форме мало похожи друг на друга такие клетки, как мышечная или нервная. Современная цитология показывает, что различие клеток связано со спсниали-(ацней их функций, с развитием особых функциональных клеточных аппаратов. Так, если рассматривать мышечнрю клегку, то в ней кроме обще клеточных структур (мембранные системы ретикулума, аппарат Гольджи, рибосомы к др.) встречаются в большом K0;,,,‘lL’CTHc'^U;iI: тярные ком нонен пл. обеспечивающие специальную фу як цую Нагрузку характерную для этой клетки.
В нервной клетке кроме обшекиеточпых ко',по,,с"™'“°*”^ет0ч. гить специфические черты: наличие длинных и ,из1'с |крсДа.
пых отростков, оканчивающихся специальным с иР. оптвмс кипим,, нервные „«пульсы; своеобразную композит” « ™ ,в элементов „що.спвмат.,ческой се,,, (™ФОпя); бо- "“т. во микротрубочек в клеточных ^ncUlliU,„sul„eii пе-
личительпых черт нервной Ю1стм и убоЧК11 „ микрофиш-
редачей нервною импульса. Однако Р°
17
менты можно обнаружить практически в любых эукариотических клетках. хотя они будут и не гак обильны. Например, филаменты, сходные ио химизму с актиновыми фибриллами мышечных клеток, имеются в цитоплазме фибробластов. В пей же обнаруживаются и микротрубочки. Следовательно, и мнкрофиламенты и микротрубочки представляют собой обязательные обшеклеточные структуры. Известно, что микрофиламенты клеток представлены актином, что указывает на их обще клеточное значение — обеспечивать подвижность клеток. В мышечных клетках эта функция стала главной, поэтому так сильно в них выражен сократительный аппарат
Структурное разнообразие клеток многоклеточного орган и зма можно объяснить отличием их специальных функций, осуществляющихся данной клеткой как бы на фоне общих, обязательных клеточных функций.
Другими словами, гомологичпость в строении клеток определяется сходством общеклеточных функций, направленных на поддержание жизни самих клеток и на их размножение. Разнообразие же в строении клеток многоклеточных организмов - результат функциональной специализации.
Клетка от клетки
Формулировка положения «всякая клетка от клетки» («omnis cellu-la е ccllula») связана с именем знаменитою ученого Р. Вирхова. Т. Шванн в своих обобщениях подчеркивал одинаковость принципа развития клеток как у животных, так и у растений. Это представление базировалось на вывозах Шлейлснаотом. что клетки могут образовываться из зернистой массы в недрах клеток заново (теория ннтобласте-мы). Р. Вирхов как противник идеи о самозарождении жизни настаивал на «преемственном размножении клеток». Сегодня сформулированное Р. Вирховым афористическое определение можно считать биологическим законом. Размножение прокариотических и эукариошческих клеток происходит только путем деления исходной kjcikii, которому предшествует воспроизведение се 1сиегичеекою маюриала (ре iyn.{икания ЛИК).
У эукариотических клеток единственно полноценным способом деления является митоз (или мейоз при образовании половых клеток). При этом образуется специальный аппарат клеточного деления — клс-Iочное веретено, с помощью которого равномерно и точно по двум дочерним клеткам распределяются хромосомы, до этою удвоившиеся в числе. Этот гип деления наблюдается у всех эукариотических (какрастительных, гак и животных) клеток.
Прокариотические клетки, делящиеся гак называемым бинарным образом, также испо иьзуют специальный аппарат разделе и зщ клеюк, значительно напоминающий митотический способ деления эукариот.
18
Современная наука отвергает иные пути образования клеток и vbc имение их числа. Появившиеся одно время описания образоX клеток и 3 '-нею,елочного живого вещества, оказались в лучшем с- ' ше результатом методических недостатков или даже ошибок.’а в худ,нам плодом научной недобросовестности.
Одно время считали, что клетки могут размножаться прямым деле-нисм. путем так называемого амитоза. Однако прямое разделение клеточною ядрами затем и ши «плазмы наблюдается только у некоторых инфузорий. При этом амиготически делится только макронуклеус, в то время как генеративные микроиуклсусы делятся исключительно путем .митоза, вслед за которым наступает разделение клетки — цитотомия. Часто появление дну ичи многоялерных клеток также считали результатом ими готическою деления ядер. Однако появление многоядерных клеток является результатом либо слияния друг с другом нескольких клеток (гигантские многоядерныс клетки тел воспаления, остеокласты и др.). либо нарушения самого процесса цитотомми.
Клетка и многоклеточный организм
Роль от дельных клеток и многоклеточном ортанизме подвергалась неолнократ ному обсуждению н критике и претерпела наибольшие изменения Т Шванн представлял себе многогранную деятельность организма как сумму жизнедеятельности отдельных клеток. Это пред станление было ясное время принято и расширено Р Чирковым и получило название теории «клеточного государства*. Вирхов писал: «...всякое тело, сколько-нибудь значительного объема, представляет устройство. подобное общественному. где множество отдельных существовании поставлено в зависимость друг от друга, нотак, однако же. что каждое из них имеет свою собственную деятельность, и если побуждение к этой деятельности оно и патучает от лрутнх частей, зато самою работу’ свою оно совершает собственными силами* (Вирхов. 1S59).
Действительно, какую бы сторону деятельности целого организма мы ни брали. буль то реакция на раздражение или движение, иммунные реакции, выделение и многое другое, каждая из них осуществляется специализированными клетками. Клетка - это единица функционирования в многоклеточном организме. Но клетки объединены в функциональные системы, в ткани и органы, которые находятся взаимной святи трут с другом. Поэтому нет смысла в сложныхора-нпзмах искать главные органы или главные клетки, ' о >
организмы представляют собой слож.... ансамбли клетс
пенные в целостные пнтетрированные системы 1кане‘ чиненные и связанные межклеточными, туморалытыми н нервными
19
формами регуляции. Вот почему .мы говорим об организме как о це-юм. Специализация частей многоклеточного единого организма, расчлененность ею функций лают ему большие возможности приспособления для размножения отдельных индивидуумов, для сохранения вила.
В итоге можно сказать, что клетка в многоклеточном организме -это единица функционирования и развития. Кроме тою. первоосновой всех нормальных и патологических реакций целостною организма является клетка. Действительно, все многочисленные свойства и функции организма выполняются клетками. Когда и организм понадают чужеродные белки, например бактериальные, то развивается иммунологическая реакция. При этом в крови появляются белки-антитела, которые связываются с чужими белками и их инактивируют. Эти антитела представляют собой продукты синтетической активности определенных клеток — плазмацитов. Но чтобы плазмациты начали вырабатывать специфические антитела, необходимы работа и взаимодействие целого ряда специализированных клеток-лимфоцитов и ма крофагов. Другой пример, простейший рефлекс — слюноотделение в ответ на предъявление пиши. Здесь проявляется очень сложная цепь клеточных функций: зрительные анализаторы (клетки) передают сигнал в кору головного мозга, где активируется целый ряд клеток, передающих сигналы на нейроны, которые посылают си шалы к разным клеткам слюнной железы, где одни клетки вырабатывают белковый секрет, друз не выделяют слизистый секрет, третьи, мышечные, сокращаясь, выдавливают секрет в протоки, а затем в полость рта. Такие цепи последовательных функциональных актов отдельных групп клеток можно проследить на множестве примеров функциональных отправлении организма.
Жизнь нового организма начинается с зиготы — клетки, получившейся в результате слияния женской половой клетки (ооцита) со снер-мисм. При делении зиюгы возникает клеточное потомство, которое также делится, увеличивается в числе и приобретает новые свойства, специализируется, дифференцируется. Рост организма, увеличение его массы есть результат размножения клеток и выработки ими разнообразных продуктов (например, вещества кости или хряща).
И наконец, именно поражение клеток или изменение их свойств является основой для развития всех без исключения заболеваний. Данное положение было впервые сформулировано Р. Вирховы.м (1858) в его знаменитой книге "Клеточная патология». Классическим примером клеточной обусловленное!и развития болезни может служить сахарный диабет, широко распространенное заболевание современности. Ею причина - недостаючнесть функционирования лишь одной группы клеток так называемых В-клеток островков Лангершнса в поджелудочной железе. Эти клетки вырабатывают гормон инсулин, участвующий в регуляции сахарного обмена организма.
20
Все ли примеры показывают важность изучения структуры свойств и функции клеток для самых различных биологических X-ииплии и для медицины. д
Тотипотентность клеток
Как же возникают разнообразные типы клеток в многоклеточных организмах’ Известно, что организм человека, развившийся всего из одной исходной клетки - зиготы, содержит более 200 различных типов кле гок. Каким образом возникает это разнообразие, сегодня до конца не ясно, так как еше мало конкретных данных, касающихся путей появления тех нлп иных клеточных типов.
Современная биология на базе представлений эмбриологии, молекулярной биологии и генетики считает, что индивидуальное развитие от одной клетки до многоклеточного зрелого организма — результат последовательною, избирательного включения работы разных генных участков хромосом в различных клетках. Это приводит к появлению клеток со специфическими для них структурами и особыми функциями. т.е. к процессу, называемому дифференцировкой.
Дифференцировка - это результат избирательной активности раз-
ных генов в клетках по мере развития многоклеточного организма. Дру! ими словами, дифференцировка - эго результат дифференциальной активности генов. Следовательно, можно утверждать, что любая клетка многоклеточного организма обладает одинаковым полным фондом генетического материала, всеми возможными потенциями для проявления этого материала. т.е. тотипотентна. но в разных клетках одни п те же гены могуч находиться или в активном, или в репрессированном состоянии. Эги представления базируются на большом экспериментальном материале. Стало возможным вырастить зрелое растение из одной его соматической клетки. Многочисленные опыты на лягушках показали, что ядра дифференцированных клеток сохра-няют нее те потенции, которые сеть у ядра в зиготе Если после оплодотворения яйцеклетки лягушки У возникшей зиготы микрохирурги чески удали гь ядро, а на его место имплантировать ядро из другой зиготы. то произойдет полное развитие нормальной лягушки. Если же в этом эксперименте ядро зиготы заметив па ядро из еиештишро-в.тннон (дифференцированной) клетки взрослого животною.• витие эмбриона пройдет норма'....мм путем, вплоть до появления
взрослой ЛЯПII1KII (рис. 5). V
Аналогичным нулем можно в бегьядерную зиготу ‘ 1 ‘ HIIVIO
ввести ядро 113 ткани взрослого животного и полу u i. ' живот-
особь. имеющую идентичную генетическую ин<1 Р . вым-лонором. Так бы та .выучена (клонирована) овсчк.1 Долли.
21
Рис. 5. Тотипотентность ядер клеток организма
Ядро, выделенное из клетки кишечника головастика Xenopus laevts(u), пересажено в яйцеклетку, лишенную ядра нузем облучения (6|. В ре ту штате яйцеклетка троим гея и par винис гея нормальный кыовастик (пример так называемого клонирования жиногных). 1 вылетание ядра из соматической клетки; 2- облучение попита; 3 пересадка ядра; 4- дробящаяся яйцеклетка: 5 личинка
И з этого вытекает, что клетки многоклеточных органи шов обладают полным набором генетической информации, свойственной ли я данного организма, в этом отношении они равнозначны. Но одновременно клетки отличаются по объему проявления этой информации, что и создает возможность появления специализированных клеток. Однако эти прел ставлен ня нс могут быть приняты полностью. так как имеются исключения. показывающие, что при шфференцировке происходит количест венное изменение генетического материала. Так, при дроблении яиц аскариды клетки, дающие начало соматическим тканям, теряют часть хромосомного материала (диминуция). Сходный процесс описан у насекомых - галлин. В этом случае при обособлении сомашческих ядер пропс ходит значительная редукция хромосомного материала. При этом клетки половых зачатков содержат 40 хромосом, а соматические — всего 8. Следует помнить. что 1акис различия были обнаружены юлько между половыми и соматическими клетками; различий в.хромосомных наборах между разными соматическими клетками не обнаружено. Однако в последнее время появились данные отом, что плазмациты в результате специфической дифференцировки при иммунном ответе претерпевают молекулярные верес громки в области iciiob, ответственных за синтез аши-тел, и тем самым генетически отличаются от ооальных клеток.
Общим же законом для многоклеточных растительных и животных opiainuMOB является то. что несмотря на структурные и функциональные различия клеток данного органи ша в (енетическом отношении они о шородны, тождественны и тошнотен ты.
Подводя итог рассмотрению современного состояния клеточной теории, нужно сказать, чго именно клетка является единицей развития многоклеточных, елиниией и.х строения, функционирования и единицей патологических изменений организма.
22
.Lis того чтобы попять не только ____
стсй клетки, но и. главное, разобраться я ФункпптХых
ниях ее отдельных компонентов и всей кле, к1, „ иелом. чтоб.ГсХтать изучение морфологии клетки с главнейшими биохимическим.^. гене тическимн особенностями ее устройства и работы, чтобы . зХ •сетку именно с позиций современной клеточной биологии, . ^холимо хотя бы вкратце вспомнить основные молеюлярно-биото. „че-екне закономерности, еще раз кратко обратиться к содержанию цент-ральнон догмы молекулярной биологии (см. главу 3)
Глава 2
МЕТОДЫ КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ
Цитология возникла как ветвь мпкроанатомии. и поэтому одним из основных методов, который используют цитологи, - это метод световой микроскопии. В настоящее время зтот метод нашел целый ряд дополнений и мо тификацнй. что значительно расширило круг задач н вопросов, решаемых цитологией. Революционным моментом в развитии современной нитолшии и бколоти вообще было применение электронной микроскопии, открывшей необычайно широкие перспективы. С введением электронной микроскопии в ряде случаев уже трудно провести границу между собственно цитологией и биохимией, они объединяются на уровне макромолекулярного изучения объектов (например, микро!р) бочек, мембран, .микрофиламентов и т.д.). Все же главным методическим приемом в цитологии остается ни зуаяьиое наблюдение объекта. При этом исследователь не просто изучает и описывает морфологию объекта, он может видеть степень его сложности, локализовать отдельные детали. полечить сведения о хи мнз.ме к>й иди пион части клетки, визуально и тоста i очи о точно оценить ее метаболические свойства, выяснить строение эюй части на макромолекулярном уровне. Эи» создает своеобразие цитологии как на)-ки. использующей главным образом метоаы изучения клетки непосредственно глазом, вооруженным увеличивающими оптическими си стемами. Кроме того, в цитологии применяются мио.счисленные при емы препаративной и аналитической биохимии, методы оиоф.св1КИ.
Световая микроскопия
Световой микроскоп - главный нрт.борбио то..,.. бой оптическую систему, состоящую из кон генса < р<.
23
окупяра. которые используются для рассмотрения объекта. Пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект (рис. 6). Пройдя через объект, лучи света попадают в систему линз объектива: они строят первичное изображение, которое увенчивается с помощью линз окуляра. Главная оптическая часть микроскопа. определяющая его основные возможности, — объектив. В современных микроскопах объективы сменные, что позволяет изучать истки при рашых увеличениях. Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность. Изображения. хаваемые объективом, можно увеличить во много раз, применяя сильный окуляр или. например, путем проекции на экран (до 105 раз). Вычислено, что разрешающая способность объектива, т.е. минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно, будет равна
J = 0,61—-—, л sin а
где X — длина полны света, используемого для освещения объекта; п — коэффициент преломления среды: а — угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив. Разрешение микроскопа зависит от длины волны чем она меньше, тем меньшего размера детель мы можем увидеть, и от пумериче-ской апертуры объектива (п since) — чем оиа выше, тем выше разрешение. Обычно в световых микроскопах используются источники ос решения в видимой области спектра (400—700 нм), поэюму максимальное разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200-350 им (0,2-0,35 мкм). Если использовать ультрафиолетовый свет (260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130-140 им (0.13-0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемого волновой природой света. Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу; — это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 раз (невооруженный глаз человека имеет разрешающую способность около 0.1 мм, что равно 100 мкм). Это и есть «полезное» увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света величина О.2-О.З мкм является конечным пределом разрешения сие-тового микроскопа.
Но все Же с помощью световою микроскопа можно видеть частицы меныиен величины, чем 0,2 мкм. Этому служит метол «темного поля», шт. как его называли раньше, метод «ультрамикроскопии». Суть его в
24
том, что, подобно пылинкам и луче света (эффект Тиндаля), в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы (меньше 0.2 мкм), отраженный свет от которых попадает в объектив микроскопа. Метод успешно применяется при изучении живых клеток.
Если же необработанные живые или мертвые клетки рассматривать в проходящем свете, то в них различаются только крупные детали, поскольку они обладают иным коэффициентом преломления и поглощения световых лучей. чем окружающая среда. Большая же часть клеточных компонен гов мало отличается по этим свойствам как от среды (воды или тканевых растворов), так и друг от друга и поэтому мало заметна и не контрастна. Дчя нч изучения приходится изменять освещенность (теряя при этом в четкости изображения) млн применять
Рис. 6. Современный световой (п1 и электронный (о) микроскопы конденсор; 2 об№кгиш(1>!|Т столик; 7 - обьектин; 4 окуляр: ? - осветитель; 6-нипты ни..гачи; 7 — фотокамера: Л’ - проекционная этектроматнмтиан линза
25
особые методы и приборы. Один из таких приемов — метол фазово-мин растной микроскопии, широко использующийся для наблюдений за живыми клетками. Он основан на том, что отдельные участки прозрачной в общем клетки хоть мало. но все же отличаются друг от друга по плотности и по светопреломлению. Проходя через них. свет изменяет свою фазу, однако такое изменение фазы световой волны наш глаз не улавливает, так как он чувствителен только к изменению интенсивности света. Последняя зависит от величины амплитуды световой волны. В объект ив фа зово-контрастно го микроскопа вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения взаимодействуют лучи, находящиеся в одной фазе либо в противофазе. но обладающие разной амплитудой: тем самым создастся светло-темное контрастное изображение объекта.
Сходный прием используется в ишсрфсрсипиопном микроскопе. Он устроен так, что пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяется на два потока. Один из них проходит через объект и при обретает изменения и фазе колебания, другой идет, минуя объект. В призмах объектива оба потока вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки разной толщины или разной плотности будут огличаться друг от друга ио степени контрастности. И змеряя сдвиги фаз, можно определить концентрацию и массу сухого вещества в объекте.
С помощью поляризационного микроскопа изучают объекты, обладающие изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц (например, волокна веретена деления. миофибриллы и др.). У такого микроскопа перед конденсором помещается поляризатор. который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Поляризатор и анализатор это призмы, сделанные из исландского шпата (призмы Николя). Если вторую призму (анализатор) повернуть затем на 90е по отношению к первой, то свет приходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий знойным лучепреломлением, тс. способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темпом ноле. С помощью поляризапионного микроскопа можно убедиться. например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.
Витальное (прижизненное) изучение клеток
Световой микроскоп позволяет видеть живые клетки Для кратковременною наолютсния клетки помешают в жидкую среду на пред
26
метное стекло. Если необходимо длительное наблюдение за клеткам и то нспользуюзся специальные камеры: это или шзоские ф.за™": керстиямн. закрытыми тонкими стеклами, и же разборные нлоскТе камеры. В качестве объектов можно использовать своболножив.шие одноклеточные простейшие и другие одноклеточные организмы клетки крови или же разобщенные тканевые клетки многоклеточных организмов как животного, зак и растительного происхождения В любом и з этих случаев клетки изучают в сисииал ьно подобранных сре-лах. Свооодноживузние одноклеточные организмы рассматриваю г и и зучают в тех же средах, в которых они живут в естественных условиях или культивируются в лаборатории. Так. для некоторых простейших созданы искусственные среды, на которых они растут н размножаются. Обычно это сбалансированные солевые растворы с добавками микрооргани змов или других простейших, служащих для них пищей.
Клетки крови или другие свободные клетки многоклеточных могут щупаться в капле плазмы или в специальных синтетических средах.
Для изучения клеток органов и тканей животных используют метот клеточных культу р. Более простой вариант этого метода заключается в том, что в камеру, наполненную ниппельной средой (смесь плазмы крови с эмбриональным экстрактом или смесь синтетической среды с добавлением плазмы крови), помешают небольшой кусочек живой гкагш. Через некоторое время на периферии такого кусочка начинаются деление и рост клеток. В другом случае вырезанный кусочек ткани слегка обрабатывают раствором фермента трипсина или хелатона версена, что приводит к его диссоциации. к полному разобщению кле-юк друг от яру га. Затем такую взвесь отмытых клеток помешают в сосуд с ниппельной средой, где они опускаются на дно. прикрепляются к стеклу и начинают размножаться, образуя сначала колонии, а затем сплошной клеточный пласт. Так растут однослойные клеточные культуры, очень удобные для прижизненных наблюдений. Лучше всего дчя получения первичных культур из тканей животных использовать эмб-риопальиый материал: культуры из меток взрослых оргашим»» рас тут очень плохо.
При культивировании клеток вне организма кроме ™с,|Ь| с _ важно ночдержпназь н необходимую температуру (около- для' некровных II окаю 37° для теплокровных). Обязательным>£ культивирования клеток является соблюдение стерильно вует целый ряд длительно культивируемых клеток. > клеточные штаммы, приспособившиеся лееязиле' |я
организма. Полыней частик ЭТОМ . cll0iltlia опухо.те-
ИЛИ значительно измененные метки. | ,,„„,.11 шиооко но-
вых клеток. Метол культивирования меток вне ор га,™ ” “ ' пользуется не только тля ш.юло.пчеекнх. по ..для гении неких, русо, км ичсских и биохимических исследовании.
27
В культуре можно выращивать и растительные клетки. Для этого кусочки ткани обрабатываются ферментами, растворяющими клеточные оболочки. Отделившиеся клеточные тела, протопласты, помещают в культуральную среду где они делятся и образуют зоны размножившихся клеток.
Наблюдения за живыми клетками обычно регистрируются в виде фотографий, сделанных с помощью специальных фотонасадок к микроскопу. Живые клетки можно снимать н на кинопленку. В ряде случаев такая микрокнносъемка лает очень важную информацию. Применяя ускоренную или замедленную киносъемку (цейтраферная киносъемка), можно подробно видеть протекание таких важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение ци го плазмы. биение ресничек и т.д.
Теперь с развитием компьютерных технологии с помощью специальных телекамер возможно получать изображение клеток прямо па мониторе компьютера, записывать их в памяти компьютера, всячески обрабатывать и получать отпечатки на цветных н.ли черно-белых принтерах. Такую компьютерную видеотехнику возможно использовать и для иейтраферной съемки подвижных объектов.
При исследовании живых клеток используют методы микрохирургии, оперативного воздействия на клетки. С помощью прибора микроманипулятора клетки разрезают, извлекают из них части, вводят вещества (м пкроннъекипя) и т.д. Микроманипулятор совмещается с обычным микроскопом, в который наблюдают за ходом операции. Микрохирургическими инструментами служат стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые имеют микроскопические размеры и изготовляются на специальных приспособлениях - «мпкрокузнинах». При микроманипуляциях клетки помещаю! в специальные камеры, в которые вводят также инструменты. Так, с помощью микромам нпулятора удалось пересадить ядра от одного штамма амебы другому и доказать, что именно клеточное ядро определяет физиологические особенности клетки в целом. С помощью микроманипулятора удалось инъецировать в клетку амебы коллоидное золото, а затем исследован, распределение его частиц в цитоплазме и ядре.
С помощью таких микрохирургических инструментов можно поворачивать в клетках митотические веретена, отгаскивать отдельные хромосомы, вводить в живую клетку меченые антитела или разные белковые молекулы. Кроме механическою воздействия на клетки в .микрохирургии в последнее время широко применяют мпкропучкн ультрафиолетовою света или лазерные мнкропучки. Эго даст возможностьпрактически моментально Инактивировать отдельные участки живой клетки. Например, можно инактивировать одно из ядрышек и следить та судьбой второю, интактного. В этом случае покатано, что второе ядрышко принимает па себя дополнительную нагрузку и «работает за двоих». С помощью микропучков удастся поразить часть ми го
28
тической хромосомы или > чисток веретеиа деления. Оказалось что поражение иеигромерь, хромосомы выводит последнюю из иропесс^ расхождения хромосом к полюсам клетки ю время митоза.
стали применять аги,араты с лазерным микропучком, что позволяв очень точно дозировать количество энергии в точке поражения и «с пользовать очень короткие (наносекунды) импульсы облучения.
При изучении живых клеток пытаются их окрашивать с помощью так называемых витальных красителей. Это красители кислой (трипа-ноззый синий, лигиевый кармин) или основной (нейтральный крас ный, метиленовый синий) природы, применяемые при очень большом разведении (1 : 200 000), следовательно, влияние красителя на жизнедеятельность клетки минимальное. При окрашивании живых клеток краситель собирается в цитоплазме в виде гранул, а в поврежденных ичи мертвых клетках происходит диффузное окрашивание цитоплазмы и ядра.
При изучении живых клеток широко используют флуоресцирующие красители и метол флуоресцентной микроскопии. Суть его заключается в том, что целый ряд веществ обладает способностью светиться (флуоресцировать, люминеепмровать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуореспениии всегда смешен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресценцию излучению. Так, выделенп ыи хлорофилл при освещении в ультрафиолетовых лучах светится красным цветом. Этот принцип используется в флуоресцентной микроскопий: рассматривание флуоресцирующих объектов в зоне коротких длин волн. Обычно в таких .микроскопах применяются фильтры, дающие освещение в сине-фиолетовой области. Существуют ультрафиолетовые люминесцентные микроскопы.
Собственной флуоресценцией обладают некоторые яш менты (хлорофиллы. бактериальные пигменты), витамины (А и В2), гормоны. Если во флуоресцентный микроскоп рассматривать клетки растений, го на темно-синем <|юне будут видны ярко светящиеся красные зерна внутри клоки - это хлоропласты.
Можно применять метол флуоресцентной микроскопии, добамяя живым клеткам флуорохромы (флуоресцирующие вещества). Этот способ сходен с витвльным окрашиванием в юм смысле, «то зле также использую! очень низкие концентрации красителя i I : 10s). Многие флуорохромы избиратьл ьно связываются '
ны.мзз структурами кле.к.., вызывая их вторичную люм. “
Например. флуорохром акридиновый оранжевый изо ра еды товя зываетея е нуклеиновым., кислотом...
ной форме с ЛИК. он Фл>оРсс,1,1^11п ;1).1&,юдс1',,11, за живыми форме с РНК светится красным шзсюм. Р „плио что их ял-
— к........ окрашенными « ядры--
ра имеют зеленый цвет свечения, а ни
29
красным цветом. В живой клетке с помощью этого метола можно видеть зокз.ниапию (а в некоторых случаях расечтывагь количество) тех или иных химических веществ. Существуют флуорохромы. избирательно связывающиеся с липидами, слизью, кератином и др.
В живые клетки можно инъецировать также меченные флуорохро-мами антитела. Например, введенные в клетку связанные с флуорохромом антитела к белку тубулину соединяются с микротрубочками, которые теперь можно наблюдать в живых клетках с помощью флуоресцентною микроскопа.
В последнее время для изучения живых клеток или их компонентов начинает широко применяться сочетание световой микроскопии (особенно фа jo во-контрастной) с электронно-компьютерной обработкой изображения. При этом используется видеозапись с электронной обработкой изображения, которая как бы «убирает» фоновые уровни и выделяет, контрастирует, наблюдаемые структуры. Методика позволяет на телеэкране видеть такие структуры, как микротрубочки, размер которых (20 нм) намного меньше разрешающей силы светового микроскопа. Применение таких систем не только заменяет цейтра-ферную киносъемку, вместо которой используется видеозапись, но и позволяет компьютерную обработку изображен ня: сведения о плотности структур, их параметрах, числе и трехмерной организации. В сочетании с флуоресцентной микроскопией эти методы открывают строчные перспективы в изучении живых клеток.
Обычные методы световой микроскопии трудно использовать для воспроизведения трехмерной картины изучаемого объекта из-за небольшой глубины резкости микроскопа. Обычно клетки рассматриваются как оптические разрезы на данной глубине фокуса. Для того чтобы получить полную трехмерную реконструкцию объекта, используют специальный конфокальный сканирующий световой микроскоп. С помощью этого прибора получают серии последовательных оптических срезов, взятых с различной глубины и изображения которых накапливаются в компьютере, и ио специальной программе реконструируется трехмерное, объемное, изображение объекта. Обычно используются объекты, окрашенные флуорохромамм.
Изучение фиксированных клеток
Несмотря на важность и достаточную информативность витальных наблюдений, большая часть сведений о структуре и свойствах- клеток получена па фиксированном материале. Если метку повредить опа начинает претерпевать ряд изменений, а после гибели клетки н ней ак тонируются автолитические ферменты, что приводит к грубым птме нениям клеточной структуры. Следовательно, задачи фиксации -
30
убить клетку, прекратить активность .тугрик.,сточных ферментов предотвратить распад клеточных компонентов, а также избежюь ™' ри структур и веществ, препятствовать поящей..» структур оХт „уюших в живон клетке (артефактные структуры). К сожХиХе нс наилен такой химический фиксатор, который удовлетворял бы всем этим требованиям. 1 ’
Часто для фиксации клеток используются альдегиды и их смеси с другими веществами. В качестве фиксаторов применяют также спирты. вы зывающис необратимую денатурацию белков, осаждение пукле-«новых кислот и полисахаридов. Осаждающим действием обладают также сулемовые фиксаторы и фиксаторы с пикриновой кислотой. Фиксаторы, содержащие четырехокись осмия (OsO4), хорошо сохраняют липиды.
После фиксации объекты в дальнейшем можно подвергать дополнительной обработке. О той из главных таких обработок является окрашивание клеток. Именно дополнительное окрашивание клеток позволило выявить в них массу деталей.
Стекла с фиксированными мазками одноклеточных организмов или с клетками культуры ткани можно непосредственно помешать в красители. Но для окрашивания клеток в составе органов необходимо получить их срезы. Изучают также срезы и отдельных клеток.
Для этого после фиксации кусочки органов обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, спирт замешают ксилолом, а ксилол парафином. Таким образом, фиксированная ткань, минуя высушивание на воздухе, оказывается заключенной в твердую массу парафина, ко
торую можно нарезать.
Срезы толщиной до 5-10 мкм получают на специальном приборе -микротоме. Такие срезы приклеиваются на предметное стекло: парафин растворяется в ксилоле, ксилол удаляется спиртами, которые замешаются водой. Теперь срезы можно окрашивать водными растворами красителей. Для изготовления постоянных препаратов окрашенные срезы снова обезвоживаются и заливаются в канадский бальзам иод покровным стеклом. Эн» препараты можно длительно хранить.
Для окраски фиксированных тканей и кюток применяют различные натуральные и главным образом синтетические красители. Натуральные красители (гематоксилин, кармин и др-) уиотреоляют в со к гании с протравами (окисли различных металлов), с которым» образуют комплексные соединения (лаки). 1Р
Синтетические красители подразделяют на кислые й
Основные красители представляю» собой соли ЛЯЮ1 ||Х
содержащие в своем составе аминогруппы. кото| с с М|| щелочность. Такие красили образуют долевые связи с группами в структурах клетки' красителями, бу-
ТЫС КПСЛО1НЫМН [руинами, свяжется с
ЯХТ как их называют, базофильными. Кислотные красители содержат в своем составе гидроксильные группы, или i руины SO2OH. Структуры клеток с основными (щелочными) свойствами связываются с кислотными красителями и называются анидо- или оксифильными. Существует множество смесей таких красителей, которые одновременно мот окрашивать различные участки клеток в разные цвета и тем самым повышать контрастность клеточных и внеклеточных компонентов. Таким образом, используя всевозможные красители, исследователи не только добиваются четкости морфологической картины клетки, но получают некоторые сведения о химизме той или иной структуры.
Ряд приемов окрашивания, направленных на выявление специфических химических веществ, получил название гистохимических, или цитохимических. Методов цитохимического анализа очень много.
Существует целый ряд специфических приемов окрашивания, прямо выявляющих те или иные вещества. Это собственно гистохимические (цитохимические) реакции. Основные требования, предъявляемые к такого рола реакциям, следующие: специфичность связывания красителя, неизменность локализации вещестна.
Примером такого рода цитохимических реакций может быть широко применяемая реакция на ДПК — реакция Фель ген а (рис. 7). Суть ее в том. что после специфического кислотного гидролиза только из ДНК в результате отщепления пуринов на дезоксирибозе образуются альдегидные группы. Эти группы могут взаимодействовать со специфическим индикатором, реактивом Шиффа (обесцвеченное основание фуксина), давая красное окрашивание в местах локализации ДНК. Связывание красителя в этом случае строго количественное, что позволяет не только обнаружить и указать места, где есть Д! IK, но и измерить ее количество. Используя этот же принцип выявления альдегидных групп, в клетках можно видеть расположение полисахаридов после гидролиза их периодной кислотой (так называемая PAS-реакция).
Также специфически можно определить локал и ганию белков реакциями на отдельные аминокислоты (тирозин, триптофан, аргинин и др.). Липиды и жиры обнаруживают в клетка* специальными красителями (судан черный), хорошо растворяющимися и аккумулирующимися в жировых включениях.
Целая группа цитохимических реакций связана с обнаружением ферментов. Общий принцип этихреакиий вто.м, что в микроскоп видны не сами бечковыс ферменты, а места их локализации, которые обнаруживаются ио продуктам их специфической ферментативной активности.
Количество конечною продукта юпохимичсскон реакции можно определигь с помощью метода питофотомстрии. Основу его составляет определение количества химических веществ но поглощению ими света определенной длины волны. НаВлено. что интенсивное! ь ио. ло-
32
он н
Рис. 7. Схема проведения реакции Фсльгена
I- краситель тцыршан и тип (основной ф> кепи) всрсхолнгв неокрашенную к-мкофор-му(Л - реактив Шм<|м|>а; 3- пглролизЙК К соляной кислотой приводят к образованию <х1Е1С1илных грхпн. которые, взаимодействуя с реактивом Шиффа, переводят сто в окра iiiciiiioc состояние (4)
•нения лучен пропорциональна конпеи гранил вещества при одной п гой же толщине объекта. Следовательно, оценивая степень поглощения света данным веществом. .можно узнать его количество. Для такого роди исследований используют приборы мнкроскопы-нптофото-метры: у них за объективом расположен чувствительный фотометр. |хл истрирующий интенсивность прошедшего через объектcbctobow потока. Зная площадь или объем измеряемой структуры и значение
зз
поглощения, можно определить как концентрацию данного вещества, лак и его абсолютное содержание. Широко используется метод лито-фотометрии яри определении количества ДНК на клетку после реакции Фёлыена. В данном случае фотомстрнруется пе сама ДНК, а содержание окрашенного в красный цвет фуксина, количество которого прямо пропорционально содержанию ДНК. Сравнивая полеченные величины поглощения со стандартами, можно получить точные значения количества ДНК. выраженные в граммах. Этот метол позволяет измерять количество ДНК до Ю-’2 - 10 14 г, в то время как микрохимические методы имеют чувствительность не более I0-6 г. С помощью иитофотомстрии содержание ДНК в клетках определяется намного точнее обычных биохимических методов.
Количественную оценку получают не только поглощающие свет объекты и вещества, по и излучающие (светящиеся). Так, разработаны приемы количественной флуорометрии, позволяющие но степени свечения определить содержание веществ, с которыми связываются флуорохром ы.
Для выявления специфических белков применяют иммунохимичс-екне реакции с использованием флуоресцирующих антител. Этот метод иммунофлуоресценции обладает очень большой специфичностью и чувствительностью. Ei о можно использовать для выявления не только белков, но и отдельных последовательностей нуклеотидов в ДНК или для определения мест локализации РНК-ДНК-гибридных молекул. Для этого сначала на белок (например, тубулин) получают специфические сыворотки, содержащие антитела. Очищенные антитела химически соединяют с флуорохромами. Такие препараты наливаю! на объекты и с помощью люминесцентного микроскопа по свечению флуорохрома находят места локализации искомых белков в клетке. Однако для того чтобы меченные флуорохромами антитела проникли н клетку, необходимо плазматическую мембрану сделать пропинаемой. Обычно это достигается фиксацией клеток и частичной экстракцией липидов из мембран. Для изучения с помощью этого метода ци-тоскслетных белков прибегают к растворению клеточных мембран различными дотер!ентами.
Для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, ,тя определения путей переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами отмельных клеток широко используют метод радио-автографии — регистрации веществ, меченных изотопами (рис. 8). Принцип JTOIO метола очень прост, он повторяет метол Беккереля, от-крывшего радиоактивный распад. При радиоавтографическом исследовании в срезу с находящимися там клетками ввозится предшественник одного и з макромолекулярных соединении (например, аминокислота или нуклеотид), один из атомов которого замешен радиоактивным изотоном. Например, вместо 12С введен атом ,4С. вместо иодоро-
34
Рис. 8. Схема метода радиоавтографин
a введение меченого -'Н- тимидина (’НТК б - втяючевие ею в ЛИК я ipa: в клетка покрыта фотоэмульсией. гранулы которой засвечиваются р-часпнйчм* г — гранулы серебра нал метами расположения изотопа в клетке; д - то же. вид сверху
да - TpiiTiiii ( Н) к др. В процессе синтеза в биополимер включится п меченая молекула прецпсстнеиника. Регистрировать ее место в клетке можно с помощью фотоэмульсии. Если клетки в пласте или на срезе покрыть фотоэмульсией. то через некоторое время в результате распада изотопа р-частипы. разлетающиеся хаотично в разных направлены-ях, попадут в зону чувствительного фотослоя и активируют в нем зерна бромистого серебра. Чем больше будет время экспозиции, т.с. кон гакта такой меченой клетки с фотоэмульсией, тем больше зерен AgBr будет засвечено. После экспозиции шало проявить препарат, при этом происходи! восстановление серебра только в засвеченных гранулах, при фиксации препарата не засвеченные гранулы AgBr растворяются. В результате из массы грапул. которые покрывали объект. останутся только те. которые были активированы р-пзлучением. Просматривая в микроскоп такие препараты, поверх которых нанесен слой фотоэмульсии, исследователь находиi места локализации зерен серебра, которые располагаются напротив .мест, где содержится меченое вещество (см. рис. 8).
Этот метод имеет от ран имения: точность его будет зависеть от величины зерна AgBr и от энергии частицы. Чем больше величина зерна, тем с меньшей точностью можно узнать место расположения изотопа.
11 чем выше энергия частицы и длиннее се пробег, тем дальше от места распада будет происходить активация зерен AgBr Поэтому для метола радиоавтог рафии используют особые мелкозернистые фото-эму тьсии (0.2-0.3 мкм) и изогоны с милой энергией р-часгиц. главным образом изотоп водорода - тритий (’Н). Тритием могут быть мечены чюбые предшественники биологических .макромолекул: нуклеотиды, аминокислоты, сахара, жирные кислоты. Дня ралноаизографических иссчетований используются также меченые гормоны, антибиотики. ингибиторы и др. Радиоачзтографичсскн нельзя изучать растворимые в воде соединения, гак как в процессе обработки клеток водными растворами (фиксация, проявление и т.д.) они могут потеряться. Другим ограничением метода является достаточно высокая концентрация данных веществ, так как яри низкой концентрации радиоактивною вещества время экспозиции увеличивается, при этом растет опасность появления фона засвеченных гранул AgBr за счет космического излучения.
Метод радиоавточ-рафни — один из основных методов, позволяющих изучать динамику синтетических процессов, сравнивать их интенсивность в разных клетках на одном и том же препарате. Так. с помощью этого метода при использовании меченых предшественников РНК было показано, чго вся РНК синтезируется только в нигерфаз-ном ядре, а наличие цитоплазматической РНК является результатом миграции сичччсзированччых молекул из ядра.
Метод ралиоавгографии используется также для определения расположения конкретных типов нуклеиновых кислот или отдельных нуклеотидных последовательностей в составе клеточных ядер или хромосом метод молекулярной гибридизации. Для этого раствор с меченой нуклеиновой кислотой (например, с рибосомной РНК) или с се фрагментом (например, с сателитиой ДНК) наносят на препарат, предварительно обработанный так, чтобы денатурировать ДНК (разорвать водородные связи в ччапчвной ДНК) в составе хромосом пли ядер, что достигается щеточной или температурной обработкой образца. В процессе реначхрапни ДНК происходит образование молекулярного гибрида между меченой нуклеиновой кислотoii из раствора и комплементарным ему участком ДН К в препарате. Место такой гибридизации определяется ралиоантографическн. Этот метол молеку лярной чибридизаини нуклеиновых кислот позволяет с большой точностью. чокал и зова гь на хромосоме места с таннои нуклсогияночч последовательностью или лаже расположение определенных генов.
Метод мо чеку чярччои гибридизации нуклеиновых кислот используется также при окраске их флуоро.хро.мамчч. Например, если вы гелен-чпю ядрышковую ДНК. ответственную за синтез рибосомных РНК, предварительно связачь с каким-либо флуорохромом, ю после гчрочзе-деччия реначурацнн ДНК на препаратах с згой ф чупресиируюшсй рибосомной ДНК можно видеть, что флуоресценция будет наблюдаться
36
только в ядрышках ннтерфазных кэетп»'
вых организаторов митотических хромосом. ьХ.йрХ^Хтках можно локалнзоватьлюоые последовательно™ ДНК и лаже р^ ото жение в ядрах отдельных хромосом. Этот прием называется FISH ме’ тол (флуоресцентная in silu гибридизация). е
Электронная микроскопия
Рассматривая характеристики световою микроскопа, можно убедиться. что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения. испускающего волны с наименьшей хтиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает иоток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в кот ором уже сейчас достигнуто разрешение в 1 А (0.1 нм). По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конлснсорная система <кои ег.орная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза;, окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают налюми-неснируюший экран или на фотопластинку (рис. 9).
Основная часть такого микроскопа представляет собой полый цилиндр (колонка микроскопа), из которого откачан воздух для юго, ч гобы не было взаимодействия электронов с молекулами газов и окисления вольфрамовой нити накаливания в катоде электронной пушки. Между катодом it анолом подается высокое напряжение (от 50 до 2OO—5OOO кВ), что служит причиной ускорения электронов. В центре анола есть отверстие, проходя через которое электроны формируют пучок, идущий вниз по колонке микроскопа. Линзы электронного микроскопа представляют собой электромагниты, поле которых может изменять путь электронов (как стеклянные линзы изменяют путь фотонов). В конленсорной линзе пучок электронов фокусируется и попадает на объект, с которым электроны взаимодействуют. отклоняются, рассеиваются, поглощаются или проходят без изменения. Этек-троны, ирошелшие через объект. фокусируются объективной линзои. которая формирует увеличенное первичное изображение объема. 1ак же как а световом микроскопе, объективная линза определяет его основные показан-.™ Первичное изображение увеличивается проекии-оиной линзой и проецируется на экран. покрытый люминесиенпшм слоем, светящимся при попадании на него азектронов. мсс е шегося экрана и «Сражение можно поместить на фотопластинку лучить снимок.
37
И*обряжение
света
Рис. 9. Сравнение хода лучен JHCKipoHHOIO (6) иикросконов ' кп,1К11сор1<ая .ч„|1И;2 объект г низа
электронов) б
И Обшей конструкт,и светово.о («) и об1-ек-т„„„.,„ 4 _ 0№1яр „роеК11ига1)и)1
38
Напряжение, которое используется дмя ускорения электронов в большинстве просвечивающих (трансмиссионных) электронных ми кроскопов. достигает 50-150 кВ. При напряжении в 50 кВ электрон обладает тин,нои волны в 0.05 А. и в этом случае теоретически можно бь, ю бы получить разрешение в 0.025 A (d - 0,51). Однако в совпе менных конструкциях электронных микроскопов достигается разве шение около I Л из за недостаточной стабильности напряжения стабильности тока линз, неоднородности металла магнитных линз и других несовершенств прибора (теоретически возможно сиге повысить разрешение электронного микроскопа в 100 раз). Но и достигнутое разрешение огромно (вспомним, что величина О -Н-связи в молекуле воды равна 0.99 А): оно сейчас уже в 106 раз выше разреша-югцей способности таза!
На экранах и фотопластинках электронных микроскопов можно получить увеличение до 50 000 раз, в дальнейшем при фотопечати можно получить еще 10-кратное увеличение, так чго конечное увеличен не, при котором максимально реализуется разрешение, может достигать I О6 раз (например, если 1 мм увеличить в IО6 раз. то он достигнет длины в 1 км).
В настоящее время электронно-микроскопическое изображение с флуоресцирующего экрана с помощью цифровой телекамеры перелается прямо в компьютер, где на экране монитора его .можно обрабатывать различными способами (изменять увеличение, контрастность изображения, применять денситометрию, плани- и морфометрию отдельных компонентов). Используя принтер можно получить отпечатки полученных изображений.
Максимальное разрешение э гектронпого микроскопа (ЭМ) реализуется сейчас только при исследовании металлов или кристаллических решеток. На биологических объектах такого разрешения получить пока не удастся из-за низкой контрастности объекта. Биологические объекты для исследования в ЭМ помешаются на медные сеточки, покрытые гонкими пленкам и-подложкам и (форм вар. коллодий, углерод). состоящими в основном из углерода. Биологические объекты также в основном содержат углерог и. следовательно, по плотности будут мало отличаться от фона, будут мало контрастны. Показано, что минимальная толщина биологического объекта с плотностью 1 г/см\ выявляемою при укоряющем напряжении в электронном микроскопе 50 кВ. равна 50 А. Вирусы. распложенные на подкржп-вакнией п топке. буНут вп шы в лом случае в вп в. .ссстр ,0 \у в<юб-теп. а м< деку <ы нуклеиновых кис .о. (то . шина ДНК р. ши»А вооо те не видны из-за низко- контрае.а. Контраст о.ю зон можно повысить, используя тяжелые металлы i
39
Контрастирование корпускулярных объектов
Корпус ку .гарными объектами можно назвать частички вирусов, фагов, выделенные клеточные компоненты (рибосомы, мембраны, вакуоли п Т.Д.). макромолекулы. Одним из широко распространенных методов контрастирования биологических объектов является оттенение металлами. 15 этом случае в специальных вакуумных установках производится термическое испарение металла. При этом атомы металла разлетаются от места испарения по прямым траекториям. Встречаясь с объектом, они осаждаются на нем в виде слоя; его толщина будет больше в местах, перпендикулярных направлению полета частиц металла. В участках, где объект экранирует пучок частиц, возникнут «тени». Таким образом, напыленная часть объекта обладает большей плотностью, чем напыленная подложка (фон), и поэтому объект булет виден. Этот метол широко применяется не только для контрастирования вирусов, рибосом, ио и для достаточно тонких молекул нуклеиновых кислот. Минус этого метода в том, что он приводит к увеличению размеров объекта на толщину напыленного слоя, который в лучшем случае достигает 10—15 А. Другим недостатком метода я ваяется то. что он даст информацию только о внешнем виде и объеме частиц. Для контрастирования оттенением используется платина, налимий, их сплавы.уран.
При негативном контрастировании объектов растворами солей тяжелых металлов применяют молибденовокислый аммоний, уранидаце тат, фосфорно-во.тьфрамоиую кислоту (ФВК) (рис. 10). Если водные растворы таких веществ смешать с биологическими объектами, а затем нанести их на пленки-подложки и высушить, то объекты (например, вирусы или белковые комплексы) окажутся как бы пш ружейными в
Рис 10. Схема контрастирования (а) напылением металл: контрастировании частицы (6)
Стрелка указывает наврав теине ткиока распыляемых частив
и при негативном
40
ТО..К.П1 слои аморфного вещества высокой плотности В электоошюм микроскопе они выглядят как светлые объекты „а темном фе не как фотоисгатив). Преимущества метола в том. что растворенные‘соли мо 1ут проникать в глубь объекта и выявлять дополнительные его детали Негативное контрастирование широко применяется при изучении виру сов. ферментных комплексов мембран Нитчатые молекулы иуклеипо вых кислот эч им метолом выявляются плохо из-за их малой толщины.
Соли тяжелых мег аз юв можно использовать при так называемом позитивном контрастировании. В этом случае контрастирующее вещество связывается со структурой, повышает ее электронную плотность. Часто для позитивного контрастирования нуклеиновых кислот используют растворы урапилацетата в спирте пли в ацетоне. Уранил-ацетат, контрастируя нуклеиновые кислоты, хорошо прокрашивает центральные полости сферических вирусов, значительно повышает контраст рибосом и позволяет видеть тонкие нити выделенных нуклеиновых кислот.
Ультрамикротомия
При изучении обьектов в электронном микроскопе возникаетешс одно осложнение — это их толщина. Дело в том. что при прохождении пучка электронов через объект часть электронов поглощается, что приводит к нагреванию объекта и к его деформации. Полому необходимо иметь тонкие объекты (толщиной не более 0.) мкм). Другое oiра-ниченис заключается в том, что даже если мы будем рассматривать нс-из.мсняю!пиеся объекты большой толщины (около 0,5 I мкм). что в принципе возможно (например, в мегавольт! юм электронном .микроскопе) (см. далее), то на конечном изображении будут наслаиваться проекции структур, располагающихся на разных уровнях по толщине объекта. Следовательно, изучать в трансмиссионных микроскопах внутреннее строение целых клеток плохо и неудобно. Выход из этого положения аналогичен тому, что было найдено для световой микро скопни: делать срезы очень малой толшипы, т.е. ультратон кие срезы (0,05-0. К) мкм). . Wtw
Процедура их изготовления в принципе сходна с топ. чю нспс.ль ется в световой! микроскопии. Клетки и ткани для этого сна «ла сиру юг. В качестве фиксаторов используются буферные Раст’ г^-дарового альдегида или четырехокисн осмия, аиоолсе it -нястся двойная фиксация: сначала глутаровый альаег ,.. ‘ ‘ мин. который как 1яжелый металл контрастирует юс с 1 смол^_ ры После обезвоживания ткани пропитываются лт поли
х... пл,, другими пчастиках... в жилкой, мономерной ^1ЫХся«-мершанпи таких пластмасс пропитанный ими < >
41
Рис. 11. Стеклянный нож для ультрамикротом пи
/ - на стекле делается насечка; 2 - после разлома образуется режущая кромка (показано стрелкой); 3 - процесс резки материала: образующие -ся срезы («) попадают на поверхность жи скости нал режущим ножом (б)
ключей ным в твердые блоки, которые уже можно резать на гонкие срезы. Здесь возникают две проблемы', где взять идеальные ножи, изъяны которых не сказывались бы при изучении клеток на почти молекулярных уровнях, в как илотовигь срезы толщиной в сотые доли микрона. Первая задача были решена таким образом: оказалось, что идеально острой и без зазубрин режущей поверхностью обладают сколы стекла (рис. 11). Но стеклянные ножи очень недолговечны, их используют только опин раз. Применяют алмазные ножи: это специальным образом заточенные мелкие алмазы, они служат в течение нескольких лет.
Проблема изготовления сверхтонкого среза была решена тоже, ка-залосьбы, просто - это термическая подача объекта. Блок с заключенным в пластмассу объектом крепится на металлическом стержне, который нагревается и тем самым продвигает объект вперед на определенную величину за известное время. И если л у термическую подачу согласовать с ритмическими циклами резания, то можно получить серии срезов заданной толщины. Эго достигается при использовании специальных приборов - ультрамикротомов. Существуют конструкции ультрамикроюмов. где подача объекта осуществляется механически.
Площадь подучаемых ультра-гонких срезов обычно очень мала (0.1 — I мм2), поэтому все операции при ультрамикротом ирона) nt и идут под микроскопическим контролем. Срезы, смонтированные на сетках с подложкой, необходимо дополнительно контрастировать — «окрашивать» с помощью солей тяжелых металлов. В этом случае используют также соли свинца и урана, которые, связываясь с внутриклеточными оруктурами на срезе, позитивно их кошрасткруюг.
42
Техника изготовления ультратонких среюп открыла сромные воз можности дляприменения электронной микроскопии буквально >ю всех областях 6110.101 пи и медицины.
Этот метол позволяет применять цитохимические приемы на у„ов не электронной микроскопии: в данном случае необходимо чтобы продукты реакции были электрон неплотными, отклоняли бы электроны. Кроме того, реакции нс должны приводить к появлению арте-фактных картин уже на ультраструктурном уровне. Число цитохимических методой в электронной микроскопии пока не велико, но это направление интенсивно разрабатывается.
В хэектронпо-микроскопическич исследованиях оказалось возможным применить методы ралиоавтографип. В этом случае используются сверхтонкозернистые эмульсии (величина гранул около 0,02-0,06 мкм). Недостатком этого метода является очень большое
время экспозиции. в некоторых случаях достигающее нескольких ме-
сяцев.
Все большее применение получают методы приготовления ультра-тонких срезов без фиксации и заливки клеток в твердые пластмассы. Это методы криоультрамнкротомии, те. получение срезов с замороженных тканей, моментально охлажденных до температуры жидкого азота (—196 ’С). При этом происходит практически одномоментное торможение всех метаболических процессов, а вода из жилкой фазы переходит в твердую, но не кристаллическую, ее молекулярная структура беспорядочна (стекловидное состояние). Такие твердые блоки при температуре жидкого азота можно резать на ультратонкие срезы (нож при этом также охлажден). Полученные срезы используют для выявления в них активности ферментов, для проведения на них имму-нохимических реакций, для ферментативного переваривания и т.п.
Для проведения иммунохпмпческих исследований используют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализация которого на препаратах И указывает на места расположения искомого
антигена.
Изучение среюн. полученных па криоулыратомах, показало, что общая структура и композиция клеточных компонентов в,инном слу чае мало сличаются от того, что видно при нсио.н.зоваиин xiiMiiie-ской фиксации и обычных приемов получения улыратонких Р® Слеловатсльно, те струмуры, которые имеют *'к
пню при разных мето tax обрабожи материала, по'‘“' " ' своему прижизненному строению, не являются ‘,plL ‘ поч0шью
Н пользу этого говорят данные по нсоелова.шю меток с помощью иных приемов элскгронпой микроскопии компонентов
Для изучения структуры Ра«»1ч"ы\“Х Хг-клетки используется метод замораживания
43
в
Рис. 12. Схема метола замораживания—ckiui ы вания а скалывание замороженного объекта; б - напыление слоя ми 1 алл а и углерода на поверхность скола; в -растворение объекта и получение реплики с поверхности скола объекта. / нож
ся в том, что объект сначала быстро замораживают жидким азотом, а затем при той же температуре переносят в специальную вакуумную установку. Там замороженный объект механическим способом скалывается охлажденным ножом. При этом обнажаются внутренние тоны замороженных клеток В вакууме часть воды, перешедшей в стекловидную форму, возгоняется («травление»), а поверхность ско ia последовательно покрывается тонким слоем испаренного углерода, а затем металла. Таким образом с замороженного и сохраняющею прижизненную структуру материала получают рсилику с его скола (рис. 12). Затем уже н условиях комнатной температуры ткань пли клетки растворяют в кислотах, но пленка-ренлмка при этом остается цела, се изучают в электронном микроскопе. Этот метод имеет два пре имущества: изучают реплики со ско юн нативных образцов; исследуют рельеф поверхности мембран клетки, что невозможно при друз их методах. Оказалось. что и в этом случае общая организация клетки и ее компонентов сходна с тем, что мы видим при химическом фиксации или при криотомии. Этот метод позволил увидеть, что и на поверхности, п в толщине клеточных мембран располагаются глобулы иитс1ральных белков, а мембраны нс однородны по своей структуре.
Метол получения реплик с микрорельефа образна широко применяется при изучении фибриллярных компонента клетки. Так, при изучении цитоскелета клеток культуры ткани или форменных элементов крови клетки обрабатываю! детергентами для того, чтобы растворить все мембраны. Это приводит к тому, что из клетки вымываются вес компоненты, кроме фибриллярных белковых компонентов нитоске юта и ма-
44
трикса ядра- Такие препараты затем фиксируются обе.,юж... специальным обратом сушатся. Вслед за этим сухие',1ре11ю^“10' " ются углеродом кои грает,труются распыле,шем тадх "«Х
„осле чего такая реплика снимается со стекла, „а котором росТк ™' ки. и просматривается в трансмиссионном здек,ройном микроскопе
Другие специальные методы электронной микроскопии биологических объектов
В последнее время начинают применять методы выеоковотьпю,, (вернее, сиерхвысоконольгиои) микроскопии. Сконструированы приборы с ускоряющим напряжением 1-3 млн В. Это очень дорогие приборы, что сдерживает их широкое применение. Преимущество этою класса электронных микроскопов не в том. что на них можно ночучкть более высокое разрешение (при более короткой длине волны электронов), а в том. что при высокой энергии электронов, которые меньше поглощаются объектом, можно просматривать образны большой толщины (1 — 10 мкм). Дополнительное использование стереоскопической съемки позволяет получить информацию о трехмерной организации внутр» клеточных структур с высоким их разрешением (около 0.5 нм).
Me юл сканирующей (растроной)электронной микроскопии позволяет изучать трехмерную картину поверхности клетки. При сканирующей электронной микроскопии топкий пучок э тектронон (зоил) пробегает но поверхности объекта и полученная информация передается на электронно-лучевую трубку Изображение может быть получено в отраженных или вторичных электронах. При этом .методе фиксированный и специальным образом высушенный объект покрывается гонким слоем испаренного металла (чаше всего золота), отражаясь от которого электроны попадают в приемное устройство, передающее сигнал на электронно-лучевую трубку. Благодаря огромной ыуоинс фокуса скаинру тощего микроскопа, которая значнгельно больше, чем у просвечивающею, получается почти трехмерное изображение исследуемой поверхности. Разрешающая способность этого типа при боров несколько ниже, чем у просвечивающих электронных микро скопов, но уже сейчас выпускаются приборы с разрешением -(рис. 13). .
С помощью растровой электронно!! микроскопии '
чить информацию о химическом составе в тех юн’ иныху L 'ОК. Гак. метол peiirreiroeiieKipanbiioio *,п|НЧССк„х
b<ei<iiK|>i,Kaiuiii „ K<>.iii4ecnieiinoit <шх»кс содхрж ...пго „зззче-лчементов „о снек,рам характеристического реиус' ктроиов с "пя. во шикающего при нииматеиствии иервпч
45
Рис. 13. Микрофотографии поверхности клетки и культуре ткани (фого Ю.А. Ровенского) («) и жгутиконосца Lwnblia iniesrinulis из культуры (о). полученные с помощью электронною сканирующего .микроскопа
атомами объекта. Для получения такой информации объекты не следует покрывать слоем металла, как при обычном методе сканирующей электронной микроскопии. Более того, объект нужно подготовить так, чтобы нс было потери или дополнительного внесения элементов. Дтя этого испочыуют быстро замороженные и высушенные в вакууме объекты.
46
Фракционирование клеток
в шттологни широко применяют раточные методы биохимии как аналитические, так и препаративные. В последнем случае можно™ лучить в виде отдельных фракций разнообразные компоненты чать их химический состав, ульграсгруктуру и свойства. Так в настоя шее время в виде чистых фракций получают практически з’юбыс кле точные органеллы и структуры: ядра, ядрышки, хроматин ядерные оболочки. плазматическую мембрану, вакуоли шдоплазматического ретикулума, его рибосомы, рибосомы гиа»оплазмы. аппарат Гольджи митохондрии, их мембраны, пластиды, пероксисомы, микротрубочки п др. В последнее время получены чистые фракции центриолей и ядер-ных пор.
Получение клеточных фракций начинается с общего разрушения клетки, с се гомогенизации. Затем из гомогенатов уже можно выделять фракции. Одним из основных способов выделения клеточных структур является дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его применения в том. что время осаждения частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности: чем больше частица и in чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на дно пробирки. Для убыстрения процесса оседании варьируют ускорения, создаваемые центрифугой. При центрифугировании раньше всего и при небольших (1—3 тыс. у) ускорениях осядут ядра и неразрушенные клетки, при 15 30 тыс. g осялуг крупные частицы, макросомы, состоящие из митохондрий. мелких пластид, пероксисом, лизосом и др., при 50 тыс. g осядут микросомы, фрагменты вакуоляриой системы клетки. При повторном дробном центрифугировании этих сметанных подфрак-ций можно получить чистые фракции. Так, при разделении микросомной подфракии» получают отдельно митохондрии, лизосомы, нерок сисомы. При разделении микросом можно получить фракцию мембран аппарата Гольджи, фрагментов плазматической мембраны, вакуолей. |раиулярного ретикулума. В случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование и градиенте плотности саха розы, что позволяет хорошо разделить компоненты, даже незнач! гелыю отличающиеся друг ог друга по удельной массе.
Прежде чем выделенные фракции анализировать оиохимн к. способами, необходимо проверить их на чистоту с помои ь
тронного микроскопа. иг.СТЬ
Получение отдельных клеточных компонентов лает миЖ|(0 изучать их биохимию и функциональные ocoociihoct^^-^ созлать бескле точную спетому для рибосом, ко орые > . рНК
иап. белок по заданной экспериментатором ш ф Р • 0СУШестн-Выделенные митохондрии в подобранных )словия.
47
шть синтез АТФ. па выделенном хроматине при участии соответствующих ферментов может происходить синтез PH К и т.д.
В последнее время применяются бесклеточные системы для воссоздания клеточных надмолекулярных структур. Так, используя очищенные от фану л желтка экстракты цитоплазмы яиц земноводных или яип морских ежен, можно получить ядра с вдерпой оболочкой из введенной в эту бесклеточную систему чужеродной ДНК (например, ДНК бактериофага). Такая ДНК связывается е белками-гистона.ми, которые есть в избытке в гаком экстракте, образуется хроматин (лезокенрибонуклеопротенл), который покрывается двойной мембранной оболочкой, иссушен даже ядерные поры. Такие модельные си
стемы помогают изучать тонкие, интимные процессы, например транспорт макромолекул из цитоплазмы в ядро, к наоборот. В цито
плазматических экстрактах яиц земноводных и иглокожих такие ядра могуч периодически делиться путем митоза. Эти модели внесли oi ром-ный вклад в расшифровку природы регуляции клеточного цикла.
Большой вклад в биологию клет ки вносят мето гы клеивший инженерии. Найдено, что различные живые клетки могут сливаться друг с другом, если специальными способами обработать их плазматические мембраны. Так можно слить эритроцит курицы и лимфоцит человека. При этом получается двуядерная клетка — гетерокарион, в котором происходит активация язра куриного эритроцита (рис. 14). Если гетерокарион образуется из близкоротственнь/х клеток (например, мыши и хомячки), то при вшуплении их в митоз хромосомы moi у г объели-
Рис. 14. Образование гетерокариона из яясрного Эритроцита курицы (/) и фибробласта чело пека (2) и — иве ризясллмс kjciки; б —с шянис их плазмин ичсских мембран и объединение клеточного cqgcpMiiMoio; «. г - тыны активации ядра -jpinpointi.t
48
Рис. 15. Получение карие-пластов и цитопяастов а - клетки культуры, обработанные нитохаяаппюч; б - центрифугирование клеток: в - отделение участка цитоплазмы с ядром (кариопласт), оставшимся участок - цитопласт; г - реконструкции клеток из разнородныхкарио-пластов и питон ластов. Стрелки указывают направление центробежных сит
питься в одну метафазиую пластинку. После разделения такой клетки получится истинно гибридная клетка. Другие приемы позволяют конструировать клетки из разных по происхождению шер и цитоплазмы (рис. 15). Так, разрушив актиновый компонент цитоскелета и подвергнув клетки центрифугированию, клетку можно разделить на две части: ядро с узким ободком IL11топлазыы кариопласт и на оставшуюся часть цитоплазм ы нитонласт. Затем, используя разные кариопласты и цитопласты. можно создавать разные комбинации реконструированных клеток.
Методы клеточной инженерии широко применяются не только в экспериментальной биологии, но и в биотехнологических целях. Например, при получении моноклональных антител используются клеточные гибриды между лимфоцитами н.хгмунизпроианны.\ животных и интенсивно размножающимися клетками миеломы. Полученные первичные дикарионы образуют истинные гибридные клетки. которые ин генеивно размножаются за счет генома опухолевых миеломных кие ток. и одновременно выделяют большое количество антител засзе работы генома иммунизированных лимфоцитов. Этот пршм 1 ‘
ет получать большое число гибридомных клеток. выраза большие количества необходимых антител. „мМ»«пв
Нет необходимости приводить описание всех мето'^ функций используемых в цитологии для изучения строения, хвх но ияТ0_ клеток или их компонентов. $тою краГК01°°б3?т,1пти!, почю.тя-го. чтобы покатать богатство арсенала меголов - ра!Ме-юпшх давать точный анализ. начиная от формы, оо де,1ьНых частей, ри клегки и кончая молекулярной композицией се т
49
ЧАСТЬ ВТОРАЯ
СТРОЕНИЕ И ХИМИЯ КЛЕТОЧНОГО ЯДРА
Глава 3
ЦЕНТРАЛЬНАЯ ДОГМА МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ'
Для того чтобы нс только понять значение структурных особенностей клетки, но и. главное, разобраться в функциональных отправлениях ее отдельных компонентов н всей клетки в целом, чтобы сочетать изучение морфологии клетки с главнейшими биохимическими и генетическими особенностями се устройства и работы, чтобы изучать клетку именно с позиций современной клеточной биологии, необходимо хотя бы вкратце вспомнить основные молекулярно-биологические закономерности, cine раз кратко обратиться к содержанию центральной догмы молекулярной биологии.
Клетка как таковая выполняет множество разнообразных функций. Как мы уже говорили, часть из них — обще клеточные, часть — специальные, характерные для особых клеточных типов. Главными рабочими механизмами выполнения этих функций являются белки или их комплексы с другими биологическими макромолекулами, такими, как нуклеиновые кислоты, липиды и полисахариды. Например, известно, что процессы транспорта в клетке разнообразных веществ, начиная с ионов и кончая макромолекулами, определяются работой специальных белков или липопротеиновых комплексов, входящих в состав плазматической и иных клеточных мембран. Практически все процессы синтеза, распада, перестройки разных белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов происходят в результате активности специфических для каждой отдельной реакции белков ферментов. Синтезы отдельных биологических мономеров, нуклеотидов, аминокислот, жирных кислот, сахаров и других соединений также осуществляются огромным числом специфических ферментов - белков. Сокращение, приводящее к подвижности клеток или к перемещению веществ и структур внутри клеток, осуществляется также сисннальнымн сократительными белками. Многие реакции клеток в ответ на воздей-
1 Глава содержит краткое и сложение введения из монографии А.С. Спирина и Л.П. Гавриловой « Рибосома’» (1971)
50
ствис внешних факторов (вирусов, гормонов, чужеродных бе .ков др.) начинаются с взаимодействия этих факторов со снени^ ны , клеточными белками-рецепторами. •ыьиыми
Белки - это основные компоненты практически всех клеточных структур, множество химических реакций внутри клетки определяет ся множеством ферментов, каждый из которых ведет одну и™ не сколько отдельных реакций. Структура каждого отдельно взятого бел ка строго специфична, что выражается в специфичности их первичной структуры - в последовательности аминокислот вдоль полипептид-ном, белковой пени. Причем специфичность этой аминокислотной последовательности безошибочно повторена во всех молекулах данного клеточного белка.
Такая правильность в воспроизведении однозначной последовательности аминокислот в белковой цепи детерминируется структурой ДНК того генного участка, который в конечном счете отвечает за структуру и синтез данного белка. Эти представления служат основным постулатом молекулярной биологии, ее «догмой». Информация о будущей молекуле белка перелается в места его синтеза (в рибосомы) посредником информационной РНК (нРНК). нуклеогидныйсостав которой отражает состав и последовательность нуклеотидов генного участка ДПК. В рибосоме строится полппептилная пень, последовательность аминокислот в которой определяется последовательностью нуклеотидов в и PH К, последовательностью их триплетов. Тем самым центральная догма молекулярной биологии подчеркивает однонаправленность передачи информации: только от ДНК к белку с помощью промежуточного звена — нРНК (ДНК -> нРНК -> белок). Для некоторых PH К содержащих вирусов цепь передачи информации может идти по схеме РНК —> и РНК —> белок. Это не меняет сути дела, так как летерм и пирующим, опрс геляюшим звеном здесь является также нуклеиновая кислота. Обратные пути детерминации от белка к нуклеиновой кислоте, к ДНК или РНК неизвестны.
Для того чтобы в дальнейшем перейти к изучению структур клетки, связанных со всеми этапами синтеза белков, нам необходимо кратко остановиться на основных процессах и компонентах, определяющих это явление. . -
В настоящее время на основании современных представлении биосинтезе белкой можно дать следующую общую нрининппал н. схему этого сложного п мпоюшупенчатого процесса (Р,,с ' •
Главная, «командная». роль в определении спепифиче к _ гуры белков принадлежит лсзоксирибонуклсиновоп кисл .ю
Молекула Д| IК представляет собой чрезвычайно ля' (ie[|cjl ещуктуру, состоящую из двух вза11моз.|кручеинчсты. Составными элементами - мономерам» эп. 10ватель-
ре сорта дезокснрпбонуклсогилов. черелован! е
51
ЯДРО
ДНК
ЦИТОПЛАЗМА
Рис. 16. Общая принципиальная схема биосинтеза белка
ность которых вдоль цепи уникальна и специфична для каждой молекулы ДНК и каждого ее участка. Различные достаточно длинные участки молекулы ДНК ответственны за синтез разных белков. Тем самым одна молекула ДНК может определить синтез большого числа функционально и химически различных белков клетки. За синтез каждого одного типа белков ответствен лишь определенный участок молекулы ДНК. Такой участок молекулы ДНК. связанный с синтезом одного какого-либо белка в клетке, часто обозначают термином «пнетрои*. В настоя шее время понятие пнетрон рассматривают как эквивалентное понятию ген. В уникальной структуре гена — в определенном последовательном расположении его нуклеотидов вдоль цени таключепа вся информация о структуре одного соответст вуюшемо белка.
Из общей схемы белкового спите за видно (см. рис. I6), что начальным пунктом, с которого начинается поток информации для биосинтеза белков в клетке, является ДНК. Следовательно, именно ДНК содержи! ту первичную запись информации, которая должна сохраняться и воспроизводиться ог клетки к kacikc. из поколения в поколение.
Кратко касаясь вопроса о месте хранения генетической информатик т.е. о локализации ДНК в клетке, можно сказать следую!пес. Уже давно и звест но. что. в отличие от всех прочих компонентов бе.юкспн тезирующего аппарата. ДНК имеет особую, весьма ограниченную локализацию: местом ее нахождения в клетках высших (эукариотических) организмов будет клеточное ядро. У низших (прокариотических)
52
организмов, ие имеющих оформленного клеточного ядра, ДНК также отмешана от остальной части протоплазмы в виде одного или нескольких компактных нуклеотидных образований. В полном соответствии с этим ядро эукариот или нуклеоид прокариот издавна рассматривается как вместил и ше генов, как уникальный клеточный органоид, контролирующий реализацию наследственных признаков организмов и их передачу в поколениях.
Главный принцип, лежаший в основе макромолекулярной структуры 1ИК. — это так называемый принцип комплемеитар-ности (рис. 17). Как уже упоминалось, молекула ДНК состоит из двух нзаимозакрученпых испей. Эти цепи связаны друг с другом посредством взаимодействия их противолежащих нуклеотидов. При этом по структурным соображениям существование такой дну гяжиой структуры ока зы кается во зможн ым только в том случае, если прошволежа-ишс нуклеотиды обеих пеней бу дут стеричсски комплементарны, т.е. будут своей пространственной структурой дополнять Друг друга. Такими взаимолопол-
Старая Цепь
Новая цепь
\Новая цепь
Старая цепь
Старая цепь
Рис. 17.
сти it схема репликации ДНК
Принцип
коитемснтарно-
някниими — комплементарными - парами нумеониов являются пара А' Т (аденин тимин) и пара Г-Ц (гуанин—цитозин).
Следовательно. согласно этому принципу комплемснтариости. сети в одной цени молекулы ДНК мы имеем Некую последовательность четырех сортов нуклеотидов, то во второй пени послетовательиосгь нуклеотидов будет однозначно детерминирована, так что каждому А первой цепи будет соответствовать Т во второй пени, каждому Т нерпой цени — А но второй непк. каждому Г первой пени И во второй пени и каждому U первой цепи Г во второй пели.
53
Указанный структурный принцип, лежащий в основе двутяжного строения молекулы ЛИК, позволяет легко понять точное воспроизведение исходной структуры, г.е. точное вое произведение информации, записанной в пенях молекулы в виде определенной последовательности из четырех сортов нуклеотидов. Действительно, синтез новых молекул ДНК в клетке происходит только на базе уже имеющихся молекул ДНК. При этом две цепи исходной молекулы ДНК начинают с одного из концов расходиться, и на каждом из разошедшихся однотяжных участков начинает собираться из присутствующих в среде свободных нуклеотидов вторая цепь в точном соответствии с принципом комплс-мснтарности. Процесс расхождения двух цепочек исходной молекулы ДНК продолжается, н соответственно обе цепи дополняются комплементарными цепями. В результате (как видно на рис. 17) вместо одной возникают две молекулы ДНК, в точности идентичные исходной. В каждой получившейся «дочерней» молекуле ДНК одна цепь педиком происходит от исходной, а другая является заново синтезированной.
Необходимо подчеркнуть, что потенциальная способность к точному воспроизведению заложена в самой двутяжной комплементарной структуре ДНК как таковой, и открытие этого, безусловно, составляет одно из главных достижений биолог ни.
Однако проблема воспроизведения (редупликации) ДНК не исчерпывается констатацией потенциальной способности ее структуры к точному воспроизведению своей нуклеотидной последовательности. Дело в том, что ДНК сама но себе вовсе Ис является са.мовоспроизво-дящей молекулой. Для осуществления процесса синтеза — воспроизведения ДНК по описанной выше схеме — необходима деятельность специального ферментативного комплекса, носящего название Д11К полимеразы. Именно этот фермент осуществляет последовательно идущий от одного копна молекулы ДНК к другому процесс расхождения двух цепей с одновременной полнмсри записи на них свободных нуклеотидов но комплементарному принципу. Таким образом, ДНК, подобно матрице. лишь задает порядок расположения нуклеотидов в ситезпрующихся пенях, асам процесс ведет белок. Paonia фермента в ходе редупликации ДПК представляет собой на сегодня одну из наиболее интересных проблем. Верой ню, ДНК-полимераза как бы активно ползет вдоль двутяжной молекулы ДНК oi одною ее конца к другому, оставляя позади себя раздвоенный редуплицированный «хвост». Физические принципы такой работы данного белка пока нс ясны.
Однако ДНК к отдельные сс функциональные участки, несущие информацию о структуре белков, сами непосредственного участия в процессе создания белковых молекул нс принимают Первым малом на пути к реализации этой информации, записанной в цепях ДНК. является так называемый процесс транскрипции, или «переписывания*».
54
в этом процессе ..а одной цеп., ДНК, как на матрице, происходите,,,, тез химически родственного полимера - рибонуклеин™™ ‘ 1
(РНК). Молекула РНК предела,сшеЛобой oZ ХТо “ которой являются четыре сорта рибонуклеотида,, которые пассхшпи. ваются как небольшая модификация четырех сортов летоксирибонхк-леотидов ДНК. Последовательность расположения четырех сортов он бонуклеотилов в образующейся нет, РНК в точности повторяет последовательность расположения соответствующих лезоксирибоиуклео-тидои одной из двух цепей ДНК. Таким путем н>клсотидная последовательность генов копируется в виде молекул РНК. те. информация записанная в структуре данного гена, целиком переписывается на РНК. С каждого гена может сниматься большое, теоретически неограниченное количество таких «копий» - молекул РНК. Эта молекулы переписанные по многих экземплярах как «копии» генов и. стало быть, несущие ту же информацию, что и гены, расходятся по клетке. Они уже непосредственно входят в связь с белокспнтезирующпмп частицами клетки и принимают «личное» участие в процессах создания белковых молекул. Другими словами, они переносят информацию ог места, где она храни гея. в места ее реализации. Соответсгпенно эти РНК обозначают как информационные («РНК) или матричные (мРНК).
Выяснено, что цепь и PH К синтезируется, прямо используя соответствующий участок ДНК в качестве матрицы. Синтезируемая цепь мРНК при этом точно копирует по своей нуклеотидной последовательности одну из двух цепей ДНК (принимая, что урацилу (У) в РНК соответствует его производное тимин (Т) в ДНК). Это происходит па основе тою же структурного принципа комплементарноеги. который определяет редупликацию ДНК (рис. IS). Оказалось, что когда происходит спитез мРН К на Д11К в клетке. то в качес гве матрицы для образования пени мРНК используется лишь одна цепь ДНК. Тогда каждому Г этой цепи ДНК будет соответствовагь И в строя те вся цепи РНК. каждому И uciii) ДНК - Гвцепи РНК. каждому Т цепи ДНК-А висни РНК и каждому А цени ДНК - У в цепи РНК. В „тоге получающаяся цепь PI IК будет строго комплементарна матричной цепи ДН и. следовательно, идентична но после ювателыюсти нуклеоти.ю (принимая Т = У) „торой цепи ДНК. Таким образом проиехаи, ренпсывание» информации с ДНК на РНК, те. транскР‘*"”*’’'_ писанные» сочетания нуклеотидов цепи РНК хже неп ..м111ю_ определяют расстановку соответствующих. кодируем,.
кислот в цеп,, белка. „ ..„.«твеод-
З.чесь, как и при рассмотрен,,,, PCJ>"',1,,MU,l,,l.i ,’,lcJmnuuii пеною и , наиболее существенных моментов прошли яв1Яюшая-Обхолимо указать „а его ФСРМС,,ТЭТ,'"',““ д^яетрасположение нук-ся матрицей в этом процессе, целиком оиред -
55
1Г Ц AIT Ц Ц|Т А Т Г Т А|Т Т TIT Г Г
ДНК ......... '................... " •' ?
(фрагмент)
Полипептид (фрагмент)
мРНК (фрагмент)
й .. 1 .. 1 .. Г TlA Г Г|А " " 1 Т А| । । . и II I Ц А Т|А А -1 » ; А|А Ц Ц
"11 1 1г 1 1 ц а|у ц ц|у А У Г У 1 А 1 У У 1 I’ 1 У| У Г Г1
|| i 11*1 -4—аланил -1— серил —тирозил ч 1 1— валил—) 1 1 1 . । 1 , фенил- I трилто- ! L аланил—L фанил-L
1 1
Рис. 18. Соотношение последовательностей мономеров в цепях ДН К. РНК и бочка
леотидов в синтезирующейся цепи мРН К, всю специфичность образуемой РНК. но сам ход процесса осуществляется особым белком ферментом. Этот фермент называется PH К-полимеразой. Его молекула имеет сложную организацию, позволяющую ему активно продвигаться вдоль молекулы ДПК, одновременно синтезируя цепочку РНК. комплементарную к одной из цепей ДНК. Молекула ДНК. служащая матрицей, яри этом не расходуется и ие изменяется, сохраняясь в прежнем виде и всегда готовая для такого переписывания с нес неограниченного количества «копий» - мРНК. Поток этих мРНК от ДНК к рибосомам и соегавляст тот поток информации, который обеспечивает программирование бело кс мн тезирующего аппарата клетки, всей совокупности ее рибосом.
Таким образом, рассмотренная часть схемы описывает поток информации, идущий от ДНК в виде молекул мРНК к внутриклеточным частицам, синтезирующим белки. Теперь мы обратимся к потоку иного рола - к потоку того материала, из которого должен создаваться белок. Элементарными единицами — мономерами — белковой молекулы являются аминокислоты, которых насчипинается около 20. Д in создания (синтеза) белковой молекулы свободные амннокислопи, присутствующие в клетке, должны быть вовлечены в соответствующий поток, поступающий в белоксин тезирующую частицу, и уже там расставлены в цепочку определенным уникальным образом, диктуемым информационной РНК. Такое вовлечение аминокислот — строительного материала для создания белка — осуществляется путем присоединения свободных аминокислот к особым молекулам РНК опюстелыю не большого размера. Эти РНК, служащие хтя присоединения к ним сво-
56
иРНК
Рис. 19. Схема функционирующей рибосомы боаиых аминокислот, не являясь информационными. несут иную -алапторнмо - функцию, смысл которой будет виден дальше. Аминокислоты присоединяются к одному из концов небольших цепочек трансферных РНК (тРНК). по олной аминокислоте иасшну молекулу РНК. Для каждой такой аминокислоты в клетке существуют свои специфические молекулы адап горных РНК, присоединяющие только эти аминокислоты. В таком навешенном на РНК виде аминокислоты и поступают к бслоксинтсзируюшие частицы.
Центральным моментом процесса биосинтеза белка является слияние этих двух внутриклеточных потоков - потока информации и потока материала в белоксинтедируюшнх частицах клетки. Эти частицы называются рибосомами. Рибосомы представляют собой ультрамик росконическис биохимические «машины» молекулярных размеров, где из поступающих аминокислотных остатков, согласно w ключенному в информационной РНК. собираются специфические белки. Хотя на рис. 19 изображена лишь одна частица, каж^я к-ле»ка сдержит тысячи рнбеом. Количество рибосом определяет ' ’Снсивпость белкового синтеза в клетке. Диаметр одной ри частины около 20 нм. По своей химической природе Р'’1’^ 1 нукпсопротсил: она состоит из особой рибосомной ишесгпый нам класс РНК в дополнение к инфорхыиш» - jro Торным РНК) и молекул структурного рибосомного ос <
57
сочетание нескольких десятков макромолекул образует идеально организованную и надежную «машину», обчадающую свойством нрочиты-Biiib информацию, заключенную в цепи мРНК, и реал и зовать ее в визе готовой белковой молекулы специфического строения. Поскольку существо процесса состоит втом, что линейная расстановка 20 различных аминокислот в цепи белка однозначно детерминируется расположением четырех разных нуклеотидов в цепи химически совсем иного полимера нуклеиновой кислоты (мРНК), то этот процесс, происходящим в рибосоме, принято обозначать гермином «трансляция», пли «перевод», — перевод как бы с чстырехбукненного алфавита ценен нуклеиновых кислот на двалпатибуквекный алфавит белковых (полп-пептидных) цепей. Как видно, в процессе трансляции участвуют все три известных класса РНК: информационная РНК, являющаяся объектом трансляции; рибосомная РНК. играющая роль организатора бслоксинтезирующен рибонуклеопротеплной частицы — рибосомы; в адапторные РНК. осуществляющие функцию переводчика.
Процесс синтеза белка начинается при образовании соединений аминокислот с молекулами адапторпых РНК, или гРНК. При этом сначала происходит энергетическая «активация» аминокислоты за счет ее ферментативной реакции с молекулой аденозин гр и фосфата (АТФ), а затем «активированная» аминокислота соединяется с концом относительно недлинной цепочки гРНК, приращение химической энергии активированной аминокислоты запасается при этом в виде энергии химической связи между аминокислотой и тРНК.
Одновременно с этим решается н вторая задача. Дело втом, что реакцию между аминокислотой и молекулой тРНК ведет фермент. обозначаемый как аминоацил-тРНК-спнтстаза. Для каждой из 20 аминокислот имскнся свои особые ферменты, осуществляющие реакцию с участием только данной аминокислоты Таким образом, существует нс менее 20 ферментов (аминоацнл-тРНК-сннтетаза). каждый из которых специфичен для одной определенной аминокислоты. Каждый из этих ферментов может вести реакцию не с любой молекулой тРНК, а лишь с теми, которые несут строго определенное сочетание нуклеоти дов в своей цепи. Таким образом, благодаря существованию набора столь специфических ферментов, различающих, с одной стороны, природу аминокислоты и, с друзой - нуклеотидную последовательность тРНК, каждая из 20 аминокислот оказывается «приписанной» только к определенным гРНК с данным характерным нуклеотидным сочетанием.
Схематически некоторые моменты процесса биосинтеза белка, насколько мы их представляем на сегодняшний день, даны на рис. 19. Здесь прежде всего видно, что молекула информационной РНК соединена с рибосомой или, как говорят, рибосома «запрограммирована» информационной РНК. В каждый данный момент непосредственно в
58
самой рибосоме находится лишь относительно короткий отпетое не.... мРНК. Но именно этот отрезок при участии рибосомы мож^взд J действовать с молекулами адаптерных РНК. И здесь снова главХ роль играет принцип комплемситарностп. ’
В этом и состоит объяснение механизма того, почему данному три нлету цени мРНК соответствует строго определенная аминокислота Необходимых, промежуточным звеном, или адаптером. при «узнавании-. каждой аминокислотой своего триплета на мРНК является этап-торная РНК (тРНК).
Fla рис. 19 видно, что в рибосоме помимо молекулы тРНК с навешенной аминокислотой находится erne одна молекулатРНК. Но. вот-тичпе от рассмотренной выше молекулы тРНК, ла молекула тРНК своим конном присоединена к концу находящейся в процессе синтеза белковой (полипептиднон) пеночки. Такое положение отражает динамику событий, происходящих в рибосоме в процессе синтеза белковой молекулы. Эту динамику можно представить себе следующим образом. Начнем с некоего промежуточного момента, отраженного на рис. 19 и характеризующегося наличием уже начавшей строиться белковой цепочки, присоединенной к ней тРНК и только что вошедшей п рибосому и связавшейся с триплетом повой молекулы тРНК с соответствующей ей аминокислотой. По видимому. сам акт присоединения молекулы тРНК к расположенному в данном месте рибосомы триплету мРНК приводит к такой взаимной ориентация и тесному контакту между аминокислотным остатком и строящейся цепью белка, что между ними возникает ковалентная связь. Связь возникает таким образом, что конец строящейся белковой цепи (на рис. 19 присоединенный к тРНК) переносится от этой гРНК на аминокислотный остаток поступившей аминоацпл-тРНК. В результате «правая» тРНК, сыгран роль «донора», окажется свободной, а белковая цепь - переброшенной на «акцептор», т.е. па «левую» (поступившую) axiinioauiu-iРНК. В итоге белковая цепь окажется удлиненной на одну аминокислоту и присоединенной к «левой» тРНК. Вслед за этим происходит пере ро ска «левой» тРНК вместе со связанным с ней триплетом’,'К''1СО™Д^ мРНК вправо, т01да прежняя «донорная» молекула т ока ж т вытесненной отсюда и уйлст из рибосом. На ее месте1 появигс ‘ тР11К со с троящейся цепью белка, удлиненной на о ши а'”” f ПЫ1! остаток, а цепь мРНК будет нроашшута относигель о I R На один триплет вправо. В результате продвижения |1р11_
<ЗД|||| TPIIIU1L-1 вправо в рибосоме появится е.1с.туюШ1Шк. - ||(|[||П)
п-шт (УУУ). „ к „ему "емсТЛС..ИО присоедпнится соответствующая гРНК с ам , (пептш|вой)
«ни-тРНК). Эго опять вызовет ...... K'ireL,\"T ‘™ татеоц в
-.....-0-рояи.ебся цепью бе^ифе==^со(се.
вслед за этим продвижение цепи mF НК на од
59
мн вытекающими отсюда последствиями и т.д. Таким путем осуществляется последовательно, триплет за триплетом, протягивание цепи информационной РНК через рибосому, в результате чего цепь иРНК « прочитывается» рибосомой целиком, от начала до конца. Одновременно и сопряженно с этим происходит последовательное, аминокислота за аминокислотой, наращивание белковой цепочки. Соответственно в рибосому одна за другой поступают молекулы тРНК с аминокислотами и выхолят молекулы тРНК без аминокислот. Оказываясь в растворе вне рибосомы, свободные молекулы тРНК снова соединяются с аминокислотами и опять несут их в рибосому, сами же, таким образом. циклично обращаясь без разрушения и изменения.
Глава 4
МОРФОЛОГИЯ ЯДЕРНЫХ СТРУКТУР
Роль ядерных структур в жизнедеятельности клетки
Приведенный в главе 3 краткий обзор основных процессов, евя зап-ных с синтезом белка, в принципе одинаковых у всех форм живого, указывает на особое значение клеточного ядра. Ядро осуществляет тве руины общих функций: одна из них — хранение генетической информации, другая — ее реализация, обеспечение синтеза белка.
В первую группу входят процессы, обусловливающие поддержание наследственной информации в виде неизменной структуры ДНК. Эти процессы связаны с наличием так называемых репарационных ферментов, ликвидирующих спонтанные повреждения молекулы ДНК (разрыв одной и з цепей ДПК часть радиационных повреждений), что сохраняет строение молекул ДМ К практически неизменным в ряду поколений клеток или организмов. Далее в ядре происходят воспроизведение, или редупликация, и разъединение (сегрегация) молекул ДНК, что дает возможность двум клеткам получить совершенно одинаковые и в качественном и количественном смысле объемы генетической информации. В ядре эукариот происходя г процессы изменения и рекомбинации генетического материала, что наблюдается во время мейоза (кросс ин говор) Наконец, ядра непосредственно участвуют в процессах распределения молекул ДНК при делении клеток.
Другой !руиной клеточных процессов, обеспечивающихся активностью ядра, является создание собственного динара га бочковою синтеза. Это не только синтез (транскрипция) на молекулах Д11К разных информационных РНК. но также транскрипция всех видов трансферных РНК и рибосомных РНК. В я j.pax эукариошческих клешк происходит «•созревание» (процессинг, сплайсиш) первичных транскриптов.
60
В ядре эукариот образуются также субъединицы рибосом путем комп локирования синтезированных в ядрышке рибосомных РНК с рибо-сочными белками, которые синтезируются в цитоплазме и переносят ся в ядро. Таким образом, ядро представляет собой не только вмести -лише генетического материала. но ц структуру, где этот материал воспроизводится и функционирует. Поэтому выпадение или нарушение любой из перечисленных выше функции гибельно для клетки в целом. Так. нарушение репарационных процессов приведет к изменению первичной структуры ДПК и автоматически к изменению структуры белков. Эго непременно скажется на их специфической активности которая может просто исчезнуть или измениться так. что не будет обеспечивать клеточные функции, в результате чего клетка погибает. Нарушения редупликации ДНК приведут к остановке размножения клеток или к появлению клеток с неполноценным набором генетической информации, чго тоже гибельно для клеток. Такой же результат будет наблюдаться при нарушении процессов распределения генетического материала (молекул ДНК) при ледеини клеток. Выпадение в результате поражения ядра или в случае нарушений каких-либо регуляторных процессов синтеза любой формы РНК автоматически приведет к остановке синтеза белка в клетке или к грубым его нарушениям.
Все это указывает на ведущее значение ядерных структур в процессах, связанных с синтезом нуклеиновых кислот и белков - основных функционеров в жизнедеятельности клетки.
Необходпмо еще раз подчеркнуть, что функционирование ядра как системы хранения и реализации генетической информации неразрывно связано с другими функциональными системами клетки, которые обеспечивают работу ядра специальными белками. потоком предшественников. энергией и пр.
Ядерные компоненты прокариот
Как уже f сворилось. клетки царства прокариотических. 11 ядерных», организмов не имеют обособленного клеточного ядр^ ~ нако у всех прокариотических клеток есть аналог ядра эукар|ю. рый носи г название нуклеоид, или нуклеоплазма. Чт0Он
можно отнести к собственно ядерным структурам из-за н • сан-ржи, ДНК Нуклеоид достаточно четко выя“'|я^y^alv фс..|Ь микроскопии после специфической окраски на Д
'сна или при окраске флуоро.хромамн. Ею можно на л < C11HCJ1..
'"ью фаюно-кои грае, иого усi ропстна у крупных оак'|ЯН11С в Сре-'CHI.IX волоросасй как темное и более контрастное о прмстав-ДИиной части клетки. На ультратонких срезах тона i ну j |( ,и)
ленатонкпмп рыхлыми сетями фибрихчтапшню i -
Ы
Рис. 20. Бактериальный нуклеоид на срезе клетки Propionihuclerium shennanii
I - н> клеена; 2- плазмагнчсская мембрана; 3 - рибосомы
Эта зона нуклеоида, или нуклеоплазмы. на ультра! он ких срезах свободна от других структур и вьнлядмт более светлой по сравнению с окружающей цитоплазмой, заполненной рибосомами. различными гранулами и мембранами. Иногда на срезах можно наблюдать контакты фибрилл нуклеоида с плазматической мембраной, с ее выростами. Нуклеоиды бактерий .можно выделить, их состав и структура изучены довольно подробно. Они на 80% состоят из ДНК, остальные 20% приходятся па различные белки и РНК.
Количество ДНК в прокариотических клетках значтсльно меньше, чем в клетках эукариот. Например, бактерия £. coli содержит 5-Ю’3 иг1 ДНК. которая кодирует около 2000 генов, в то время как в ядре клетки человека содержится около 6 пг ДНК. что соответствует oi ром-ному (10s) числу генов.
При анализе радиоавтографов меченых молекул ДНК в световом микроскопе было обнаружено, что бактериальные ДНК имеют кольцевую структуру. У Е. coll периметр такого кольца составляет около 1,6 мм. Считается, что на клетку при ходится одна гигантская циклическая молекула
ДНК, одна бактериальная хромосома. или 1снофор, с молекулярной массой 4-Ю9 Ла. Самая маленькая бактериальная хромосома обнаружена в клетках микоплазмы — 0.25 мм (для сравнения, длина ДНК на одну хромосому эукариотической дрож женой клетки составляет около 4,6 мм, а у человека 40 мм (!)).
У ряда бактерий, например у /1 subiilis, имеется ол двух до девяти одинаковых молекул ДНК и соответственно несколько нуклеоидов. В ipyi их случаях (Azorobaclervinelandii) около 40 хромосом органы зовам ы
в один нуклеоид.
1 Единицы измерения ДНК: пг — 1-10 12 г. Да 1.67 24 г. Расстояние между нуклеотидными парами равно -0,34 нм.
62
С помощью ралпоавтографп-ческой методики также обнаружено. что репликация такой кольцевой хромосомы у £ coli начинается на а той исходной (origin) точке репликации, при ком образуются лис репликаци-ониые вилки, которые по мере синтеза ДНК движутся вдоль молекулы до терминальной, конечной точки (рис. 21). Вся такая гигантская молекула Д11К представ-
Рис. 21. Репликация хромосомы £. call
/ - исходная Д Fl К колъисиой хромосомы;
2, J вилки рспликапии; 4 - вновь синтезированные участки
:а связаны с плазматической мемб-
ляет единицу репликации - репликой. Скорость репликации у бактерии составляет около 30 мкм в минуту, что согласуется со временем удвоения клеток, равным около 40 мин.
Бактериальные хромосомы все
раной через специфические мембранные белки, которые взаимодействуют с ДНК в зоне старта ее синтеза (рис. 22). В процессе клеточно-
го деления существенных изменений в компактности нуклеоплазмы
не наблюдается, в отличие от эукариотических хромосом.
Такие кольцевые молекулы ДНК бактерий были получены при полном удалении белков (депротеинизация). Если же изучать выделенные целые нуклеоиды бактерии, го они представляют собой тела, состоящие из многочисленных суперснирализованных петель ДНК.
ходящих от плотной центральной области (рис. 23). В одну такую петлю, или домен, входит до 10—15 мкм ДНК. или около 40 000 п.н., а
всего таких петель около 120. ,
Обработка вы (елейных нуклеоидов РНКазой и протеса i
МИ ферментами приводит к разрыхлению ,1С1|Трм1’но,\<*’1’^’1г>а,.||'за.
Леоплон, а короткая обработка ДНКазой - к снятию спер.
2 2 2
Рис. 22. Сия 1Ь хромосомы бактериальной клетки е гпазма т ’М>°я<комасвизыпае1сяе мембраной в (очке налам рсп.н'К. ^аин '“«оинма I -Д|1К хромосомы пр ктеоюы): 2 тонко на-г-ма |К
всего «СТ04*
63
Рис. 23. Модель конденсации бактериальной хромосомы (Зенгб)ш. 1982) а кольисвэя хромосома: б - белковые сшивки образуют пепсине иомены: fr -снфхснмра.|имиия доменов; гм д - различные формы 1ско>К1снсаним нуклеоида
ими петель и деком пактизании всего нуклеоида. Таким образом, было показано, что компактизания нуклеоида связана с наличием связок, содержащих РНК и некоторые белки. Гигантская кольцевая молекула -хромосома - с помощью РНК и белков многократно складывается. образуя многочисленные петли. ДНК которых подвергается свсрхепира-лизании, что приводит к значительной комнакгизации всего комплекса, который и представляет собой нуклеоид. Степень компактизапии ДНК в нуклеоиде бактерий достигает 1000 крат, а концентрация ТНК доходит до 10 мг/м । (!). Необходимо подчеркнуть, что часть ДНК нуклеоида связана с небольшим числом специальных основных белков, отличных от гисгонов эукариот. Одна молекула одного и з таких белков (Н NS) приходится на400 п.н. ДНК. С петлями ДНК нуклеоида связано большое число молекул различных сии тезируемых РНК и рибосом. которые обнаруживаются по периферии нуклеоплазмы.
Одна и з моделей организации нуклеоида предполагает, что центральная его часть представлена неактивной и стзерхспирализованной ДНК.
64
тогда как по его периферии расположены деспнралпзованныс петли, на ко_ торых происходит синтез различных РНК (рис. 24).
Отличительной чертой ялерных структур прокариот является то, что у них синтез 1’11К и сип гез белка могут происходить одновременно: рибосомы связываются с еще не до копна синтезированными молекулами иРНК II производят на них синтез белка. Таким образом, возникает тройственный синтетический комплекс: ДНК - синтезирующая цепь НК рибосомы с синтезируемой
ПО.П1ПСПТИЛЦОЙ цепочкой (рис. 25) Такая ситуация возможна лишь в том случае, когда образующаяся молекула иРНК нс подвергается дальнейшей модификации тина процессинга. характерного для эукариотичс-<СМ-яалес’- У прокариот, акнм образом, процессы траискрип-и трансляции не разобщены тср-го о™',аЛЫЮ' “ Т° Нрсм” как У э>'ка-поот1-. еСК1,Х KJIe,0K эт" Процессы меню "°Т. " ЛВ)Х Раз,,ых компарт-ялспц4 ₽^вдсленных специальной серпом ооолочкой.
^ого мате ЛСПИИ КЛеткн 11 стечение клеточного никла поведение ядер-К1ст ^И<и,а пРокаР”от отличается от такового эукариот.
деления К14” Ц,,КЛ это вРемя существования клетки отделения до лит то ,К 'ЖС *’ка5Ыв;иось» деление всех типов клеток происхо-Лсления^? ПОС;,С ^лвое,,,,я ДНК. У бактерий часто сам процесс раз-ДНк т ТС М КЛСТК|1 ~ пигогомия - нс связан с окончанием синтеза “Торой К КЯК Л° ,1аст-'ш,с,,ня клеточного деления может начаться беспр- 1,111 Д<1ЖС ’Ре1,|й раунд репликации ДПК. В резуз!ьтате такого Разде, ° с’йнте ДН К в быстро ()аст\тних куль гурах на каждую
Д«ШаясВ1,,’,|<>СЯ Клетк- ириходнтся одна кольцевая хромосома, нако-(Рис 26)1 HU ,,ромеж>'ТОЧнмх стадиях ее дальнейшего удвоения Ди г ч-. ’ Т‘С КаЖДая дочерняя клетка сразу после деления ужесатер-
‘Сгнчно реплицированный геном.
Рис. 24. Схема организации нуклеоида бактериальной клетки 1 - петлевые домены ДНК; 2- рибосомы на вновь синтезированных молекулах нРНК: J - рибосомы нито-л квмы
65
3
Рис. 25. Одновременная транскрипция иРНК и синтеза белка на участке бактериального нуклеоида
1 - ДНК: 2 - PH К-полимераза; 3 - иРНК, 4 - рибосома; 5 - полииеитил
Рис. 26. Повторная реп чикания бактериальной хромосомы при интенсивном размножении клеток
а исходная хромосома; б •цктмчно реплицированная хромосома (I раунд репликации»: в инициация синтеза ДНК во 11 pay и те репликации; О - точки начала репликации (on). Стрелки указывают па реи лика и ио иные вилки
При делении бактериальных клеток не происходит особой конденсации ДНК в составе нуклеоида. По мере роста клетки в длину зона нуклеоида после синтеза ДНК увеличивается, а затем делится с помощью специальною механизма. Обособление и разъединение двух дочерних хромосом связано с расхождением мест прикрепления хромосом к плазматической мембране (см. далее).
66
Ядро эукариотических клеток
Термин «ялро» впервые был применен Брауном в 1833 г. для обозна чсния шаровидных постоянных структур в клетках растений Позднее такую же структуру описали во всех клетках высших организмов
Ядсрный аппарат эукариотических клеток имеет ряд отличий от прокариотических. Во-первых, ДИК-содержашнй компонент отделен от цитоплазмы специальной оболочкой (ядерпая оболочка), во-вторых. количество ДН К в ядрах эукариот в тысячи раз больше, чем в составе нуклеоидов бактерий, в-третьих. ДНК эукариот представляет собой сложный нуклеопротеидный комплекс, образующий спецназы-ную структуру — хроматин, из которого и состоят эукариотические хромосомы. Далее, и состав ядер эукариот входят несколько физически не снизанных хромосом, каждая из которых содержит одну линейную i in антскую молекулу ДНК. Каждая хромосомная ДНК представляет собой полпрепликонную структуру, т.е. содержит множеств автономно реплицирующихся участков. Синтез и образование транскриптов эукариотических клеток сопровождаются процессами вторичной их перестройки, «созревания», включающей в себя как фрагментацию (процессинг), так и сращивание отдельных фрагментов ДНК (сплай-сиш). Наконец, в ядрах ие происходит синтеза белков, т.е. в эукариотических клетках процессы синтеза ДНК и РНК разобщены от процесса синтеза белков.
Клеточное ядро, обычно одно на клетку (есть примеры .многоядерных клеток), состоит из я черной оболочки, отделяющей его от цитоплазмы, хроматина, ядрышка и других продуктов синтетической активное iи. ядерного белкового остова (матрикса) и кариоплазмы (или ядер-ного сока) (рис. 27). Эти основные компоненты встречаются практически во всех неделящихся клетках эукариотических одно- или многоклеточных организмов.
Главный компонент ядер - хроматин, является стр} кт}'рой. выпота няющей генетическую функцию клетки, в хроматиновой Д зало жена практически вея генетическая информация. Ядерпая .кика выполняет сложную барьерно-рецепторную, а также транспорт»}ю и каркасную функции. Нехроматнновый ядерный белковый рикс) обеспечивает не то сом в ядре, но и ччаствуе : хромосомных участков, клеточных рибосом, ян.т хроматином и матриксом и.тныс с|руктуры. солерж компонентами заключена в которой протекают многое нроимл.'». -- р,.~
болнзмом. так и с внутрия терным транспортом оелко
67
, В ИХ Ф>НК11ПОШЫЫ1ОЙ УКТ11Н11ОСТИ. Одним из от.резедяюшпх синтез рРНК и обра=е ястся ядрышко. Кроме того, я ядре наряд) с обнаруживаются различные ршишукчеопро ашпе разные тины РНК. Между всей ™' , жидкая Фаза клеточного ядра - Wиоюазв, __________.. .-«я «иные как с ядерным мега
9
Рис. 27. Схема строения клеточного ядра
7 ядерная оболочка (две мембраны - внутренняя и внешняя, и перинуклеарное пространство); 2 - ядерная пора; 3 - конденсированный хроматин. 4 лнфф) шый хроматин; 5 - ядрышко (гранулярный и фибриллярный компоненты, в центральных светлых зонах находится рДНК); 6 интерхроматиповые ранулы (РНПк 7
псрихроматиновые транулы (РНП); S - нсрихромдтиноиыс фибрины (РИП); 9-кариои тазма, ядерным сок
При наблюдении многих живых клеток, особенно растительных, или же клеток после фиксации и окраски внутри ядра выявляются даны плотного вещества, которое хорошо окрашиваю гея разными красителями, особенно основными. Благодаря этому свойству выявленный компонент ядра получил название «хроматин» (Флеммиш, 1880). Способность хроматина воснринимаи. основные (щелочные) красители указывает на его кислотные свойства, которые определяются тем, чго в состав хроматина входит ДНК в комплексе с белками. Такими же свойствами окрашиваемое!и и содержанием ДНК обладают и хромо сомы, которые можно наблюдать во время митотического деления клеток.
В отличие от прокариотических клеток ДНК-еолсржаишй материал хроматина эукариот может пребывать в двух альтернативных состояниях: деконденсированном в ингерфазс и в максимально уплотненном во время ми юза. в составе митотических хромосом.
68
Рис. 28. Структурные типы ядер
а аиффушым: б - хрочоиентричсскнй; в хромонемнын; г - хроминсмно-хромоненгричсскпй; Э - хромосомный; с - ялрос ншитснными хромосомами
В неделя шнхся (интерфазных) клетках хроматин. выявляемый с помощью светового микроскопа, может равномерно заполнять объем ядра пли же располагаться отдельными сгустками (хромопсктры). Нередко он особенно четко обнаруживается на периферии ядра (пристеночный, маргинальный. нримембранный хроматин) пли образует внутри я ipa переплетения довольно толстых (около 0,3 мкм) и длинных тяжей в виде внутриядерной сети. Такие ядра часто встречаются в
клетках растений (рис. 28-30).
Хроматин интерфазиы.х ядер представляет собой несущие ДНК тельца (хромосомы), которые теряют в это время свело компактную Форму, разрыхляются. лекоплснспруются. Степень такой декомпенсации хромосом может быть различной в ядрах разных клеток. Когда хромосома или се участок полностью декондснснрованы. эти зоны на зывают диффузным хроматином. При неполном разрыхлении хромо сом в интерфазном ядре видны участки конлевенровавното хроматина (иногда называемого гетерохроматином). Многочисленными ра ми показано, что степень декоиденсацип хромосомного материя, к хроматина, в интерфазе может отражать функциональную ьгр . Ж)й структуры. Чем более диффузии хроматин . И1(^
тем выше в нем синтетические процессы. Так. в кле'<»• - ^еточ||ого хроматин обра зует значительные скопления по перифер
69
Рис. 29. Ультраструктура иитерфа тных ядер
а ядро аиффу шо| о типа (клс i кд кули) ры ткани почек); б ядро хромонс.мпо1 о i ина (корешок пророс ска лиса) ЯК ядрышко; Я О ялерная оболочка: XII - хромонсма
70
и
Рис. 30. Улырас1р\ктда11нгерфазных>иср фрагмент ипангсм*
° v гыpaiuiiкии срез хромосомного яцм эньк ядрышко; ЯО
иолитенной хромосомы ядра слюнной железы ’2,-оиыс >‘«aw<K»t'М’ОмОСОМ ялерндя оболочка; Д хроматиновые диски; МД чежли
71
ядра. При стимуляции этих клеток к синтезу ДНК но мере включения предшественника ДНК тимилнпа происходит постепенная декомпенсация хроматина. Таким же образом меняется структура хроматина при синтезе РНК. Падение синтеза ДНК и РНК в клетках обычно сопровождается увеличением зон конденсированного хроматина. В эритроцитах низших позвоночных практически весь хроматин ядер находится в конденсированном состоянии, и в этих ядрах не происходят синтеза пи РНК, ни ДНК. Если же ядра этих клеток стимулировать к синтезу РНК. например в гетерокарионах (см. далее), то они переходят в диффузное состояние.
Максимально конденсирован хроматин во время митотического деления клеток, когда он обнаруживается в виде телец - хромосом. В этот период хромосомы не несут никаких синтетических нагрузок, в них не происходит включения предшественников ДНК и РНК.
Исходя из этого, можно считать, чго хромосомы клеток могут находиться в двух структурно-функциональных состояниях: в рабочем, частично или полностью деконлсцсированиом. когда с их участием в интерфазном ядре происходят процессы транскрипции и редупликации, и в неактивном — в состоянии метаболическою нокоз! при максимальной их конденсации, когда они выполняют функцию распределения и переноса генетического материала в дочерние клетки.
Эухроматин и гетерохроматин
М пожми исследователями было отмечено, что степень структуризации, конденсации хроматина в интерфазных ядрах может быть вы ражена в разной мере. Так, в интенсивно делящихся и в мало специализированных клетках ядра имеют диффузную структуру, в них кроме узкого периферического ободка конденсированного хроматина встречается небольшое число мелких хромоцентров, основная же часть ядра занята диффузным, деконденсированным хроматином. В то же время в высокоспециализирован пых клетках или в клетках, заканчивающих свой жизненный цикл. хроматин представлен в виде массивного периферического слоя и крупных хромоцент ров, блоков конденсированного хроматина. Такую структуру имеют, например, ядра нормо-бластов (одна из стадий дифференцировки эритроцитов), ядра зрелых лейкоцитов. Эти два примера могут иллюстрировать обшее правило: чем больше в ядре доля конденсированного хроматина, тем меньше метаболическая активность ядра. При естественной или экспериментальной инактивации ядер происходит прогрессивная конденсация хроматина и, наоборот, при активации ядер увеличивается доля диффузного хроматина.
Однако при метаболической активации не всякие участки кончен сированного хроматина могут переходить в диффузную форму. Еше в
72
начале 1930-х голов Э. Гейтием было замечено, что в интерфазных я„ рах существуют постоянные участки конденсированного хромаХ наличие которого не завися от степени Диф^реипироваиности ткЯ ни или от функциональной активное™ клеток. Такие участки получи ли название гетерохроматина, в отличие от остальной массы хромат „а - гухроматииа (собственно хроматина). По этим представлениям гетерохроматин - компактные участки хромосом, которые в профазе появляются раньше др) гих частей в составе митотических хромосом и в телофазе не декомпенсируются, переходя а ннтсрфазное ядро в виде интенсивно красящихся плотных структур (хромоиентров). Первоначально понят не гетерохроматина имело сугубо морфологическое значение, потому что при изучении препаратов окрашенных ядер нельзя знать, может ли данный участок конденсированного хроматина - хро-чоцеитр - перейти в будущем в разрыхленное, эухроматическое состояние или нет. В связи с этим в специальной цитологической литературе часто без всякого основания любой участок конденсированного хроматина стали называть гетерохроматином. Провесе обшей кон депсаиии хроматина, например в ядрах лейкоцитов, называли гетеро-хроыатизаиией я (ер. На самом же деле в составе ядерного хроматина только лишь некоторые участки практически никогда не теряют особого ко1>лснсцровациого состояния. Такими постоянно конденсированными зонами чаще всего являются центромерные и теломерные участки хромосом. Кроме них постоянно конденсированными могут быть некоторые участки, входящие в состав плечей хромосом - вставочный, или иитеркалярпый, гетерохроматин. который в ядрах также представлен в виде хромоцентров. Такне постоянно конденсированные участки хромосом в интерфазиых ядрах сейчас принято называть ког1етип1иш1Ы.м (постоянным) гетерохроматином. Необходимо отметить, что участки конститутивного гетерохроматина обладают целым рядом особенностей, которые отличают его от остального хроматина. Конститутивный гетерохроматин генетически не активен, он не транскрибируется, реплицируется позже всего остального хроматина, в его состав входит особая (сателлитная) ДП К. обогащенная высок повторяющимися последовательностями нуклеотидов (см ла. ее .. локализован в центромерных, теломерных и шгтеркаляриых зон . . готических хромосом. Доля конститутивного хроматина можс «еатипаковой у разных объектов. Так. у млекопитающих н. приходится 10 15% всего генома, а у некоторых амфиби''
60% Функциональное значение конститутивного геТС[*\ фхик-когща нс выяснено. Предполагается, что он несет ря TVphJa-чий, связанных со спариванием гомологов в МС1,°*’ ^..„йииямн. пней иитерфазпого ядра, с некоторыми регулятор" • менягьсте-
Вся остальная, основная масса '<>’омаг""а^Хииоиаяьной актив-пень своей компак?изаппи в зависимости от Ф)
73
кости. она относится к эухромагииу. Эухроматическнс неактивные хчасткн. которые находятся в конденсированном состоянии, стали называть факуяыагивпым гетерохроматином, подчеркивая необязательность такого его состояния. Хорошим примером факультативного гетерохроматина может служить Х-хромосома в организме человека. В клетках мужской особи X-хромосома ле конденсирована, она активна, транскрибируется и морфологически не выявляется из-за своего рыхлого, диффузного состояния. В клетках женского организма, где присутствуют две X хромосомы, одна из них находится в активном, диффузном состоянии, а вторая - в неактивном, конденсированном и временно гетерохроматнзована. В этом состоянии она может существовать в течение всей жизни организма. Но потомки ее. попадая в клетки мужского организма следующего поколения, снова будут активированы.
В дифференцированных клетках всего лишь около 10% генов находится в активном состоянии, остальные гены инактивированы и входят в состав конденсированного хроматина (факультативный гетерохроматин). Это обстоятельство объясняет, почему большая часть хроматина ядра структурирована (табл. I).
Таблица I
Сравнительные характеристики эухроматичсских и 1стерихроматичсских районов интерфа шых хромосом
Показатель Эухроматин Гетерохроматин конститутивным
активный нсактинный (факуль гагикный гетерохроматин)
Структура Диффузный Кончснсиро ванный Конденсированный
Синтез РНК +
Смите! ДНК + + Поздняя репликация
Тип нуклеотидных Уникальные. Уника 1ьныс, Высокоцен горя ю-
последовательное - умеренные у меренные шаяся. сателлит-
геи ДН К повторы повторы пая ДПК
Локализация Плечи Плечи Центромера,
хромосом хромосом теломера, интерка-лярный гетерохроматин
74
Хромосомный ЦИКЛ
как известно, половые женские н мужские клетки несутодинап ный набор хромосом и, следовательно, содержат в 2 раза меньше ДНК чем все остальные клетки организма. Половые клетки (сперматозоид и оолиты) с одинарным набором хромосом называют гавлоимычи Плондность (от грен, ploos - кратность) обозначают буквой в Так метки с 1/1 - гаплоидны. с 2п - диплоидны, с Зи - тринлоидны и тд Соответственно количество ДН К на клетку (с) зависит от ее плондно-сти: клетки с числом хромосом 2и содержат 2с количества ДНК. При оплодотворении происходит слияние двух клеток, каждая из которых несет 1л набор хромосом, поэтому образуется исходная ипстоидвая (2л. 2с) клетка — зигота В дальнейшем в результате деления липлоид-ной зиготы и последующего деления диплоидных клеток разовьется организм. клетки которого, кроме половых. будут диплоидными.
Однако мы знаем. 41 о процессу деления клеток предшествует фаза синтеза - редупликации ДНК, что должно приводить к появлению клеток с количеством ДНК 4с. у которых количество хромосом 4л. т.е. в два раза больше, чем у исходной диплоидной клетки. И только после деления такой тетрандоидной (4с) клетки снова возникнут две исходные диплоидные клетки.
В ядрах ннтерфазных клеток выявить тела хромосом с помошью .морфологических методов очень трудно. Собственно .хромосомы как четкие, плотные, хорошо видимые в световой микроскоп тела выявляются только незадолго до клеточного деления. В самой же интерфазе хромосом как плотных тел не видно, так как они находятся в разрыхленном состоянии. В ипгерфазс происходит удвоение. релуняикаиня хромосом. Этот период характеризуется синтезом ДНК, он называется синтетическим, или S-перполом. Как раз в это время в клетках обнаруживается количество ДНК большее, чем 2с. После окончания S-не-риода к ат и честно ДНК в интерфазном ядре равно 4с. ибо произошло полное удвоение хромосомного материала. Однако микросколи !ески регистрировать удвоение числа хромосом па этой стадии не всыла ется. Собственно хромосомы как нитевидные плотные тела нами обнаруживаться микроскопически в начале процесса делен»!• а именно в профазе ми готического деления клетки (рис. -Пытаться подсчитать число хромосом в профазе, то и* к0 ™ '
1ст равно 2л. Но это ложное впечатление, потому чго в п
2*”‘ ИЗ хромосом двойная в результате их спира-
НИИ пара .хромосом тесно соприкасается др}i с яр- • двОйствен-,и зхясь одна относительно яругой, но этому трудно, • поегь всей структуры в целом. Позднее хромосомы ’’ 10сТьхромо-‘1инают обосабливаться, раскручиваться- Такая дно .1ГХ)фазЫ. ко-сом в митозе наблюдается даже у живых клеток в к
75
Рис. 31 Схема стадий митотического деления клетки
а — интерфаза; б профаза; в - меифаза.г — анафаза; д ~ ранняя телофаза; е - поздняя тстофаза. начало реконструкции ядер
гда видно, что общее число хромосом в такой начинающей делиться клетке равно 4//. Следовательно. уже в начале профазы хромосомы состоят из двух сестринских хромосом, или, как их еше называют, хроматид.
И в профазе, и в следующем периоде деления клетки — в метафазе - сестринские хромосомы остаются связанными друге другом в виде пары. В метафазе происходит выстраивание хромосом в экваториальной плоскости клетки и окончательное их разъединение. И в профазе и в метафазе клетки остаются тетра-плоилными.
В анафазе идет расхождение каждой из хромосом данной пары к противоположным полюсам клетки, после чего тело исходной клетки начинает делиться. Затем н телофазе разошедшиеся диплоидные (2л) наборы хромосом начинают дсконденсироваться. Отдельные хромосомы теряют свои четкие очертания. и теперь уже внутри нового ннтерфазного диплоидного ядра с 2с ДИК трудно у шать хромосомы. которые мы могли видеть во время митоза. Так заканчивается один хромосомный цикл к начинается следующий.
Общая морфология митотических хромосом
Хромосомы всех эукариотических клеток построены но одному плану. Они включают в себя три основных компонента: собственно тело хромосомы (плечо), теломерный, конечный участок и нентроме ру. Наиболее просто устроены хромосомы дрожжевых клеток: па юч
76
ковилное тело хромосомы на од-ном конце имеет теломеру, а на другом - центромеру. Хромосомы животных и растении также представляют собой палочковидные структуры разной длины с довольно постоянной толщиной, но обычно имеют два хромосомных плеча, соединенных в зоне центромеры. Эта зона называется первичной перетяжкой. Соответственно оба плеча .хромосомы оканчиваются теломерами ( рис. 32). Хромосомы с равными пли почти равными плечами называют метацентрическими. с плечами неодинаковой длины — суомеiацентрическими, палочковидные хромосомы с очень коротким, почти незаметным вто-
Рис. 32. Схема .морфологии метацентрических (d), субметаневтри-ческих (о). акроцентрических (тс-лоцснтричсских) (в) и епугничных (ядрышковых) (г) хромосом
Т - теломеры: И центромеры (первичные перетяжки): ЯОР - ядрышковый организатор (вторичная перетяжка)
рым плечом - акроцентрическими.
В области первичной перетяжки (центромеры) расположен кинсго-\ор пластинчатая структура, имеющая форму диска. К нему подходят пучки микротрубочек митотического веретена, идущие в направ-ленцц к иептрполям. Эти пучки микротрубочек принимают участие в движении хромосом к полюсам клетки при митозе.
Обычно каждая хромосома имеет только одну центромеру (моно-иентрнчсские хромосомы), но могут встречаться .хромосомы дниеит-рические п полицентрические, т.е. обладающие множественными кп-нето.хорами.
В зоне первичной перетяжки присутствует особая, центромерная, сателлитная ДНК, отличающаяся высоким уровнем повторенности нуклеотидных последовательностей.
Некоторые .хромосомы имеют вторичную перетяжку. СХ'11'ДН”> обычно расположена вблизи дистального конца хромосомы и Ст маленький участок - спутник. Вторичные перетяжки «азы|к’“ 11 Яфышковыми организаторами. так как именно на ззиху ыстк мосом и интерфазе происходит образопаиие ядрышка. десь ''«шанаДНК. ответственная засингез рРНК ядрышковые организаторы расположены в корозкпх .
'«ли ромер ,-лс.зсмсра-
Плечи хромосом оканчиваются конечными учасз ками |1МИ
Теломерные концы хромосом не способны сосзнн осоч |И. хромосомами и hi их фрагментами, в отличие оз конз . моПТ Шеиных теломерных участков (в рпулыате разрывов), козоры .
77
Рис. 33. Хромосомы разных видов животных (М юн пинг. 1963)
о - речной рак (2л = 196); 6 комар Culcx (2ft 6); в щука (2л 18): г - курима: d -кошка (2и = 38); с - лошадь (2и 66); зк - бык (2м 60); з - саламандра (2и 34ни-овна(2л 54)
присоединяться к таким же разорванным концам других хромосом. В теломерах локализована особая теломерная ДПК, защищающая хромосому от укорачивания в процессе синтеза ДНК.
Размеры хромосом у разных организмов варьируют в широких пределах (рис. 33). Так, длина хромосом может колебаться от 0,2 до 50мкм. Самые мелкие хромосомы (л мечены у некоторых простейших, грибов, водорослей: очень ме жие хромосомы — у льна и морскою камыша: они настолько малы, что с трудом видны в световом микроскопе. Наиболее длинные хромосомы обнаружены у некоторых прямокрылых насекомых, у амфибий и у лилейных. Длина хромосом человека находится в пределах 1,5-10 мкм.
78
Рис. 34. Хромосомные наборы аксолотля и вики (б)
Число хромосом у различных объектов также значительно колеблется, но характерно для каждого вида животных и растений. У некоторых радиолярий число хромосом достигает 1000-1600 Рекордсменом среди растений но числу хромосом (около 500) является папоротник ужовник. 308 хромосом у тутоного дерева, у речного рака 196 хромосом. Наименьшее количество хромосом (2 хромосомы на гаплоидный набор) наблюдается у одной из рас аскариды, у сложноцветною Haplopappus gracilis всего 4 хромосомы (2 пары).
Совокупность числа, величины и морфологии хромосом называется кариотипом данного вида. Кариотип - это как бы лиио вила. Даже у близких видов хромосомные наборы отличаются друг от друга или по числу хромосом, или по величине хотя бы одной или нескольких хро мосом, или по форме хромосом и по их структуре. Стру ктуракариотп па данного вида нс зависит ни от типа клеток. ни от возраста живот о-юили растения. Все клетки индивидуумов одного видаi имени ь тичные наборы хромосом. Простой морфологический анап Убедительно показать различия в кариотипах лаже у xnii . Следовательно. структура кариотипа может быть такс • с_ (систематическим) признаком, который все чаше исполь тематике живот ных и растений (рис. 34). шиооко
В последние юлы в практику хромосомною аи*и f Ulicp_
входить методы дифференциального окрашивания ._ Ч1О пр11
вые .метод был предложен Каснерссоном. к0Г0*’ '' шьЮ флуорохро-обработке препаратов митотических хромосом с • нечерчен-Ма акрихиниприга во флуоресцентном мпкроскш с
79
2 X
a
i SI i i i s s
Y456789 10
Рис. 35. Хромосомы даурского хомячка
и - гистограмма размеров хромосом; б - дифференциальная окраска лих же хромосом ность но длине хромосом. В хромосомах были видны поперечные светящиеся полосы («бэнды») (Q-полосы, Q-окраска), расположение которых было характерно для каждой хромосомы.
Затем оказалось, что исчерченность тела хромосомы, ее способность днфферсн и нал ьно окрашиваться подлине. можно выявить с помощью нсфлуоресинруюших красителей (например, смесь но Гимза: метилен-азур. ментеновый фиолетовый, метиленовый синий и эозин). Перед окраской препараты обрабатывают разными способами (короткая обработка трипсином, щелочными или кислыми растворами и др.). В зависимости от мето ia окраски можно выявить окрашивание прицеп гримерных участков (С полосы, или перевязки) или различных полос в плечах и теломерах хромосом (G-полосы). При этом, так же как при окраске акрихин и при том. расположение полос характерно для каждой хромосомы (рис. 35).
80
-IINU -Uli ii
। 2 3 4 5
«ИМПИНК II
fc 7 8 9 Ю И 12
D A A A ft А Л E XK X К Л л
в 14 15 16 17 18
F XX XX °АЛ лл b
19 20 71 Х Y
Рис. 36. Кариотип мужчины
Хромосомы обозначены согласно ясивсровской системе
Интересно, что получение дифференциальной окраски хромосом связано, скорее всего, с различной способностью к искусственной ас-конленсацип разных участков хромосом. Так, дифференциальную окраску, соответствующую С- и G-иолосам. можно получить при окраске обычным гематоксилином пли наблюдать под фазовым контрастом на нефиксированных хромосомах в процессе их постепенной деконденсации при удалении двухвалентных катионов из окружающих хромосомы растворов, те. наблюдать дифференциальнуюлеконденса-
Ш1ю митотических хромосом.
Такая дифференциальная окраска позволила детально из> и строение хромосом человека. При обычных методах окраски вес бор из 46 хромосом человека принято подразделять по ихр<нмс семь групп (А. в. с. D, Е, Е G). Если при этом лечко олличи Р.
иыс (I -я. 2-я) хромосомы от мелких (19-я. 20-я). метапен1ри с * акроцентрических (13-я), то внутри групп П’УЯ'10 Р"31"4 cXJV ««ому от другой. Так. в фу.юе С 6 я » 7-я собой гак же, как и с Х-хромоеомоп (рис. 36)-ДифФьРu qt Jpyra
Рашпванпе позволяет четко отличить эти хромосом • геиети-1РИС. 37). Этот прием цитологическою анализа в со к • । ^1а1Ь с0. ясскими наблюдениями уже в настоящее время п0 ' . 1сполохе ставдять хромосомные карты человека, те. находить • "ия генов на определенных участках хромосом (рис-
81
Рис. 37. Хромосомы мужчины при лиффсрс!1111|.и1ьной окраске
К2
Рис. 38. Генетическая карта хромосомы I человека Отче 1ьныс гены 'гокагизопавы в определенных сегментах хромосомы: / гены группы крови Синанна. группы крови Do. ген фосфонирунатг и гратазы. 2- гены фос<|ю1люкоиз1 дегидрогеназы. »рифопитариои группы крови резус (Rhy. аденила «кина ял гокхс 2; 3- ген фосфог.гюкомут ш локус I; 4 — гены уритмн-монофосфаткинязы. гдлпиюиитшэ I. <х-амнчазы слюны. а-ами газы панкреатической. группы кропи Даффи и гр.; 5 - глкжози-Ьфоефатури гмлтрансфсразы, катаракты: 6 геи ггепчипазы С: 7- гены 5S РНК: А‘- ген фу марли шрам гы; 9 - гены гуанилаткинэзы. гх-фукозгегазы. место гля аденовируса 12
Несмотря на то что молекулярные механизмы специфической окраски до сих пор еще не ясны, многие исследователи такую способность отдельных у чисткой хромосом к окрашиванию связывают с их химическими различиями. Большое число наблюдений говорит о том. что избирательное окрашивание связано с локализацией так называемою гетерохроматина. ДН К которого обогащена А- и Т-основаниями.
Клеточный цикл эукариот
В отличие ог клеточного никла прокариот эукариотические клетки удваивают число своих хромосом в результате синтеза ДНК задолго ло пнтотомии, до разделения исходной клетки на две дочерние. Время протекания клеточного цикла у эукариот также значительно больше, нем у бактерии. Так. если для бактериальных клеток время отделения зю деления kjicikh составляет 20-30 мни. то у одноклеточных эукариот, таких как инфузория туфелька, клеточный никл занимает уже 10-20 ч, время клеточною пикта у амебы составляет около 1,5 суюк. Около суюк продолжается клеточный никл и у многоклеточных орта-пи IMOH.
Клетки многоклеточных организмов обладают ратной способностью к делению. Если в раннем эмбриогенезе клетки животных организмов делятся часто, то у взрослых особей они большей частью теря-Ю| лу способность. У круглых червей и коловраток клетки теряют способность к делению после прохождения эмбрионального развития.
Ю
i] рост организма. например аскариды, происходит нс за счет роста числа клеток, а за счет увеличения их размера.
Клетки различных тканей и органов высших позвоночных имеют неодинаковую способность к делению. Встречаются клетки, полностью потерявшие свойство делиться: это большей частью специализированные, дифференцированные клетки (например, клетки центральной нервной системы, кардиомиоциты, клетки хрусталика глаза). В организме есть постоянно обновляющиеся ткани (различные эпителии, кровь, рыхлая и плотная соединительные ткани). В таких тканях существует часть клеток, которые постоянно делятся (например, клетки базального слоя покровного эпителия, клетки крипт кишечника, кроветворные клетки костного мозга и селезенки), заменяя отработавшие или погибающие клетки. Многие клетки, не размножающиеся в обычных условиях, приобретают вновь это свойство при процессах репаративной регенерации органов и тканей.
Примерно такие же типы клеток по их способности вступать в процесс деления встречаются и у растительных организмов: это интенсивно делящиеся камбиальные клетки, дающие начало различным органам и тканям; это клетки, возобновляющие деление при ре генерации; это дифференцированные клетки, потерявшие способность делиться в естественных условиях.
Клетки многоклеточных животных и растении, так же как одноклеточные эукариотические организмы, вступают в процесс деления после ряда подготовительных процессов, важнейшим из которых является синтез ДНК.
Весь смысл клеточного деления заключается в равномерном распределении редуплицированного генетического материала по двум новым клеткам. Следовательно, нужно ожидать, что от отделения до деления где-то в течение жизни клетки должен существовать период син теза ДНК. Это предположение было подтверждено и ршюавтогра-фических экспериментах. Если размножающимся клеткам животных или растений лап» на короткое время меченый предшественник ДНК. а затем его убрать (так называемое импульсное мечение), то он будет включаться только в те клетки, в которых во время эксперимента шел синтез ДНК. В гетерогенной популяции клеток, средн которых были как делящиеся, так и нсделящиеся клетки, метка включалась только в часть ннтерфазных клеток. Это наблюдение показывало. что синтез ДНК происходит только в ишерфазс, в которой существуют периоды, когда синтез ДНК нс происходит; отсутствие метки в некоторых интерфазных клетках могло говорить, что в них синтез ДНК или еше не начинался, или уже закончился.
Это положение было доказано следующим образом. Если клеткам Дать импульсную метку (например, меченный тритием предшественник ДНК - гимилни), а затем наблюдать за распределением метки
84
Рис. 39. Изменение количества меченых митозов в разнос время после однократного введения 3Н-тимидина
а. I идеальная кривая, 2 кривая, полученная при изучении никла клеток крипт тощей кишки мыши. По оси абсцисс — время, по оси ординат - лронент меченых митозов, б диаграмма в пиле круга, обозначающею клеточный никл и его отдельные фазы
среди меток, взятых через определенные интервалы времени, то можно обнаружить следующую картину Через некоторое время в образцах будут встречаться как меченые интерфазные клетки, так и немеченые клетки и делящиеся клетки, не содержащие метку. Клетки делящиеся, но нс содержащие метки. - это тс клетки. которые уже закончили синтез ДНК до начала эксперимента. Позднее в препаратах начинают появляться меченые делящиеся клетки. Это как раз тс клетки, которые в момент введения меченого предшественника в интерфазе синтезировали ДНК, были в синтетическом периоде (S-псриод). Через некоторое время снова появляются немеченые делящиеся клетки - те, которые в момент введения меченого предшественника в интерфазе еще не вступили в S-период. Наконец, снова появляются меченые делящиеся клетки - это тс, которые вступили в деление уже второй раз. Если построить график встречаемости меченых митозов (рис. 39), то получится многовершинная кривая: точки между соседними вершинами будут отражать полную .длительность времени от деления до де тения клетки Дли гельмость клеточною цикла. Время от начала эксперимента до лояв лення первых меченых митозов - это время интерфазы после 5 периода.
пост синтетический исрио I. пли. как принято его обозначать.
Ока 1<1лось. что S периоду предшествует нрссивтстнческми исриол. или Gg-iicpiio-i - отрезок времени от митоза до начала Зная длительность клеточного синтеза, по проценту ме при импульсном введении меченого предшсствс......
тать д-Ш1ельпость S-иернода. Например. пр.1 цикла Г, равном 20 ч, встречается до 30со клеток, ме i
85
Таблица 2
'tiHifji.iiocn. ЧИ101ИЧССКОГО никла и сю периодов /в часах)
Вит \1и готический ПИКЛ Митш S Ч
Вика посевная (2(1 °C)
боковые корни 18,1 1,0 3,7 8,0 5,4
Горох (22 С) К\ керу за 19,3 2,3 6,7 8,0 2,3
клетки периферии чехлнка Мышь 22,5 2.2 6,3 6,7 7,3
эпителии тонкой кишки 18,75 1.0 9,5 7,5 0.75
эпителий роговицы L- клетки 72,0 0,75 8,50 4,0
(опухолевые фибробласты) 20,0 1,0 9-11 6-7 3-4
Кроветворные клетки 24,0 0,5-1 9.0 10 4,5
лином. из чего следует, что длительность S-нсриода занимает около 7 ч. Таким образом, весь клеточный цикл состоит как бы из четырех огре зков времени: собственно митоза (М), преемИтстического (Gj). синтетического (S) и постсинтетического (Go) периодов: / — G, + S + G2 + М-Общая продолжительность как всего клеточного никла, так и отдельных сто отрезков (периодов) значительно варьирует не только у разных организмов, но и у клеток разных органов одного организма (табл. 2). Существуют объемы с более коротким клеточным циклом. Так, у некоторых дрожжей он занимает 1,5 ч. а при дроблении эмбриональных клеток амфибий - 0,5 ч.
Различные периоды клеточного никла отличаются друготдрущ по общему содержанию в клетках белка. ДНК и РИКи по уровню (интенсивности) их синтеза. В Gt-периоде клетки имеют лкилоичпое содержание ДНК на ядро (2с), в S-периоде содержание ДНК колеблется от 2с до 4с, вИ2-11сриодс содержание ДНК соответствует ге1раплоилному (4с). Следовательно, если мы изучаем однородную популяцию клеток, то простой фотометрией ДНК в интерфазных клетках можно определить, в каком из периодов клеточного цикла находится та или иная клетка (рис. 40).
Количество РНК в клетках на разных этапах никла также может меняться: в интенсивно делящихся клетках содержание РНК в течение интерфазы увеличивается ио крайней мерс в 2 раза. После деления в Период Gf поступают дочерние клетки, в которых объем и общее со-
86
Рис. 40. Диаграмма \ ровней клеточных синтезов в течение клеточного цикла / coiepAJHHC ДНК: 2 - иктснсивночгь синтеза ДНК; 3 интенсивность синк-м РНК: 4 интенсивность синтеза белка. Остальные обозначения см. в тексте
держание белков и PH К вдвое .меньше, чем в исходной родительской клетке. В эго время начинается рост клеток главным образом за счет накопления клеточных белков, что определяется увеличением количества РНК ла клетку. Необходимо вспомнить, что втечение всего митоза (от поздней профазы до средней телофазы) синтез РНК в клетке полностью подавлен, поэтому накопление клеточных белков и РНК связано с возобновлением синтеза РНК в начале новою клеточного цикла. В S-нерподе уровень синтеза РНК возрастает соответственно увеличению количества ДНК и достигает своего максимума в середине С?-периода. В конце G-»-пернача плп в профазе синтез РНК резко падает по мере конденсации митотических хромосом и снова нолно-
сшо прекращается во время .митоза.
Синтез белка во время митоза падает до 25е? от исходного уровня и затем в последующих периодах достигает своего максимума в G?-периоде, в общем повторяя характер синтеза РНК.
Отдельные периоды пнгерфазы отличаются друг oi друга не только общим содержанием и активностью спите job ДНК. РНК и белка, но и
характером синтезируемых РНК и белков.
Такое регулярное повторение последовательности клеточных инк лов легко можно наблюдать во время щхнрессивного роста клеток культуры ткани. В естественных условиях в расту ших тканях растении ч Животных всегда есть клетки. которые находятся «вне цикла», нс переходят регулярно из G.- в S-. затем в G2 и потом в М-фазу. 1икис клетки принято называть клетками Gc-ncpno.<a. Именно им е представляют собой так называемые покоящиеся, псреставн i <-множиться клетки. 11ол дейепше.м специфическихоетковых Р ' ’ факторов, или митогенов, они Moiyi снова вступать н клс
87
it начать делиться. В некоторых тканях такие клетки G^-фазы могут находиться длительное время, не изменяя особенно своих морфологических свойств: они сохраняют в принципе способность к делению, превращаясь в камбпгигьиые, стволовые клетки (например, в кроветворной ткани). Чаше такая потеря (хотя бы и временная) способности делиться сопровождается cneniia.niзацией. дифференцировкой клеток. В этом случае дифференцирующиеся клетки выходят из цикла, но в особых условиях могут снова входить в никл. Например, большинство клеток печени находится в С0-периоде; они не участвуют в синтезе ДНК и не делятся. Однако если произнести удаление части печени, го многие клетки начинают подготовку к митозу (G,-период), переходят к синтезу ДНК и могут ммтотичсски делиться. В других органах, выходя из клеточного никла, клетки необратимо дифференцируются и теряют способность к делению навсегда. Так происходите нейронами: нейробласты (эмбриональные нервные клетки) после нескольких циклов клеточного деления теряют способность размножаться. дифференцируются и остаются в этом состоянии до конца жизни организма.
Следует отметить особо, что у многоклеточных зрелых организмов заведомо большая часть клеток находится в С0-фазе. Прохождение клетками клеточного цикла как и интенсивно размножающихся популяциях, так и в клетках, стимулированных к размножению, регулируется целой сложной системой циклирующих белков, от активности которых зависит прохождение каждой из стадий клеточного цикла (см. главу 26).
Эндорепродукция и полиплоидия
Если делящиеся клетки на некоторое время охладить или обработать каким-либо веществом, разрушающим микротрубочки веретена (например, колхицином), то деление клеток прекратится. При этом исчезнет веретено, а хромосомы без расхождения к полюсам будут продолжать никл своих превращений: они Иачнуч набухать, одеваться ядернои оболочкой. Так возникают за счет объединения всех нсразо-шедгпихся наборов хромосом крупные новые ядра. Они. естественно, будут содержать вначале 4л число хроматид и соот ветст пенно 4с количество ДНК. По определению, это уже не диплоидная, а тетра плоил-пая клетка. Такие полиплоидные клетки могут из сталии G( переходить в S-период и. если убрать колхицин, снова делиться мц готическим путем. давая уже потомков с 4л числом хромосом. В результате можно получить полиплоидные клеточные линии разной величины нлоилно-ети (4л. Хя, 16л и т.д.). Этот прием часто используется для иолучения иол и плоидн ы х растс пни.
8К
Как оказалось, во многих органах и тканях нормальных дигпгяи кых организмов животных и растений встречаются клетки с кот 1 ми ядрам», количество ДНК и которых кратно больше 2л. При делении таких клеток видно, что количество хромосом v них также кратно увеличено по сравнению с обычными диплоидными клетками Эти клетки являются результатом соматической полиплоидии Часто это явление называют жюрепродукшшй - появление клеток с ^сличенным содержанием ДНК Подобные клетки появляются в результате отсутствия в целом или в результате незавершенности отдельных этапов митоза. Существует несколько точек в процессе митоза. блокада которых приведет к его остановке и к появлению полиплоидных клеток. Блокада .может наступить при переходе от С2-периоаа к собственно митозу, остановка может произойти в профазе и метафазе. в последнем случае часто происходит нарушение целостности веретена деления. Наконец, нарушения цитотомпи также могут прекратить деление, что приведет к появлению явуялерных и полиплоидных клеток.
При естественной блокаде митоза в самом его начале - при переходе Gi в профазу — клетки приступают к следующему циклу репликации. который приведет к прогрессивному увеличению количества ДНК «ядре. При этом не наблюдается никаких морфологических особенностей таких ядер, кроме их больших размеров. При увеличении ядер в них не выявляются хромосомы митотического типа. Часто такой тип эндорепродукции без митотической конденсации хромосом встречается у беспозвоночных животных, обнаруживается он также и у позвоночных животных, и у растений.
У беспозвоночных в результате блока митоза степень полиплоидии может достигать огромных значений. Так, в гигантских нейронах моллюска 1 рнтопии, ядра которых достигают величины ао I мм ('). содержится более 2 10? гаплоидных наборов ДНК. У некоторых беспозвоночных гигантские железистые и нервные клетки в результате 18—20 циклов эндоредупл и капни могут содержать 2 097 152с ДНК.
Другим примером гигантской полиплоидной клетки, образовав шеися в результате редупликации ДПК без вступления клеток в митоз, может служить клетка гиелкоотделительноИ железы тутовою шелкопряда. Ее ядро имеет причудливую ветвистую форму и может содер жать огромные количества ДНК. Гигантские клетки железы пишевы Акариды могут содержать до 100 000с ДНК. „не
Особый случай эндорспродукнии представляет сооо )вс-плоидности путем полпенни. При полпенни в S-периоде i кации ДНК новые дочерние хромосомы продолжают оставатс с»ирали зова ином состоянии, но располагаются яруг ок . Расходятся и нс претерпевают митотической конденсации др тиком истинно иитерфазпо.м виде хромосомы снова вс > Посте-юший цикл репликации, снова удваиваются и не Р3
89
Рис. 41. Схема строения политенной хромосомы (Я) и се участков (Я) а - нить интерфазной хромосох«ы с участками кон 1спсмронанншо хроматина; б - две нити после релу вникании; « восемь сближенных нитей в результате трехкратной редуптикапии хромосом: / диски, 2 - мсжлисковыс участки; 3 пуф. образовавшимся за счет юкопаснсании хроматина диска
пенно в результате репликации и нерасхождсния хромосомных вшей образуется многонитчатая, полигонная структура хромосомы ннтерфаз-когоялра. Последнее обстоятельство необходимо подчеркнуть, так как такие гш антские политенные хромосомы ни ко ига не участвуют в митозе. более того - это истинно интерфазные хромосомы, участвующие «синтезе ДНК и РНК.
От митотических хромосом они резко отличаются и по размерам: они в несколько раз толще митотических хромосом из-за тою. чго состоят из пучка множественных неразошедши.хся хроматид; по объему политенные хромосомы дрозофилы в 1000 раз больше митотических. Они н 70—250 раз длиннее митотических вследствие гою, что в иптер-фазном состоянии хромосомы менее конденсированы (спирализова-ны). чем митотические хромосомы (рис. 42). Кроме тою. у двукрылых их общее число в клетках равно гаплоидному из-за тою, чго при поли тонизации происходит объединение — конъклаиия - гомоюгичных хромосом. Например, диплоидная сомазическая клетка лрозофппы содержит восемь хромосом, a i in антская каст ка слюнной железы четыре.
Встречаются гигантские полиплоидные ядра с полмтенными хромосомами у некоюрых личинок двукрылых насекомых в клетках слюнных желез, кишечника, мальпигиевых сосудов, жирового тела и г.д. По-
90
литенные хромосомы встрсчают-ся также в ядрах синср1 ид некоторых луков, в ядрах антипод аконита и пшепины. Описаны полн-тениые хромосомы в макронуклс-гсе инфузории стилонпхин.
Лучше всего этоз тин эндорс-вродукнии изучен у насекомых. Подсчитано, что у дрозофилы в клетках слюнных желез может произойти до 6-8 циклов рсдуп-1икаиии, что приведет к общей втопдности клетки. равной 1024. У некоторых хирономия (их личинку называют мотылем) плотность в этих клетках достигает 8000-32000. В клетках политенные хромосомы становятся видны после достижения ночптсиии в 64—128/1. ло этого такие ядра ничем. кроме размера, не отличаются отокрхжаюпиш диплоидных ядер.
Отличаются ноли генные хро
И) МКМ
Рис. 42. Набор полненных хромосом из гигантских клеток слюнных желез дрозофилы (a) в сравнении с размером ми готических .хромосом в делящихся клетках (б)
мосомы и своим счроением; они структурно неоднородны подлине, состоят из дисков. МСЖ.ДИСКОВЫХучастков» пуфов (рис. 43). Рисунок расположения дисков строго .характерен Для каждой хромосомы и отличается даже у близких пилон животных.
Диски представляют собой участки конденсированного хроматина. Если на одной ингерфазнон хромосоме участки конденсированного хроматина будут выглядеть как глобулярные сгустки (хромомеры), io ври латеральном расположении множества одинаковых интерчял ь хромосом эти отдельные участки выстроятся в диск, лежавши попе хромосомы. Хромомерное строение дисков иолитениых хромое ь четливо проявляется при искусственной дсконленсашнг >тих^ сом растворами с низким содержанием двухвалентных каги' ’
Этом диски (особенно мелкие) распадаются на ряд I||ОДОб-(О.2-О.З мкм). от которых ралнетыюотходятфиорплл |ЧесКил
потому, что иаблкжастся при такой же декоииенсаш i хромосом и хроматина нптерфазных ядер. Обшее их число
Диски мот отличаться пру) от яру) а по кхшшш удрцофи->'попоенных хромосом xnpouoMiu достигает .2 " ...о(,ычи про-
лы имеется около 5 тыс. дисков. Диски рацелены оиат111м,
"РДнетвамн. состоящими, так же как к диски, из фкор"" т°тько более рыхло упакованных (см. рис 30. О-
91
Рис. 43. Один н тот же участок лолитсиной хромосомы Chironomus fen tans в ядрах слюнной железы (о), мальпигиева сосуда (б), прямой («) и средней (г) кишки
На политенных хромосомах лпукрылых часто виллы вздутия - пуфы. Оказалось, что пуфы возникают на местах некоторых дисков за счет их деконденсации и разрыхления. В пуфах выявляется РНК, которая там же и синтезируется. Следовательно, пуф является местом транскрипции на этих интерфазных хромосомах к представляет собой экспрессированные хромосомные участки.
Рисунок расположения и чередования дисков на паштенных хромосомах постоянен н не зависит ни от органа, ни от возраста животного. Это является хорошей иллюстрацией одинаковости качества генетической информации в каждой клетке организма (см. рис. 43).
92
Рис. 44. Последовательность образования пуфов на различных локусах хромосом слюнной железы дрозофилы (плечо .хромосомы 3) (Ashburn, 1967)
Однако в расположении пуфов такой однозначности нет. Пуфы являются временными образованиями на хромосомах, и в проиессе развития организма существует определенная последовательность в их появлении и исчезновении на генетически различных участках хромосомы (рис. 44). Эта последовательность различна для разных тканей. Сейчас доказано, что образование пуфов на полптенных хромосомах-это выражение генной активности: в пуфах синтезируются РНК, необходимые для проведения белковых синтезов на разных этапах развития насекомого. Оказалось, что можно вызывать специфическую 1ш-д)квию активности пуфов. Так. на определенной стадии развития личинки гормон экдизон вызывает активацию специфических пуфов, что предшествует линьке. Если же этот гормон ввести на другой стадии развития, то в этом случае активируется тот же пуф. хотя в норме он на этой стадии не функционирует.
В естественных условиях у двукрылых особенно активны в отношс-них синтеза РНК дна самых крупных пуфа. гак называемые копии Назьбиани, который описал их 100 лет тому назад. Совсем недавно с помощью микроманнпу.знтора удалось выделить кольца в зосгаточ пом количестве, чтобы определить тип их РНК Эго оказалась ,|Нч' маииоииая РНК с гигднтской молекулярной массой (70 тыс. нук. -’Идой), кодирующая образование секреторных белков слюнных Эта же РНК была выделена из полисом цитоплазмы. Размер ТР»Л РуП. которые образуются в кольцах (нуфах) Батьопави.
Донос время неясной оставалась природа МС'^"|С^0”Ь'Х^1.А_111СКО-ГО.1ИТС11НЫХ хромосомах. была выдвинута гипотеза, чвае_ ,1LIx участках могут также располагаться гены, которые . конденсированном состоянии, в отличие от генов в дцод-пеактпвиы. Это пре що.южение в последнее время п1 гранулы
птерждеиий. Так, в межлископых участках были оо Р. ч цмсж. "Фибриллы РКП такой же хюрфаяогии. как и в мел
93
Рис. 45. Пол men лыс хромосомы в ядре антипод Dicenira spectabitis
хромосомах зависит только от i
дисковых участках зарегистрировано слабое включение в РНК, там с помощью пммуно.химически.х методов удалось локализовать PH К-полимеразу и ДНК РНК комплексы, что указывает па участие .межтпековых зон в синтезе РНК. Характер этой РНК неясен. Возможно, что это РНК генов, работа которых в клетке необходима постоянно, генов, которые кодируют белки основного метаболизма клетки, т.е. белки «для домашнего хозяйства». Информация же. необходимая дня специализации, дифференцировки, в таком случае должна поступать от пуфов.
Так как расположение дисков на ияовой специфики, то удалось с помо
щью генетических методов локализовать целый ряд генов и нанести их на морфологические карты хромосом. Отдельный диск может быть вместилищем одного и ш нескольких генов. Целый ряд признаков
удалось локализовать в определенных участках хромосом.
Как уже указывалось, гигантские хромосомы встречаются в некоторых клетках зародышевых тканей растений. Такне гигантские хромосомы были описаны, например, у фасоли и ячменя. Это толстые короткие хромосомы, во много десятков раз превосходящие но объему митотические хромосомы. В анти лол пальных клетках ячменя в огромных ядрах видны семь (гаплоидное число) хромосом, которые претерпели до 20 пиклов репликации. Однако общая их орзанилшия резко отлична от таковой у двукрылых насекомых. Во-первых, в данном случае нет разделения тела хромосомы на диски и междисковые участки, во-вторых, нет пуфов. Все РНП-пролукты равномерно расположены вдоль хроматиновых участков. Хроматин этих пн антских хромосом обладает типичной хромонемноп opiannзаписи, характерной .ня ин-терфазных ядер этою объекта (рис. 45).
Итак, мы разобрали два случая, два способа образования полиплоидных клеток, возникающих при блокаде вступления их в мнтшиче-ское деление.
В других случаях эндорепредукции полиплоидные клегки иоишкают в результате нарушений аппарата деления веретена: при этом происходит .митотическая конденсация хромосом. Такое явление носит название эидомигоз, потому чго конденсация хромосом и их изменения происходят внутри ядра, без исчезновения ядерной ободочки (рис. 46).
94
Рис. 46. Схема эндомнтоза в клетках тапетума шпината
I - эндопрофаза; 2 - эн юметафаза; J- эпдоанафазэ; 4 - эндотслофаза
Впервые явление эндомнтоза было хороню изучено в клетках различных тканей водяного клопа - геррии. В начале эндомнтоза хромосомы конденсируются, благодаря чему становятся хорошо различимы внутри ядра, затем хроматиды обособляются, вытягиваются. Эти стадии по состоянию хромосом могу» соответствовать профазе и метафазе обычного митоза. Затем хромосомы в таких ядрах исчезают, и ядро принимает вид обычного иитерфа того ядра. ко размер его увеличивается в соответствии с увеличением плоидности. После очередной ре-Л)П1Пкаиии ДПК такой цикл эндомитоза повторяется. В результате мот возникнуть полиплоидные (32л) и даже гигантские ядра.
Сходный тип эндомнтоза описан при развитии макропумеусов у некоторых инфузорий, у целого ряда растений. Так, в клетках кл)бней картофеля хромосомы практически все время находятся в спираликжишом состоянии, время собственно интерфазы здесь значительно укорочено.
Следующий вариант появления полиплоидных к четок связан с отсутствием веретена на сталии метафазы: при этом происходит слияние двух хромосомных наборов, как в случае применения колхицина.
Иной процесс появления полиплоидных соматических югсток в ре зультате блокады деления клеточного тела подробно и з\чен па метка млекопитающих. Было обнаружено, что в печени взрослых, п ос к нестареющих, крыс и мышей встречаются кроме диплоидных leipa октоплоадиые клетки, а также двуядерные метки разной степи ш идности. Оказалось. что в этом случае процесс полиплоп шза. у ток можно описать следующим образом (рис 4 ). осле' Метки, облачающие 4с количеством ЛИК, вступаю! в' |13Ю1
Деление, проходят вес сю стадии, включая телофаз), по <• qhа
Кпи । отомни. Таким образом, образуется л ведерная мстк т- -*И!С| снова пройти S период, и ре гультате чс10^’1' верная ктет-** станут содержат ь по 4с Д11К и 4л хромосом. Гака - |||1С чр0.
Ка 1,х°яит в митоз, на стадии метафазы происход» < * Иор-Мос°мных Наборов (общее число хромосом рант
95
Рис. 47. Образование двхядерных и полиплоидных клеток паренхимы печени
S - еммте* ДНК
мальное деление, в результате которого образуются две тетраплоидные клетки. Процесс попеременного появления двуядерных и одноядерных клеток может принести к появлению ядер с 8/1. 16л и лаже 32/1 количеством хромосом. Таким способом образуются полиплоидные клетки в печени, н эпителии мочевого пузыря, в пигментном эпителии сетчатки, в ацинарных отделах слюнной и поджелудочной желез, на ранних стадиях образования мегакариоцитов и др.
В целом ряде случаев процессы эндоре пролу кии и используются организмом как для построения тканей, так и для их функционирования. В чем же биологический смысл этого явления? Необходимо отмети гь, что соматическая полиплондизацпя встречается на терминальных участках пути развития клеток, тканей и организмов, она большей частью характерна для специализированных, дифференцированных клеток и не встречается при генеративных процессах, таких, как эмбриогенез (исключая провизорные органы) и образование половых клеток. нет полиплоидии среди стволовых клеток. Действительно, гигантские полиплоидные клетки в деление не вступают; клетки с ноли-тенпыми хромосомами также не делятся и в процессе метаморфоза насекомых лизируются. Мноюядерные и полиплоидные клетки у млекопитающих встречаются главным образом у стареющих организмов.
По видимому, главным результатом соматической полиплоидии является увеличение размера клеток и тем самым увеличение их продуктивности
Пространственное расположение хромосом в интерфазном ядре
Представление о том, чго митотические хромосомы после деленпя клеток превращаются в хроматин интерфазного ядра, нс теряют своей целостности (не распадаются на фра! менты), а сохраняют свою фи вескую индивидуальность, переходя лишь в разрыхленное, декондеп-
96
сированное состояние, было высказано Т. Бонерл еще в 1887 г. Эти ппецсгавлеиия получили название теории непрерывности хромосом которая гласит: хромосомы, вошедшие в состав дочернего ядра втело-фазе. сохраняются в нем хотя бы к в очень измененном виде в качест-вс индивидуальных структур и появляются снова в собственном смыс-1е слова в следующей профазе.
Основой для этого вывода послужило наблюдение Т. Бовери за поведением хромосом в дробящихся яйцах одного из видов аскариды (Лзсоп5 megfllocephata univaiens}, в клетке которой всего две хромосомы. Быяо обнаружено, что в профазе первых двух делений зиготы хромосомы вновь обнаруживаются в местах бывших телофазных хромосом предыдущею деления, повторяя их форму и локализацию (рис. 48). Конечно, эти наблюдения нс могут служить прямым доказательством этой теории, но являются основой для высказывания предположения о судьбе хромосом в клеточном цикле. Однако кроме этою наблюде-
ния существует целая серия косвенных данных, говорящих в пользу теории непрерывности хромосом. Вот некоторые из них.
В интерфазиых ядрах целого ряда объектов удается pei нстриро-вать отдельные специфические , участки, аналогичные но своим свойствам те юмерам и центромерам митошческих хромосом. Например. у некоторых луков все хромосомы имеют постоянно конденсированные участки на теломерах (рис. 49). Эти теломеры митотических хромосом обладают свойством окрашиваться как С-сегмент. В интерфазных ядрах этих видов также обнаруживаются ^-положительные зоны. Их количество вдвое меньше, чем число
Рис. 41 Мор. °
ст|.о хромосом Н пер
дро&.еяияасмр.1А^^^>
,чс Об-
НИИ хромосом в о.*”*
плечей митотических хромосом, вероятно, за счет того, ч го в интерфазе теломерные участки сосел-1,11 * хромосом могут ассоциировать друг с (ругом. Интересно, что в интерфазном я Ярс такие участки Раскола! аются на одном из полю-с°в. как бы новюряя теломерную °Риецта1нно хромосом в ми row.
97
Рис. 49. Полярное периферическое расположение теломерных хромопент-ров (показано стрелками) в тслофазных ядрах клеток меристемы корешка A.fislu!osum
Подобным же образом можно наблюдать в интерфазных ядрах центромерные участки хромосом. Так, у мыши центромеры всех акроцентрических хромосом интенсивно окрашиваются но методике выявления С-сегментов (рис. 50). Таким же свойством обладают связанные с периферией ядра плотные участки иптерфазного хроматина - хромоцентры. Показано, что эти участки по своей молекулярной композиции аналогичны центромерным участкам митотических хромосом.
Наконец, в интерфазных клетках можно наблюдать целые отдельные хромосомы; например, одну из Х-хромосо.м самок млекопитающих. Правда, по морфологии такие целиком конденсированные хромосомы (тельца Барра) отличаются от митотических хромосом, но по объему и количеству ДНК полностью соответствуют Х-хромосоме в митозе. У пашенной полевки (Microtus a&restis) X половые хромосомы обладают способностью целиком интенсивно окрашиваться по С-ме-тоднке. В интерфазных ядрах различных клеток самок этою животного можно е помошью этой же окраски видеть два больших блока интенсивно окрашенного хроматина.
Каково же пространственное расположение отдельных сконденсированных итерфазных хромосом в трехмерном объеме клеточного ядра? Существует ли какой-либо порядок в размещении хромосом в интерфазном ядре или же они хаотически разбросаны внутри ядра? Первые исследования о порядке расположения хромосом внутри ядра принадлежа! К. 1’аб.но (1885), коюрый. изучая профазные ядра растений, предположил, что внутри ядра хромосомы поиторяют свою ана-фазную ориентацию (пеитромсры на одном полюсе, теломеры на другом) в течение всего клеточного никла.
98
Рис. 50. С окраска центромерных районов метафазных хромосом и интерфазного ядра (/7) клеток культуры мыши
В издьзу этого говорит расположение в интерфазном ядре центромерных и теломерных участков де конденсированных хромосом. Но особенно демонстративно это положение было показано при изучении пространственной локализации полнтенпых хромосом. С помощью послойных оптических разрезов, используя компьютерную технику воспроизведения изображения, удалось создать объемную стереоскопическую реконструкцию иптерфазного ядра и проследить в его трехмерном пространстве каждую из четырех гигантских поли генных хромосом (рис. 51). Обнаружено, что действительно в объеме ядер хромосомы располагаются, повторяя ана-телофазную ориентацию (так называемую ориентацию по Раблю). При этом каждое плечо хромосомы занимает определенную зону, объем которой не заходит в объем соседних хромосом, хотя они расположены тесно друг с другом. Каждая из хромосом образует пологую правую спираль (5-7 М™™'’ которая в нескольких местах связана с ялерной оболочкой. как фи ксируясь па ней. Фиксированы на ялерной оболочке п теломерные участки всех хромосом, которые располагаются на одном из интерфазного ядра. Па противоположном полюсе ядра также всюi ялерной оболочкой располагаются центромерные районы хро’ ’
часто объединенные в один хромоиентр - крупный блок пн с
Прямые наблюдения за локал и заи иен в ядре
сом были сделаны с помощью метода FISH (флуоресис мвхро-брилизакия нуклеиновых кислот) в сочетании с к0"^к;^ хроМОСО-скопией. Вначале выделили индивидуальные мпюти
Рис. 51. Трехмерная реконструкция топографии полигонных хромосом в ядре слюнной железы дрозофилы Т - теломеры хромосом; И центромеры
мы, из них получили ДНК, которые метились разными флуорохромами. Такие меченые хромосомные ДНК наносились на препараты интерфазных ядер, ДНК которых была предварительно денатурирована. В результате молекулярной гибридизации флуоресцирующая ДНК ре натур провала только со сходной хромосомой. С помощью конфокального микроскопа просматривалась флуоресцентная метка в трехмерном пространстве ин терфа злого ядра. Было обнаружено, что ннгерфазное ятро состоит из тесно расположенных хромосом пых территорий, объем которых значительно превосходил объем митотиче-
ских хромосом. Никоторые особенно крупные хромосомы действительно проявляли ана-телофазную ориентацию.
Рис. 52. Схема пространственного расположения двух ингерфагных хромосом.
Участки хромосом: Т - теломерные. Ц центромерные
Суммируя общие представления о формах организации Хп0МО(.га1 можно ирпйтн к заключению, что они могут находиться и нативных состоя пнях, в двух морфологических выражениях: I > максимально конденсированное, компактное, метаболически неактивное транспортное состояние, предназначенное для того, чтобы в минимальном объеме без структурных нарушений перенести вовремя кле точного деления огромные подлине молекулы ДНК; 2) декотценсиро-ванное, при котором линейная длина развернутых хромосом увеличивается в десятки, а иногда и в сотни раз. метаболически активное состояние, связанное с синтезом ДНК и РНК (интерфаза).
Отличительной особенностью шперфазной хромосомы от митотической. кроме всего прочего, является то, что по своей длине она может быть /[сконденсирована, развернута неравномерно: наряду с участками полной тсконденсапии есть участки, находящиеся в плотном, конденсированном и. соответственно, в неактивном состоянии Эгон придает интерфазному ядру своеобразную структуру, где хромосомы -хроматин - могут быть представлены то плотными блоками, торыхты-мн деконденсировапными участками (рис. 52).
Глава 5
СТРУКТУРА И ХИМИЯ ХРОМАТИНА
Хроматин — основной компонент клеточного ядра: сто достаточно
легко получить из выделенных иитерфазпых ядер и из выделенных митотических хромосом. Для этого используют его свойство переходить в растворенное состояние при экстракции водными растворами с низкой iioniioii силой или просто деионизованной водой. При этом участки хроматина набухают и переходят в гель. Чтобы такие препараты перевести в настоящие растворы, необходимы сильные механи ie скис воздействия: встряхивание, перемешивание, дополнительная могенизация. Это. конечно, приводит к частичному разрУШенн ходной структуры хроматина, дробит его на мелкие фрагмез
практически не меняет его химического состава. „ттляют
Фракции хроматина, полученные нз разных объектов..„о что по
Довольно однообразным набором компонентов. Было наезде суммарному химическому составу хроматин из интерфаз • [.]а11иыи|| До отличается от хроматина из мн готических хромосо - . o>,_
компонентами хроматина являются ДНК И белки, сре.
Ионную массу' составляют гистоны и иегистоновые с око |0 607 -
В среднем и хрома тис около 407 приходится на ,С1О11Ы состав-
ил белки, сре ш которых специфические ятерные э енпогохро-тяют ОТ 40 до Х0% от всех белков, входящих и состав
101
Таблица 3
Химический состав хроматина
Источник хроматина ДНК Ihciohm J 1ГГИСТОНОВЫС белки РНК
Стебель зародыша гороха 1.0 1.1)3 0,29 0.26
Печень крысы 1.0 1.16 0,67 0.043
Клетки Нс La (опухоль человека 1.0 1.02 0,71 0,09
Тимее теленка 1.0 1.14 0.33 0,007
Эритроциты курины 1,0 1.08 0.54 0,02
Примечание. Содержание белков и PH К дано по отношению к ДН К
маткиа. Кроме того, в состав хроматиновой фракципи входят мембранные компоненты, РНК. углевоты. липиды, гликонротепды. Вопрос о том, насколько эти минорные компоненты входят в структуру хроматина, еше нс решен. Так. РНК может представлять собой транскрибируемую РНК. которая еше не потеряла связь с матрицей ДНК. Другие же минорные компоненты могут относиться к веществам со-осажди иных фра!ментов ядерной оболочки.
В структурном отношении хроматин представляет собой нитчатые комплексные молекулы дезоксирибопуклеопрогеида (ДНП), которые состоят из ДНК, ассоциированной с гистонами (см. рис. 57). Полому укоренилось друзое название хроматина — нуклсогнстон. Именно за счет ассоциации гистонов с ДНК образуются очень лабильные, изменчивые нуклеиново-гистоновые комплексы, где отношение ДН К: гистон равно примерно единице, т.е. они присутствуют в равных весовых количествах. Эти нитчатые фибриллы ДНП и есть элементарные хромосомные, или хроматиновые, нити, толщина которых в зависимости от степени упаковки ДНК может колебаться от Ю до 30 нм. Фибриллы ДНП могут в свою очередь дополнительно компак-тиюваться с образованием более высоких уровней структуризации ДНП, вплоть до митотической хромосомы. Роль некоторых негистоновых белков заключается именно в образовании высоких уровней ком i 1акти за и и и хромати на.
ДНК хроматина
В препарате хроматина на долю ДНК приходится обычно 30-40 с-Эта ДНК представляет собой двухцепочечную спиральную молекулу, подобную чистой выделенной ДНК в водных растворах. Об лом f оперт многие экспериментальные данные. Например, при нагревании растворов хроматина наблюдается повышение оптической moi кости
102
раствора, так называемый пшсрхромиый аффект, связанный е оашы воммежнуклеотидных водородных связей между цепями ДНК пожй’ но тому.что происходит при нагревании (плавлении) чистой ДНК
Вопрос о размере, длине молекул ДНК в составе хроматина имеет важное значение для понимания структуры хромосомы в целом При стандартных методах выделения ДНК хроматина обладает молекулярной массой 7-9 10 , что значительно меньше молекулярной массы ДНК из кишечной палочки (2.8 109). Такую сравнительно малую молекулярную массу ДНК из препаратов хроматина можно объяснить механическими повреждениями ДНК в процессе выделения хроматина Если же выделять ДНК в условиях, исключающих встряхивание, гомогенизацию и другие воздействия, го удается из клеток получить молекулы ДНК очень большой длины. Длину молекул ДНК из ядер и хромосом эукариотических клеток можно определить с помощью .метода светооптической радиоавтографпн. подобно тому как это изучалось на прокариотических клетках.
Было обнаружено, что и составе хромосом длина индивидуальных пененных (в отличие от прокариотических хромосом) .молекул ДНК может достигать сотен микрометров И даже нескольких сантиметров. Так, > разных объектов длина молекулы ДНК варьировала от0.5 мм до 2 см. Эти результаты показали, что расчетная длина ДНК на хромосому близко совпадаете цифрами, полученнымирадиоавтографическим
методом.
После мягкого лизиса клеток эукариот молекулярные массы ДНК .можно определять непосредственно физико-химическими методами. Показано, что максимальная молекулярная масса молекулы ДНК дрозофилы равна 41 -109, что соответствует длине около 2 см. У некоторых дрожжей на .хромосому приходится молекула ДНК с молекулярной массой MO8 -109, которая имеет размеры около 0,5 мм.
Такие длинные ДПК представляют собой одну молекулу, а не несколько более коротких, сшитых гуськом с помощью белковых связок, как считали некоторые исследователи. К этому заключению пришли после тою. как оказалось, что длина молекул ДНК нс изменяете после обработки препаратов протеолитическими ферментами.
Общее количество ДНК. входящее в ядерные структуры кле . геном организмов, колеблется от вида к визу, хотя у микроорш' количество ДПК на клетку шачительно ниже, чем >'оес™лпПИЧ0Д|1Т-высших рас гений и животных (табл. 4). Гак. у мыши на ядр Р Си ПОЧТИ н 600 раз больше ДНК. чем у кишечной пазот i Q • ц миичеепи, ДНК на метку у .укариотачеекиз "Р™^, ^,,.,„„3-. ловить какие-либо корреляции между степей ' количество 111V КО-'"’,'ССТ,ЮМ Л11К |,а *L',P°- Пр"',еР"0<Х,,морской еж. окунь ДПК имеют такие различные организмы, как лс , ^’4-1.9 11Г) 11Л|, pbl(ja Юлен и бык (6.4 и 7 иг).
103
Таблица 4
Содержание ДНК в клешах некоторых объектов
Объект
Бактериофаги
Т1
Т4
Бактерии кишечная палочка
Грибы
дрожжи нсироспора
Высшие растения лен кукуруза лилия
Беспозвоночные животные дрозофила сверчок домашний
Рыбы осетр протоптсрус
Амфибии
тритон обыкновенный амфиу.ма
Пресмыкающиеся черепаха зеленая
Птицы курица
Млекопитающие мышь человек
Количество ЛИК. пг
На частицу 0.000007 0,000027
На клетку 0,009
На гаплоидную клетку 0,027 0,0! 7
На диплоидную клетку
1.4
15.4
134,2
0,2 !2,0
3.2
100.0
73,0
108.0
5.0
2.3
5,0
6,0
Значительны колебания количества ДН К в больших таксономических группах. Среди высших растений количество ДНК у разных видов может отличаться в сотни раз, так же как и среди рыб. в десятки раз отличается количество ДНК у амфибии.
В ядрах некоторых амфибий количество ДН К больше, чем в ядрах человека, н 10-30 раз. хотя генетическая конституция человека несравненно сложнее, чем у лягушек. Следовательно. можно предполагать, что «избыточное» количество ДНК у более низко организованных организмов либо нс связано с выполнением генетической роли, либо число генов повторяется го или иное число раз.
Разрешить эти вопросы оказалось возможным на основании изучения кинетики реакции ренагуранни, или гибридизации ДНК. Если фрагментированные молекулы ДПК в растворах подвергнуть тепло-
ИИ
Рис. 53. Кинетика реассоциации денатурированной ДНК из различных источников
I - Е. colt; 2- зобная железа теленка
вой денатурации, а затем инкубировать при температуре, несколько более низкой, чем та, при которой происходит денатурация, то будет происходить восстановление исходной двуспиральной структуры фрагментов ДНК за счет воссоединения комплементарных пелен -денатурация. Для ДНК вирусов н прокариотических клеток было показано, что скорость такой ренат уранин прямо зависит от величины генома: чем больше геном, чем больше количество ДНК на чаепшу мти клетку, тем больше нужно времени для случайного сближения комплементарных целен и специфической peaccouiiaumi ^0ЛЬ^?,Г5) числа разных по нуклеотидной последовательности фрагменгов (рис. 53). Характер кривой реассоциацинЛНКпрокариогическихьле ток указывает на отсутствие повторяющихся послеловательпосте "маний в геноме прокариот: все участки их ДНК несут аосяелователыюстн, число и разнообразие которых страж о |(< сложности генетической композиции объектов и. слеловат
общей биологической организации. .-jnno-
Совсем другая картина реассоциации ДНК 11ХД1П. фак-
тических организмов. Оказалось, что в состав их Я ’ ть|0 ,|ем ,1«и. которые ренатурируюг с гораздо бо.чсе высоко аик.
"ожно было бы предполагать на основании размер. ,н,1|и.|ьным Ае Фракция ДНК. рснатурнруюшая медленно. п0" отТ(Х.6>ется ’’ослепонатсльностям ДНК прокариот. Однако для . • ,|Т0СЮ1за-"ачителыго большее время для ренатурании агон фр.
105
нос общим большим размером их генома и с большим числом различных уникальных iciiob.
В той части ДНК эукариот, которая отличается высокой скоростью ре вату рации. различают две полфракции: I) с высоко или часто повторяющимися последовательностями, где сходные участки ДНК могут быть повторены I06 раз; 2) с умеренно повторяющимися последовательностями. встречающимися в геноме 1О2-1О3 раз. Так. у мыши во фракцию ДНК с часто повторяющимися последовательностями входит 10% общего количества ДНК на геном и 15% приходится на фракцию с умеренно повторяющимися последовательностями. Остальные 75% ДНК мыши представлены уникальными участками, соответствующими большому числу различных нс повторяющихся генов.
Фракции с часто повторяющимися последовательностями могут обладать иной плавучей плотностью, чем основная масса ДНК, и поэтому их можно выделить в чистом виде как фракцию сателлитной ДНК. У мыши эта фракция имеет плотность, равную 1,691 г/мл, а основная часть ДНК 1,700 г/мл. Различия плотности определяются различиями в нуклеотидном составе. Например, у мыши в этой фракции имеется 35% Г- и Ll-Нар, а в основном нике ДНК — 42%.
Сателлитная ДНК. или фракция ДН К с часто повторяющимися последовательностями, не участвует в синтезе основных типов РНК в клетке, не связана с процессом синтеза белка. Этот вывод сделан на основании того, что ни один из типов РНК клетки (тРНК. и РНК. рРНК) нс гибридизируется с сателлитными ДНК. Следовательно, на этих ДНК пет последовательностей, отвечающих за синтез клеточных РНК. т.е. сателлитные ДНК не являются матрицами для синтеза РНК. не участвуют в транскрипции.
Существует гипотеза о том, что часто повторяющиеся последовательности, нс участвующие непосредственно в синтезе белков, .могут нести информацию, важную для сохранения и функционирования хромосом. К Ним могут быть отнесены многочисленные участки ДНК, связанные с белками остова интерфазного ядра (см. далее). участки начата репликации или транскрипции, а также участки ДНК, регулирующие эти процессы.
Методом торили займи нуклеиновых кислот прямо на хромосомах (in situ) была изучена локализация этой фракции. Для этою на изолированной сателлитной ДНК с помощью бактериальных ферментов синтезировали меченную ’И-уридииом РНК. Затем ниголотическии препарат с хромосомами подвергали такой обработке, ври которой происходит денатурация ДНК (повышенная температура. щелочная среда и др.). После этого на препарат помешали меченную ’Н РНК и добивались гибридизации между ДНК и РНК. Радиоавтографически выявлено, что большая часть метки локализуется в зоне первичных перетяжек хромосом, в зоне их центромерных участков. Метка обпару живалась также и в других участках хромосом, но очень слабо (рис. 54).
106
Рис. 54. Радиоавтограф, полученный после гибридизации меченной ’Н-тимидином сателлитной ДНК мыши с препаратом хромосом
Зерна восстановленного серебра локализуюгся над центромерами акроисктрическмх хромосом
За последние 10 лет сделаны большие успехи в изучении центромерных ДНК, особенно у дрожжевых клеток. Так, у S. cerevisiaeцентромерная ДНК состоит из повторяющихся участков по ПО ин. Она имеет два консервативных участка (I и И!) и центральный элемент (II). обогащенный АТ-парами оснований. Сходное строение ДНК центромеры имеют хромосомы дрозофилы. Центромерная ДНК человека (альфо пдная сате шитная ДНК) состоит из тандема мономеров по 170 п.к.. организованных в группы димеров или пентамеров. которые в свою очередь образ) ют большие последовательности по 1-6 10 И.н. акая самая большая единица повторена 100—1000 раз- С згой спенифи к ской центромерной ДНК комплекс и руются особые ueHTJ’?^]* бедки, участи) кшше в образовании кинсюхора - структуры, >। ваюшей связь хромосом с микротрубочками веретена, и в хромосом в анафазе (см. далее). , -„мт жена
HI К с часто повторяющимися нос.чслон«п«льносгям1 ‘ также в теломерных хчаегках хромосом многих ’ я
"«мок (or дрожжей ю человека). Здесь ча.ис в“гоу“^^те. "опторы. к которые входят 3--4 гуаниновых нукдетн днК вы-'<>'iepi,i содержат 500-3000 повторов TTAGGG ‘ „ „ре-
"олняют особую роль: они ограничивают хромое wi,.„|K;1uiiii. ‘10,вР'|Ц<ак)Г ее укорачивание и процессе miioiok|x пОС1Сдоюгсть-
Нелавнобыло найдено, что высоко повторяющие |й;м1 с бет-
••octii дик иитерфазных хромосом сняты«;1ютсяс
107
ками - ламинами, подстилающими ялсрную оболочку, к участвуют в заякори ванн и растянутых декомпенсированных интерфазных хромосом, тем самым определяя порядок в локализации хромосом в объеме интерфазного ядра.
Сделано предположение, что сателлитная ДПК может участвовать в узнавании гомологичных районов хромосом при мейозе. По другим предположениям, участки с часто повторяющимися последовательностями щракэт роль разделителе и (спенсеров) между различными функциональными единицами хромосомной ДНК. например между рспликонами (см. далее).
Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от I02 до 105 раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в процессах создания аппарата белкового синтеза. В нес входят гены рибосомных ДНК, которые могут быть повторены у разных видов от 100 до 1000 раз. В эту же фракцию входят многократно повторенные участки для синтеза всех т PH К. Более того, некоторые структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, также .могут быть .многократно повторены, представлены многими копиями. Это гены для белков хроматина — гистонов, повторяющихся до 400 раз. Кроме того, в эту фракцию входят участ кн ДН К с разными послсдоваге 1ьносгями (по 100-400 п.н.), также многократно повторенными. но рассеянными по всему геному. Их роль еще нс до конна ясна. Высказывается предпепожеиис, что такие участки ДНК могут представлять собой акцепторные или регуляторные участки разных генов.
Итак, ДНК эукариотических клеток гетерогенна по составу, содержит несколько классов последовательностей нуклеотидов: часто повторяющиеся последовательности (>|06 раз), входящие во фракцию сателлитной ДНК и не транскрибирующиеся; фракция умеренно повторяющихся последовательностей (102-Ю5), представляющих блоки истинных генов, а также короткие последовательности, разбросанные по всему геному; фракция уникальных последовательностей, несущая информацию для большинства белков клетки.
Исходя из этих представлений, становятся понятными ге различия в количестве ДНК. которые наблюдаются у разных организмов: они могут быть связаны с неодинаковой долей тех или иных классов ДНК в геноме организмов. Так. у амфибии Amphiuma (у которой ДНК в 20 раз больше, чем у человека) на долю повторяющихся последовательностей приходится до В0% всей ДНК. у луков до 70, у лосося - до 60% и т.п. Истинное же богатство генетической информации должна отображать фракция уникальных последовательностей. Не нужно забывать, что в нативной. нефрит монтированной молекуле ДНК хромосомы все участки, включающие уникальные, умеренно п часто повторяющиеся последовательности, связаны в единую гигантскую ковалентную пень ДНК.
108
Молекулы ДНК гетерогснны не только по участкам™ тилной последовательности, но и различны в оп.ошенш’"«c'Z’”’' ческой активности. """ их «виети-
Репликация эукариотических ДНК
Бактериальная хромосома реплицируется как одна стрскп™™ единит, имеющая одну стартовую точку репликации в одну точке терминации. Таким образом, бактериальная циклическая ДНК явля ется одним рсндиконом. От стартовой точки репликация Шет в двух противоположных направлениях, так что по мере синтеза ДНК образуется так называемый глазок репликации, ограниченный с двух сторон ренчикаиионнымн вилками, что хорошо видно при электронно-микроскопическом изучении вирусных и бактериальных ретинирую-шихся хромосом.
У эукариотических клеток организация репликации иного характера- полире л л и кон и пая. Как уже говорилось, при импульсном включении ’Н-тимилпна множественная метка появляется практически во всех митотических хромосомах. Это означает, что одновременно в ин-герфазиой хромосоме существует множество мест репликации и множество автономных точек начала репликации. Более подробно это явление было изучено с помощью радпоавтографип меченых молекул выделенных ДНК (рис. 55). Если клетки были пмпульсно мечены -Н-тцмидипом. то в световом микроскопе на автографах выделенных ДНК можно было видеть участки восстановленного серебра в виде пунктирных линий. Это небольшие отрезки ДНК. которые успели реплицироваться. а между ними расположены участки нереплииирован-нои ДНК, которая не оставила радиоавтографа и поэтому была невидимой. По мере увеличения времени контакта 'Н -гимн вша с клеткой величина таких отрезков возрастает, а расстояние между ними уменьшается. Из этих экспериментов можно точно рассчшать скорость репликации ДНК у эукариотических организмов. Скорость движения Репликами он мои витки ока залась равной 1-3 т.п. н. в I мину млекопи-тающич, около I г.п.и. в I мин у некоторых растений, «по намного ни-*е скорости репликации ДНК v бактерий (50т.п.н. в 1 мин)- В этих же ^Римептах Gwj,a «Рям<> показана полнрегыиконная структура
К хромосом эукариот: но длине хромосомной 1Н К, вдоль нее. рас полагается множество независимых участков репликации °в- По расстоянию между средними точками смежных мс1ЯШ“^’ 'иконок, т.е. по расстоянию между двумя соседними сь1р ° жами репликации, можно узнать величину отдельных реп. сРелнем величина реиликонов у высших животных сое так 0 30 мкм, или 100 т.н.н. Следовательно, в пшлоитном напоре . .
109
a
Рис. 55. Репликация эукариотической ДНК
а - ралиоавтотраф включения 3Н-тимилина в молекулу ДНК; б схема репликации: четыре диаграммы представляют последовательные ста дин двух смежных единиц реп тикании (рецди-конов). Сплошные линии указывают исходные, а пунктирные - новосик те тированные цепи молекулы ДНК. О - начало репликации; I - коней реп тикании; / перед началом репликации; 2 репликация качалась в правом ре пл иконе; 3 репликация началась в левом ренликинс; 4 репликация закончилась в обоих рептикоиач
питающих должно быть 20 000-30 000 репликонов. У низших эукариот величина репликонов меньше - около 40 т.п.н. Так, у дрозофилы на геном приходится 3500 репликонов, а у дрожжей - 400. Как говорилось, синтез ДНК в ре пли коне идет в двух противоположных направлениях. Это легко доказывается радиоавтографпиески: если клеткам после импульсном метки дать возможность продолжить синтезировать ДНК в среде без 3Н-тимидина, то его включение в ДНК уменьшится (будет происходить как бы разбавление метки), и на радиоавтографе можно будет видеть симметричное, с двух сторон реплицируемого участка, уменьшение количества зерен восстанов ленного серебра.
Реплицирующиеся концы. или вилки, в репликоне прекращают движение, когда встретятся с вилками соседних репликонов (в терми иалыюй точке, обшей для соседних репликонов) В лом месте реплицированные участки соседних репли-конов объединяются в единые ковалентные цепи двух
новосинтезированных молекул ДНК. Функциональное иол разделен не ДНК хромосом на репликопы совпадает со структурным подразделе нием ДНК на домены, или петли, основания которых, как уже упоми налось. скреплены белковыми связками.
Таким образом, весь сип 1ез ДНК на отдельной хромосоме протекает за счет независимого синтеза па множестве отдельных реп тикононс последующим соединением концов соседних отрезков ДНК. Биологический смысл этого свойства становится ясным при сравнении спнте-
нп
за ДНК > бактерий и эукариот. Так. бакгсриа1ьная моНОре11;1,11СОИНШ1 хромосома длиной в 1600 мкм синтезируется со скоростью около по ттчаса. Если би сантиметровая молекула ДНК хромосомы млекопитТ-J0HH1X реплицировалась тоже как моиорепликонная структура, то на это ушло около ,,едели (Ь сУг)- Но если в такой хромосоме распото-жеяо несколько сотен репликоиов. то для полной ее репликации понадобится всего около часа. На самом же деле время репликации ДНК у млекопитающих составляет 6—8 ч. Это связано с тем. что не все реп-лпконы отдельной хромосомы включаются одновременно.
В некоторых случаях наблюдается одновременное включение всех репликонов или же появление дополнительных точек начала реплика-иии. что даст возможность закончить синтез всех хромосом за минимально короткое время. Это явление происходит на ранних этапах эмбриогенеза некоторых животных. Так. известно, что при дроблении яки шпорцевых лягушек Хепорих faevis синтез ДНК занимает всего 20 мин. тогда как в культуре соматических клеток этот провесе продолжается около суток. Аналогичная картина наблюдается у дрозофилы: на ранних эмбриональных стадиях весь синтез ДНК в ядре занима ет3.5 мин. а в клетках культуры ткани — 600 мин. При этом в клетках культуры величина реп л н конов оказалась почти в 5 раз больше, чем у эмбрионов.
Синтез ДНК полчине отдельной хромосомы происходит неравномерно Обнаружено, что в индивидуальной хромосоме активные реп-ликоны собраны в группы — репликативные единицы, которые включают в себя 20-80 точек начала репликации. Эго следовало из анализа радиоавтографов ДНК. где наблюдалась именно такая сблоченность реплицирующихся отрезков. Другим основанием для представления о существовании блоков (кластеров) репликонов или репликаииоиных единиц были эксперименты с включением в ДНК аналога тимидина-э-бромлсзоксиурпдина (BrdU). Включение BrdU в интерфазиый хроматин приводит к тому, что во время митоза участки с BrdU конденси руются в меньшей степени (недостаточная конденсация), чем те уча сткн. где включался гимиднн. Поэтому те участки митотических кро 'Юсом, в которые включился BrdU, будут слабо окрашиватьсяi n д,,Фференциши.ной окраске. Это позволяет па синхрон”3”^ культурах клеток выяснить последовательность включения’ ••
послсловдте п.ноегь сипгеза ДНК по длине одной взятой хро _°-Оказалось, что предшественник включается вболыиие) мт • л(^
«Мы. Включение разных участков происходит строго > - №coMJji
"о в течение S-периода. Каждая хромосома характер'1. era с„е.
СТао,,льностью порядка репликации по своей длине i «"Фический рисунок репликации. .икапионныеединицы.
Кластеры репликоиов, объединенные в Рс" ,Тппые вместе с “«МНЫ с белками ядерного матрикса (см. далее), которь
ферментами репликации образуют так называемые кластеросомы -зоны в интерфазном ядре, и которых идет синтез ДПК.
Порядок, в котором активируются реплмканионные единицы, может, вероятно, определяться структурой хроматина в этих участках Например, зоны конститутивного гетерохроматина (вблизи иен громе-ры) реплицируются обычно в койне S-периода, также в конце S-периода удваивается часть факультативного гетерохроматина (например, Х-хромосома самок млекопитающих). Особенно четко во времени последовательность репликации участков хромосом коррелирует с ри-супком дифференциальной окраски хромосом: R-сегменты относятся к рано репликкруюишмея, G сегменты соответствуют участкам хромосом с поздней репликацией. C-cciменты (центромера) - места самой поздней репликации.
Так как в разных хромосомах величина и число разных групп дифференциально окрашенных сегментов различны, то это создает картину асинхронного начала и завершения репликации разных хромосом в целом. Во всяком случае, последовательность начала и окончания репликации отдельных хромосом в наборе нс беспорядочная. Существует строгая последовательность репродукции хромосом относительно других хромосом в наборе.
Длительность процесса репликации отдельных хромосом прямо не зависит от их размеров. Так. крупные хромосомы человека группы А (1-3) оказываются мечеными в течение всего S периода, так же как и более короткие хромосомы группы В (4—5).
Таким образом, синтез ДНК в геноме эукариот начинается почти одновременно на всех хромосомах ядра в начале S-перко ia. Но при этом происходит последовательное н асинхронное включение разных репликонов как в разных участках хромосом, так и в разных хромосомах. Последовательность репликации того или иного участка генома строго детерминирована генетически. Это последнее утверждение доказывается не только картиной включения метки в разные отрезки S-периода, но также гем, что существе г строгая последовательность появления в холе S-периода пиков чувствительности определенных генов к мутагенам.
Основные белки хроматина - гистоны
Роль ДНК в составе как интерфазных хромосом (хроматин интерфазного ядра), так и митотических хромосом поста точно ясна: хранение и реализация генетической информации. О тако для выполнения этих функций в составе ннгерфазных ядер необходимо иметь четкую структурную основу, которая позволила бы расположить огромные по длине молекулы ДНК в строгом порядке, чтобы с определенной вре-
Н2
послеаовательпостыо протекали процессы как синтеза РНК гакирг-Уп1"каи11и'^'1^' ,,нтсРФа’и°М иЧ>с концентрация ДНКдо стагает 100 мг/мл (!). В среднем на интерфазное ядро млекопитающих приходится около 2 м ДН К. которая локализуется в сферическом ядре передним диаметром около 10 мкм. Эго значит, что такая огромная масса ДНК должна быть уложена с коэффициентом упаковки l lO’-l lO4. При этом в ядре должен сохраниться определенный поря-ток в расположении частично или полностью декондснспроваиных хромосом. Кроме того, должны быть реализованы условия для упорядоченного функционирования хромосом. Ясно, что все эти требова-нля не могут быть осуществлены в бесструктурной, хаотической сис
теме.
В клеточном ядре ведущая роль в организации расположения ДНК, веекомлактизации и регулировании функциональных нагрузок принадлежит ядерным белкам. Как уже указывалось, хроматин представляет собой сложный комплекс ДНК с белками - дезокспрнбонуклсо-протеин (ДНП), где на долю белков приходится около60% сухой массы. Белки в составе хроматина очень разнообразны, но их можно разделить на дне группы: гистоны и пегиетоновые белки. На долю гистонов приходится до 80% всех белков хроматина. Их взаимодействие с ДНК происходит за счет солевых или ионных связей и неслонифично в от-
ношении состава или последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК. Несмотря на преобладание в общем количестве, гистоны представлены небольшим разнообразием белков: эукариотические клетки содержат всего 5—7 типов молекул гистонов. В отличие от i истонов так называемые пегиетоновые белки большей частью специфически взаимодействуют с определенными последовательностями молекул ДНК. очень велико разнообразие типов белков, входящих в эту группу ^несколько сотен), велико разнообразие функций, которые они вы ВОЛНЯЮТ.
Гистоны связаны с ДНК в виде молекулярного комплекса. ввв*^ ^ъелпнии. или нуклеосом. До недавнего времени считалось, ч JHK равномерно покрыта этими белками, связь которых с Д овр ДС1ЯСТСЯ СВОЙСТВаМН ГИСТОНОВ. «КпялзЮГ
чстоны - белки, характерные только для хроматина. йства Р’Дом особых качеств. Это основные или шелочные белки.
*010Рых определяются относительно высоким содержанием т.м.
аминокислот, как лизин .. аргинин. Именно
на аминогруппах .шзпна и аргинина обус1<^1''(,ь]Ч11 заряда-v., ^’Ргстатнческую связь этих белков с о,р,,иа\ г .кгко на фосфатн ЫХ группах ДНК. Эта связь лостаточн^
на ln'i/TCH' 11 РечУльтате чего может происходи’ ...^деоиротеин. чаи К " гисто,,ы- Поэтому хроматин (дезокспри’ м нук-,U"- «* его раньше называли. пукцеогистоН) является «о*'
Общие свойства тс гонов млекопитающих
Таблица 5
Гистом Молекулярная масса Основные аминокислот ы. % Кис тыс аминокислоты, % 01 ношение ОСНОВНЫХ аминокислот к кислым
.Тииш Аргшнш
HI 23 000 29 I 5 5.4
Н2А 13 960 И 9 15 1.4
НЗВ 1.3 770 16 6 13 1,7
нз 15 340 10 13 13 1.8
Н4 И 280 и 14 10 2.5
лснново-белковым комплексом, в который входят линейные высоко-полимерныс молекулы ДНК и огромное множество молекул гистонов (до 60 млн копни каждого типа гистонов на ядро). Гистоны - наиболее хорошо биохимически изученные белки (габл. 5).
Гистоны — относительно небольшие по молекулярной массе белки. Практически у всех -эукариот они обладают сходными свойствами, обнаруживаются одни и те же классы гистонов. Классы гистонов отличаются друг от друга ио содержанию разных основных аминокислот. Так. I истоны ИЗ и Н4 относят к аргининбогатым из-за относительно высокого содержания в них этой аминокислоты. Эти гистоны являются наиболее консервативными из всех исследованных белков: их аминокислотные последовательности практически одинаковы даже у таких отдаленных видов, как корова и горох (всего две аминокислотные замены).
Два других гистона — Н2А и Н2В - относятся к белкам, умеренно обогащенным лизином. У различных объектов внутри этих i руин гистонов обнаруживаются межвидовые вариации в их первичной структуре, в последовательности аминокислот.
Гистон HI представляет собой нс уникальную молекулу, а класс белков, состоящих из нескольких достаточно близкородственных белков с перекрывающимися последовательностями аминокислот. У этих гистонов обнаружены значительные межвидовые и межжаневые вариации. Однако их общим свойством является обогашенность лизином, что делает их самыми основными белками, которые легко отделяются от хроматина в солевых (0,5 М) растворах. В растворах с высокой ионной силой (1-2 М NaCI) все гистоны полностью отделяются от ДНК и переходят в раствор.
Для гистонов всех классов (особенно для Hl) характерно кластерное распределение основных аминокислот - шзпна и аргинина, на N и С-конпах молекул. Срединные участки молекул iистоков образуют несколько (3-4) а-спиральпых участков, которые компактизуются в глобулярную структуру в изотонических условиях (рис. 56). По-внди-
114
momv. богатые положительными зарядам it и ес пи рал и з ова иные кониы бочковых молекул гистонов и осуществляют их связь друг с другом и с ДНК
У гистона НI наиболее вариабельных* является N-конец, осуществляющий связь с другими гистонами, а С-консц, богатый лизином, взаимодействует с ДНК.
В процессе жизнедеятельности клеток MOiyr происходить
Рис. 56. Схема трехмерной структуры гистона Н1
а-Спиральные участки г /-4) и фибриллярные С- и N-мишы |Ю.1инспп1Л1юй псин
посттрансля! знойные изменения (модификации) гистонов: ацети-
лирование и метилирование некоторых остатков лизина, что приводит к потере числа положительных зарядов, и фосфорилирование сериновых остатков, приводящее к появлению отрицательного заряда. Ацетилирование и фосфорилирование гистонов могут быть обратимыми. Эти мо зификашш значительно меняют свойства i Истонов, их способность связываться с ДПК. Например, повышенное ацетилирование метонов прел шествует активации генов, а фосфорилирование и дефосфорилирование связаны соответственно с конденсацией и дскон-
ленсанией хроматина.
Гистоны синтезируются в цитоплазме, транспортируются в ядро и связыванием с ДНК во время ее репликации в S-периоде. т.е. синтезы гистонов и ДНК синхронизированы. При прекращении клеткой синтеза ДНК гистоновые информационные РНК за несколько минут распадаются и синтез гистонов останавлз1вается. Включившиеся в.хрома-
тин гистоны очень стабильны, имеют низкую скорость замены.
Подразделение гистонов на пять зрупн и достаточное ’ внутри каждой группы в целом характерны для эукариот, ли Дый ряд отличий в составе гистонов наблюдается каку высш и?• У низших эукариотических орзаиизмов. Так, у низших f_
•’место И1. характерною для всех тканей этих орзаиизмов. пШ(а
U4 находят гистон Н5. который содержит больше api изинь В зо же время наблюдается отсутствие некоторых гРуП,,У11 ле?|К01« на Л<1 эукариот и в целом ряде случаев полная замена
ipvi ис
Гистоиоподобные белки были обнаружены 11 вы
'ернй и митохондрий Так. у £ «Л11 клетке “большI 11а110чцца-
>нысиы белки (HU и Н-NS), но аминокислотному со >
ЮИП1С IИСТОНЫ.
115
Функциональные свойства гистонов
Широкое распространение гистонов, их сходство даже у очень отляпанных видов, обязательность вхождения их в состав хромосом - все это говорит об их чрезвычайно важной роли в процессе жизнедеятельности клеток. Еще до открытия нуклеосом существовало две взаимодополняющие друг друга пэуппы гипотез о функциональной роли гис-гонов. о регуляторной и структурной их роли.
Обнаружено, что выделенный хроматин при добавлении к нему РНК-иолимеразы может быть матрицей для транскрипции, однако активность его составляет всего лишь около 10% от активности, соответствующей активности вы {еденной чистом ДНК. Эта активность прогрессивно возрастает по мере удаления групп гистонов и может достичь 100% при полном удалении гистонов. Отсюда следовало, что общее содержание гистонов может регулировать уровеныранскрипшш. Это наблюдение совпадает с тем фактом, что по мере удаления гистонов, особенно HI, происходит прогрессивная декоиденсапия разворачивание фибрилл ДНП, что, возможно, облегчает взаимодействие PH К-пол и мсразы с матричной ДНК. Также обнаружено, чго модификация гистонов приводит к усилению транскрипции и одновременной декомпактизанни хроматина. Следовательно, напранзивается вывело том, что количественное и качественное состояние гистонов влияет на степень компактности и активности хроматина. Однако оста пячен открытым вопрос о специфичности регуляторных свойств гистонов: какова роль гистонов при синтезе специфических иРНК в различно дифференцированных клетках? Этот вопрос по сих пор еще не решен, хотя можно сделать некоторые обобщения: па эту роль могут претендовать те группы гистонов, которые наименее консервативны, такие как Н) или как Н2А и Н2В, которые могут в значительной мере модифицироваться и тем самым изменять свои свойства в определенных участках генома.
Была очевидна и структурная — ком пак титрующая — роль iисто-нов в организации хроматина. Так. постепенное добавление фракции гистонов к растворам чистой ДНК приводит к выпадению в осадок комплекса ДНП, и, наоборот, частичное удаление гистонов из препаратов хроматина ведет к его переходу в растворимое состояние. В то же время в цитоплазматических экстрактах ооцитов земноводных пли я и и морских ежей, содержащих свободные гистоны, добавлен не любой ДНК (включая фаговую) приводит к образованию хроматиновых фибрилл (ЛИП), длина которых в несколько раз короче исходных ДНК. Эги данные говорят о структурной, компакти зируюшеи роли гистонов. Для того чтобы огромные сантиметровые молекулы .11IK уложить подлине хромосомы, имеющей размер всего несколько микрометров. молекула ДНК должна быть скручена, комнактнзована с
116
плотностью упаковки, равной I : ю ООО. Оказала i
компакта заиии ДНК существуют несколько у^ей
вые из которых прямо определяются вяимодействием гистонов с
Первый уровень компактизации ДНК' структурная роль нуклеосом
В ранних биохимических II электронно-микроскопических работах было покачано, что препараты ДНП содержат нитчатые структуры с тиаметром от 5 до 50 нм. Постепенно стало ясно, что диаметр фибрилл хроматина зависит от способа выделения препарата.
На улыратонких срезах интерфазных ядер и митотических хромосом после фиксации глутаровым альдегидом обнаруживались хроматиновые фибриллы толщиной 30 им. Такие же размеры вмели фиб-ритлы хроматина при физической фиксации ядер - при быстром замораживании ядер, скалывании объекта и получении реплик с таких препаратов. В последнем случае исключалось воздействие на хроматин переменных химических условий. Но все эти методы и приемы не давали никакой информации о характере локализации ДНК и гисто-
нов в хроматиновых фибриллах.
Крупным событием в изучении хроматина было открытие двумя разными способами нуклеосом - дискретных частиц хроматина. Так, ври осаждении на подложку для электронной микроскопии препаратов хроматина в щелочных условиях при низкой ионной силе можно было видеть. Что пит и хроматина представляли собой что-то напоминающее «бусы на нитке»: небольшие, около 10 нм, глобулы, связанные •Друг с другом отрезками ДНК длиной около 20 нм (рис. 57 и 5 >• ’И наблюдения совпадали с результатами фракционирования хроматина после частичного нуклеазного переваривания.
было найдено, чго если подпер! нуль действию нуклеазы микро, ков выделенный хроматин, то он подвергается распаду на регу. повторяющиеся структуры. Например. ДНК. полученная изхр па, обработанною нуклеазой, сосз ояла и з серии °’Р“К“"'" uvraeo-парам оснований; встречались отрезки в 200.400.6 0. .-оста-|и.тов(п и.) и больше. Это говори г о том. что нуклеазной а 1 вс хроматина по ввергаются участки ДНК, расположен!! ,
’“Ре*каждые 200 н.п. При лом в кнс!1оторас™оримуюфр..кцик кополимерпая) ДНК у ходит всего 2% ядериой Д1 ' |(t)VI нрова-
•зе такой нуклеазной обработки из хроматина пу им „ltj|CHrauun "''« удается выделить фракцию частиц со ск^’ “ сыииеитаиии s - единица Сведберга. определяющая с Р* величине разниц, равна I 10 с), а также частицы кратного згой вел.
117
Рис. 57. Фибриллы хроматика
° фибриллы. вылс денные hi ядер jpiiTpoititTOB тритона: б - нумепсомшк строение хроматина. « нуклсимсры (ИМ) (супербилы) к сосите ЗД-нлиомсгроных фибрилл хром.-пина
мера: димеры, гримеры. тетрамеры и т.л. Оказалось. что чистины 1 IS содержат около 200 н.н. ДНК к восемь гистонов (октамер) полис копии 1ИСТОНО» Н2А. Н2В, ИЗ и Н4 и одну копию iистина 111. Такая сложная нуклеопротеидная часгипа получила натнание нуклеосомы Более подробный анализ лой фракции показал, что нуклеосома устроена следующим образом: октамср rncioiiouобразуетбелковую<х:но-
118
, - сердцевину (от англ, core -кор, коровая частица). по поверхности которой располагается ДНК величиной в 146 п.н., образующая 1,75 оборота; остальные 54п.н- ДНК образуют участок. не связанный с белками серлпеви-ны, - линкер, которым, соединяя две соседние нуклеосомы, переходит в ДНК следующей нуклеосомы. Гистон HI связыннется частично с основой (ссрлиевнной) и с участком линкера (около 30 п.н.). Следовательно, полная
Рис. 58. Нуклеосомы в виде «бусин на нити»
нуклеосома содержит около 200 п.н. ДНК (146 п.и. - сердцевина, 30п.н. -участок линкера в комплексе с гистоном HI. 30 п.н. - свободная ДНК), октамер сердцевинных (коровых) гистонов и одну молекулу гистона HI (рис. 59). Молекулярная масса полной нуклеосомы- 262 000 Да. Рассчитано, что на весь гаплоидный геном человека (3 • (О9 лар оснований) приходится 1.5 К)7 нуклеосом.
Сердцевина. или коровая частица (или минимальная нуклеосома), очень консервативна по своей структуре: она всегда содержат 146 п.н. ДНК и окт амер гистонов. Линкерный участок может значительно
варьировав юг 8 до 114 п.н. на нуклеосому).
Используя метод рассеяния нейтронов, удалось установить форму и точные размеры нуклеосом; при грубом приближении это плоский цилиндр или шайба диаметром II нм и высотой 6 нм. Располагаясь на под-чожке для электронного микроскоп ировалия, они образуют •бусины» — глобулярные образования около 10 нм, гуськом, тандемно сидящие на вытянутых молекулах ДПК. На самом Жс деле вытянутыми являются тотько линкерные участки, остальные гри четверги длины ДНК спирально уложены но пе-Рифгрип гистоновою окза.мсра. dM гистоновый октамер, как
Н4 IB Н2А П2В
Рис. 59. Схема строения нсклеосом-нои частицы (/) ,„сгм„я
Всосмяс-с «хоаяг^.ир -Р ок1.пк|К|-’>"ФР‘,',,’",‘1 Х|" пар ochokjhihi (Л
119
Рис. 60. Схема расположения шетонон в нуклеосоме
Рис. 61. Фибрилпа хроматина диаметром 30 нм (</) и нуклеосом ная нип. ДНП (6)
считают, имеет форму, напоминающую мяч для игры в регби, и состав которого входят тетрамер (НЗ Н4)2 и дна независимых димера Н2А-П2В. На рис. 60 представлена схема расположения гистонов в сердцевинной части нуклеосомы.
В фибриллах хроматина линкерный участок не линеен. Продолжая спираль ДПК на поверхности нуклеосомной частицы, он связывает соседние нуклеосомы так, что образуется как бы сплошная нить толщиной около Ю нм, состоящая из тесно расположенных нуклеосом (рис. 61). При Этом за счет дополнительной еппрализа-нии ДНК (один отрицательный супервиток ДНК на одну нуклеосому) происходит первичная компакт и запия ДНК с плотностью упаковки, равной 6-7 (200 п.н. длиной 68 нм уложены в глобулу диаметром 10 нм). Укладка почти двух витков ДНК по периферии сердцевины нуклеосомы происходит, как считается, за счет взаимодействия положительно заряженных аминокислотных остатков на поверхности окта-мера гистонов с фосфатами /III К. N- и С концевые участки сердцевинных гистонов, обогащенные положительными зарядами, вероятно, служат для дополнительном стабилизации структуры нуклеосомы.
Ведущая роль сердцевинных (коровых) белков в компакта запии ДНК показана при самосборке нуклеосом. Регулируя пос 120
^овагельность добавления гистонов и ДНК, удалось позучю, ПП1 иую реконструкцию нуклеосом. В этом процессе не играет рази источник, откудабыла взягаДНК: это может быть ДНКбактс™" «даже циклическая ДНК вирусов. «казалось, что для сбразоХХ гаеосом гистон НI не требуется, он участвует в связывании уже гот-’ вь« „умеосом друг с дрУ гом и в образовании более высоких уровней компаетизаиии ДНК. Ключевыми в построении нуклеосом оказались гистоны НЗ и Н4. При этом вначале ДНК связывается с тетрамепом (НЗ Н4)2. к которому позже присоединяются два димера H2AH2li.Be-роятно. высокая консервативность в строении гистонов НЗ и Н4отражает их ведущую структурную роль на первых этапах компакта запив ДНК при образовании нуклеосом.
Нуклеосомы при репликации и транскрипции
Как же происходит образование нуклеосом при репликации ДНК. какова судьба нуклеосом в вилке репликации, как распределяются новые II старые нуклеосомы или их белки - все эти вопросы еще до копия не разрешены.
При электронно-микроскопическом исследовании реппниирую-шегося хроматина было обнаружено, что обе новообразованные фибриллы содержат нуклеосомы. Если учесть скорость синтеза ДНК эукариот (20 нм/с), то новые нуклеосомы при удвоении хромосомных фибрилл должны возникать со скоростью 3-4 с. Такая высокая скорость образования нуклеосом связана с тем, что в момент синтеза ДНК уже существует пул синтезированных гистонов всех классов, готовых войти в состав нуклеосом. Гистоновые гены, относящиеся к фракции уме рснио повторяющихся последовательностей ДНК. представлены в вп лс множественных копий для каждого гистона. Они активируются «местес началом синтеза ДНК. поэтому по мере пратвижения ревли-«шионной вилки новые участки ДНК могут сразу взанматсиспюгать с ноносиитсзированными гистонами. Новосиитсзированнью гис и старые гистоны в составе предшествующих нук1еоСОМ *и^М^мссг0 ются при образовании нуклеосом во время репликации ' _.таЮ1СЯ него октамеры гистонов, присутствующие ло реиликаип». интактными и переходят на дочернин дуплекс ДНК. втоврех от
пктоиы собираются в совершенно новые кор-частпны нас с “уклсосом участках ДНК. Старые и новые октамеры iистоков рэспрс Ляются между дочерними дуплексами ДНК случайным оо|м1 ‘дцк.
4in происходит со старыми нуклеосомами в вилке ре • х0М пр[| 40 1(0,1 на не ясно. Согласно одной из гипотез. каждая из „полу-
г,олхоле к пей реплика шиной вилки как бы расшспляис пройти ’’Уклсосомы», а нуклеосомная Д11К ра шорами вас гея. мт
12!
этот учветок ДНК-полимеразс. После лого новосинтезированная цепь ДПК связывается со свободными жетонами. которые есть в избытке в ядре, и образуются новые нуклеосомы на второй цепи ДНК.
Как у же \ поминалось, для активно функционирующих зон хроматина характерно деконденсироваиное, диффузное, состояние. На этом свойстве хроматина основан одни из методов получения фракций активного хроматина, когда с помощью центрифугирования удается осадить конденсированный хроматин из гомогенатов ядер, отделив его тем самым от диффузного хроматина, обладающего высокой транскрипционной активностью. Фракции активного хроматина обладают рядом характерных свойств: повышенной чувствительностью к нуклеазам, повышенным уровнем модификации жетонов (особенно ацетилированием жетона HI), повышенным содержанием некоторых не гистоновых белков.
Биохимические данные показывают, что во время транскрипции часть иуклеосомиых белков остается связанной с ДНК. Нуклеосомы как частицы видны на .хроматиновых фибриллах как до места отхождения транскрипта, так и после него при редкой посадке РНК полимеразы - фермента, вдвое большего, чем нуклеосома. При частой посадке этого фермента (например, при транскрипции рибосомных генов или генов в других активных локусах) частицы РНК-нолимеразы располагаются тесно друг к другу и между ними нуклеосомы не видны (см. рис. 101). Вероятнее всего, пуклеосомные белки при прохождении РНК полимеразы не теряют связи с ДНК, а сама ДНК в составе нуклеосомы разворачивается. Предлагаются два варианта изменения структуры нуклеосом при синтезе РНК. При одном их них нуклеосома «расщепляется» на две полунуклеосомы. а ДИК разворачивается, при трутом — нуклеосома, частично лекомпактизируясь. сохраняет гетра мер (ИЗ Н4)2, а лва димера Н2А-Н2В временно отходят, а затем, после прохождения PH К-полимеразы, возвращаются, при этом восстанавливается исходная нуклеосома.
Второй уровень компактизации ДНК - фибрилла диаметром 30 нм
Таким образом, первый, нуклсосомный, уровень компактизации хроматина итраег как регуляторную, так и структурную роль, обеспечивая плотность упаковки ДНК ирибли знтсльно в 6-7 раз.
Однако во многих электронно микроскопических исследованиях было показано, что как в митотических хромосомах, так и н интерфазных ядрах выявляются фибриллы хроматина диаметром 30 нм (рис. 57, ей 62). Хромщ иновыс фибриллы такого диаметра были видны как на ультратопких срезах после фиксации глутаровым алкает и дом. так и на препаратах выделенного хроматина и выделенных хро
122
мосом в растворах, содержащих хотя бы низкие концентрации двухвалентных катионов. Показано, что фибрилла хроматина диаметром 30 нм может обратимо менять свой диаметр: становится фибриллой толщиной 10 нм. если препараты хроматина перевести в деионизованную волу ити в растворы, содержащие хелатон ЭДТА. В то же время важе частичная экстракция в истока Н I переводит исходные фибрины хроматина (30 нм) в нити диаметром 10 нм. имеющие типичный нуклеосомныи уровень организации. При добавлении к ним гистона HI восстала вливается первоначальный диаметр фибрилл.
Все это гоиорило о том, что нуклеосомы ые цепочки хроматина каким-то специфическим образом уложены так. что возникает нс .хаотическая азревапия нуклеосом, а правил ь-
а б
Рис. 62. Схема строения 30-нано-McrpoHoii фибриллы хромагина а - соленоидный гни; 6 тклеомср-ний тин укладки нуклсосомкон фибриллы
пая нитчатая структура диаметром Ч) нм.
Относительно характера упаковки хромагина диаметром 30 нм существуют. ио крайней мерс, две ленки зрения. Одна из них защищает так называемый соленоидный тип укладки нуклеосом. Согласно этой модели, нить плотно упакованных нуклеосом д намел ром 10 нм обра зует в свою очередь спиральные вит ки с тагом спирали около 10 им. На один виток такой суиерспирдлн приходится шесть нуклеосом (см. рис. 62). В результате такой уиаков ки возникает фибрилла спирального типа с центральной поЛ^г^и которая иногда на невагивно окрашенных препаратах ык1^ как узкий «канал» в центре фибриллы. При частичном раз нии. декомнактизании такой фибриллы и нанесении ее п. . хорошо видно «звн зав «образное» расположение нуклывеолi схду
риллы. Считается, что впсгон HI обеспечивает взаимолс1с с
соседними нуклеосомами, нс только сближая,,сня3.1 _ межд\' иук-Гом« но и способствуя образованию кооперативно»! с ирачь (П лсосомами, благодаря чему возникает довольно н- ‘ г11СГОца Ш Фибриллы диаметром К) нм. Ула-вение, лаже час! в * .1аметром «ызыиаст нерехо i фибриллы диаметром 30 им нФ11 ' |Непослсл-1,1 нм, а при полном удалении его происходитра шора MiaK0U. Нс" незрукгуру тина «бусин па нити». Такой сазеновиньп
нуклеосом в составе фибриллы
123
кп ДНК приводит к плотности упаковки, равной приблизительно40 (т.с. на каждый микрометр нити приходится 40 мкм ДНК). Эти представления получили подтверждение при анализе структуры хроматина с помощью дифракции рентгеновских лучей и нейтронов. Здесь необходимо отметить, что представление о соленоидном типе укладки получено ill анализа вторично конденсированного хроматина. Вначале были получены препараты хроматина в присутствии ЭДТа или выдела тись в растворах низкой ионной силы в присутствии ионов магния. Во всех этих случаях первоначально хроматин дсконденсировался до уровня «бусин на нити», где отсутствует или дестабилизируется контакт между нуклеосомами.
Если же исследовать хроматин в составе ядер или в виде выделенных препаратов, но при поддержании определенной концентрации двухвалентных катионов (не ниже 1мМ). ю можно видеть дискрет ность в составе фибрилл хроматина диаметром 30 нм: она состоит как бы из сближенных глобул того же размера - из ну клсомеров. В зарубежной литературе такие 30-нанометровые глобулы, или нуклеомеры. получили название сверхбусин («суиербиды») (см. рис. 57, ей 62). Обнаружено, что если в условиях, когда нуклеомерная структура фибрилл хроматина сохраняется, препараты хрома! ина подвергнуть нуклеазной обработке, то часть хроматина растворяется. При этом в раствор выходят частицы, имеющие размер около 30 нм. с коэффициентом седиментации, равным 45S, в растворах, содержащих 1 мМ .магния. Если такие выделенные нуклеомеры обработать ЭДТА. удалить ионы магния, то они разворачиваются в нуклсосомные цепочки, содержащие 6-8 нуклеосом. Таким образом, в состав одного пуклеомера входит отрезок ДНК. соответствующий 1600 парам оснований, или 8 нуклеосомам.
Компактность нуклсомера зависит от копией граним ионов магния и наличия гистона Н|. Негистоновые белки в конформационных превращениях нуклеомеров не участвуют.
Итак, основная фибрилла хроматина диаметром 30 нм представляет собой линейное чередование нуклеомеров вдоль компактнзованной молекулы ДНК (см. рис. 621. Вероятно, гистоны НЕ находясь в центральной зоне этой крупной частицы и взаимодействуя друг с другом, поддерживают ее целостность. В пользу этого говорят данные о кооперативном связывании гистонов Н1 в группе по 6-8 молекул.
Противоречие между соленоидной и нуклеомерной моделями упаковки нуклеосом в составе фибрилл хроматина может быть снято, если при нягь модель нерегулярного соленоида: число нуклеосом на виток спирали нс является строго постоянной величиной, что может привести к чередованию участков с большим или меньшим числом нуклеосом на виток.
Нуклеомернык уровень укладки хроматина обеспечивает 40-кратное уплотнение ДНК. что важно не только для достижения пелен компакт изаиии гигантских молекул ДНК. Компа ктпзаиия ДНК в составе
124
фибрилл хроматина диаметром 30 им может налагать допозните/»..,^ функциональные ограничения. Так, обнаружено, что в составе Либ риалы .хроматина диаметром 30 нм ДНК становится практически е доступной для взаимодействия с таким ферментом как метитЛ ДНК. Кроме того, резко падает способность .хроматина связываться с РНК полимеразой и рядом регуляторных белков. Таким образом второй х ровен ь ко.мпактизании ДНК может Играть роль фактора, инакти-виру кэше го гены.
В заключение необходимо еше раз напомнить, что как иуклеосом-вый. так и иуклеомерный (супербидный) уровни компакгизапииДНК хроматина осуществляются за счет гистоновых белков, которые участвуют не только в образовании нуклеосом, по и в их кооперативном объединении в Blue фибрилл ДНП. где ДНК претерпевает дополнительную сверхсииралнзашно. Все остальные уровни компактизашш связаны с дальнейшим характером укладки фибрилл диаметром 30 нм и новые ком-пактизашюнные уровни, где ведущую роль играют исгистоиовыс белки.
Негистоновые белки
Негистоновые белки составляют около 20^ всех белков хроматина. По определению, негистоновые белки - это все белки хроматина (кроме гистонов), выделяющиеся с хроматином или хромосомами. Это сборная группа белков, отличающихся друг от друга как по общим свойствам, так и по функциональной значимости. ОколоЖУ* негисго-новых белков относится к белкам ядерпого матрикса, обнаруживаемых как в составе пнтерфазных ядер, так к митотических хромосом. Эта группа белков будет отдельно рассмотрена в разделе, посвяшь» ном комплексу структур, в.хо гяших в состав ядерно!о матрикса, фио розный слой, иди ламина ядерной оболочки, и внутренний ядерныи матрикс, иитерхроматнновая сеть, матрикс ядрышка.
Во фракцию негнетоновых белков может входить около , вилуальпых белков с различной молекулярно» массой р - *
Часть этих белков водорастворима, другая часть растворимаi в растворах, а третья часть непрочно связана с хроматином и ет при 0.35 М копнен грации сочен (NaCI) в присутствииг._ ‘ x||K.r ших агентов ( 5 М мочевина). Повт^У xapiiKrepHtTi’K^ ‘ ч»я лих белков затру, щены, а сами белки еше нед<^” оеплятир-
Срсди негнетоновых белков обнаруживается Нель |1Н.
иых белков, какешмулируюшн.х траИсК{^..ии11|1еся с омре-
ее. а „Ле белки.
леленными последовательностями на ДНК. *х нуклеиновых
откосят также ферменты, участи)юшие » мс™*'’сонаты ДИК и кис,от (ДНК-пмимсразы, ДПК топоизомеразы.
РНК. РНК полимеразы. РНКазы и ДНКазы и т.д.), белков хроматина (протеинкиназы, метилазы, ацетилазы, протеазы и др.) и многие др} ГИС.
Наиболее подробно изучены негистоновые белки так называемой группы с высокой подвижностью (HMG — high mobility group, или «белки Джойса»), Они .хорошо экстрагируются в 0.35 М NaCl и 5%-ной НСЮ4 и обладают высокой электрофоретической подвижностью (отсюда их название). Основных HMG-белков четыре: IIMG-I (мол .масса 25 500 Да), HMG-2 (мол. .масса 26 000 Да), HMG-14 (мол. масса 100 000 Да). HMG-I7 (мол. масса 9247 Да). Эта группа наиболее богато представлена средн net нс тоновых белков: в клетке их около 5% от всего числа гистонов. Особенно часто эти белки встречаются в активном хроматине (примерно I молекула HMG-белка на 10 нуклеосом). Беткн HMG -1 и HMG-2 не входят в состав нуклеосом, а связываются, видимо, с линкерными участками ДНК. Белки HMG-I4 и HMG-I7 связываются с сердцевинными белками нуклеосом, что обеспечивает, вс роятно. изменение уровня компактизанин фибрилл ДНП. которые становятся более доступными для взаимодействия с РНК-по.чимеразой. В этом случае HMG-белки выступают в качестве регуляторов трапскрпп-ционной активности. Обнаружено, что фракция хроматина, обладающая повышенной чувствительностью к ДНКазе I, обогащена HMG-белками.
Петлевые домены ДНК - третий уровень структурной организации хроматина
Расшифровка принципа строения элементарных хромосомных компонентов — нуклеосом и фибрилл диаметром 30 нм - ешс мало что дает для понимания основ трехмерной ор!анизацин хромосом как в ннтерфазе, так и в митозе. Сорокакратнос уплотнение ДНК. которое достигается при сверхсннральном характере ее компактизанин, совершенно еще недостаточно для получения реального (МО4) уровня уплотнения ДНК. Следовательно, должны существовать более высокие уровни компактизанин ДНК. которые в конечном счете определяют размеры н общие характеристики хромосом. Такие высшие уровни организации хроматина были обнаружены при искусственной его декой дснсации, коыа выяснилось, что поддержание их связано с негистоновыми белками. В этом случае специфические белки связываются с особыми участками ДНК, которые в местах связывания образуют большие петли, или домены. Таким образом, следующие более высокие уровни компякти займи ДНК связаны нс с ее дополнительной спи рализаиией. ас образованием поперечной петлистой структуры, илу шей влочь интерфазиой или миюшческой хромосомы.
Как уже указывалось, сложная структура ядра, или нук.теои ia. про кариот opi авизована в виде иерархии петлевых доменов Д11К, связан-
126
1|Ых с небольшим количеством специальных белков. Петлевой поив цнп упаковки ДНК обнаруживается также и у эукариотических клё гок. Тик, если выделенные ядра обработать 2 М NaCl, т.е. удалить все гистоны, то целостность ядра сохраняется, за исключением того что вокруг ядра возникнет так называемое гало, состоящее из огромного числа петель ДНК. Такая структура ядер получила название <нуклеина» (это только терминологическое сходство с яиерным аппаратом прокариот). Гало (или периферия такого нуклеоида) состоит из огромного (до 50 000) количества замкнутых ла периферии петель ДНК средний размер этих петель около 60 т.п.п. Основание петель закреплено внутри ядра, на участках негпетоновых белков. Тем самым считается. что после удаления гистонов основания петлевых доменов ДНК связаны с так называемым матриксом, или скэффоддом, - негистоновым белковым остовом иптерфазного ядра. Оказалось, что участки ДНК, связанные с этим остовом, имеют особое сродство к негистоио-вы.м белкам. Их состав изучен, они получили название MAR- (matrix attachment region), или SAR- (scaffold attachment region) участков.
Оказалось, что петлевые иомены ДНК интерфазных ядер можно выделить. В выделенных ядрах в присутствии двухвалентных катионов (2 мМ Са2+) в хроматине ядра выявляются небольшие сгустки величиной около 100 им — хромомеры. Если такие хромомеры препаративно
вылези гь. а затем экстрагировать из них гистоны, то с помощью электронною микроскопа можно видеть розетковидные петлистые структуры. где отдельные петли отходят от пентрхтьного плотного участка. Количество петель в такой ротетке может составлять 15-80, а общая величина ДНК может достигать 200 т.п.п. с суммарной длиной ДНК до 50 мкм. Обработка таких розеток протеиназами приводит к исчезновению плотной центральной области розетки и к разворачиванию петель ДНК
Признаки петлевой доменной организации хроматина .можно наблюдать с помощью электронного микроскопа после помещения ядер или хромосом в солевые растворы низкой войной силы (0.01 М в присутствии низких концентраций двухвалентных катионов (I м В этих условиях не происходит депротеинизации хроматина, он сохра няетсвою Нормальную химическую композицию, но значительно fxu рыхляется и представлен стандартными фибриллами толщиной н. При этом в некоюрык местах можно видеть, что отдельные сг^ конденсированного хроматина выявляют особую структуру то ^ткоипдныс образования, состоящие из многих петель Ф»юр1 МегРом 30 нм. соединяющихся в обшем плотном центре, ре позет. Чер таких петлистых розеток достигает 100-150 им. СЛМЫ\
ки фибрилл хроматина - хромомеры - можно видеть в Ракообразных объектов: животных, растений. простевших (Р> на
Особенно демонстративно такие хромомеры выявп препаратах хроматина из макрон»^овв.к!» «’Р»'1
127
Рис. 63. Хромомеры в составе хромосом, дскондснсированных гипотонией о обшив вид ультра гонких срезов дскои. геисиронанных мшогических хромосом; б-розеткови имя структура отдельных хромамеров того же препарата; / - центральная часть хромомера: 2- ранга гыю расходящиеся фибрн г гы ДНП
В этом случае можно видеть, что каждый хромомер состоит из нескольких содержащих нуклеосомы истечь, которые связаны в одном центре. Хромомиры связаны jipyi с другом участками нуклеосомного хроматина, так что в целом видна цепочка розетковидных структур (рис. 64).
Сходные картины можно наблюдать при разрыхлении ио.титенных хромосом. Здесь хромомеры в виде розеток хромагина выявляются в зонах хроматиновых дисков, в то время как междисковыс участки их не содержат (рис. 65). При дсконденсанин хроматина ядер некоюрых растений (Allium. Ilacniannius, Vicia). /ыя которых характерна особая структура интерфазных ядер, хромомеры видны в составе хромопем пых нитей.
128
Подобные розстковпдныс псгли-стые структуры хромомеры. можно видеть также при разрыхлении митотических хромосом как животных, так и растении. Следовательно. хромосомные фибри ты тиаметром 30 им. состоящие из ДНК и гистонов, упаковываются в пиле петлистых розетко-видных структур, пре герпсвая еше ло-полнительную компакт шипю. Этот третий уровень структурной организации хроматина, как считается, может приводить уже к 600-кратной компак-тизаиии ДНК (рис. 66).
Важно отметить, что размер отлет ьных метче вых доменов совпадает с размером средних ренликонов и может соответсгвонать одному или нескольким >енам. В своих основаниях пени ДПК связаны негистоновыми белками ядерного матрикса, в состав которых могут входить как ферменты репликации ДНК. так и фанскрип-пип. Такая петельно-доменная структура хроматина не только обеспечивает структурную компактизанию хроматина, но и организует функнио-
Рис. 64. \ромомсры. выделенные из макрону клеуса инфу зорим Попенко)
129
Рис. 66. Схема начальных уровней компактизании хроматина
/ пук (сосочный: 2 - нуклеомерный (30-наиомсгроваи фибрилла ДНП); 3 -хромомерныи (петлевой домен); 4 - хромонемный
кой структурно-функциональной ортанизапии .хроматина, относится к белкам ядерното матрикса.
Глава 6
ЯДЕРНЫЙ БЕЛКОВЫЙ МАТРИКС
Общий состав ядерного матрикса
Мы уже познакомились с тем, что в интерфазном ядре развернутые хромосомы располагаются не хаотично, а строго упорядоченно. Такая организация хромосомы в трехмерном пространстве ядра необходима не только для того, чтобы при митозе происходила ссгрекшия хромо сом и их обособление от соседей, но и для упорядочения процессов ре пликапии и транскрипции .хроматина. Вероятно, для осуществления этих задач должна существовать какая-то каркасная внутриядерная система, которая может служить объединяющей основой для всех ядерных компонентов, хроматина, ядрышка, ядерной оболочки. Такой структурой является белковый я торный остов, или матрикс. Необходимо сразу же оговориться, что ядернмй матрикс нс представляет собой четкой морфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический гетерогенный компонент при эксгракиии из я тер практически всех участков хроматина, основной массы РНК и пню-протеилов ядерной оболочки. От ядра, которое нс теряет при лом сво'
130
ей обшей морфологии, являясь сферической структурой оста бы каркас, остов, который иногда называютеше верным скеТтТ"
Впервые компоненты ядерното матрикса (остаточные ядерныХ ки) были выделены и охарактеризованы в начале 1960-х годов Г» ружено, что при последовательной обработке изолированных ятеп nt чеии крыс 2 М раствором NaCl. а затем ДНКазой происходит ..отноё растворение хроматина, а основными структурными элементами‘я™ остаются: ядерная оболочка, связанные с ней компоненты - тикл'ео иемы (ядерные нити), содержащие белок и РНК. и ядрышки Была высказана гипотеза, что фибриллы хроматина в нативных ядрах при креплены к этим осевым белковым нитям наподобие ершика для чи-CTKII бутылок (рис. 67),
ох
схсма строения пнгерфазного ядра (Георгиев
II ’ )
М№;. ядрылко; ОХ око к»|дры1лкопый хроилиш; СЯ яирный
л,е ЮКс»‘Р»»боц> K_ieoiipo । сил
131
Значительно позднее (середина 1970-х голов) эти работы получили развитие и приведи к появлению массы новых сведений о нсхромати-новых белках ядерного остова и о его роли в физиологии клеточного ядра. В по же время был предложен термин «ялерный матрикс» дли обозначения остаточных структур ядра, которые могут быть получены в результате последовательных эксгракиий ядер различными растворами Новым в этих приемах было использование неполных детергентов. таких как Тритон X ТОО. растворяющих ядерпые липопротеидные мембраны.
Последовательность обработки выделенных ядер, приводящая к получению ирепараюв ядерного матрикса, обогащенного белком, представлена в табл. 6.
Изолированные ядра, полученные в растворах 0,25 М сахарозы, 0,05 М /и/jwc-HCI буфера и 5 мМ MgCl2. помещались в раствор низкой ионной силы (LS), где деградировала основная масса ДНК за счет эн-доиуклсазио!о растепления. В 2 М NaCl (HS) затем происходила диссоциация хроматина на гистоны и ДНК. шла дальнейшая экстракция фра!менгов ДНК и различных белков. Последующая обработка ядер в 1%-ном растворе Тритона Х-100 приводила к почти полной потере фосфолипидов яясрной оболочки и получению ядерного матрикса (NM). содержащего остатки ДНК и РНК. которые дополнительно растворялись при обработке нуклеазами. в результате чего получали конечную фракцию ядерного белкового матрикса (NPM). Он состоит на 98% из негистоновых белков, в него, кроме того, входит 0,1% ДНК. 1,2% РНК и 1.1% фосфолипидов. Химический состав ядерного матрикса. полученный таким способом, сходен у различных объектов (табл. 7).
По своей морфологической композиции ячерный матрикс сосюит. по крайней мерс, из грех компонентов: периферического белкового сетчатого (фиброзного) с гоя — ламины (nuclear lamina, fibrous lamina), внутренней, или интерхромагииовои, сети (остов) и «остаточною» ядрышка (рис. 68).
Гао. ища б
Экстракция (в %) ялерных компонент» в процессе получения ядерного бе гкового магрмкса
П ослетователыюсть обработки Фракция Белок шк 1’НК Фнсфо.НГПМТЫ
Контроль NI 0 0 0 0
0.2 мМ MgCI2 LS 52 75 19 2.5
2 М NaCl IIS 83 97 66 6.4
1%-ный Тритон X-100 XXI 90 97 71 97.8
ДНКазан РНКаза NTM 90 99 98 98
132
Рис. 68. Ядерный белковый матрикс
о схема строения ядер ло экстракции; б - после экстракция. / - примембринный белковый стой (ламина) и поровые комплексы: 2 - межчро\1.-п ивовая бетковая сеть матрикса; 3 — бе шовым матрикс ядрышка
Ламина представляет собой тонкий фиброзный стой, подстилающий HiiyipcHinoK) мембрану ядерной оболочки. В ее состав входят также комплексы ядерных пор, которые как бы вмурованы в фиброзный слой. Часто эту часть > шого матрикса называют фракцией •поровый комллекс-ла.мина» (i CL: роге complex-lamina). В интактных клетках и ядрах ламина большей частью морфологически не выявляется. так как к ней тесно прилегает слой периферического хроматина. Лишь иногда сс удается наблюдать в виде относительно тонкого (Ю-20 нм) фиброзного слоя, располагающегося между внутренней мембраной ядерной оболочки и периферическим слоем хроматина.
Структурная роль ламины очень велика: она образует сплошной фиброзный белковый слой по периферии ядра, достаточный для того, чтобы поддерживать морфологическую целостность ядра. Так. удаление обеих мембран ядерной оболочки с помощью Тритона X-100 не вызывает распада. растворения ядер. Они сохраняют свою округлую форму и нс расплываются лаже в случае перевода их в низкую ионную ситу, котла происходит набухание хроматина.
Внутриядерный остов, или сеть, морфологически выявляется толь КО после экстракции хромагина. Он представлен рыхлой фиорозн i
Tuu.iuiQ 7
Состав ялерною белковою матрикса
Объект Белок ДНК ГНК Фосфолипиды
кРЫса (печеш.) 97 0.1 1,2 и 6.9 0.5
Клетки Не! а 92,? 1.2 0.05
ТсФахимена 97 0.1 1.2
ITT
сетью, располагающейся между участками хроматина, часто в состав этой губчатой сети входят различные гранулы PH П-природы.
Наконец, третий компонент ядсрного матрикса - «остаточное» ядрышко н.чогная структура, повторяющая ио своей форме ядрышко также состоит из плотно уложенных фибрилл.
Морфологическая выраженность этих трех компонентов ядсрного матрикса, так же как и количество во фракциях, зависит от целого ряда условий обработки ядер. Лучше всего элементы матрикса выявляются после выделения ядер в относительно высоких (5 мМ) концентрациях двухвалентных катионов.
Для выявления белковою компонента ядсрного матрикса большое значение имеет образование дисульфидных связей. Так. если ядра предварительно инкубировать с иодацстамидом. препятствующим образованию S-S-связей, а затем вести ступенчатую экстракцию, то ядерный матрикс представлен только комплексом PCL. Если же использовать тетратионат натрия, вызывающий замыкание S--S-связей, тоядерный матрикс представлен всеми тремя компонентами. В ядрах, предварительно обработанных гипотоническими растворами, выявляются только ламина и «остаточные» ядрышкн.
Все эти наблюдения привели к выводу, что компоненты ядсрного матрикса представляют собой не застывшие жесткие структуры, а компоненты, обладающие динамической подвижностью, которые могут меняться не только в зависимости от условий их выделения, но и от функциональных особенностей нативных ядер. Например, в зрелых эритроцитах кур весь геном репрессирован и хроматин локализован преимущественно на периферии ядра, в этом случае внутренний матрикс не выявляется, а можно видеть только ламину с порами. В эритроцитах пятидневных куриных эмбрионов, ядра которых сохраняют транскрипционную активность, элементы внутреннего матрикса выражены отчетливо.
Как было видно из табл. 7, основной компонент остаточных структур ядра — белок, содержание которого может колебаться от 98 до 88%. Белковый сослав ядсрного матрикса из разных клеток довольно близок. Характерными для него являются три белка фиброзною слоя. называемые ламинами. Кроме этих основных полипептидов в матриксе присутствует большое количество минорных компонентов с молекулярными массами от И -13 до 200 кДа.
Ламины представлены тремя белками (ламины А. В. С). Два из них. ламины А и С, бли зки друг к друзу иммунологически и но псп гилному составу. Ламии В ог них отличается тем, что он представляет собой ш попротеид и поэтому более прочно связывается с ядерной мембраной. Ламин В остается в связи с мембранами даже во время ми юза. готда как ламины А и С освобождаются при разрушении фиброзного слоя и диффузио распределяются ио клетке.
134
Как оказалось, ламины близки ио своему аминокислотному соетя w промежуточным микрофиламентам (виментановым и нитокегтв новым), входящим в состав цитоскелета. Часто фракция вызеленит ядер, а также препараты ялерного матрикса содержат значительные количества промежуточных филаментов, которые остаются связанны М11 с перифериий ядра лаже после удаления ядерных мембран
В отличие от промежуточных филаментов ламины при полимеризации не образуют нитчатых структур, а Организуются в сети соргого-нальиым типом укладки молекул. Такие сплошные решетчатые участки подстилают внутреннюю мембрану ядерной оболочки, могут разбираться при фосфорилировании ламинов и вновь полимеризоваться при их дефосфорплированни. что обеспечивает динамичность как этого слоя. так и всей ядерной оболочки.
Молекулярная характеристика белков внутриядерного остова детально еще не разработана. Показано, что в сто состав входит ряд белков. принимающих участие в доменной организации ДНК в интерфаз-ном ядре при создании розе гковидной. хромомсриой формы упаковки хроматина. Предположение относительно того, что элементы внутреннего матрикса представая ют собой сердцевины розеточных структур хромомеров, находит подтверждение в том. что полипеитиднып состав матрикса ин герфазнмх ядер (за исключением белков ламины) и остаточных структур метафазных хромосом (осевые структуры, или екзффолл) практически одинаковы. В обоих случаях зтн белки отвечают и поддержание петлевой организации ДНК.
ДНК ядерного белкового матрикса
Рассматривая особенности ДНК. входящей в состав ядсрного матрикса. необходимо сиге раз подчеркнуть, что зта остаточная Д1 представлена в минимальном количестве (0.1—I*» от сухой массы Фракции) и составляет лишь менее 1% от всей ДНК ядра. та#, оказалась устойчивой к действию нуклеаз, вероятно, за счет се сушест
чия в виде прочных ДНК белковых комплексов.
Ших^,ЬШ01* ”|,тс*>сс представляет изучение фрагментов ДНК, иходя-ст. ’ В СОсгав ядерного матрикса. Расчеты показали, что в ядрах cyuie-н г °Т 60 °°° Д° 125 000 **,:,стков ЯНК. «шшиенных от действия Са|’ и jin х чистки мокт быть расположены на всех трех компо-
нентах ядерного магркса. киитнои кар-
Подробно изхчина ДНК ялерного магрикс.1 кл ‘ ные1р\лиы ,в‘номы Эрлиха мышей. Так, были обнаружены лвс ^y|t, rpyr](Iy вхо-Wimchiob ДНК в составе ядерного матрикса, в ir т'(] |( оцИ «’ли высокомолекулярные фрагменты размером о * • Ч11С10 юс-
составлялц всего 0,02% от исходного количества
135
читало примерно 100 на гаплоидный набор хромосом, т.е. всего 2-3 участка прикрепления ДНК к ядериому матриксу па хромосому. Эти фрагменты были обобщены сателлитной ДНК и связаны с ламином Функциональное значение этих участков может состоять в обеспечении фиксированного положения хромосом в ядре с помощью закрепления их определенных участков (центромер, теломер) на ламине.
Вторая группа фрагментов, связанных с матриксом, состояла из небольших участков ДНК (120-140 п.н.), гетерогенных по последовательности. Они встречаются между участками ДНК длиной около 50 т.п.п.. представляющих собой, вероятно, петли основной массы хроматина (рис. 69). Функциональное значение второй группы этих коротких участков ДНК может заключаться в том. что они ассоциированы с белками, лежащими в сердцевинах розетки подобных структур хроматина или в основании разверну гых петель ДНК хроматина при его активации.
Сходные результаты были получены на многих объектах. Было обнаружено. что зоны (районы) связывания ДНК с матриксом (MAR matrix attachment regions, или SAR - scaffold attachment regions) содержат приблизительно 200 п.н. и располагаются друг от друга на рассто янии 5—112 т.п.п. У дрозофиты на ядро приходится по крайней мерс 10 000 таких MAR (или 8АК)-областей.
Места расположения последовательностей SAR (MAR) очень сходны или даже идентичны с местами связывания ДНК с топоизомера-
Рис. 69. Схема связи ДНК с компонентами ядерного белковою матрикса (по: Разин. Яровая. I9XT)
136
ЗОЙ П. которая 111 рае г основную структурную и ферментативную роз ь ^образовании петель хроматина. Более того, один из белков матрикса (сктффолла) митотических хромосом (белок Scl) оказался просто топоизомеразой 11. С помощью иммунофлуоресценции было показано, что на пнтер<]>а зных хромосомах Scl локализуется в основании петель ДНК
При изучении кинетики гидролиза вновь синтезированной ДНК нуклеазами было обнаружено, что ядерный матрикс связан с реплика-вией ДНК. Выявлено, что большая часть ДНК, содержащая радиоактивную метку, связана с матриксом' свыше 70% новосинтезированиой ДНК было локализовано и зоне внутреннего ядерного матрикса. Это наблюдение давало основание считать, что на Штерном матриксе происходят инициация и собственно репликация ДНК. Фракция ДНК. ассоциированная с ядерным матриксом, оказалась обогащенной репликативными вилками. В составе ядерного матрикса обнаружена ДНКполимераза о — основной фермент репликации ДНК. Кроме нс-гос ядерным матриксом связаны и другие ферменты репликативного комплекса (реилисомы): ДНК-ираймаза, ДНК-лигаза. ДНК-топоизомераза II. Высказана гипотеза о том. что репликация ДНК осуществляется таким образом, что петли ДНК как бы протягиваются через закрепленные в матриксе репликационныс комплексы (рис. 70). Обнаружено. что участки начала репликации ДНК располагаются вблизз! nun совпадают с ними) участков постоянного прикрепления ДНК к
ядерному матриксу.
В состав ядерного матрикса вхо шт окало 1% РНК. включающей в себя как гетерогенную высокомолекулярную РНК. так и рибосомную РНК II РНК ядерных малых РНП. На возможность связи цементов матрикса с процессами транскрипции указывали данные о том. что при коротком мечении матрикс обогащался быстро меченной ieiepo генной РНК. Обнаружено, что в состав белков внутреннего ядерно матрикса входит РНК полимераза II. ответственная за синтез ин> маинонных РНК. С ядерным матриксом клеток яйцеводов К'Р° ‘ ‘ лась связанной большая часть (95%) новоси тезированных пре овальбумина и пре-рРНК. Эти наблюдения привели к зак. что ятериый метрике может выполнять структурную роль i процессинге и транспорте РНК в ядре. -тюшиеся
С ядерным матриксом связаны собственно транскр“ матрик-гены. Дранскринционные комплексы закреплены на я. с С111е11И. се. асахш транскрипция осуществляется одновременн 1 110ННЫх ем матричной ДНК относительно закрепленных тр‘ р.|К|)гецред-комплексов. содержащих РНК-лолпмсразу 11 Кр‘’'‘1. ^„ар¥жтмют-и|естненннков в составе ядерного белкового магр • хчзсгвук>т св малые я черные рибонуклеонротеиды (мяР )• к‘ а (см. ы-11 созревании информационных РНК. в процессе
137
Рис. 70. Протаскивание петлн рас гущей цепи ДНК (/) через репликашкш-ный комплекс (2)
а ралиоакгеирафы ДНК; б i шютетичсская схема этого процесса
лее). Эти PH К-содержашне частицы, иногда называемые cii.iaricuco-мами, собраны п группы, или кластеры, связанные с белками ядерного .матрикса.
Элементы ядерного матрикса могут прямо участвовать в регуляции транскрипции. Так. участки MAR обычно связаны с такими регуляторными последовательностями на ДИК. как энхансеры и сайленсс-ры, определяющими интенсивное гь транскрипционных процессов. На ядерном матриксе докали зованы белки-рецепторы для ряда стеро илных юрмонов.
Относительно связи ДНК с элементами ядерного матрикса на сеюлня сложились представления о том, что зта связь может отражать различные функциональные особенности. Например, связь ДИК е ламином может отражать структурную, постоянную ассоциацию ДНК. а связь с внутренними элементами — функциональную, связанную каке синтезом ДНК. так и РНК.
Поведение белков ялерною матрикса во время митоза изучено еще недостаточно. О судьбе ламины при митозе уже было сказано: ес компоненты разбираются, частично переходя в цитоплазму. частично (ламин В) оставаясь в связи с мембранами. Относительно компонентов внутриядерного матрикса сведении меньше: известно, что часть этих белков входит в состав мат рикса (скэффолда) митозичсских хромосом
Глава 7
ХРОМОНЕМНЫЙ (ЧЕТВЕРТЫЙ) УРОВЕНЬ УПАКОВКИ ХРОМАТИНА
Исследуя структурную организацию хромагина и хромосом, можно определенно говорить о нескольких уровнях компактизации ШК.
I3X
П(.рВНП - нуклсосомнмн, лаютпий семикратное уплотнение ДНК „ составе фибрилл ДНП. второй - фибрилла диаметром 30 им или иск иомериай уровень, с 40-70-кратной степенью упаковки, третий -доменно-петлевой, или хромомерный, приводящий к 600—700 кратному уплотнению ДН К в составе этих структур. Для поддержания пер вых двух уровней компакта танин было достаточно участия только гистоновых белков, тогда как петлевые и розеткоподобные доменные структуры уже требовали участия нсгистоповых белков и перехода от спирального, или соленоидного, типа укладки ДНК к образованию компактных глобулярных структур, состоящих из нетель хроматиновых фибрилл диаметром 30 им, к структурам типа хромомсров, имею-ших уже размеры 0.1 -0.2 мкм.
Однако еще в классических работах цитологов начала XX века как в иптерфазных ядрах, так и. особенно, в митотических хромосомах описывались нитчатые структуры - хромонемы, имеющие толщину 0.1 —0,2 мкм. Их удавалось наблюдать как на фиксированных объектах, так и в живых клетках Подробные исследования ультраструктуры митотических хромосом на разных этапах митоза с помощью электронной микроскопии полностью подтвердили наличие этого четвертого уровня компактизации хроматина (рис. 71).
При изучении ультраструктурных основ строения митотических .хромосом необходимо учитывать хромоиемиый уровень компактизации хроматина. Хромонему - нитчатую хроматиновую структуру со средней толщиной 0.1-0,2 мкм удается проследить в естественных условиях на разных стадиях начальной конденсации хромосом в профазе митоза и При дсконденсапии хромосом в телофазе. Причем такие .хромонемы вы-являюгся как в клетках растений, так и животных (рис. 72 и 73).
И «учение профазиых хромосом как животных, так и растений показывает, что процесс конденсации хромосомного материала включает в себя промежуточный этап - образование из фибрилл ДНП иитча тых хромонем ных структур, являющихся единицей последующей хромосомной сгруктуризаиии.
В естественных условиях в составе метафазных хромосом хромо немные элементы на ультра тонких срезах нс выявляются. 1о по м р ^конденсации ми готических хромосом в поздней анафазе и jm < телофазе снова можно видеть при таки хромонемной хромосом. В поздней анафазе. когда хромосомы достигают р иоложпых полюсов клетки, в их структуре снова выявляются.• ' новые нитчатые образования с толщиной 0.2 мкм. При з ,(.кпн..сн-етУРа хромосом разрыхляется, что отражает "ач"“ “^01иснса.ии, ивии митотических хромосом. Эта начальная стадия. 0_
связана не с разрыхлением фибрилл ДНП внутрихр<’м° Особенно «леннем. обособлением участков хромонемы лруго -ч. • в эт0 Сметным и выраженным это, процесс становится в
139
Рис. 71. Хромонсмы на ультратонких сре зах
а — прифазпыс хромосомы пиона; б - тело-фазные хромосомы клеток культуры ткани
время хромосомы начинают увеличиваться в объеме, при этом расстояние между отдельными участками хромонсмы также возрастает. В расположении отдельных нитей хромоие-мы, так же как и в профазных хромосомах, улавливаются при-зн аки спи рал ьнос ги в и \ у кладке: часто видны кольчатые или петлистые незамкнутые участки, иногда располагающиеся параллельно друг другу. Спиральность хромонемы в составе митотических хромосом удается наблюдать в ряде случаев при частичной искусственной де-коидепсации выделенных митотических хромосом (рис. 74). В поздней телофазе хромосомы уже полностью окружены ядер ной оболочкой. Хромонемныс
элементы расходятся на шачп тельные расстояния, по все же зоны отдельных хромосом еше выявляются. В это время некоторые участки хромоием начинают разрыхляться. их толщина возрастает. Таким образом, наблюдая за состоянием структуры и расположением хромонемных участков в ядрах и хромосомах в телофазе, можно видеть картину, обратную той, что наблюдалась в профазе: разрыхление хромосом за счет первоначального расхождения участков хромонемы и
последующего их разрыхления, деком юнсании самих хромонсм.
Учьтраструкгурная организация хромонемного уровня упаковки ДНП хорошо выявляется при постепенном экспериментальном разрыхлении хромосом при понижении конпетраиин двухвалентных катионов. Оказалось, что плотное тело митотических хромосом сначала разрыхляется, блаючаря чему выявляется его хромонемная организация: на срезах видно, что хромосомы представлены сечениями толстых (0.1-0,2 мкм) хромосомных нитей хромонсм (см. рис. 76). Затем. при последующем снижении концентрации двухвалентных каш онов, происходит как бы распад хромонемных элементов на множество линейно расположенных глобулярных блоков хроматина с ди«мст’ ром около 0,1 —0,2 мкм. В дальнейшем эз и блоки (хромомеры) начина им де конденсироваться: на их периферии видны петли фибрилл ДНП. а в центре остается пело хромомира. Возникает розеткоподобноя cipVK
140
'»поза
ЯК ЧIPMihko; ХС хромосома; XII - .хромо»е^
141
Рис. 73. Хромонсмная организация хромосом
а участок хромосом клеток СИ ЭВ » ранней 1сл<и)ы'<е О|кло В. К) Полями».»). хромонсмы и сосганс жснеримснныыю гекон iciiCHpoiKiiiHLix хромосом <<|мно
В.В. Ь\ражим»
142
гура. Важно отметить, что расположение зон с розсткополобными хромомерами совпадает с рисунком G-бэндирования хромосом. По мере дальнейшей де конденсации петли увеличиваются влипну, а вентральные участки хромо мерой про-1рсссивно уменьшаются. При подпой лс-кондсисащш нее тело хромосомы представлено на срезах равномерно расположенными фибриллами ДНП.
Необходимо отметить, что в современных молекулярно-биологических исследованиях строения хромосом хромо-
Рис. 74. Спиральность выделенных хромосом посте обработки 0,6 М KCI
немный уровень, как один из высших
уровней упаковки ДНП. совершенно выпадает из поля зрения иссле-доватслеп. Лишь в последнее время некоторые исследователи на осно-
вании косвенных данных нрн.хотят к выводам о наличии в интерфазных ятрах хромоиемопотобных структур.
Общая организация митотических хромосом
Интенсивное изучение ультрастру ктуры хромосом началось в сере-липс 1950-х юдов. что было снязанос внедрением в цитаюнио метола электронной микроскопии. Однако вклад электронной микроскопии в изучение структуры иитерфазных и митотических хромосом оказался неизмеримо ниже того, что дал этот метод для изучения структуры цитоплазмы. Наши представления о структурной орыниза ним даже элементарных компонентов ядра и о структуре хромосом очень скудны и противоречивы. Разрыв между успехами в иохимик ском изучении процессов биосинтеза.111К и РНК. с одной сторонь, чрезвычайно медленным прогрессом в исследовании тонкой q; « иции клеточного ядра - с другой, объясняется многими при ’ Одна из основных причин та. что современные методылк п
Щучать ятро и хромосомы в целостной совокупности с ^jb||oro их элементов. Хромосома оказалась слишком мала дл - а анализа с помощью светового микроскопа и слишком и ♦ омах
хтя изучения в электронном микроскопе. На выделе»» иг3анало-нэлектронном микроскопе нс удастся выявить на и. характер *сний проекций разных уровнен и можно на г,Ю|Д‘П1. (Ч ^сслсдова Формы и in хе тонкую структуру во»ра|Н1чснных.у ,iK * кГсрИстикой ,,Ис Учьтратонких сре юн хромосом о!р<шпчиВ‘кте” *ч|Ное прстстав-отлельных элементов без возможности получить ио 1аННОм ел?' Лс,|,к о всей структуре. Эго происходит из-за гою.
143
чае мы можем исследовать тишь плоские сечения, составляющие только 0.05-0.025-ную часть общего объема ядра. Так как для ядра и хромосом характерно преобладание тонких л длинных спутанных фи брил !ярных структур, которые на ультратонких срезах будут иметь вид беспорядочно разбросанных коротких отрезков, то по таким сечениям воссоздать трехмерную картину взаимосвязи этих элементов друг с другом практически невозможно.
При изучении ультраструктуры хромосом исследователи сталкиваются с парадоксальной ситуацией: чем ближе подходим к высшим структурным уровням организации хромосом, тем меньшей но объему л более низкой по надежное гл становится информация об этой важ-Heii шей клеточной структуре (рис. 75).
Действительно, получена полная информация о генетическом коде человека, хорошо изучен нуклсосомный уровень компактизанин ДНК. опредсчсн общий петлевой доменный характер дальнейшей укладки ДНК. подтверждаются представления о хромонемном уровне, но все же на сегодня мы до конца не знаем, как построена митотическая хромосома (рис. 76).
Трудности изучения хромосом связаны кроме всего прочего с тех», что это очень лабильная структура, легко меняющая свою морфологию в зависимости от условий эксперимента. Так. обращает на себя внимание свойство митотических хромосом обрашмо изменять свой объем при и пленении ионною окружения. Как уже указывалось, при менение i миотонических растворов приводит к набуханию хромосом, но при возвращении их в изотонические условия они вновь приобретают исходную морфологию. Из этого следует, что существует какой-то механизм, стабилизирующий общую организацию хромосомы. В хромосоме существует какой-то структурный порядок, алгоритм взаи модемегвия компонентов, который инвариантно приводит интерфазную разверну тую, леконденсированную хромосому в состояние плотного тела (митотическая хромосома), не меняющею ни сноси толщины, ни ад ины, ни особенностей структуры в бесчисленном ряду клеточных поколений.
Как уже говорилось, для изучения ультраструктуры хромосом широко применяется метол получения целых выделенных митотических хромосом. На таких препаратах видно, чю в состав хромосом входят элементарные фибриллы диаметром 25 36 нм. Однако уловить характер их укладки, какой-либо порядок в их расположении не удастся. Хромосомы в этом случае имеют вид тел, состоящих как бы из перепутанных изгибающихся фибрилл, или. по образному выражению одного из цитологов, напоминают результат аварии на макаронной фабрике.
На препаратах таких вылеченных и распластанных хромосом нет pCcL'ILHOii возможности выяснить, из какого числа нитей состоит хро-
144
Рис. 75. Общий вид хромосом , й вид выае «сивы*
° хромосомы юкчок кулыуры СПЭВ кА улыратнко« срезе. ' * _ В|1Я
мч.|(|)атых хромосом и просвечивающем электроином i >!НКц-|пн1х Meij<tKBin.ix хромосом в скаиир'юни-м элсмромно-
145
Рис. 76. Ступени дифференциальной дскондснсании хромосом
Ц ишпрочера; ЛОР - ядрышковый организатор; G. К сегменты хромосомы; ХМ хромомеры; Х11 хромонема
мосома, тем более проследить путь и порядок укладки одной нити от начала до конца, если бы она была основой хромосомы, более того, процесс выделения хромосом приводит к изменению их структуры. Легко видеть в световом микроскопе, что при переносе живых делящихся клеток в гипотонические растворы их хромосомы ре жо набухают, становятся плохо различимы, увеличиваются в объеме, их оптическая плотность уменьшается. В целом митотические хромосомы в этих условиях ведут себя так же, как препараты выделенного хроматина: набухают и переходят в менее конденсированное состояние. Такое воздействие на них гипотонической среды приводит к потере суб-структуризапии хромосомы.
Однако о том, что такая субсгруктуризадия существует, говорит масса фактов не только электрон но-микроскопических, но и получен ных с помощью светового микроскопа. Вся совокупность морфологи ческих и биохимических данных должна быть учтена при воссоздании трехмерной организации митотических хромосом.
В 1970-х голах удалось уловить общий принцип структурной организации митотической хромосомы. Было обнаружено, что хромосомы нс теряют своей морфологической целостности, не распадаются даже при резком набухании, вызванном удалением всех гистонов. Эго дос тигаекя обработкой выделенных хромосом растворами полианионов, декстраисульфага и гепарина. В этом случае хромосомы настолько ле-
146
конденсируются, что перестают быть видны в фазово-контрастном микроскопе. При добавлении же флуорохрома, связывающегося с ДНК (этияиум бромид), было виню, что сильно набухшие хромосомы не разваливались, а значительно (до 4 раз) увеличивались в длину и ширину. Такие сильно набухшие, лишенные гистонов хромосомы помешали на подложку и рассматривали с помощью электронного микроскопа.
Оказалось, чго набухшие хро
Рис. 77. Латеральные петли ДНК и осевые компоненты метафазной .хромосомы после полной экстракции гистонов
мосомы состоят из двух компо-
нентов: из рыхлой сети плотных фибрилл в центральных участках (хромосомный остов - скэффотд) повторяющих контуры х-етафа й(Ььх хромосом (осевые кол,по *? » печи^ л-’"""ь,х то,,к"х ПСТ“Ь. отходящих отиих в попе-
речном напраптснпи (рис. 77). Была показана белковал врврола «с-вьк компонентов н ДНК „ составе исге.ть. Средний размер боковых 1ИК Ь <®став'”,л около 30 мкм. Если такие препараты обработать
п°Н 10 можно Получить белковые остовы и анализировать ихсо-с ав. казалось. чго в них присутствует около 20 белков негистоновой рироды. сходных с белками ядерного матрикса. Исходя из этого, была предложена модель структурной организации митотических хромо-
СС ос,1ове леЖ||Т принцип поперечного расположения петель кло п» белковой осевой структуры. В црпнллпс этот тип органн-.ШИЦ митотической хромосомы очень напоминает хромосомы типа «ламповых щеток », встречающихся в процессе мейоза.
етлепос расположение ЛИК вдоль хромосомы получило в дальнейшем петый ряд подтверждений. Однако при разных способах ле-Р°Тйн<иза1ши кроме петель в периферии набухших хромосом можно bL‘o выявил» и розеткоподобные структуры, состоящие in ДНК. ст Г1оследпее время получены данные, говорящие о том, что осевые РУкзуры могут представлять собой артефакт, получившийся в ре-по'Ь1аТе Ч,0!,1ажа 11 пмеушнванпя деппл оптированных хромосом на вые f0*KC’ самом же деле в геле хромосомы существуют негпетоио-
г ^^опые свяжи (скрепки), сшивающие основания боковых пе-(оис 1,0 ЭП| СВя,кп разбросаны рыхло по объему хромосомы nuS Как бы го ни было, принцип петлевой поперечной укладки ст в ге’1с хромосомы очень важен для понимания ее обшей ультра
^ОТной организации.
147
I 2
Рис. 78. Схема возможного расположения петель ДНК (7) и белковых «скрепок» (2). связь между которыми определяет параметры хромосом
Необходимо подчеркнуть, что на поперечных и продольных сечениях митотических хромосом, фиксированных в нативном состоянии, внутри клеток никаких центральных или осевых элементов нс обнаружено. Они выявляются только после удаления из выделенных хромосом всего набора гистонов, чему предшествует изоляция хромосом в гипотонической среде.
На основании этих наблюдений широкое распространение нашла христо-матийная схема, объясняющая общую структуру митотической хромосомы (рис. 79). По этой схеме первым уровнем компактизации ДНК является нуклсо-сомная фибрилла толщиной 10 нм, где вокруг одной нуклеосомы оборачивается 146 п.н. ДНК с коэффициентом компактности (к.к.), равным 6—7; второй уровень — фибрилла (соленоид) толщиной 30 нм имеет к.к., равный 40: третий уровень — петлевой домен (60 т.п.и.) размером 0,2—0.3 мкм имеет к.к., равный 680. Далее отрезок примерно с 18-20 петлевыми доменами образует вокруг осевого элемента .хромосомы один виток диаметром 0.7—0,8 мк.м (толщина хроматиды) с коэффициентом компактизации 12 104. Такой виток из петлевых доменов может представлять собой минимального размера бэнд, а набор из нескольких витков - средний бэнд.
По другим представлениям можно предположить, что петле ДНК. выявляемой иа хромосомах, т пшенных гистонов, соответствует хромомер, промежуточным этапом де конденсации которою является розеткоподобная ст руктура ДН П.
Важно отмстить, что хромомерные участки ДНП встречаются и в интерфазных ядрах (там они называются хромоцентрамн). Оказалось, чго порядок их де конденсации такой же, чго и в митотической хромосоме: из хромопентрон возникают розсткопояобные структуры с петлями ДНП по их периферии.
Итак, можно несколько иначе оценить некоторые этапы компакты займи ДНК, которые приводят в конце концов к нос i роению плотного тела ми готической хромосомы (рис. 80).
Первый уровень - нуклеосом» ый - образует свсрхскручиванне ДНК но поверхности гистоновой сердцевины. Второй - пуклеомср
148
кый (сверхбусина), где идет объединение 8-Ю нуклеосом в виде глобулы. Так как все эти уровни компакпгзацпи происходят на огромных линейных молекулах ДНК. то ряд сближенных нуклеомеров образует фибриллу ДН П диаметром 30 нм. Третий уровень - хромомерный. петли фибрилл ДНП, объединенные скрепками из негистоновых белков, образуют компактные тела, которые при искусствен ной дс-копденсапии дадут розетко-видные структуры. Расположение петлевых доменов - хромомеров, может быть неравномерным; участки тела митотической хромосомы, обогащенные ими. могут соответствовать бэндам или сегментам при дифференциальной окраске хромосом. Четвертый уровень -ком порядке хромомсры образу
Рис. 79. Схема уровней организации хроматид (Альберте и др., 1994)
хромонемный: сближенные влиней-'ют толстые (0.1-0.2 мкм) хромосом-
Рис. 80. Схема ра спичных уровней компактизации хроматина
,,'KlvotOMd‘ -2 нуклепмер. «екрхбусииа-; J хримомер. п0С1СМачена
_ чонсма; 5 - хроматида. Орелна показывает. что петля домена
«|,,мрИ1чоц толщиной 3|) |(М j?)
149
ныс нитчатые структуры, которые уже можно наблюдать и в световом микроскопе. Характер упаковки этой ни i и в геле хроматиды еще недостаточно выяснен; возможна спиральная укладка хромонемы, но не исключено образование сю и еще одного уровня петлистых структур.
Конечно, такая общая схема организации митотических хромосом очень неполно отражает особенности строения их специализированных участков, таких как ядрышковый организатор, теломеры и пент-роме ры.
ЧАСТЬ ТРЕТЬЯ
ЯДЕРНЫЕ ТРАНСКРИПТЫ И ИХ ТРАНСПОРТ
Одной in важнейших функций клеточного ядра является реализация генетической информации в виде синтеза целого раза РНК. или служащих матрицами для синтеза белка, или образующих аппарат белкового синтеза. Синтез разного типа РНК на матрицах ДНК хроматина транскрипция, включает в себя образование нескольких типов РНК. синтезируемых с помощью различных PH К-полимераз - ферментов. синтезирующих РНК по одной из цепей матричной ДНК. Всего в эукариотических клетках встречается пять типов РНК (табл. 8).
Информационные РНК. самые разнообразные по величине и по строению нуклеотидных носледоватечьиостей. являются самыми нестабильными по времени их жизни: они синтезируются в большом количестве и быстро деградируют, что обеспечивает смену функциональных активностей клетки. В связи с их быстрой заменой общее число иРНК относительно невелико — 10% от массы всех РНК в клетке. Эти иРНК синтезируются при участии фермента РНК-ноаимеразы II. которая может образовывать первичную копню РНК с любого гена, колирующего структуру белка. Дальнейшее созревание этих первичных транскриптов, их значительное укорочение и перестройка (сплайсинг) происходят с помощью особых рибонуклсопротеидных частив, содср-
Таб.иша 8
Гииы РНК. их количество, стабильность и ферменты, учаенпйощие в их стилей
1и» ГНК Количество Р11К. % Сингешриванные молекулы та единиц? времени. Фермент
"РНК 58 РНК-полимераза И
Pl’HK IV 5П 70 39 РНК-лолимераза 1
'ГИК } рНК-иолммсразл М f
миРНК 5 3 РНК-полммсраза II. н*
'ВЦ PH К 15 3
151
мыс нитчатые структуры, которые уже можно наблюдать и в световом микроскопе. Характер упаковки этой нити в геле хроматиды еще недостаточно выяснен; возможна спиральная укладка хромонемы, но не исключено образование сю и еще одного уровня петлистых структур.
Конечно, такая общая схема организации митотических хромосом очень неполно отражает особенности строения их специализированных участков, таких как ядрышковый организатор, теломеры и центромеры.
ЧАСТЬ ТРЕТЬЯ
ЯДЕРНЫЕ ТРАНСКРИПТЫ И ИХ ТРАНСПОРТ
Одной in важнейших функций клеточного ядра является реализация генетической информации в виде синтеза целого ряда РНК. или служащих матрицами для синтеза белка, или образующих аппарат белкового синтеза. Синтез разного типа РНК на матрицах ДНК хроматина транскрипции, включает в себя образование нескольких типов РНК. синтезируемых с помощью различных РНК-полимераз - ферментов. синтезирующих РНК по одной из цепей матричной ДНК. Всего в эукариотических клетках встречается пять типов РНК (табл. 8).
Информационные РНК. самые разнообразные по величине и по строению нуклеотидных носледоватсчьпостей. являются самыми нестабильными но времени их жизни: они синтезируются в большом количестве и быстро деградируют, что обеспечивает смену функциональных акгивкостен клетки. В связи с их быстрой заменой обшес число иРНК относи !ил|»но невелико — 10% от массы всех РНК в клетке. Эти иРНК синтезируются при участии фермента РНК-ноанмеразы II. которая может образовывать первичную копню РНК с любого гена, колирующего структуру белка. Дальнейшее созревание этих первичных транскриптов, их значительное укорочение и перестройка (сплайсинг) происходят с помощью особых рибонуклсопротеидных частиц, содср-
Табмиа 8
Гииы PI Ik. их количество, стабильность и ферменты.
учаснпиощие в их сии юзе
1ип РНК Ко.-1нчес1но 141К. % Сии гешровамные молекулы и е «ниш? Фермент
времен».гс
"1’НК ю 58 рНК-иол>гасрам II
Pl’HK IV 51) 70 39 РНК-жйИмерзю *
гРНК т РНК-ПСПИМЧМ» Ш „
мчрцк ZJ 5 з РНК-поли.чсраза ПЭН
'BtipHK 15 3
151
жаншх малые ядсрные РНК (мяРНК). Последние синтезируются так же с помощью этого фермента, их количество в клетке невелико ($%\ но они более стабильны и долгоживущие. К мяРНК относится целая гетерогенная группа РНК, входящая в состав малых РНП-частиц. таких как SRP, теломераза, сплайсосомы и др. (см. далее). Все остальные клеточные РНК необходимы для создания аппарата белкового синтеза. Рибосомные РНК синтезируются с помощью PH К-пол и меразы I они представляют основную массу клеточных РНК и относительно стабильны. Одна из рибосомных РНК - 5S РНК, а также 20трансферных РНК, тоже стабильных, синтезируются с помощью РНК-лолиме-разы III. Митохондриальные РНК синтезируются в самих митохондриях независимо от синтеза РНК в ядре.
Реализация генетической информации, выражающаяся в синтезе разнообразных молекул РНК, должна быть связана с изменением морфологии ядерных компонентов. На светоотическом уровне активация ядерной транскрипции всегда связана с декомпенсацией хроматина, с увеличением объема ядрышек, с повышением их базофилии, т.е. с увеличением в них количества РНК. Эти общие признаки увеличения ядерной активности мало что дают для понимания хода молекулярных процессов на уровне реальных ядерных компонентов. Чго происходит с участками хроматина, заключающими индивидуальный ген. кодирующий определенный белок, выяснить очень трудно, так как эти гены в подавляющем большинстве случаен существуют в единичных копиях и проследить в гигантском клубке декондснсирован-ных интерфазных хромосом за работой индивидуального гена чрезвычайнотрудно (хотя и возможно).
Относительно более просто эту же задачу можно решить на генах, многократно повторенных в геноме, таких как гены рибосомных РНК, входящих в состав интерфазных ядрышек, основной функцией которых является образование рибосом. Изучая ультраструктуру ядрышек и особенности морфологии синтеза рибосомных РНК. впервые удалось с помощью электронного микроскопа визуализировать работающий ген.
Глава 8
ЯДРЫШКО - ИСТОЧНИК РИБОСОМ
Внутри интерфазных ядер как при витальных наблюдениях, гак и на фиксированных и окрашенных препаратах видны мелкие, обычно шаровидные тельца ядрышки. Впервые ядрышки были обнаружены Фонтана в 1774 г. В живых клетках они выделяются на фоне лифф) нои организации хроматина из-за своей светопрсломтяемосш. Пос
152
леднее свойство связано с тем. что ядрышки являются наиболее плотными структурами в клет ке. Они обнаруживаются практически во всех ядрах эукариотических клеток за редким исключением. Это говорит об обязательном присутствии этого компонента в клеточном ядре.
В клеточном цикле ядрышко присутствует в течение всей интерфазы, в профазе по мерс компактизации хромосом во время митоза оно постепенно исчезает и отсутствует в мета- и анафазе, вновь появляется в середине телофазы, чтобы сохраняться вплоть до следующего митоза, или до гибели клетки.
Долгое время функциональное значение ядрышка было непонятно. Вплоть до 1950-х годов исследователи считали, что вещество ядрышка представляет собой своего рода запас, который используется и исчезает в момент деления ядра.
Еше в 1930-х годах рядом исследовагелей (МакКлинток. Хейтц, С.Г Навашин) было показано, что возникновение ядрышек связано топографически с опреде ленными зонами на особых, ядрышкообразу-юшпх хромосомах. Эти зоны были названы ядрышковыми организаторами, а сами ядрышки представлялись как структурное выражение хромосомной активности. Позднее, в 1940-х годах, когда было найдено, что ядрышки содержат РНК, стала понятна их «базофилия*, сродство к основным (щелочным) красите лям вследствие кислой природы РНК. По данным цитохимических и биохимических исследований, основным компонент ом ядрышка является белок; на его долю приходится до 70—80% от сухой массы. Такое большое содержание белка и определяет высокую плотность ялрышек. Кроме белка в составе ядрышка обнаружены нуклеиновые кислоты: РНК (5-14%) и ДНК (2-12%).
Уже в 1950-х годах при изучении ультраструктуры ядрышек в их составе были выявлены гранулы, сходные по своим свойствам с цитоплазматическими гранулами рпбонуклсопротеилной природы-ери босомами. Следующим этапом н изучении ядрышка было открытие принципиального факта — «ядрышковый организатор» является вме chiiiHucM генов рибосомных РНК
Строение рибосом
Рибосома представляет собой элементарную клеточную синтеза любых белков клетки. Все они построены в ^CTKt ‘ 1К0.’ имеют одинаковую молекулярную композицию, ныполн»
функцию - синтез белка, полому их также м0*и ||ИТОП/зазмы точными органоидами В отличие от других ор|;‘н^’' . вакуОляриой 11 'астид, митохондрий, клеточного центра, мемора ’ w кде-с,,сте.мы и др.) они представлены в клетке шромных
153
точный цикл их образуется НО7 шгук. Поэтому осноиная масса точной РНК представляет собой именно рибосомную РНК Рнк босом относительно стабильна, рибосомы могут существовать п к.!ет ках культуры гканн в течение нескольких клеточных циклов. В псте ночных клетках время подужизни рибосом составляет 50-120ч
Рибосомы - >то сложные рибонуклеопротеидные частицы в со стаи которых входит множество молекул индивидуальных (нейовто репных) белков и несколько молекул РНК. Рибосомы прокариота
эукариот но своим размерам и молекулярным характеристикам отличаются, хотя и обладают общими принципами организации и функционирования К настоящему времени методом ренггеноструктуриого анализа высокого разрешения полностью расшифрована структура рибосом.
Полная, работающая рибосома состоит из двух неравных ехбьеди ннп. которые легко обратимо диссоциируют на большую субъединицу и малую. Размер полной прокариот пиеской рибосомы составляет 20 х 17 х 17 нм. эукариотической - 25 х 20 х 20. Полная прокариотическая рибосома имеет коэффициент седиментации 70S и диссоциирует на две субъединицы: 50S и 30S. Полная эукариотическая рибосома с коэффициентом седиментации SOS диссоциирует на субъединицы 60S и 40S. Форма и легальные очертания рибосом из разнообраз
ных opianiiiMOB и клеток. включая
Рис. 81. Рибосомы бактерий в разных проекциях а - чалая субьедииила; б — большая субьелипипа: в - полная 70S рибосома (аил сверху и сбоку»
как прокариотические, так и эукариотические, поразительно похожи, хотя и отличаются рядом дета лей. Малая рибосомная субъединица имеет палочковидную форму с несколькими небольшими выступами (рис. 8I). ее длина составляет около 23 им, а ширина -|2 им. Большая субъединица похожа на полусферу с тремя торчащими выступами. При ассоциации в полную 70S рибосому малая субчастина ложится одним концом на один из выступов 50S частицы. а другим и ее желобок. В состав малых субъединиц входит но одной молекуле РНК, а в со став большой — несколько: у прокариот — две. а у эукариот — три молекулы. Характеристики молекулярной композиции рибосом даны в табл. 9.
154
Молекулярная характеристика рибосом
Таблица 9
Объект Коэффициент седиментации полной рибосомы и ее субъединиц Количество молекул РНК на субъеди- ницу Молекулярная масса РНК. Да Коэффициент сслименгацнн РНК Количество белковых молекул на субъединицу
•jrJOS 1 0,56 Ю6 I6S 21
Рибосомы 70S
прокариот •< 50S 2 1,2106 23S1 34
4,0-104 5S J
^40S 1 0,6 IO6 ISS
Рибосомы 80S
эъкариот 60S 3 1.6-106 28S Всего
4.а io4 5S около
4,5 |04 5.SSJ 80
Таким образом, и состав эукариотической рибосомы входят четыре молекулы РНК разной длины; 28S РНК содержит 5000 нуклеотидов, I8S РНК - 2000, 5,8S Pl IК - 160,5S РНК - 120. Рибосомные РНКоб-чалают сложной вторичной и третичной структурой. образуя сложные петли и шпильки на комплементарных участках, что приводит ксамо-упаковке, самоорганизации этих молекул в сложное по (|юрме тело. Например, сама по себе молекула I8S РНК в физиологических ионных условиях образует палочкови шую частицу, определяющую форму малой субъединицы рибосомы.
Пол действием низких ионных сил. особенно при удалении ионов магния, плотные рибосомные субьединниы могут разворачиваться в рыхлые рибону клеон роте иди ые тяжи, где удается наблюдать кластеры отдельных белков, но правильных структур типа нуклеосом нет. так как нет групп из сходных белков: в рибосоме все 80 белков разные.^
Для того чтобы образовались рибосомы, необходимо наличие: тырех типов рибосомных 1’11 К и аквимолярных отношениях и ил чм всех рибосомных белков. Сборка рибосом можетг iiponc* Д спон тайно /л vino, если последовательно добавлять к
Рслсяеиной носчсдовагельности. множе-
Слеловате..|Ы|О. для биосинтеза рибосом необходим с ’oM|Iolj
чиа специальных рибосомных белков и четырех пн о Р
•’НК Где ала РНК^нтезнруетея. на каком количеств _
гоны локализованы, как они opi авизованы в составьд _|даШСНы
UCC »ги вопросы в последние дссягилстия были успешн Г|ри изучении строения и функции ядрышек.
155
Чем определяется число ядрышек в клетке
Как уже говорилось, вес клетки имеют обязательные внутриядер ные структуры - ядрышки. Это правило имеет исключения. которые только подчеркивают важность и необходимость участия ядрышка в жизненных отправлениях клетки. К таким исключениям относятся клетки дробящихся яиц. где ядрышки отсутствуют на ранних этапах эмбриогенеза, или клетки, закончившие развитие и необратимо специализировавшиеся, например некоторые клетки крови.
В остальных случаях в клетках наблюдается 1—5 ядрышек, причем их количество не строго постоянно даже у одного и того же типа клеток. Более того, в некоторых половых клетках (растущие ооциты) число ядрышек может достигать нескольких сотен, т.е. на два порядка выше, чем в соседних соматических клетках. Увеличение числа ядрышек называется амплификацией ядрышек.
Еще в 1930-х голах было сделано предположение, что число ядрышек зависит от числа «ядрышковых организаторов» — особых участков, на которых «телофазе происходит новообразование ядрышекиптерфазного ядра. Часто ядрышковые организаторы локализованы во вторичных перетяжках хромосом (образуют вторичные перетяжки хромосом). Так. у человека ядрышковые организаторы расположены в коротких плечах 13, 14, 15. 21 и 22-й хромосом (10 на диплоидный набор) (рис. 82). У млекопитающих обычно имеется несколько ядрышкообразующих хромосом на диплоидный набор, у кошки — 2; у свиньи -2: у мыши - 4; у коровы - 8. У хладнокровных позвоночных и у ппш обычно имеется только по одной паре ялрышкообразуюших хромосом.
Таким образом, максимальное число ядрышек в разных клетках оп ределяется числом ядрышковых организаторов и увеличивается согласно плоилиости ядра: в крупных полиплоидных ядрах всегда количество ядрышек больше.
Это правило подтверждается прямыми наблюдениями над мутантными особями с разным числом ядрышковых организаторов. Так, у шпорцевой лягушки в норме в диплоидной клетке есть две ядрышкообразующие хромосомы и соответственно 1-2 ядрышка. У гетеро ш-готной особи с одной ядрышкообразуюшей хромосомой имеется одно ядрышко, у гомозиготных мутантных личинок, у которых нет ядрышковых организаторов, ядрышки не возникают и не происходит синтез рРНК. Сходные наблюдения были получены на дрозофилах с разным числом ядрышкообразующих хромосом — от U до 4.
Локализация ядрышковых организаторов определяется довольно точно на митотических хромосомах с помощью окраски солями серсо ра, которые имеют специфическое сро ictbo к некоторым ядрышковым белкам. Более точным является определение ядрышковых орга-
156
Рис. 82. Хромосомы (13. 14. >5, 21. 22) с ядрышковыми организаторами в кариотипе человека
низаторов с помощью метода молекулярной гибртшизашш «> яш- Гак. меченная тритием рРНК при контакте с денатурированной ДпК )< препарате митотических хромосом образует ДНК-рРНК-пгоридта ко в тех местах, где есть последовательности ДНК. комплемкн
РРНК.
Чаше всего в клетках количество ядрышек меньше. темi' рышковых организаторов. Это связано с тем, что при но чип ядрышек они могут сливаться лрхт с другом в о д ну ( -ышк0);ые КУРУ. т.е. в пространстве интерфазною ядра отде. .,тканяхче-организаторы разных хромосом могутобъединяться • • Ч11Т_ что
•’опека могут встречаться клетки с одним ядрышком . набора Десять ядрышкообразуюших участков - локусов. Д ышек друге Рочосом входят в состав очного ядрышка. Сл тк.,ни при ие,|Т’ Другом хорошо показано па живых клетках культур
P;«l>epHoii киносъемке.
157
Множественность рибосомных генов
При изучении числа ядрышек при различных хромосомных аббе-раниях было найдено, что при разрыве хромосомы на месте вторичном перетяжки ядрышки могут возникать на каждом из фрагментов хромо сом. Так. при обмене участками между двумя хромосомами в микро спороцитах кукурузы, в том случае, когда разрыв одной из хромосом происходил через ядрышковый организатор, возникали две хромосомы, каждая из которых несла часть исходного ядрышкового организатора. В этом случае обе хромосомы обладали способностью образовывать ядрышки, хотя и в неодинаковой степени. Из этих наблюдений был сделан очень важный вывод (который полностью подтвердился в 1960-х голах на молекулярно-биологическом уровне) о том, что ядрышковый организатор представляет собой не точечный локус хромо сомы, а является множественным по своей структуре, содержит несколько одинаковых генных участков, каждый из которых отвечает за образование ядрышка.
Метолом молекулярной гибридизации было показано, что в составе геномов эукариот рибосомные гены представлены сотнями и тысячами единиц; они принадлежат к фракции умеренно повторяющихся последовательностей ДНК. Даже у бактерий в геноме может быть несколько (6 -7) рассеянных по юному идентичных последовательностей. ответственных за синтез рРНК Общее количество этой фракции ДНК (рДНК) у Е. со//составляет около 1% от всей ДНК. У эукариотических организмов этот процент может составлять 0,18 для A'. laevis. 0,4 -для человека, 1.3 - для дрозофилы и 5,5% — для пекарских дрожжей. Число рибосомных генов у эукариот намного больше, чем у прокариотических клеток. В габл. 10 приведены некоторые примеры числа гопов рРН К у различных представителей эукариог.
С помошью метода молекулярной тбридизапип проанализировано нс только число рибосомных генов но и их локализация. Из этих экспериментов следовало, что именно зоны ядрышковых организаторов во вторичных перетяжках хромосом Хенориз: содержат рибосомные гены и что в каждом из этих организаторов имеется примерно но 300 генов, т.е. ядрышковые организаторы представляют собой naiMunc-тронныс участки, содержащие множество одинаковых генов (1юяи-изо/енные участки). Следовательно, рибосомные гены собраны вместе в группы, или кластеры.
Наблюдать непосредственно порядок расположения рибосомных генов на ДНК выделенных ядрышек с помощью элек! ройного микроскопа удалось на дополнительных ядрышках ооцитов амфибий.
I5X
Таблица 10
Количество рибосомных генов на гаплоидный набор хромосом
Объект Число генов Объект Число генов
Кортовые Моллюски
Мгеконитаюшис устрица 220
человек 200 Нематоды
мышь 100 аскарида 300
кошка 1 000 Простейшие
Птииы эвглена S00
курина Амфибии 200 тстрахимсна Высшие растения 290
тритон гребенчатый 4 100 фасоль 2000
амфихма Рыбы 19 600 кукуруза Грибы S500
линь 120 дрожжи пекарские 140
лосось 730 Водоросли 150
неоцератод 4 S00 хламидомонада
Беспозвоночные Иглокожие ацстабулария Слизне пики 1900
морской сж 260 диктмостслиум 200
Насекомые сверчок домашний шелкопряд тутовый 170 240 физарум S0
Амплифицированные ядрышки
Обычно число генов рибосомных РНК постоянно на геном, оно нс меняется в зависимости от уровня транскрипции этих гсн0^ ‘П1Р’’ мер, у клеток с высоким уровнем метаболизма число iснов р 1 но такое же. как у клеток, полностью прекративших синтез p’,L*K При рен.1икацни Д11К н S- периоде происходит и удвоение чвс» pf’HK. поэтому их количество коррелирует с плоипиостьюкл
Однако существуют случаи, когда гены рРНК подверг»г точной репликации. При этом дополнительная Реп11||'‘ ко,|Иче-РРНК происходит в целях обеспечения продукции оодь копии ттиа рибосом. Н результате такого сверхспнтеза генов р ек[1оМ0. Могут становиться свободными, тксграхромосомвымк в ре-
сочные копии генов рРНК могут Ф>-к""0Н,'Р“Х™х ^ьднек, ‘сльтате чего возникает масса свободных довод • ||МЮмосома-НоУАе не связанных структурно с ядрыигкообрагу • Осо.
Ото Явление получило название амплификапи аМфцбип. подробно это явление изучено на растуши
*отя оно встречается как у животных, гак и у рвспн
159
Так, v Л', laevis (нниболсе подробно изученный и популярный об скт) амплификация рДНК происходит и профазе I деления созрева пня, когда синтез хромосомной ДНК давно закончен. В этом случае количество амплифтшированиой рДНК (или генов рРНК) становится в 3000 раз больше того, что приходится на ran юидное количество рДНК. и соответствует I.5-I06 генов рРНК. Эти сверхчисленные вне хромосомные копии и образуют сотни дополнительных ядрышек в растущих ооцитах. В среднем же на одно дополнительное ядрышко приходится несколько сотен иди тысяч генов рРНК.
Амплнфицированные ядрышки встречаются также в оонитах насекомых. Так, у окаймленного плавунца в оонитах обнаружено ЗЮ6 экстрахромосомных копий генов рРНК.
Биологический смысл появления сверхчисленных экстрахромо-сомных ядрышек при росте ооцитов вполне понятен: для синтеза огромного количества запасных продуктов, которые будут использованы на ранних стадиях эмбриогенеза, необходимо соответственно огромное количество рибосом, которые могут быть синтезированы в клетке на дополнительных матрицах этих многочисленных амплифицнро-ванных ядрышек. После периода созревания ооцита при его двух последовательных делениях эти дополнительные ядрышки в состав митотических хромосом не входят, они отделяются от новых ядер и деградируют. Следовательно, амплификация рДНК в ооците представляет собой временное явление, нс сказывающееся на постоянстве генома.
У низших эукариотических организмов наблюдаются также экстра-хромосомные ядрышки. Например, у Teirachymena pyriformis в составе гаплоидного генома микронуклеуса имеется только единственный ген рРН К. В макронуклеусе этого орган и зма содержится около 200 гаплоидных эквивалентов в виде экстрахромосомных котик У дрожжевых клеток также обнаружены экстрахромосомные копии генов рРНК в виде циклических молекул ДНК длиной около 3 мкм. сояержаших один ген рРНК.
Строение и функционирование генов рРНК
Итак, в ядрышковых организаторах определенных хромосом локализованы места множественных сгруппированных вместе генов рибо сом ной РНК. Но как уже говорилось, существуют четыре титю молекул рибосомной РНК, каждый из которых в полной эукариотическом рибосоме представлен один раз. Значит ли эго, что для каждой из этих РНК (28S рРНК. 18S рРНК, 5,8Spl’HK, 5S рРНК) доджей существо вать отдельны!! ген, долгое время было неясным. Непонятным бы то также, как осуществляется в клетках одновременное сбалансирован ное образование этих разных рРНК. Этот вопрос был решен при ,,с
160
ссдоиаппи динамики синтеза рибосомных [>ЦК. Обнаружено чт при использовании импульсной короткой метки среди 'клеточных РНК выявляется быстро синтезирующая РНК с высокой скорост.ю ан1МентаИ|,и тяжелая 45S РНК. Если после появления этой 45S РНК продолжать наблюдать за распределением метки во фракциях РНК, но уже в отсутствие меченых предшественников, то можно ви деть, что по мерс убывания метки в зоне 45S РНК она начинает появляться и стабильно накапчиваться в зонах Ж, I8S н 5.8Sрибосомных РНК Эти данные говорили о том. что при синтезе рибосомных РНК сначала образуется гигантская молекула-праштестаенник (45S РНК) которая затем ласт начало основным молекулам рибосомной РНК. Найдено, что молекула 45S РНК содержит около 13 10’ оснований, имеет массу около 4.6 10“ и может достшать 2-5 мкм в длину. Явление распада молекулы 45S рРНК на фрагменты, соответствующие размерам 2SS. I8S и 5.8S РНК. получило название «процессинг», или созревание Во время процессии!.! происходи г разрыв предшественника на три фрагмента и. кроме того, наблюдается значительная деградация РНК (около 50%. т. е. 6 000 нуклеотидов). Кроме этих танпых было вычислено. что молекула 5S РНК спите тируется независимо от 45S РНК и локализация гена 5S рРНК не связана с ядрышковым opiaiutia-
юром.
Почти одновременно с получением этих биохимических тайных О. Миллеру (1969) удалось с помощью электронного микроскопа увидеть работающие рибосомные гены. Для этого пат световым микроскопом вручную вы те чили ядра из средних ооцитов тритона, микронг-лачи разорвали ялериую оболочку и и микропнпетку втянули много-чис генные амнлифипнрованиые я ipmuiKii. Такая катя, сатержатая Я1РЫ1ПКН и карпон 1азму. была перенесена в раствор низкой ионной стны со щелочным значением среды. Этот раствор наслаивай! на раствор сахарозы с формалином, находящийся в мпкроячейке ucinpu Фужной пробирки, на дно мнкроячейки помешали сеточку с формв' Р”м для электронно)! микроскопии. Действие низкой ионной си i Щелочной среде при водило к набуханию и juenepi ироваиию выд -пых ядрышек, они разрыхлялись настолько, что становилие Различимыми в световом микроскопе. При пентрифут иров<ii набухшие ядрышки прохочилп через слой сахарозы.11111 ' сп1Пиш вравлячись и фиксировались в формацию. Наконец. 0 |-]0С.
мнкроячейки и распластывались на формваровоп11 и пр0. с этого сеючкп вынимали, обезвоживали, оттеняли i
сматривали в пскгроином микроскопе (рис. S3). перепутанные На таком препарате были вп ты сложно luoiu> "J- „ромежут-
чннные осевые молекулы ?ll 1 К. на которых через;- к„ Ддцна
Р^пояащлцсь фибриллярные зоны, имеющие вил1 . равня-
'Ьймента днк. занятого такой «елочкой», была постоянно'1 Р-
161
Рис. 83. Рибосомные транскрипты в выделенных и дсконденсированных дополнительных ядрышках из ооцитов тритона / - транскрибируемый участок (р-геи); 2 - слейссры
лась 5 мкм. На этом отрезке располагалось около 100 плотных гранул величиной около 20 им, от каждой из которых отходила в сторону тонкая изогнутая нить. Величина такой нити была минимальной на одном конце такого отрезка и максимальной на другом. Эти извитые латеральные нити и образовывали структуру типа «елочки». Доказано, что крупные гранулы на ннги ДНК представляют собой молекулы РНК-пол и,меразы I, ответственной за синтез рРНК, а боковые изогнутые нити — транскрипты, состоящие из синтезируемых молекул РНК. Самые длинные транскрипты находились на одном копне «елочки» п соответствовали 45S предшественнику рРНК. Следовательно, синтез рРНК начинался на копие отрезка с короткими боковыми нитями и заканчивался на участке с длинными нитями РНК. Такой участок ДНК, на котором были видны молекулы рРНК в процессе их удлинения. получил название транскрипционной единицы. Между транскрипционными единицами располагались участки ДНК. лишенные гранул PH К-полимеразы I н транскриптов. Это — зоны так называемых спенсеров, которые не транскрибируются, и. более того, на таких препара тах они имеют нуклсосомное ст роение, тогда как транскрипционные единицы свободны от нуклеосом. Величина таких слейссриых участков может варьировать нс только в данной клетке, но быть различной у разных видов. Длина боковых фибрилл была в 5-10 раз короче, чем 45S РНК, из-за того, что эта новосинтсзированпая РНК связана с бел ками, образуя рибонуклеопротеидный тяж — предшественник рибо сом.
162
Дрожжи
Простейшие
(Г^иивСТ^^ивииий^Насскомыс
С^Ив^ХЙ^ИИИИИиЙ Бесхвостые амфибии, рыбы
” Птицы
d -ZZ^—М \~1 ' Млекопитающие
»Se S рРНК IS, I.-pPHK
рис. 84. Строение р-генов разных организмов ( А. Хаджиолов)
tS и iS, - соответственно внешняя и внутренние транскрибируемые последовательности
Исходя из этих работ стало очевидным то, что рибосомный ген состоит из двух участков: нетраискрибируемой последовательности 1НК (nis) - спсйсера - и транскрипционной единицы. В состав транскрипционной единицы входят участки, соответствующие 28S, 18S и 5.8S рРНК. разделенные вставками, которые деградируют при процессинге45S РНК.
Расшифровка структуры рибосомных генов различных эукариотических объектов показала удивительно универсальный тип их строения.
3' nis-npoMOTop-tse— 18S рРН K-tsif—5.8S рРНK-lsi2-28S рРНК 5,
где nis - нстранскрнбируемые последовательности ДНК спонсорного участка. Is - транскрибируемые последовательности ДНК (внешняя и две внутренние) и участки, соответствующие зрелым рибосомным РНК В состав транскрипционной единицы входит весь ген за исключением спсйсериого участка. Такая структура рибосомногогена прак тически одинакова для всех эукариотических организмов (рис-8 )• риабельными являются как нстранскрнбируемые (спейсериые) у мет ки. гак и транскрибируемые вставки (ts), которые нс входят в состав
’рслых рРНК.
транскп ТРИ Oc,,Owiwc молекулы рРНК синтезируются на одной °"а к липшие. Что же касается молекулы 5S рРНК. то
ся На от МУ ,ХНУ ,,,1как°го отношения не имеет: 55рРНКсинтезирует-,‘изатопДеЛЬ1,Ь,Х ,с,,ах* локализованных не в зонах ядрышковых органы Н| р>П * **а совсем иных хромосомах при участии РНК-лолимера-^омосо'41'' У ',е-,,овека основная масса генов 5S рРНК находится на I са ’сны $с’ и Мслк,*с кластеры - на 9 и 16 хромосомах. У ксенолу-Фомосп г расположены в теломерных участках большинства Клнстсп М СГ,Ы 5$ РРНК. гоже множественные, также собраны в у,,слов.Ы-1,0 ИК ч,,сло ньние, чем у остальных генов рРНК. Например.
tK<l Их насчитывается до 2000. у ксенопуса - 24 000. у гребенча-
163
Рис. 85. Транскрипция p-генов на циклической ДНК дополнительного ядрышка ооцита жука-плавунца (<?) и строение одной транскрипционной единицы (р-гена) (б)
того тритона - 32 000 Есть объекты и с меньшим их числом: дрозофила — 320. крыса - ЗЗо У нейросноры и дрожжей число генов 5S рРНК одинаковое с числом других рибосомных генов, так как участок 5S рРНК включен и транскрибируется в снейсер-нои тоне.
Транскрипция рРНК идет с помощью двух ферментов: РНК-поли-меразы 1, которая участвует в с Интеле 45S прет шестиеннпка рРНК и PH К-полимеразы 111, ответственной за синтез 5S рРНК. Матрицей для синтеза рРНК по опре-дс 1CHIHO должна быть ядрышковая ДПК.
В изолированном р-хро.мнтинс обнаружены ГИСТОНЫ. НС1ИСТОНО-
вые белки и белки рибосом. Гак, в р>хромат ине выявлены основные сердцевинные (коровые) гистоны, но их количество составляет только 40% но сравнению с таковым в тотальном хроматине.
Первичные транскрипты (морз]юлогически представлены в виде латеральных филаментов на «елочках», образующихся па активных транскрипционных единицах) про1рессивно увеличиваются в длину ио мере прохождения РНК-но.тнмсразы I вдоль всею транскрипционного участка гена, начиная с точки начала репликации до терминального у*юстка. Скорость роста пени npc-pPI IK составляет около 20 30 пук леотидов в секу и ну. г.е. весь синтез 45S рРНК занимает около 5 Ю мин
На каждой транскрипционной единице расползается множество (50—КХ)) молекул PH К-полимера ил I. гем самым на каждом гене одновременно происходит синтез множесиш молекул нрс-рРНК, которые находятся на разных стадиях роста иолитту клсотичной цепи (рис. 85). Максимальную величину пре-рРНК имеет вблизи терми нального участка, тде се молекулярная масса дос ин ас г 4,5 Ю1’ Да (лдя
164
млекопитающих)- а длина должна соответствовать 5 л мкм На самом же деле йталатерального транскрипта в 5-10 раз короче злой величины. Эго обусловлено тем. что но мере роста транскрипта он связывается сразу же с белками, образуя в конечном участке транс-крин Him рииончклсопротсид с коэффициентом сешмен-ташш 80S. Такие 80S рРНП составляют до ’<)% от всех РИП ядрышка.
Рис. 86. Процессинг 45S РНК 1-5- места шктечонпе 1ьиого распнчпсния
предшественника рибосомных Pit К
Большая часть белков, которые связываются с 45S РНК. являются белками, входящими в состав малой и большой субъе-1111ИШ зрелых рибосом Таким образом, уже па уровне незрелой nt гантской молекулы npc-pl’HK происходит специфическое связывание с рибосомными белками: около 50% белков большой субъединицы и около 30% малой субъелишшы связываются с пре рРНК ни время се синтеза или вскоре после нею. Такая связь45S РНК с белками приводит к тому, что латеральные транскрипты имеют толщину около 1 >нм iпосле оттеснения металлами), на их свободном конце часто наолюда стся крупная г ранула (30 нм), что может указывать на высок)ю степень компактизации РНК п белка на 5*-копие непи РНК.
Распад 45S РНК на более короткие отрезки, явление созрсвани рРНК. или процессинг, происходят после завершения транскрипт t Ферментативный механи зм этого явления до конца еше не ясен, , в принимают уч;icrue зцдо- к экзонуклеазы. При ,г0''1 ,1С_
ск>ватс.1ыюс расщепление пре-рРНК на фр.и менты и ч‘'с ’ га 'Пиаиця участков РНК на этих фра! ментах. В результат; п[с . пре-рРНК примерно 5(Р< нуклеотидов первично син L , ~ а 'Юлеку зы отщепляется (мол. масса 45S 1’11К ’ о(,)
сГ ' арная мо 1 масса зрелых рРНК около I, ' „.„оиные
Пким образом, в ядрышке локализуются с • ,сссеихрос предшественники рибосом: I) зранскрипты рРНК'» «Р Ю-2О4% га- 2) 80S РИЦ. содержащие 45S РНК. мо.ут субъе-
"сс* 1’Н|| ядрышка; .3) 55S РНП - п'"ni 1П1ка:ирсмя
зчнппы. могут составлять до 70 80е? всех PH я Р одного ча-,1‘Чн!я большой рибосомной субъелиниша зазшмае
165
сл: 4) незрелые шчые (40S РИП) субъединицы рибосом, быстро (за 15-30 мии) покидающие ядрышко. ' р
В интенсивно функционирующих ядрышках происходит синтезог ромного числа рибосом: 1500-3000 штук в минуту. Поэтому в ядрышке насчитывается около 5 104 предшественников рибосом.
Структура ядрышка
Сведения стойком строении ядрышка были получены главным образом методом электронной .микроскопии. Световая микроскопия давала ограниченный набор данных о структуре ядрышка из-за малого их размера (1-5 мкм) и недостаточной разрешающей способности этого метода. Из прижизненных наблюдений видно, что ядрышки обладают высокой плотностью и высоким светопреломлением. В их структуре даже прижизненно видна некоторая неоднородность: нитчатые (иукяеодонемы), гранулярные компоненты (нуклеолини), а также светлые зоны — «вакуоли». Гистохимически в ядрышках выявлялась РНК, но не ДНК. ДНК обнаруживалась лишь в периферической зоне ядрышек в виде так называемого околоядрышконого хроматина, который мог прилежать к одной из сторон ядрышка, окружать его кольцом или вообше отсутствовать. Считалось, чтоокояоядрышковый хроматин представляет собой гетерохроматиновые зоны. Кроме того, было найдено, что ядрышки имеют некоторое сродство к солям серебра, т.е. обладают аргентофилией, могут восстанавливать серебро из различных растноров: нитрата серебра, «аммиачного серебра», протеинатов серебра. При этом происходит о сложение темных осадков исключительно в ядрышках шперфазных клеток, а также в ядрышковых организаторах на митотических хромосомах при делении клетки.
Первые электрон но-микроскопические работы показали. что ядрышки самых различных объектов, несмотря на их разнообразие, построены из одинаковых компонентов: гранулярного и фибриллярною (рис. 87). При этом гранулы в составе ядрышек имели размеры 15 20 им и были несоизмеримо меньше тех «гранул», что были видны в световом микроскопе. Кроме гранул в составе ядрышек обнаружили зоны скопления тонких (3—5 нм) фибрилл диффузная часть ядрышек. Взаимное расположение гранулярных и фибриллярных зон в ядрышке может быть различным. Так, в некоторых случаях фибриллярный компонент занимает центральную часть ядрышка в виде однорот ного образования (печень аксолотля, многие ядрышки растительны4 меристем) или в виде нескольких (3-5) отдельных зон (рис. 88).
Обычно гранулярный компонент (ГК) расположен на периферии ядрышка, но встречаются случаи, когда фибриллярный и гранучярныи компоненты распределены в ядрышке равномерно. Часто в структуре
166
СП ЭВ пр11 ма'10М 101
Рис. 87. < троение ядрышка клеток культуры
большом (Л увеличении (фото О.В. 3;П1СП,'"_ ’ „ярныН коми»»- <₽>
ЯО И.КТШ.1Я ООО.ЮЧК.1: ЯК ИДрЬОВКО. 1 компонент
Фкбри |лярныи uctiip; НФК - плотный фнбрилляр»
Рис. 88. Схема компонентов ядрышка
I - гранулярный компонент (нуклеоло-нсма); 2 - фибркл гярные центры; 3 -плотный фибри ынрншг компонент; 4 око.ц>я.1рыц1коьь1и хромаI ин
ядрышек Фчбр1и|лярно-|рануляр-ные компоненты обратит нитчатые структуры - иуклеолоиемы (ядрышковые нити), толщиной около 100-200 нм. Эти нуклеоло-немы при достаточном контрастировании моцт быть видны даже в световом микроскопе. Ядрышковые ннги. или иуклеолоиемы.также неоднородны по своему строению: в них кроме гранул толщиной 15 нм входит множество тонких фибрилл, которые могут образовывать в нуклеоло! темях отдельные сгущения.
Неодноро шой оказалась структура и диффузного, фибридырио-го компонента. Найдено, что практически во всех типах ядрышек как животных, так и растительных объектов встречаются так называемые фибриллярные центры (ФИ) — участки скопления фибрилл с низкой электронной плотностью, окруженные зоной фибрилл более высокой электронной плотности плотный фибриллярный КОМПОНС1!г ( ПФК).
Кроме гранул и фибриллярных участков в структуре ядрышка обнаруживаются хроматиновые компоненты: такие как околояйрышьо-вый хроматин, который может примыкать к ядрышку и даже окружать его. Часто 30 нанометровые фибриллы хроматина по периферии ядрышка заходят в лакуны между нуклеолонемными участками.
Наконец, в составе ядрышка выявляется белковый остов - маг-рикс. На улыратонких срезах необработанных ядрышек матрикс не выявляется в виде отдельного компонента, но если жст ранг ропать из ядрышек РНК. ЧП К и белки, связанные с ними, то можно видеть, что ядрышко как таковое не распадается, не теряет своей обшей <|юрмы. После таких обработок структура ядрышка представлена рыхлой фио-риллярной сетью, заполняющей объем ядрышка.
Таким образом, в структуре ядрышек можно различить слелуюишс пять компонентов. гранулярный, фибриллярные центры, плотный фибриллярныii компонент, хрома г ин, белковый сетчатый магрпке.
Каким же образом распределены внутри ядрышек рДНК. pi’HK и бедки, где располагаются матрицы для синтеза pl’ll К. где первичные транскрипты, тле предшественники рибосом, зрелые рибосомы - все
168
зги вопросы были решены с применением самых разнсюбт . ккелярно биологических и itino.ini ических методов Одним п методов является метод рефессииного окрашивания нуклеинов,и* слот. Он основан на том. что ноны хранила, связанные с ДНК б™ легко вымываются со срезов при обработке их хе.татоном ЭДТЛ ч воны, связанные с РНК Это позволяет различить в ядре : плотные ок' решенные структуры. содержащие РНК. и структуры, потерявшие ок риску, те. что содержа г ДНК. Так, в разнообразных ядрах участки хро матина. как кон гененрованпото. гак и диффузною, теряют окраску а компоненты, содержащие РНК. - сокраняют. В ядре при лом контрастно выделяются разнообразные РКП, содержащиеся в основном объеме я гра и ядрышка. При пом в ядрышках интенсивно окрашены многочисленные гранулы, они окрашены так же. как рибосомы цитоплазмы. Окрашенным является плотный фибриллярный компонент, фибрилчярные центры окрашены слабее, а внутриядрышковый и око-тоядрышковый хромат ины выглядят светлыми. Следовательно, мож
но пре тол ожить. что как гранулярный компонент, который скорее всею пре юта пл я ст субъединицы рибосом, так и плотный фибриллярный компонент со гержаг РНК.
Так. при короткой пучьсовой метке тритированным урнчином (-Н-
уридин) первые следы мечения обнаруживались сначала (через
I 15 мин) в плотном фибритляриом компоненте (ПФК). а татем (до 30 мим) меченым оказывался гранулярный компонент (ГК). Важно от-
мстить. что в фибриллярных центрах (ФИ) метка не обнаруживалась. И г этого наблюдения был сделан вы вот. что 45S пре-рРНК синтезируется в области плотного фибриллярного компонента, а гранулярный компонент ядрышка соогвстсгвчст прерибосомным частицам (55S-, 40S РНП).
Оставался открытым вопрос о прнро.ie фибриллярных центров, ок ружейных плотными РНК содержащими фибриллами. Различны мег очами (специфическое окрашивание с помощью осмии ами *• ДНКазы, меченной золотом, связыванием меченого ^К,,’НОМ” 0
прямой молекулярной гибри ш задней с меченой рДН ) нар что в составе фибриллярных центров находится ЛИК. ‘
«синтез рРНК. Зоин фибриллярных центров отличаются "ОТО хром.шша гем. что состоят из гонких хроматшн»1 значите.И.НО обедненных гистоном HI (что показано с
’«енных коллоидным золотом ан гн гел). данные молеку-
Дги нсслелонания позволили связать другс ЛР'гол _)}с данными 'яркой организации транскрибируемых рноосомных t [ка про-МОрфо.Ю! ИИ ядрышек и выяснить тополог ИЮ в OObt.
Чесса сип гсза рибосомной 1’11К и образования1 флбри.гчярных
модели, предложенной Жоссеном ( - • и иозможио.
1,е'прах расшшожепы иеакзивные рггбосомиыс к
169
ФЦ
Рис. 89. Трехмерная реконструкция ядрышка и одного фибриллярного центра
Транскрипты рРНК соответствуют птотиому фибриллярному компоненту (ПФК) рДНК. «спсйссры* и неактивные цистроны расположены внутри фибрил тарного центра (Ф11)
еле веерные участки. Граискригшия пре рРНК происходит по периферии фибриллярных центров, где плотный фибриллярный компонент представляет собой 45S ирс-рРН К, располагающиеся в виде «елочек- на деконденейроваипых участках рДНК (рис. 89). После завершения транскрипции 45S РНК гсряст связь с транскрипционной единицей на ДНК в зоне плотного фибриллярного компонента, каким-то сшс непонятым образом переходит в транулярную зону, где и происходят процессинг рРНК, образование и созревание рибосомных субъединиц
Фибриллярный центр и ядрышковый организатор
Строение и химические характеристики фибриллярных центров (ФЦ) оказались практически одинаковыми с таковыми ядрышковых организаторов ми готических хромосом. И те и друтие построены из тесно ассоциированных фибрилл толщиной 6-10 нм и обладают характерной особенностью - окрашиваются солями серебра, что ’зависит от наличия особых ядрышковых белков, а также содержат 1’НК' полимеразу I. Однако число ФЦ в ннтерфазных ядрышках нс соответствует числу ядрышковых организаторов в ми гозс. Так. в клетках культуры СП ЭВ число ФЦ может быть в 2—4 раза выше, чем число ядрышковых организаторов (табл. И).
170
Количество ядрышек (ЯК), фиирилтяриых центров и (^-иерищах и во время мигом
Таблица U
(ФЦ)вС0-
Период (редисе число Общий объем, мкм3 Средний объем одного ФЦ, мкм3
ЯК Ф11 як ФЦ
6„ 2.3 7 8.05 0.212 0.033
G, 2,3 33,7 23.43 0.430 0.014
Митоз — 6 8 - 0.2 0,025
Более того, количество ФЦ возрастает по мере увеличения плотности клетки (G2, 4л?) и транскрипционной ее активности. При этом уменьшается величина каждою отдельною фибриллярного центра. О.чиако суммарные объемы ФЦ при пересчете на гаитоилный хромосомный набор остаются постоянными в интерфазе, ио превышают это число вдвое по сравнению с метафазой. Другими словами, при активации синтеза рРН К наблюдается такое изменение числаФЦ и их размеров, которое может говори гь о какой-то фрагментации исходных ФЦ в относительно малоактивных ядрышках.
Противоположная картина наблюдается при затухании синтетических процессов в дифференцирующихся клетках эритроидного ряда мышей (табл. 12). При этом видно, что в размножающихся и активно синтезирующих гемоглобин ироэритробластах количество фибриллярных центров зависит от плопдности клетки (88 в6(-фазе и 118 в Gj-фазе клеточного цикла), размер индивидуальных ФЦ изменяется мало. После прекращения размножения этих клеток и падения их синтетической активности резко меняются параметры ядрышка. Их объем, начиная со сталии базофильного эритробласта, уменьшается в 4-5 раз. а на конечной стадии дифференцировки (иормобласт) - в сотню раз. При этом резко падает число ФЦ (10-40 раз) и почти в 10 раз возрастает величина отдельного фибриллярного центра.
Исходя из этих наблюдений, можно так представить общую схему активации и инактивации рышкового организатора, затор представлен в виде включающего в себя комн ДНК. несущей тандемно кРицциопныс единицы). В конденсация р-генов на периферии такою фибриллярно^’ ^ти р-|ены начинают транскрибироваться, на них оораз) пянскринты. которые при созревании дают начало ^’^^^ышка. предшественникон рибосом по периферии активироваикак5Ы ° МсРс усиления транскрипции единый фибриллярн t
ядрышка (рис. 90) на примере одною В неактивной форме ячрышковый оргаии-олиого крупного фибриллярного центра, акгио уложенную часть цепи хромосомной расположенные рибосомные гены (траис-начале активации ядрышка происходит ле------------------------------,,.»МТля
171
Таб.тии 12
Кодичесгво фибриллярных центров и значения их размеров при эршропоззс в печени тараlunicii мыши (приводятся средние значения)
С та.зия шфферешгироики Объем ядрышек, мкм1 Количество Лиаме гр Объем ФЦ. мкм’ Суммарный объем фЦ. мкм3
ФИ ФЦ, мкм*
П ро эритробласт (2с ДНК) 17.7 88 0.2 0.0042 0,369
Про эритробласт (4с ДНК) 29,4 118 0.23 0.0064 0,749
Базофильный эритробласт (2с ДНК) 4,5 8 0,35 0,0248 0,170
Попихромато-фильный эритробласт (2с ДНК) 0.5 4.3 0,4 0,0259 0.1 К)
Нормобласт (2с ДНК) 0.102 2.7 0.42 0,04 0.102
распадается на ряд более мелких фибриллярных иен трон, связанных друг с другом полностью декомнактнюванпыми угас псами рДНК Чем выше транскрипционная активность ядрышка, тем бо.чыие число мелких, связанных друге другом фибриллярных центров, окруженных плотным фибриллярным компонентом (ПФК), содержанты 45S
Рис. 90. Схема активации и инакзивашш ядрышкового орган» w гора 1 - начало лкшнлгни «с точки- появляются по периферии одного крепкою (ЯОР-хромосомы); 2. 3 дальнейшая активация приводит к <Лр.н<,нлН*,ю М ниАсс г лепных ФЦ: ? полная активация; 5 - полная инактивация
172
рРНК. При полной активации ядрышка все мелкие фибриллярные центры «сконденсируются; в лом случае зоны плотного фибр, X,то исто компонента содержат всю рДНК. находящуюся в активномТ стоянии. Такая струк.ура наблюдается у ам.|.1иф|шИровапн1.1х я ’ щек растущих ооцитов. В случае инактивации ядрышка происходит постепенная котепсання рДНК. снова образуются фнбрипярныс центры- они объединяются друг с другом. величина их растет’ параллельно уменьшению доли ПФК. При полной инактивации. каквелу-чае нормобдастов. ядрышко представлено одним крупным (4-5 мкм) сферическим ФИ без сопутствуютсго транскрипций ПФК: оно окружено зоной конденсированного хроматина. Такое инактивированное я ipuiiiKO сходно но своим структурным особенностям с ядрышковым организатором в составе митотических хромосом.
Структурные типы ядрышек
Приведенные выше описания лают основу для понимания разнообразия строения ядрышек в клетках с соответствующим уровнем синтеза рРНК. Однако кроме различной степени выраженности ipany-ляриого и фибриллярных компонентов существуют и иные варианты структурной организации я грышек. Обычно различают несколько структурных типов ядрышек: ретикулярный, или иуклеолонемный, компактный, кольцевидный, остаточный (покоящийся), сегрегированный (рис. 91).
Ретикулярный тин ядрышка наиболее характерен дчя бояыпинстна клеток. для него свойственно нуклеолонемное строение, обилие гранул и фибриллярного плотного материала. Во многих случаях фнбрил-1ярныс центры выявляются и юхо, вероятно, из-за высокого уровня транскрипции. Этот тип ядрышек встречается в клетках животных и растений. Так. ретикулярный гни я Гришка гигантских политенных хромосом дву крылы.х насекомых и i шиитских хромосом щпиподнал пых клеток ячменя очень сходен. . й
Компдкшый тип ядрышка отличается ог предыдущего выраженностью нуклеолонемы. большей частотой негр фибриллярных центров. Такие ядрышки характерны лля bTV_ '’иожаю1Ш1хся клеток (клетки расгительных меристем, ые -
Ры ткани и др.). Вероною, оба эти типа могут пс^х,^ во всяком случае, они чаше всего встречаются в кде )Ровном спитеза Pl IК и белка. животных. Вснсю-
Кольцеви тыс я трышки встречаются в клетках снег,юй цети-,,ом микроскопе они имеют форм' кольца е опта чес рцП-фиб-
pit,b*ioii юной эго фибриллярный центр. оКр-'*с он) । мкм. Р“ мми и гранулами. Ра змер этих ядрышек составляй око.
173
Рис. 91, Структурные типы ядрышек
I - ретикулярный; 2 - компактный; J - вакуол ирный; 4 кольцевидный; 5 -се|рсгировак1 < ы й
Типичные кольцевидные ядрышки характерны для лимфоцитов и эндотел иоинтов, т е. для клеток с относительно ни жим уровнем транскрипции.
Остаточные ядрышки характерны для клеюк, полностью потерявших способность к синтезу рРНК (нор.мобласты. дифференцированные энтероииты, клетки шиповатого слоя кожного эпителия и др ). Часто они настолько малы и так окружены конденсированным хроматином, что с трудом обнаруживаются в световом микроскопе. В ряде случаев они moivt снова активироваться и переходить в компактную и пи ретикулярную форму.
Сегрегированные ядрышки характерны для клеток, обработанных различными антибиотиками или химическими веществами, вызывающими прекращение синтеза рРНК (актиномицин Д. амфотерицин и др.), а также антибиотиками, влияющими на синтез ДИК и белков (митомицин, пуромииин, многие канцероюны и г.и). Термин «сегрегация» используется в данном случае в связи с тем. ч го происхо шт мк бы разделение, обособление разных компонентов я крышек. сопровождающиеся нро1рессивным уменьшением ею объема. При лом обособляются друг от друга крупные фибриллярные Петры и цэануляр-но-фибриллярный компонент.
174
Белки ядрышек
До 60% сухой массы выделенных ядрышек приходится на белки, число которых может составлять несколько сотен разных видов. Помимо белков ассоциированного с ядрышками хроматина в состав ядрышек входят белки рибосом и специфические ядрышковые белки, связанные с транскрипцией рибосомных генов, с происссингом 45S рРНК. такие как PH К-полимераза I, факторы транскрипции, топоизомеразы, метилазы, нуклеазы. протеи нкиназы. фосфатазы. Часть ядрышковых белков имеет сродство к серебру (аргентофильные белки): РНК-полимераза I, фактор транскрипции UBF, нуклсолин (С-23), нуклеофозмин (ньюматрии, или В-23).
Аргеитофилия характерна для белков, обогащенных сульфгидрильными, дисульфидными связями. Как уже указывалось, четкой арген-гофи.шей обладают интерфазные ядрышки и зоны ядрышковых орга-
низаторов на митотических хромосомах.
Собственно ядрышковые белки расположены в специфических местах их активности. Так. РНК-полимераза I и фактор транскрипции рРНК UBF располагаются в фибриллярных центрах (ФЦ) и/иди в плотном фибриллярном компоненте (ПФК).
Аргентофильным является также белок с молекулярной массой 195 кДа, представляющий собой большую субъединицу РНК-лолиме-разы I. участвующую в синтезе рРНК. Этот белок локализуется в зоне фибриллярных центров, по их периферии. На плоскостных препаратах ядрышек аргентофилией обладают участки над осевой частью «елочек», непосредственно нал расположением гранул РНК-полимс-разы I. Кроме того, с помощью иммуноморфологически.х методов РНК-полимераза I обнаруживается в зоне ядрышковых организаторов митотических хромосом. Это обстоятельство не противоречит данным о том. что но время митоза транскрипция полностью йрскрашас’ся. Вероятно, что во время митоза гены, нагруженные неактивной полимеразой I. переносятся вместе с нею в области ядрышковых ор ни заторов из одной клеточной генерации в другую. , „
С непифический для ядрышек белок фибрилларии ( -1 . м• •* 34 кДа) располагается в ПФК. где он осуществляет r,pnULL .ц рРНК в комплексе с друз ими РИП. в состав которых в -мяРПК. необходимая для начального этапа процессинга - _ Фибрилларии обнаруживается также в остаточных ядрьш рьппковом матриксе». плотно-
Веяок 03 (110 кДа). или «ную.еолпн».
го фшбрил {яркою компонента И в фибриллярны ,.....1|Ч KDOMO-но также и «шах ядры.мк.и.ых орган., торов
сом. Счслоиателыю. он обнархживаегея как па .ранекр naciuiac-.. на неактивных учае.кзх рибосомных ге.ю». В препаратах рао.иас
I7S
тайных ядрышек он выявляется нал транскрипционными единицами («-елочками»), Он обнаружен во фракциях, содержащих предшественники рибосом. Функции его до конца нс ясны, хотя стало известно, что белок С23 может играть важную структурную роль в процессе транскрипции: своим N-koiiuom, на котором находятся лизиновые группы, он связывается с ядрышковым хроматином, а С копцом - с транскрибируемым спенсером (tsi) на 45S рРНК. Обнаружено, что этот белок связывается не с ДНК транскрипционной единицы, а с ДНК. имеющей нуклсосомиое строение (вероятно, со сиейсернымн участками).
Белок В-23 (нуклсофозин, мол. масса ^7 кДа) с помошью иммуноцитохимических методов локализован в области ПФК и главным образом в зоне гранулярною компонента. Считается, что В 23 участвует в промежуточных и терминальных стадиях биогенеза рибосом и в транспорте пре-рибосом.
Общая схема работы ядрышка как специального локуса синтеза рибосом
При сшновлснии синтеза рРНК в ядрышках на поверхности ФЦ происходит активация транскрипционных единиц связывание с факторами транскрипции и РНК-нолнмеразой I. которая начинает считывать первичный транскрипт рРНК. По мере прохождения первой PH К-полимеразы 1 на освобождающийся участок транскрипционной единицы салится следующая Pl IК-полимераза и начинается синтез новой рРНК. Одновременно и последовательно па одном р-ге-нс могут находиться до согни РНК-полимераз I, ог которых отходят транскрипты разной cienenn завершенности. Конечным продуктом является пре-рРНК и in 45S рРНК. По мерс синтеза растущие пени рРП К одеваются рибосомными белками, поступающими в ядро из цитоплазмы. так что сразу образуются цепи PH П-предшественников. Совокупноеп» продуктов транскрипции нескольких транскрипционных единиц образует вокруг ФЦ зону ПФК. Конечным про |укгом такого синтеза является рибонуклсопротеидный тяж, или глобула, имеющая константу седиментации около KOS и содержащая одну мочеку-TV45S рРНК После отделения 4SS рРНК в терминальной точке транскрипционной единицы происходи! растепление процессии: 45S рРНК, в копне которого образую гея 40S и 60S рибосомные субъединицы. Синтез малых субъединиц в ядрышке занимает примерно 30 мин. а больших - около I ч В я фьникс незрелая 60S рибосомная субъедп пина. кроме двух фрагментов рРНК (2XS и 5.KS). связывается с треть им (5S). который еишс зировался независимо оI хромосом с ядрышковыми ор! аки за юрами на других хромосомах. Какие новообразованные
176
Рис. 92. Общая схема работы ядрышка ,
7 ячро: 2 - обмен. ядрышка; Г илаззытичсеквя Пынскришнюнивя сзиюща; 5 Ж РИН. содержащая 45S ирс-рРНК. 6 РнГюсомния субъеднншы. 7 - маня рибосомная исбъедшгмна. < -5мд’
сите «ируемая ине ядрышка; 9 полная M)S рдбоглюпыя рибосома.
Пунктирные стрс ней ноюки бе шов из hiiiuium«мы к рРНК
Рибосомные субъединицы особым образом bm«>.wt “1 * ! ” н Плазму через ялерныс поры. В зиззозизазме закис незре.тьL нача_ мозугсвязазься с,зопо.1нззгс.зз.нымз| белзязми. '5,!- , . .„„iineij
Ы связываемся с ззРНК толям, за.ем с больсои 60S .................
образуя полную 80S фупмнюнирукииую риб°сом' 'Р,1С-
Новые, неканонические функции ядрышек
Последние тайные гюказынакп. что кроме синкза рРНК я U 'часгнует но mkoihx других аспектах экспрессии ,сНОВ‘ ,.(X-TIi «1
Первые ,замен, (1965 з) на „риз.зам, necn.ln
РЫИ1СК были получены при п/учении гетерокарно» о
177
нпп человеческих клеток HcLac эритроцитами кур были получены гетерокарионы с первоначально совершенно разными ядрами. Ядра клеток HcLa были функционально активны, в них шел синтез разнообразных РНК. Исходные ядра эритроцитов кур содержали сверхкон-денсмрованный хроматин, не содержали ядрышек и не транскрибировались. В гетерокарионе после слияния с клетками Не La в ядрах эритроцитов кур хроматин начинал дскондснсироняться, активировалась транскрипция, появлялись ядрышки. Иммуноцитохимическими методами изучалось появление в гетерокарионах белков, характерных дчя куриных клеток. Несмотря на то что в клетках Не La имелась готовая система функционирования рибосом и были сформированы ядрышки. появление куриных белков откладывал ось до тех пор, пока не возникали ядрышки в ядрах эритроцитов. Эго означало, что ядрышко куриного эритроцита как-то должно вовлекаться в образование кури пых нРНК, т.е. ядрышко должно играть какую-то роль в продукции куриных иРНК.
Позднее были накоплены данные в поддержку этой гипотезы. Было обнаружено, что созревание (сплайсирование) с-тус иРНК в клетках млекопитающих происходит в ядрышках. В ядрышках были выявлены снлайсосомные малые РНК (sn РНК), факторы сплайсинга пре-иРНК.
Далее в ядрышках обнаруживаются РНК, входящие я SRP-частм-цы. участвующие в синтезе белков в эндоплазматическом ретикулуме. С ядрышком оказалась ассоциирована РНК теломеразы — рибонук-леопротсида (обратная транскриптаза). Имеется много данных о локализации в ядрышках процессинга малых ядерных РНК, входящих в состав сплайсосом, и даже о процессинге тРНК.
Ядрышко во время митоза: периферический хромосомный материал
С помошыо световой микроскопии ядрышко выявляется во время интерфазы, в митотических клетках оно исчезает. При использован в в цейграферной микрокиносъемки можно наблюдать в живых клетках как по мере конденсации хромосом в интерфазе происходит исчезновение ядрышка. Сначала оно слегка уплотняется, но затем ко времени разрыва ядерной обо ючки начинает быстро терять плотность, становится рыхлым п на глазах быстро исчезает, как бы тает. При этом видно, что часть ядрышкового материала растекается между хромосомами. В метафазе и анафазе ядрышки кактаконыс отсутствуют Первые признаки новых ядрышек появляются посте средней телофазы когда уже достаточно разрыхлились хромосомы дочерних ядер, имеющие НОВУЮ ЯДСрнуЮ ОбОЛОЧКу. В ЭТО Время ВблИЗИ ДСКОНДГИСИруЮПШХСЯ
178
хромосом появляются Плотные тельца предъядрышки. Обычно их число выше, чем число ядрышек в интерфазс. Позанес, уже в G,-перво ле клеточного никла предъядрышки растут, начинают объелшятьсядрут сдругом. их общее число падает, носуммарный объем возрастает Общий объем ядрышка удваивается в S С2-фазах. В некоторых случаях в профазе (культуры клеток человека) при конденсации хромосом крупные ядрышки распадаются на более мелкие, которые в митозе исчезают
На самом деле никакого полного исчезновения, или «растворения», ядрышка иск происходит изменение его структуры, редукция одной части его компонентов при сохранении другой. Так, было пока зано, что аргентофильные гранулы в интерфазных ядрышках, обнару жнваемые н световом микроскопе, начиняют в профазе сливаться друг с другом, одновременно уменьшаясь в объеме, минимальный размер они занимают в метафазе, локализуясь в зонах ядрышковых организаторов хромосом. В таком виде они существуют до средней телофазы, котта выявляются в виде отдельных множественных предъядрышек, разбросанных среди лсконденсированных хромосом. Уже в койне телофазы такие аргентофильные предъядрышки начинают расти. Таким образом, можно видеть, что во время митоза исчезновению подвергается только часть ядрышковою компонента, в то время как аргентофильный компонент сохраняется, постоянно существует во время митоза и переносится на хромосомах в дочерние ядра.
Радиоавтографическими исследованиями показано, что исчезновение ядрышек совпадает с прекращением синтеза клеточной (в основном рибосомной) РНК. который возобновляется в поздней телофазе. совпадая по времени с появлением новых ядрышек.
Кроме того, обнаружено, что активность РНК-иолимеразы 1 также исчезает на средних стадиях митоза. Это дало основание считать, что Новообразование ядрышек сия зано с восстановление синтеза рРНК в лочерзшл клетках.
Но в то же время существуют факты, указывающие на перманентное. постоянное присутствие ядрышковых компонентов в течение всего клеточного цикла. Это в первую очередь относится к аргентофильному материалу ядрышек.
Цигологи в начале XX века часто наблюдали во время митоза появление какого-то нс хроматинового материала. окружающего каждую хромосому. Этот материал. или «матрикс». митотических хромо сом. как считали. мог иметь ядрышковое происхождение, и его роль могла заключаться втом, что он может служить источником новых яд рыпгек в дочерних ядрах после митоза.
Электронная микроскопия показала. что «матрикс* “ нех^1‘ НОВЫЙ компонент МНТОТПЧССК'И.Х Хромосом. СОСТОЯЩИЙ из С OI е рыхло расположенных фибрилл и гранул, имеюшпх рибонуклеопротс-идпую природу, морфологичсскн сходных с компонентами, вх .
179
ми в состав нптерфазных ядрышек, выявляется в условиях конденсации митотических хромосом как растительного, так и животного происхождения. При этом некоторые компоненты ядрышек диссоциируют и ухатят в цитоплазму (большая часть PH П-частиц), в то время как другие тесно связываются с поверхностью хромосом, образуя основу «матрикса» или, как этот компонент теперь называют, основу периферического хромосомного материала (ПХМ) (рис. 93). Этот фибриддяр-но-гранутярный материал, синтезированный до митоза, переносится хромосомами в дочерние клетки. В ранней гслофазе ешс в отсутствие синтеза РНК по мере дсконденсации хромосом происходит структурное перераспределение компонентов ПХМ. Его фибриллярные компоненты начинают собираться в мелкие ассоциаты предъядрышки. которые могут сливаться друг с другом, собираться в зоне ядрышкового организатора хромосом в поздней телофазе, где возобновляется транскрипция рРНК.
Новый этап в изучении периферического материала митотических хромосом связан с ттспо твзоватнтем иммуноцитохимических методов выявления ядрышковых белков. Было показано, что митотические хромосомы действительно участвуют в переносе в дочерние клетки белков ядрышек, белков ялерною остова и различных РИП. Например, установлено, что ядрышковые белки, участвующие в транскрипции рРНК (РНК-полиыераза I, топоизомераза I» фактор инициации транскрипции UBF и др.), аккумулируются в зоне ядрышкового организатора. в то время как белки, связанные с процессингом пре-рРНК (фибрилларии. нуклсолин, В-23), а также некоторая часть пре рРНК и малые ядрышковые РИП переносятся поверхностью хромосом в составе периферическою хромосомного материала (рис. 94).
Кроме того, в состав ПХМ могут входить некоторые негистоновые белки из состава ялерною интерфазиою остова (рис. 95).
Следовательно, митотические хромосомы нс только выполняют свою главную функцию переносят генетический матершш в виде ДНК, но. кроме того, участвуют в переносе целого ряда белков и РНК (рис. 96).
Биологический смысл появления ПХМ на поверхности митотических хромосом может кткяючаться в том, что переносимые хромосомами белки не являются случайными «пассажирами», а представляют собой комплекс бе ткон разного происхождения: ферменты и факторы ядрышковой транскрипции, проиессшна рРНК. сборки рибосом, незрелые предшественники рибосом и, кроме того, белки ялерною и ядрышкового матрикса, также содержащие малые ядерлыс РПП и все компоненты, связанные с образованием нирибоеомных РНК. с их сплайсингом и др. Хрутими словами, ПХМ переносит в новые ядра многие белковые компоненты и ферменты, что сотдаег условия, необходимые 'тля форсированною возобновления синтеза и созревания
1ST!
f’nc. 93- MitKpmjwtojрафия периферического хромосомного материала (Пх\1) ц ленящихся клетках эндосперма пшеницы. полученная с помощью vicKipoHHoro микроскопа (фото В.В. 1>у района)
<* к.!А.'1.1Я хромосома окружена II.X.M; о го ме "Р” окраске ii.i III11 но
Ьерих.цч!) / хромосомы;’- НХМ; J мпкрсярх бочки nt|x’ieii.i
fKl
Рис. 94. Микрофогография периферическою хромосомного млгсри.п.1 в ле-1ЯШИХСЯ KiciKax анлоеперма пшеницы, пи (ученная с помощью светового микроскопа ( (фото F М. Лазаревой).
« -z - окраска AgNo, а ишерфача. 6 - ранняя профам. и мечафаза, г помняя аи.» фаза: d, <’ окраска пин teaauii к я фЫ1иммн.>му бе ik\ фмбрн i мринч d ранняя интерфаза. е ЯК я ipiaiilKH, \1’С чромск'имм
1X2
Рис. 95. Микрофон»!рафия периферического хромосомного материала (Пг\М> к к|сгка\ СП ЭВ. поточенная с помощью снстоного микроскопа
М Ц \hpjnioiion)
° окраска ф оиресниирхкниих«ц ли иге tavii к я.1рышконому бе »ку В 23: б окраска аннпс 1.1МИ к белку 40 кДл я.icpiioit» vctipuKc.i. / ялрышки и 1Ш1ерфазиы\ клетках: 2 нонерхштнос oKpaintiKiHite хромос-ох» (НАМ)
1X3
Рис. 96. Участие периферического хромосомного материала (П\М) в переносе хромосомами компонентов ядрышка и ядерного белкового матрикса на разных стадиях ядерного цикла
I интерфаза: И мстафам. Ill - телофаза; IV ранняя интерфаза. I - компонент траке крш in ион ною комплекса синтеза рРНК ip.UIK. РНК-полимерии I <|мк1оры транскрипции): 2 компоненты прсшасеикм р1*НК: 3 пре инееiпенники рибосом и белки матрикса ядрышка ЯК я ipuniKO. ЯОР я kpuiiiKoiiuii орган и спор хромосомы. ФИ фибриллярный tump; ПФК плотный фибриллярным компонент; ГК - ipa»i>-1йрныи компонент ячоинис i. PC рибосомы. ИЯ К пред|.я.чрып1кн; XPI хроматин'. ХРС хромосома: ПХ1 периферические 1раиуты; ЯЬМ ялирнын белковый мат рикс. ЯО ядерная оболочка
рибосом, а также синтеза информационных РНК. Митотическая хр° мосома переноси! в новое ядро нс ю н>ко генетическую информаипи1 в виде ДНК хроматина, но и необходимые компоненты синтетически-
184
го аппарата, готового к активации транскрипции в новом клеточном цикле. Хромосома при клеточном делении «все снос несет с собой, как гласит латинская поговорка.
Глава 9
НЕРИБОСОМНЫЕ ПРОДУКТЫ КЛЕТОЧНОГО ЯДРА
Транскрипция нерибосомных генов
Информационные РНК образуются при участии РНК-полнме-разы И. начинающей синтез со стартовой точки граискриишюниой единицы и кончающей его в точке терминации. При этом образуется одна молекула РНК транскрипт, предшественник информационной РНК Размер транскрипционных единиц разных leiiou может значн-гель но варьировав от 6 тыс. до 200 тыс. нуклеотидов. Поэтому суммарная фракция РНК. синтезированная на разных генах, содержит .молекхлы различной длины. Эта первично синтезированная РНК. или так называемая гетерогенная ядерная РНК (гяРНК), встречается тальке в ядре и ис обнаруживается в цитоплазме В цитоплазму попадает где информационная РНК. образующаяся в результате изменении в ядре первичных транскриптов РНК (гяРНК).
Величина гяРНК в несколько раз больше Toil, которая требуется язя синтеза белков: для синтеза « среднего белка», состоящего из 400 аммнокис.юг. необходима матричная РНК в 1200 нуклеотидов. На самом челе величины информационных РНК в составе синтезирующих белок полисом в несколько раз короче первичных транскриптов. Это Укорочение является результатом «созревания» гяРНК процессинга, но иного характера, чем процессинг рибосомных РНК. Структура гена эукариот оказалась состоящий из чередующихся последовательностей нуклеотидов экзонов и интронов. Экзоны участки ДНК. которые обладают кодирующей информацией и вхо шт в состав информапнон-ных РНК, а интроны содержат последовательности, нс входящие н ин-Формапионнхю РНК. Первичный транскрипт РНК содержит полиую копию гена, включает в себя вес нослс'ювтелыюсги. как эк юны. гак и интроны. Интроны виослслспши вырезаются из первичного транскрипта, концы же фрагментов РНК сшивакэтся ковалентно. что при води г к общем} у корам и на и ню образовавшейся молекелы информа «ионной РНК Эюг процесс iio.tjmh.t название сплайсинга. (лк как бол ши и нс ню icHOH млекопитающих союржит большее число интронов. чем эк ЮНОВ, процесс cii.iaiicnnia РНК привошгк тому что очень яишные молекулы гяР11К (первичных ipancKpitiiTou. содержащих оо->се чем 50 000 нуклеотидов) укорачиваются до длины пинттазмагиче-
1X5
I 3< -
Рис. 97. Созревание (сплайсинг) гетерогенных ядерных (гя) РНК
I - матрица ДНК: 2 - гяРНК - нсриич-ным тракскршн; 3 - мРНК: 4 - интроны;
5 - экзоны; б • ендайсосома
скнх иРНК (обычно от 500 до 3000 нуклеотидов длиной) (рис. 97).
По мерс синтеза и роста гяРНК она связывается с рядом ядерных белков, образуя гяРНП частицы (гетерогенные ялерные рибонуклеопротеиновые частицы). При этом высокомолекулярная гяРНК в ядрах наметывается на глобулярные белковые частицы ииформоферы На каждый информофер приходигея отрезок РНК длиной около 500 - 600 нук-
леотидов. Такой комплекс инфор-мофера и РНК образует мономер или 30S частицу. В состав каждого информофер» входи г более 30 белковых молекул информатина. Таким образом, первичный транскрипт структурного гена, отвечающего за образование информационной РНК, представляет собой гигантскую молекулу гяРНК. связанную со множеством белковых чистин — информофер. Считается чго участки гяРНК между ииформоферами могут быть использованы хтя сплайсинга с помошью специальных белковых комп гексон силайсосом. В
состав силайеосом входят 5—7 малых ядерных риболуклеонро! сидов (мяРИП, или snRNP - small nuclear ribonucleoprotcin). Эги особые малые ялерные РНП (мяРПП) представляют собой РНП-частицы (UI, U2, U5. U4. U6 snRNP) с константой седиментации около 10S. В каждой час nine содержится одна малая мо «скула РНК (90-400 нуклеотидов) и около семи молекул белка. Так что спчайсосома представляет собой крупный рпбонуклеопротсилиый комн гекс величиной, сравнимой с рибосомой (констанга седиментации около 60S).
При синтезе гяРНК и после него сплайсосомы связываются с цепью РНК в местах на границе между зк зонами и интронами, специфически узнавая ли места, производят разрыв в основании петли нитрона и сшивают свободные концы (рис. 98). Таким способом участки и трон пых последовательное геи вычленяются из состава первичного транскрипта, а затем быстро деградируют в ядре. В результате этою процесса длина ре зулыируюгиси молекулы РНК может укорачиваться в несколько раз. Например, размер гена белка тироглобули-на включает 3()() тыс. нуклеотидов, размер же иРНК тля этого белка составляе) всего 8.7 тыс. нмезеошлов из-за тоги, что в составе гена включены 36 инлрониых последовательное гей, т.с. происходит укорочение молекул РНК более чем в 30 раз. Размер гена кагалазы равен
1X6
34 т.п.н.. а размер иРНК -1.6 т.п.и. Величина овальбуминового гена у птиц составляет 7.5 т.п.н.. а соответствующая этому гену эре »ая иРНК - всего 1.8 т.п.н. Обычно иРНК в 2.5-10 раз короче первичного транскрипта- гяРНК.
Считается, что после созревания иРНК при переходе из ядра в цитоплазму теряет белки, входящие в состав ииформофе-ра. «переодевается» в ядерной поре, а бе тки информофер остаются в ядре. В цитоплазме иРНК снова одеваются новыми белками. образуя «мнформосо-мы* - форму хранения и PH К в неактивном состоянии, или связываются сбсчками. нсобхо-шмыми тля трансляции.
Рис. 98. Последовательное вырезание интрона и сплайсинга экюнов
/ - «ннрон; 2. 2' экзоны; 3 - образование сп •мисосомы; 4 зре ня иРНК: 5- вырезан-
ным ни фон
Морфология РНП-компонентов ядра
Вся информация о морфотогии транскриптов рРНК и иРНК. об ииформоферах и сппайсосомах получена в результате изучения вылеченных из ядер этих компонентов, подвергнутых специально» обработке для расп застывания их на препаратах для электронной микроскопии. Чгоже касается морфологии РНП-нротуктоззinsitu. нобъеме интактных ядер, то здесь информация неточная и противоречивая.
Кроме хорошо выраженною ядрышка другие продукты ядерной активности при изучении клеток на учьтратонких срезах не бросаются в глаза: их зрулно отличить от различных фибрилл (ДНП. матрикс) и к«зки\-го зраку з. казалось бы. без особого порядка разбросанных «ядре. Нее Же. пспо |ьз\я метол и збирательного контрастирования солями vpana структур. содержащих РНК. укается выделить ряд компонентов, ^озорые можно отнести к иея зрышковым протуктам транскрипции. Зю - Псрихроматиноныс фибриллы, перихроматиповые гранулы и ингерхром.-миновыс гранулы (рис. 99, би 100).
Исри.хромативовые фибриллы обнаруживаются но периферии участков конденсированного хроматина (околоыембраннозо или тю-6<>!о зрукио). Они имени iо.пинну около 3-5 нм. часто образуют рых
Рис. Э9. Микрофотографии РКП-компонентой ядра, полученные с помощью электронною микроскопа
и транскрипционные с шпицы янссон пиронами ых ядрышек (но Miller. Beath). 1969). в - РПК-со'лсржашие орчктуры в ядре печени крысы, окраска но Бернхарде (фок> В.Ю (IniHkoirtl ИХГ псричроманиюные jp.inj |м. ИХ| ипн-рхрам.пииошле ipmi) ил. ЯК ядрышки
1КН
ню неправильную есть. Оказалось, что этот компонент ядра спило изменяется при стимуляции синтеза РНК. Так. при возрастании синтеза РНК 13 клетках печени крыс после голодания и последующего пи-гания или после введения кортизона адрсналэктомпроваиным животным зоны псрихроматиновых фибрилл значительно увеличиваются. Эти зоны оказались наиболее активными но включению меченых предшественников в РНК, что было показано радиоавтографпчески с помощью электронного микроскопа. Такие фибриллы могут представлять новое и птезп рован ну ю гяРНК.
Ipxioii тип РНК-содержаших структур ннтерфазного ядра - перихром липовые гранулы. Они имеют диаметр около 45 нм и окружены светлым орсилом. Эти гранулы встречаются только на периферии конденсированного хроматина, в диффузном хроматине их нет. Считает
ся. что между этими гранулами и перпхроматированными фибрилла мн существует структурная связь. При больших увеличениях внутри фанул можно видеть тонкие извитые фибриллы 3-5 н.м толщиной.
Крупные гранулы типа перпхреиштиновых встречаются в специфических активных в отношении синтеза РНК участках лолитеняьи хромосом в пуффдо (см. далее). Сходные i ранулы обнаружены в боковых пет 1ях функционирующих мейотичсских хромосом. Исходя из
этого, некоторые исследователи делают предположение, что такие ри-бонуклеоп ротон тные гранулы могу г представлять собой зрелые комплексы из нескольких информофер рибопу клеоп роте цдные частицы, содержащие информационную РНК. О тако это предположение нуж-
дается в проверке.
Пиюрхроматшювые гранулы третий тин РНК-содержаших структур. Они имеют размер 20—25 нм и группируются всегда в форме скоплений между участками хроматина. Эти гранулы не стандартны по величине и переплетены тонкими фибрнлзмми
В последнее время были получены антитела к мяРНП. Оказалось, что среди них есть и различные сп.тайсосо.мы - гранулы размером 20- 30 нм. Эти мяРНП расползались в зонах, свободных игконленси-рованного хроматин:!, и ио своей лежалимши совпадали с зонами, тле располагались скопления нигерхрамагиновых гранул, ни moi У* представлять собой скопление сплайсосом. хчасшуюших в коне > i
стадиях согревания гяРНК. «тел-
в га. ». coyiae всю кар...у тнамики сзиззе*. nilИК 'Д"
ставни.следующим образом. .IcKOiriciiciipyKHiinecii) .е ш4
"а (Ахроматин) по вервферпи конденсирован11 ''
С»я .ываясь с 1’1 IK-iio.uiMep.. е бёХ
чаньиых неричромагпрованиых ф"0ри.-1.1. ‘’"ь ‘ ,шетием
информофер. которые «тем иолв^.зрелым фо, СП Ш.1СОСОМ (интерхром: miioiiMK >р.">- ' ‘ „„«вым .ра
мам иРНК комплекизм ц||фо(1мофер. ii.ni шР" I
IK9
Рис. 100. Схема расположения РНП-продуктов в митерфазном ядре клетки животных (а) и н растениях с хромонемкой организацией ядер (4) / - ядерная обо ючка; 2- хроматин: 3- ядрышко; 4 нерихроматмповыс гранулы; 5-перихроматиноныс фибриллы; б - ин герхромл типовые гранулы; 7 — гранул ярмо-фнб рил тяркая сеть РИП
нулям. Вероятно, не все зрелые иРНК могут переходить в крупные (45-60 нм) пери хроматиновые гранулы, а последние, вероятно, характерны для РНК с высокой мо гскулярной массой.
Иную топографию в интерфазных ядрах имеют PI Ш-нродхкты растительных клеток Так. в ядрах с хро.монемной организацией интерфазного хроматина РНП в виде крупных гранул (20-30 нм) и тон ки.х фибрилл (6-Х нм) располагается по периферии такою конденсированного хроматина и в межхроматинокыч зонах: создается впечатление, что вся периферия хромопемных участков хроматина вовлечена в синтез РНК (см. рис. 100. б).
Были сделаны попытки изучить морфолотю транскрипции пери босомны.х генов на тотальных плоскостных upenapaiax. Для этого из гомогенатов ядер осаждали фракцию диффузного хроматина. обобщенного включенными мечеными предшественниками РНК Активный хроматин на таких препаратах имел вил типичных нуклсосомных 190
фибрилл с редко сидящими одиночными гранулами РНК полимеразы, от которых отходили транскрипты РНК разной длины и конфигурации (рис. 101). Обычно это были изогнутые фибриллы. иногда имеющие на свободном конце глобулярные образования. Чаще всею расстояние между одиночными । ранулами РНК-полимсразы доходило до 0,1 0,3 мкм, поэтому представлялось, что с гена транс крибируится лишь одна копия, в отличие от множественных копии, получаемых с генов рРНК Однако в редких случа-ях обнаруживались участки хроматина с тесно располо-
Рис. 101. Морфология транскрибирующихся участков интерфазного хроматина
/ интенсивная транскрипция. 2 слабая транскрипция
ленными РЫК-полимеразами, от которых отходили в сторону ipaiic-крипты разной длины. образуя «елочкополобиыс» структуры.
Попытки наблюдать морфологию транскрипции на определенных генах были еде чаны на целом ряде объектов, включая политенные хромосомы двукрылых насекомых и мейотические профазныс хромосомы.
Синтез РНК в пуфах полигонных хромосом
Болес полные представления о морфологии синтеза и образования конечных продуктов транскрипции определенных генных участков и,,тсрфазны\ хромосом были получены при исследовании политен-иых хромосом.
Светоопгическ'ое изучение строения политехник хромосом двукрылых обнаружило, что кроме дисков и межлисконы.х участков везре чаются локальные расширения хромосом, так называемые пуфы. В Них участках ДНК не раеподагасгся в пи зе дисков. они имеют аморф-'OmcipyKiypj. часто содержат РНК. ба зофнльны. В пуфах происходит °сновнос включение 5Н-ури нша; но однозначно показывает, что они являются активными участками ят(\ своеобразных интс|х|к1зных хромосом.
Количество тфон и их локализация нс являются постоянном характеристикой roii или пион нплитекзюй хромосомы. Более того, рисунок пуфирокшпя (i.c. расположение пуфов на хромосомах) на од-191
Рис. 102. Четвертая полите иная хромосома тычинки Chiranamus dorsalis (слева) и куколки (справа) (по: Кимтадте. I9S5)
Я - ялрышко; ЯОР областьятрышкопогоортанизглора; КБ1 пуф (кольцо Бальбма-iiit I): КБИ - пуф (кольцо Бальбизни Н)
нон и топ же хромосоме разный, в зависимости от стащи развития ли
чинки или от типа клеток, взятых для исследования.
Так как возникновение пуфов прямо связывается с актнваниен синтеза РНК, то было показано, что развитие определенного пхфа отражает собой активацию отдельною или группы ichoii, детерминирующих функционально-метаболические особенности клеток на дан ном этапе развития. Поэтому в различных дифференцированных клетках картина нуффипирования не должна совпадать, что и наблюдается на самом деле (рис. 102).
При затухании синтеза РНК пуф начинает спадаться. уменьшаться в размерах, терять базофи шю. и в копне концов на ею месте можно видеть шск. из которого он развился. Особенно демонстративно это видно на особо крупных пуфах четвертой хромосомы Chinmomns, которые носят название колен Бальбиани (КБ). Так. на личиночной стадии можно виден, на четвертой хромосоме вблизи от ядрышка дна постоянных базофильных пуфа: КБ! и КБ2.
С помои идо электронною микроскопа было обнаружено, что зона этих крупных пуфов содержит большое количество транул рибонуклео-iipoicTVTHOH природы размером 50-60 нм. Эти гранулы, предположи
192
Рис. 103. Схема транскрипции в кольце Бальбианк II
a WKUH КНС.1ЦИЯ хромлина с обралжшнем пхпккриоирмоши.ия ишаков ДНК в районе пм|м; о - транскрипционная с-шншы ш у шратаикоч срезе; « - она ас ш препаратах ио Ми.перх
тслыю содержащие информационную РНК и соогветствующие ин-формосомлм в составе кольца Батьбпани 2 (КБ2). располагаются особым образом На улырэтонки.х срезах можно наблюдать, что они располагаются рядами вдоль осевых элементов. Каждая гранула оказалась свя шиной с осевой структурой с помощью ножки-фнбрпл ты толщиной 14—16 нм (рис. 1(B). Эта картина соответствует предположению, что грану ты размером 50-60 нм представляют собой РНГ1-прозу кты данного хромосомного локуса, находящиеся и процессе их синтеза. На плоское।ных препаратах по Мидлеру такие участки КБ2 были представлены многом ис 1енными «елочкоподобнымн’ стр) ктх рами. состоящими из осевых компонентов и отходящих от них многочисленных ипангских i рас и криптон, имеющих длину до 7.7 мкм. От участка транскрипции в данном с'дчае отходит в среднем 123 гигантских транскрипта, связанных с комплексами PH К-полимеразы.
Расшифровка лих морфологических наблюдений стала возможной при анализе тшливилуальных РНК. выделенных из КБ2. Для зто-•о с помощью микроманииу.тятора выделяли ядра, затем отделяли от трут их четвертую хро.моеомх и с помощью .микро шссекпии вырезали и накапливали зоны, содержащие КБ2. Затем из лих пуфов выделяли РНК, ко1орук»иеслсюна.ш с помощью к-ль- мекпюфореза. Выделенная РНК окаKLiacbогромных размеров, она имела молекулярную массу 15 35 ДО6 Да и «сяименгаиин 75S> Сзютвстсгвснно ге-
ны мой 75S РНК содержали -’7 т.п.н. Вероятно, они нс имеют интро
193
нов, так как 75S РНК не подвергается процессингу и служит матрицей для синтеза гигантских молекул секреторных белков. Гены 75S РНК оказались построены наподобие сателлитных ДНК: в их составе наблюдается иерархия внутренних повторов.
После завершения синтеза 75S РНК ее молекулы в виде крупных (50-60 нм) РНП-гранул транспортируются в цитоплазму. Однако значительная их часть разрушается: только 4-7% этой РНК обнаруживается в цитоплазме. Эти гигантские молекулы РНК образуют в цитоплазме особо крупные полисомы (700S). в состав которых входит 55-65 рибосом, на которых синтезируются длинные цепочки гликопротеидов клеток слюнной железы мотыля. (На самом деле эта железа не участвует в пищеварении, она не содержит ферментов: ее функция заключается в синтезе белка, необходимого личинке для построения домика и ловчих сетей.)
Транскрипция на мейотических хромосомах
Мсйотическис хромосомы типа «ламповых щеток» (см. далее) встречаются главным образом на стадии диплотены мейоза как усам нов, так и у самок. По сравнению с митотическими хромосомами меметические хромосомы типа «ламповых щеток» намного длиннее и хороню видны в световом микроскопе но двум причинам: они представ* ляю1 собой спаренные и удвоенные хроматиды, так что в их состав входят четыре продольные субъединицы. Но отличительной особенностью этих хромосом является наличие боковых петель, отходящих от множества хромомеров, попарно симметрично располагающихся вдоль каждого гомолога (рис. 104). Именно в петлях хромосом типа «ламповых щеток» происходит синтез РНК во время длительной мей этическом профазы
Следовательно, хромосомы типа «ламповых теток» занимают как бы промежуточное положение между инактивированными максимально конденсированными хромосомами и активными иитерфазиы-ми хромосомами: конденсированные участки хромо.меров соответствуют участкам митотических хромосом, а боковые петли - участкам активных интерфазных хромосомных районов. Считается, что число боковых петель соответствует числу хромомсров, за исключением того, что хромомсры. представляющие пси гримерные участки, петель нс несут. Гак, у гребенчатого тритона, чьи хромосомы типа «ламповых щеток» особенно подробно изучены, насчитывается около 5 000 хро-момероп на гаплоидный набор и соответственно 20 000 боковых нетель на диплотенную митотическую хромосому (напомним, что в профазе мейоза клетки содержат гетраилоиднос количество хроматы.1).
194
ис. 104. С хсма диллотснной хромосомы на сталии «ламповых шсток» а - бивалент с двумя хиазмами, парное расположение боковых петелы б- пара петель на сестринских хромай» ia.x. Матрикс цепи образован РНП-фибризлами - продуктами ।сннои актинности лих участков хромосом. Покаикы два цистрона на каждой негде, отходящей от хромоцентра
-Латеральные. пли боковые, петли в составе хромосом типа «ламповых щеток» неоднородны ио своей структуре. Преобладают ординарные ичи нормальные петли длиной около Ю мкм. Они асимметричны по своей толщине, в световом .микроскопе видно, что один из концов петли тонкий, а другой — толстый; развернутая петля имеет клиновидную форму. С помощью светового микроскопа в составе ординарных петель видно, что каждая петля покрыта как бы чехлом или матриксом. имеющим неясную гранулярно-фибриллярную структуру
ДНК входит в состав осевого элемента нетель и представляет собой основную хромосомную ДНК. Это дока «.пилось тем. что как боковые петли, так и осевые компоненты днплтенных хромосом рвутся при обработке ДН Казой. ,,,
Ьоковые петли способны к синтезу РНК включение -Н-уридина вроистадит практически но всех петлях но всей их длине. Новосинтс-знроплнная PH К н не тлях быстро ассипирует с белками, заранее сип-
тезированными в цитоплазме.
г irx .«..v.v пртсаь на V п.тратонких срезах в их со-
Нрц изучении оодмнарных iKiw*» и.» j- i ।
«иве бы к,' шинено большое количество гранул величиной 25-40 нм. «Очных с .опер- и „ерихромагиновыми .ринулами интегфвного яд Ра и с грану ыми я пуфах поли генных хромосом.
195
Рис. 105. Схема ориентации транскрипционных единиц в петлях мейотичс-ских хромосом
Более подробно ст рук гура боковых петель была изучена с помощью метола электронной микроскопии на препаратах распластанных длило генных хромосом.
Оказалось, что общая морфология транскрипции Набоковых пет лях хромосом типа «ламповых щеток» удивительно маломизгаег таковую на рибосомных цистронах (см. рис. 104). Большинство ординарных боковых петель представляет собой одну транскрипционную единицу, начало транскрипции которой расположено на одном конце петли, а терминальный участок - на другом. Следовательно, такая транскрипционная единица гоже имеет форму «елочки», только изо-шутом в виде петли. Здесь также наблюдается линейный градиент транскриптов: короткие в начале. а максимально длинные (до нескольких десятков нанометров) на концах транскрипционных единиц.
Транскрипты здесь представлены в виде рибонуклсоп роте илов. В результате воздействия низких ионных ст они нз глобул величиной 25-40 нм превращаются в вытянутые, изогнутые фибриллы, часто на копие имеющие утомшенис. Морфология транскрипгов из разных петлях неодинаковая. Встречаются расправленные, линейные фибриллы а также кустистые фибриллы, многократно сложенные сами на себя, вероятно, в результате образования дуплексных структур РНК.
В некоторых петлях могут располагаться несколько транскринии онных единиц разной длины как с идентичной, так и с оппозитной ориентацией транскрипции (рис. 105). Интенсивность транскрипции также неодинакова на различных петлях: встречаются петли с 30 и с 3—5 транскриптами на I мкм.
При палении транскрипционной активности в естественных условиях или при зкспсримсн галитом подавлении синтеза РНК длина петель уменьшается, они приобретают пуклеосомнос строение.
196
Морфология транскрипции индивидуальных генов
Недавно был предложен более прогрессивны!! подход для после юва-шгя морфолог ни транскрипции шшивгиуальных структурных (кодирующих полппеп^и гиые пени) генов. В тксперимснтс бы ш использованы ооциты V luevis, в ядра которых с помощью микроинъекций мо/ io вво-дип,любые матску гы втом числе и ДНК. Если для такого введения взять клонированные гены, то, получая препараты ио Миллеру можно обнаружить отдельные от ядрышек и хромосом молекулы ДН К. которые в условиях высокой гранскрнпиионнон активности в играх ооцитов, в свою очередь, вовлекаются в процесс транскрипции. Это и част возможность наблюдать за транскрипционной активностью и нливпл сального гена.
Так. в ядра ооцитов бы ш инъецированы небольшие циклические молекулы клонированных генов овальбумина кур. Инъекция большого количества лик гонов (2-5 hi на ядро) приводила к тому, что в ядре обратиы вались кластеры из нескольких сотен циклических молекул, хорошо обличающихся от элементов собственного хроматина ооиктон. Оказалось. что 80—ЧОЗг инъецированного материала неактивны. В лом случае индивидуальные циклические молекулы генов были сплошь покрыты нуклеосомами и не содержали транскрипционных комплексов (PHк-полимераза вместе с цепочкой синтезированной РНК)
Небольшая часть инъецированных гонов, однако, обладала типичными транскрипционными комплексами. Срезш таких активированных генов встречаются, по крайний мерс, три морфологических класса. В первом случае это были циркулярные молекулы со с iu6oii транскрипцией (3-10транскриптов на 1 мкм длины хроматина), транскр|шгы были разной длины и не обладали шнейным градиентом. В другом случае наблюдали интенсивно транскрибируемые циклические участки хроматина, покрытые транскрипционными комплексами по всей длине молекулы ДНК (30-50 транскринюн на 1 мкм хроматина). Здесь транскрипты достигали Л1ИНЫ до 1,2 мкм. ВПК на интенсивно транскрибируемы* участках всегда была расположена по градиенту длины. образуя участки, напоминающие «елочки»» на транскрипционных единицах ядрышковых ЯНК Первичный транскрипт с клонированного гена овачъоумина кур содержи! участки колирующих цосдедоиательшютей (экзоны и интрс ны На подобных upeiiapaiax в тесной ассоциации < ннгып.шн 2 криптами бываю» вп шы пнеже глобулярные сплайсосомы. Мким оора-зом удается наблюдать за работой -нобых ишшвцдуальных генов.
Синтез транспортных РНК
........™ ........
197
95 ихклсотиюв (примерно 30 нм), уложенных в сложную трехмерною фигуру. Отдельный ген тРНК состоит из двух крайних экзонов и одного центрального интрона. Во время процессинга интрон удаляется, а два экзона с помощью фермент а лигазы соединяются в зрелую молекулу
Глава 10
ЯДЕРНАЯ ОБОЛОЧКА
Структура, ограничивающая параметр клеточного ядра, - ядерная оболочка, характерна для эукариотических клеток. Она разделяет два внутриклеточных компартмента друг от друга - цитоплазму от ядра. Значение такого разделения структур в пространстве очень важно: это приводит к обособлению процессов синтеза белка и процессов синтеза нуклеиновых кислот, что создает дополнительные, по сравнению с прокариотами, возможности для регуляции генной активности и ее реализации в виде синтеза специфических белков. Активная регуляция транспорта из цитоплазмы в ядро и из ядра в цитоплазму через специальные комплексы пор создает систему избирательного транспорта веществ, делая ядерную оболочку «генными воротами» со специальными «привратниками» (контрольными пунктами), регулирующими потоки ядсрного импорта и экспорта. Кроме того, как уже упоминалось, ядерная оболочка играет большую роль в орг анизации трехмерной структуры интерфазного ядра, элементы ядерной оболочки являются частьюялерного белкового матрикса.
Ядерная оболочка состоит из двух мембран - внешней и внутренней, между которыми располагается перинуклеарное пространство (рис. 106). Внутренняя мембрана ядерной оболочки структурно связана с ламиной - фиброзным периферическим слоем ядсрного бе гково-го магрикса. В общем виде ядерная оболочка может быть представлена как двухслойный мешок, отделяющий содержимое ядра от цитоплазмы. Однако ядерная оболочка имеет характерную особенность, отличающую ее от других двухмембран пых структур клетки (митохондрий и пласт ил). Это наличие особых ядерных пор, которые образуются за счет многочисленных зон слияния двух я горных мембран и представляют собой как бы округлые, сквозные перфорации всей ядерной оболочки.
Компоненты ядерной оболочки
Внешняя мембрана ядернойоболочки, непосредственно контактирующая с цитоплазмой клетки, имеет ряд структурных особенностей, позволяющих отнести ее к собственно мембранной системе эндоплазматическою ретикулума (ЭПР). Так, на внешней ядерной мембране
19Х
Рис. 106. Участок периферии ядра
I - внешняя мембрана ядерной оболочки; 2 - перинуклеарное нросгрансгво; ? -|<||угренняя мембрана ялерном обо «очки; -1 ялерные поры; 5 - имины; б хроматин; 7- мембраны тноплазмы
ооычно располагается большое количество рибосом, как и на мембранах эр!астонлазмы. Существуют мноючисленные наблюдения о непосредственном переходе внешней ядерной мембраны в систему каналов ямойла магического ретикулума, что особенно подчеркивает стрхк-турную идентичность этих мембран (см. рис. 106).
Так, у клеток, бедных эндоплазматическим ретикулумом, внешняя ядерная мембрана может представлять собой «минимальный» объем эндоплазматического ретикулума, который может участвовать в синтезе белковою и липидного компонентов мембран. Описаны случаи, когда от внешней ядерной мембраны отшей тяются мембранные вакуоли» направляющиеся в проксимальный отдел аппарата Гольджи. Состав Iипидов и белков внешней ядерной мембраны очень схож с таковым рстикулхма. Возможно, именно это определяет их общие биохимические функции, что особенно подчеркивается наличием рибосом на поверхности мембран, обращенной в гиалонлазму. Эти рибосомы сингсзир\к>г как мембранные, так и секретируемые белки, которые Moiyj транспортироваться в перинуклеарное пространство. a on уда в полости HMCicpH ЭПР. Например, при стимуляции образования ?-гло-бучинов в плазмацитах первые продукни клеточной активности локализуются в перинуклеарном пространстве, а потом начинают появляться в полостях ЭПР У большинства животных и растительных кле
199
ток внешняя мембрана ядерной оболочки не представляет собой идеально ровную поверхность, она может образовывать различной величины выпячивания или выросты в сторону цитоплазмы.
Внутренняя мембрана я терной оболочки рибосом на своей поверхности не имеет, но связана с фиброзным слоем ядерной ламином (lamina nuclcum limiians). которая, в свою очередь, здякоривает хроматин на ядерной ободочке. Связь хрома!ина с внутренней мембраной оболочки является ее характерной особенностью, хотя существуют примеры, когда эти связи наржпаюгся при сохранении целостности ядерной оболочки. Так, в ооцитах амфибий на стадии ди плоте ны все хромосомы собираются в центре ядра if пояностьютеряют связь с ядерной оболочкой. В то же время при делении клеток с так называемым закрытым типом митоза большая часть внутренней ядерной мембраны теряет свя зь с хроматином.
О специфичности белков ламины уже говорилось в главе 6 «Ядер-ный белковый матрикс», здесь же необходимо еще раз подчеркнуть, что эти фибриллярные белки ис образуют ней змеиную структуру. Фиброзный слой ламины все время перес граи вас гея, особенно в связи с ростом поверхности ядра, во время клеточною цикла. Характерные для внутренней ядерной мембраны белки — ламины А. Си В - относятся к фибриллярным белкам V типа промежуточных филаментов (см. далее), их фибриллярные мономеры могут образовывать димеры и тетрамеры, а последние образуют фибриллы толщиной около 10 нм. Со стороны кариоплазмы под внутренней ядерной мембраной такие фибриллы образуют ортогональные структуры, череду юпгиеся с рыхло расположенной сетью этих же фибрилл.
Белки ламины с мембраной связаны двояким образом. Лак, ламин В после синтеза модифицируется добавлением нырофобной июнем -т ильной । руппы вблизи С-копия. Эта липофи шная группа встраивается в слой мембраны и как бы заякори наст ламину на мембране. Кроме того, целый ряд интегральных белков внутренней ядерной мембраны (LBR, LAR, змсрин и др.) также закрепляет ламины посредством дополнительных белков, входящих в состав этого фиброзного слоя. Эги же белки участвуют в связывании ядерной мембраны с хроматином.
Наиболее характерной и бросающейся в глаза структурой в сошаве ядерной оболочки является я герпая пора. Поры в оболочке образуют ся за счет слияния шух ядерных мембран в виде округлых сквозных отверстий, или перфорации, с диаметром окаю ИЮ им При aniaeiидиом фиксации или при использовании .метода ымораживания и ска лывания в электронном микроскопе видно, что округлое сквозное отверстие в ядерной ободочке зано шеио сложно opt аки зонпннымн глобулярными и фибрил горными орукгурами (рис. )()7). Совокупность мембранных перфорации и этих структур называют комплексом пор ядра. Гем самым подчерки кается, что ядерная пора не просто сквозная
20(1
Ис- 107. \1лхрофого1рафия понсрхн'мли клсючною ядра (мегод ымора-*”Й‘*»ИЯ-СК<МЬ/НЗНИЯ). полученная С ИСЛЮШЫО Л7смр0ННо(0 микроскопа
5чайки ku.mii 1скс<>и>исриы\пор
201
дыра в ядерной оболочке, через которую непосредственно вещества ядра и цитоплазмы могут сообщаться. Компоненты комплекса пор имеют белкову ю природу.
Ялсрный поровый комплекс (ЯПК, или NPC - nuclear роге complex) представляет собой супрамолекулярную структуру с молекулярной массой более 125-106 Да, состоящую из более 1000 белков, масса которых в 30 раз больше, чем рибосома. Белки ЯП К носят название нук-лсоноринов. Насчитывается 50-100 видов этих структур; они собраны примерно в 12 субкомплсксов.
В последнее время удалось получить отчетливые изображения Я ПК в электронном микроскопе, что дает возможность понять их структурную организацию. Внешний диаметр порового комплекса составляет около 100 нм. а высота - 75 нм. В целом он представляет собой цилиндрическую фигуру с признаками ортогональной симметрии. Несмотря на впечатляющие изображения выделенных Я ПК, разные авторы дают разные схемы строения зтого сложного комплекса, обладаюшего симметрией восьмого порядка.
Если посмотреть на ЯП К и плане на ультратон ком срезе, то бросается в глаза, что его периферия представлена восемью глобулами (рис. 108 и 109). На выделенных же ЯПК и первую очередь видны кольчатые структуры. От периферических компонентов ЯПК в сторону цитоплазмы простираются фибриллярные выросты. Со стороны ядра фибриллярные выросты образуют корзин копо.чобную структуру связанную терминальным кольцом. В большинстве моделей центр цилиндрической фигуры ЯПК содержит *пробку» (центральную гранулу, или транспортер) По одной из моделей (рис. НО), цитоплазматические филаменты отходят от цитоплазматического кольца, состоящего из восьми субъединиц. Между ним и внешней ядерной мембраной располагается тонкое кольцо, а затем звездчатое кольцо. Цитоплазматическое кольцо связано внутренними филаментами с транспортером, который находится в центре и заполняет пространство между внешней и внутренней ядерной мембраной. Сходная структура находится не внутренней мембране: нуклеоплазматическос кольцо поддерживает фшш-менты «корзины» Другие варианты моделей показаны на рис. 110.
ВссьЯПК закрепляется интегральными белками - глнкопротеида-ми gp 210 и РОМ 121 — в стенке мембранной перфорации. Пос южно-сти opiaxu заиии и. главное, по функциональной значимости комплекс ядерной поры можно бы ю бы отнести к органеллам клетки. так как их роль заключается в контроле за ядерно-нитотпазменными связями.
Размер я торных пор и их структура стандартны нс только для данной клетки, по и для всех клеток данного организма, более тою - Д™ всех эукариот. Число ядерных пор (табл. 13) зависит от метаболической активности клеток: чем выше синтетические процессы в клетках.
202
рис. 108. Комплексы я хорных пор (КЯП) на у хырагонких срезах
" " нт > плакс; б. г тикрсчиис срезы. / КЯ1Г; 2 - восемь периферических с'^’Ьслиниц (г «ибу'О; 3 ядерная оболочка; -f xpovaiuu. 5 ~ неипшымя «рану ia ^*чр.1нсвортер-)
203
Таи.ища 13
Количество ядерных нор в различных объектах
<)1'»Ы*К1 Число пор Объект — Число пор
па 1 мкм* на одно ядро на 1 мкм2 на одно ядро
Ксенону? почки 10,05 3400 гГт Человек культура ткани И,24 3930
ооцит 51,0 37.6-10ь лимфоцит 4.47 700
Мышь ку ibrvpa ткани 10.S3 5050 Крыса гспатоинт 16,1 3800
ЩМфоПИТ 3.3 400
тем больше пор на е шпицу поверхности клеточного ядра. Так. у зрит-роб застои (клетки-предшественники ядерных эритроцитов) низших позвоночных животных во время интенсивною синтеза и накопления гемоглобина обнаруживается в ядре около 30 ядерных пор на I мкм*. После того как эти процессы заканчиваются, в ядрах зрелых клеток эритроцитов, прекращаются синтезы ДНК и РНК и количество пор падает до пяти па I мкм2. В ядерных оболочках полностью зрелых сперматозоидов поры не обнаруживаются, так же как v микронуклс-усов некоторых инфузории. Количество пор может изменяться в теме ние клеточного цикла. Первое возрастание числа пор наблюдается при реконструкции и росте ядер посте митоза, второй этап увстичепия числа пор происходит во время синтеза ДНК.
Рис. 109. Обшая схема строения ядерных пор
а мненшин Ml. Ядерных пор адрс <Х)111И(,И- 6 СХсма cip(K.t|„„ „ 1срноИ „ори I капаю; 2 спины; ? псигдоыкш Ф;ту..и. 4 хромай,,!. J рибосомы
204
2
Рис. 1 Ю. |»а*личные модс1И строения комплекса ялерной лоры
и но 1-odh.h It соаиг. (20001; 6 - но Каф (19991, в no Albert» и совет. (1994). С гена ’речмерныс moiciii. ciijkhu пори н разрете. / - ялерная оболочки, 2 union i.itM.uii-iecKi(c фи ы мен гы, 7 пси t ра гыыя граней (-трзнспоргерЧ: 4 iiinuii i.nM.iiiriecMK* копию: imroH.iaiM.HHWK.iH cjiiwiinniiia; 6 спина: 7
ятернос кольцо. .¥ фиорн i гы коряшки. терчинлнаюс кольцо. /0 - .чип г ирные l'}6mmhiiiiui4
205
I
По поверхности ятра поры распознаются более или менее равномерно. но их число резко падает в местах ассоциации с ядерной оболочкой участков гетерохроматина, ядрышкового opiaumaTopa и тело-мерных участков.
Поровые комплексы могут встречаться и в других мембранных компонентах клетки, но гораздо реже, чем в ядерной оболочке. Иногда поровые комплексы видны в составе мембран гранулярного эндоплазматического ретикулума. Они обнаруживаются в составе окончатых мембран цитоплазмы, которые представляют собой тесно расположенные пачки замкнутых плоских мембранных мешков, сплошь пронизанных поровыми комплексами, имеющими такую же структуру, как и поры в ядерной оболочке.
Интересные данные были получены при морфометрическом изучении поровых комплексов в ядрах и окончатых мембранах бластодермы эмбрионов дрозофилы. Оказалось, что при переходе от синцитиальной к целлюлярной стадии количество пор в оболочках ядер остается неизменным, а количество пор в окончатых пластинках вырастает примерной К) раз. В дальнейшем окончатые мембраны полностью исчезают. На основании этого было сделано предположение, что на ранней стадии развития в бластодерме дрозофилы происходит «супернро-дукиия» поровых комплексов (или их компонентов), избыток которых «встраивается»» в окончатые мембраны, т.е. макромолекулярный ансамбль, составляющий комплекс ядерных пор, способен к автономной самосборке и к последующему встраиванию в различные мембранные системы.
Роль ядерной оболочки в ядерно-цитоплазматическом обмене
После открытия ядерной оболочки и описания ее строения пришли к заключению, что ядерная оболочка может служить ршуля тором в ядерно-цитоплазматическом обмене, главная роль в этих процессах отводилась ядерным порам. Обмен продуктами между ядром и цитоплазмой в самом деле очень велик: все ядерные белки поступают в я г ро из цитоплазмы и все формы РНК выводятся и j ядер. И и этом процессе комплекс поры выступает как суп рКвдоле куля рный комплекс, выполняющий роль нс только тран ело каюра - механизма переноса, но и роль сортировщика, узнающего и отбирающею специальным образом переносимые молекулы.
В процессеядерно-ццiсилазматичсскоготранспортаядерные поры функционируют как некоторое молекулярное сито, пропуская частицы определенно!о размера пассивно, по i радисту концентрации. Так-ионы, сахара, нуклеотиды. АТФ и гормоны свободно поступают в яД"
206
ра. В то же время ялерные поры осуществляют избирательный транспорт.
Через ялерную оболочку беспрепятственно в обе стороны происходит пассивный транспорт высокомолекулярных соединений имеющих массу не более 5 I О3 Да. Для определения размеров частиц могущих пройти сквозь пору, используются гранулы декстрана пли коллоидного золота, которые путем микроинъекции вводятся в цитоплазму живои клетки. Обнаружено, что максимальный размер частиц, способных транспортироваться в ядро, составляет 8,5 Ю нм. При этом сначала частицы собираются в зоне поровых комплексов, а затем оказываются в ядре. Неядерные белки с массой больше 20 000-40 000 Да проникают н ядро медленнее, если вообще проникают. Так. инъецированные белки с массой 17 кДа могут проникнуть в ядро довольно быстро. за 2—3 мин, белки с массой 40 кДа — за 30 мин, белки с массой 60 кДа вообще не проникают в ядра. Считается, что белки с гидродинамическим радиусом больше 3,5 нм (что соответствует глобулярному белку с массой 65 кДа) не Moiyr просто механически проходить через ялерную пору. В этих случаях ядерная пора выступает в качестве реального молекулярно! о сига.
Но дело осложняется тем. что многие белки как поступают в ядро, так и выхолят из него против градиента концентраций. Так, концентрация гистонов в ядре значительно выше, чем в цитоплазме. Но несмотря на это, во время синтеза ДНК происходит транспорт огромного количества (I06 молекул каждые три .минуты, или по 100-500 молекул через одну лору за I мин) гистонов из цитоплазмы в ядро. В тоже время через ялерные поры реально могут проходить некоторые белки и даже макромолекулярные комплексы с .массой значительно большей. чем 60 кДа.
Через ялерные поры из цитоплазмы в язро транспортируются крупные молекулы белков, например белок нуклеоплазм и и - пенга-Мер с молекулярной массой 125 кДа. Из ядра через поры пыхтят в цитоплазму субъединицы рибосом и другие рибонуклеопротеиды, меньшие из которых могут иметь массу 250 кДа. Эти данные показывают, что комплексы ядерных пор нс представляют собой просто механические сита, которые oiраннчивают транспорт молекул в зависимости от
их размеров.
Работы последнего времени показывают, что мно!ие ялерные о л ки проходят через ялерные поры с помощью специальных механз Мон. включающих узнавание и связывание крхлны.хя (срны.х ос , затем только их транслокацию, перенос через норы. ыло । > ‘ ’
чго белки. граиспоргируемыс к ядро, имеют onpeM ’
Тслыккги аминокислот - |1ос.!словагс.1ы1ости ядерной . > ‘ (NLS nuclear locali/afion sequences). которые у знаютс pc Р« _ ядерных пор. Такие NLS .характерны для кариофильных белков.
207
для белков ялерной локализации, которые синтезируются на рибосомах в цитоплазме, а затем транспортируются в ядро.
Импорт кариофильных белков
Впервые аминокислотные последовательности ялерной локализации были обнаружены на С-koi те субъединиц молекулы нуклеоплаз-мина (ядериын белок, принимающий участие в структуризации хроматина). Эти эксперименты были проведены на бесклеточной системе. когда выделенные ядра пометой в цитоплазматический экстракт ооиитов ксенопуса, куда добавляли нативные или измененные молекулы нуклеоплазмина. Это крупный белок (молекулярная масса 125 кДа), состоящий из пяти субъединиц, каждая из которых обладает глобулярной и фибриллярной С-концевой частью. Если удалить путем протеолиза примерно 50 аминокислот с С-конца, то ни цента-мер, ни мономеры в ядро не попадают, в то время как отщепленные фибриллярные участки через поры проходят свободно, так как содержат NLS-участок.
Болес того, при смешивании неядерных белков с л ими NLS-фрагментами такие комплексы способны транспортироваться в ядро. Даже крупные частицы декстрана (20 н.м), неспособные проникать в ядро, при связывании с ними NLS-последовательностей иук-лсоплазмина транспортировались из цитоплазматического жстрак-та в ялро.
Подробно строение NLS изучено у белка Т-антигсна вируса SV40. Кариофи ц.ный си।нал состоял из последовательности: Pro L\s-,2*Lys Lys-Arg-Lys- Vai. Одна лишь аминокис тотная замена (,2sLys на Гйг или Asp) полностью лишают этот фрагмент кариофильных свойств. Оказалось, что можно создавать химерные белки с этим аминокислотным доменом, что позволяет необычные для ядер белки (альбумин плазмы, иммуноглобулин G и лаже ферритин с молекулярной массой 46S кДа) транспортировать чере з ялерные поры.
Показано, что белок с NI.S проходит в ядро в несколько этапов {рис. III). Импорт начинается с того, что NLS-бслок связывается с гстсродимсром рсиеигора NLS. с белками импортинами О', и Р- локализованными в цитоплазме. Возникший белковый комплекс {импортируемый белок с NLS. снизанный с импортинами и и р) подходит к внешней ялерной мембране и закрепляется на цитоплазматических филаментах норовою комплекса. Затем этот комплекс входит в ядер' иую нору и проходиI через «транспортер». Считается. что транспортер состоит ii । множества извитых белковых филаментов. оботашеИ' вых аланином и i шинном (I G филаменты). представляющих собой
20Н
барьер для транспорта не-кариофм 1ьных белков. Комплекс, имеющий NLS. как бы разрыхляет эту сеть и проходит через канал транспортера. После перехода комплекса в нуклеоплазму импортин 0 связывается с белком RAN. представляющим собой малую СТР-азу. чю приводит к распаду комплекса. Импортируемый белок освобождается и остается в ядре, импортин а возвращается в цитоплазму, так де как и импортин 0, ио в связи с RAN GDP. где последние также диссоциируют. Тем самым только белок с NLS остается в составе ядра (см. рис. III).
Рис. 111. Схема импорта цитоплазматических беиков в ядро
ЯIIК комплекс ятернон лоры: ЯО мерная оболочка. / импортируемый бе чок с NLS: 2 -импортин а; 3— импортин 0; 4~ импортируемы!! комплекс: 5 бе ток RAN. 6 - комплекс RAN импортин 0
Экспорт из ядра в цитоплазму
Из ядра в цитоплазму также существует поток как белков, так и ядерных транскриптов в виде рнбонуклеопротеи.чов. В принципе этот экспорт сходен с процессом импорта кариофи п.ных белков. Обнаружено. что гликопротеи.тныс молекулы, связывающие лиганды. лока--11! зуюгся в месте норовых комплексов и со стороны ядра. Одна и та же п°ра может принимать участие как в импорте, так и в экспорте макро-ч’О.1СКу.!. В HO'Ibiy КОГО ГОВОРИТ ТО, ’ПО ЧасТПЧКИ КОЛЛОИДНОЮ золота, связанною с нуклсоплазмином. сорбируются на ялерной поре со стороны union, laiMM одновременно с сорбцией частичек, связанных с РНК и инъецированных в ядро ооцитов. Псцобные эксперименты по мзади, 410 МНО1ИС РНК (гРНК. 5S РНК. поли-У и ноли-А». связанные с ко.той шым золотом, аккумулируются в зонеядерных пор. а за-ГС-М переносятся в пиюплазму. Ьолес того. РНК способствует переносу чере з я черную иор> крупных частиц золота дозмером «о 20 нм. Обратною переноса не происходит: аналогичные частички, инъецированные в ниишлазму (хиппи, в я.цю нс проникают.
21»
Цитоплазма
Рис. 112. Схема экспорта ядерных белков в цитоплазму
ЯПК - комплекс ядерной норы; ЯО - ядерная оболочка. I — экспортируемый бе токе NES; 2 -экспорт ин; 3 - белок R-XN; 4 - экспортируемый комплекс
Что касается естественных видов РНП. то комплексы ядерных пор также должны узнавать специфический сигнал на экспорт. Белковые компоненты РНП несут аминокислотные последовательности — сигналы ялерного экспорта (NES - nuclear export sequences), которые дают возможность различным РНП проходить через ядер-ную оболочку в цитоплазму.
В этом случае также образуется сложный комплекс, состоящий из переносимого белка с NFS-последовательностью (связанного с РНК или свободного), ассоциированного с белком экспортном I, который в свою очередь связан с белком RAN СТР. Этот комплекс
проходит через центральный канал, создаваемый транспортером, в цитоплазму, где и диссоциирует. При этом освобождается белок с NES-участком (или РНП), который остается в цитоплазме. Экспортин I и RAN после гидролиза GTP снопа воизратаюгся в ядро (рис. 112).
В процессе экспорта РНП ядерная пора контролирует яс только белковый компонент. Ядерные поры узнают и нс экспортируют короткие (100 нуклеотидов) тРНК. если в их структуре есть хоть одна замена. Незрелые формы иРНК имеющие интронные участки, не транспортируются. Вообще в пи|оплазмс нс обнаруживаются незрелые РНК. Вероятно, для экспорта некоторых РНК необходима их связь с особыми белками.
Маю изучен вопрос о транспорте в шпонлатму крупных РНП комплексов, таких как субъединицы рибосом. и1п|юрмосомы и малые ядерные РНП. Возможно, все они под действием каких-ю факторов разворачиваются, меняют свою конформацию и проходя! через поровый комплекс. В пользу этою говорит наличие гингелсвидных РНК содержащих частиц в просвете пор ядер пн антских слюнных желез насекомых. Считается, что эта картина отражает момент выхода и» ядер PHII-частиндиаметром 60 нм, относимых к информоферам. Интересно. что состав белков н union тазматических информационных *ЭНП
210
„нои. это может говорить о том. что и зоне поровых комп тексов про всхолит «переодевание» информационных РНК и осушествтястся снизь их с иными белками.
Динамика ядерной оболочки в митозе
Большей частью, но не у всех видов (исключение составляют амебы. эвгленовые. инфузории, динофлагелляты, многие водоросли, некоторые грибы), ядерная оболочка разрушается при митозе и снова возникает после деления клеток. Это так называемый открытый тип митоза (рис. 113). При этом в профазе по мере конденсации хромосом ядерная оболочка теряет с ними связь, а затем в ней появляются разрывы. Она приобретает вид плоских мембранных вакуолей - цистерн. В эю время ядерные поры еще видны. Позднее они исчезают. Во время митоза комплекс ядерной поры с мол. массой 120 кДа разбирается па субкомп тексы с мол. массой примерно по I кДа. Разборка пор начинается с фосфорилирования ряда нуклеопоринов .miitoi ичсскон c<jc2/uiiK.*nni В-кнназой.
Ядерная оболочка превращается в скопление мелких мембранных пузырьков, окружающих зону бывшею ингерфазного ядра. Такие пузырьки морфологически нельзя отчичить от других мелких вакуолей в union тазме. они. вероятно, сливаются с вакуолями эндоплазматического ретикулума. В метафазе мембранные элементы цитоплазмы оттесняются к периферическим зонам кпеток микротрубочками веретена деления.
В конце анафазы, когда прекращается движение хромосом к про-тивоно южным полюсам клетки. мембранные пузырьки цитоплазмы, в первую очередь мембраны гранулярного эндоплазматического ретикулума, начинают контактировать с поверхностью хромосом. Эти контакты происходят сначала в небольшом числе точек, но затем начинаются перестройка и рост этих первичных зачатков ядерной оболочки, ^ни из мелких пузырьков превращаются в плоские вакуоли, которые Растут в ширину и обволакивают поверхность дсконденсируюши.хся хромосом. Участки таких растущих плоских мембранных мешков сливаются. замыкая и опоражиная содержимое новою ингерфазното ядра. Интересно, чго я черные поры появляются на самых ранних этапах Реконструкции ядерной оболочки, когда двойные меморанные цистерны еще не сомкну тис», и фактически ничего нс разделяют.
11ри реконструкции ядерной оболочки Происходит сборка я терных нор. Она начинается с образования ямки при слиянии внешней и «нутрепней мерной мембраны, которая затем превратиас*гся в отверстие. В лом процессе принимают участие интегральные оелки gp -Ш
211
Ш1СР"°" ' —...........................................
' »>и,рф.1и:2.2 профам^ «рож,аф.„„; J_MC,7 1С„<„рзи;
Л рековстрЖ,.,,,, »„ерИ„, „1ф. Хром^мы „ с ^ ,,,,„
<*««.№.. и в к....... а,Ми ,и К1у„ав„ „ «,,, v v ...........
212
и РОМ 121 которые впоследствии будут закреплять Я Ц к на мембра нах. Затем появляются внутренние структуры ЯНК: комплекс кольца стш, добавление звездчатого кольца и других структур и. наконец филаментов.
У некоторых низших организмов в случае закрытого митоза ядерная оболочка не исчезает, она в зоне ядерной перетяжки замыкается чго приводит к образованию двух новых ядер. Здесь участие ядерной оболочки в делении клетки заключается в том. что на ней закреплены хромосомы, и она, по-внлимому, принимает участие в индукции обра-зования микротрубочек, необходимых при делении клеток.
Вероятно, для реконструкции ядерной оболочки необходимым условием является декомпенсация хромосом. Показано, что если вы шать преждевременную дскон чснсанию мета фазных хромосом, то они очень быстро контактируют с мембранными пузырьками и каждая одевается своей ядерной оболочкой, вследствие чего в клетке возника-
ет множество так называемых ми кроя дер, каждое их которых возникло из одной хромосомы.
В то же время можно экспериментально вызвать разборку ядерной оболочки у интерфазного ядра. Это происходит при слиянии в культуре ткани двух клеток на разных стадиях клеточного цикла: получается так называемый гетерокарион, где очно из ядер будет находиться в ин-терфазс. а другое - в виде митотических хромосом в метафазе. В этом случае в интерфазном ядре начинает конденсироваться хроматин, образуются преждевременно конденсированные хромосомы, а ядерная оболочка исчезнет так же. как во время нормального митоза (рис. 114). Эти данные говорят о том. чго в питон |ашс митотической клетки существуют какие то факторы, вызывающие как конденсацию хромосом, так и параллельный этому процесс распада ядерной оболочки.
Сходная динамика совпадения процессов перестройки хромосом и ядерной оболочки наблюдается и в другой системе - в цитоплазме оонигов или в бесклеточных цитоплазмагических экстрактах ооцитов. Так. если в ни гон квму ооцита амфибий на стадии мегафазы инъецировать выделенные иитерфазные ядра, то их ядерная оболочка разбирается, а хроматин конденсируется в виде митотических хромосом Если в оолит на сталии пптерфазы ввести митотические хромосомы, то они начинают дскон.icncкропаться, появляются множественные Me жие вакуотл. которые, с шкаясь .1руг с другом, образуют ядерпые оСюлочки llinepcciio. чго в цитоплазму ингерфалкмо оогппа можно внести даже чужероднуючистуюДНК. которая, свя макаясь с МИ в пиши шз'ме. сюрззус. хроматиновые глыбки. которые с вок е-
Рель о. .ецаюш,, яцгрным.. обш.о-.камц и превращают " =
>г>| жевегшмеита 11Р»емы имеете с методам цммтоофлто РееиешйшХ»„« РР- к- судьбу многих «и»» >н ООО-
213
Рис. 114. Преждевременная конденсация хромосом и растворение ядерной оболочки в гетерокарионе
/ - митотические хромосомы донорском клетки; 2 - ядро клстки-рснииисита
дочки во время митоза. Подробно изучена судьба ламинов. Найдено, что фиброзный слой ламинов деполимеризуется параллельно распаду ядерных мембран и конденсации хроматина. Этому пре л шествует обильное (в 7 раз выше, чем в Интерфакс) фосфорилирование ламинов. Ламины А и С при этом деполимеризуются до димеров и тетрамеров и. переходя в растворимое состояние, равномерно распределяются в цитоплазме вис связи с другими структурами. Ламин В тоже лспо-лимсри зуется до олигомеров, но остается связанным с мембранными пузырьками, возникшими из ядерной оболочки.
При сборке я черной оболочки в телофазе белки ламины иммунохимически начинают выявляться в центромерных и теломерных участках хромосом. Там же обнаруживаются первые признаки образования новой ядерной оболочки и накапливаются антитела к бе «кам порового комплекса. В бесклеточной системе ниюнлазматнчсского экстракта ооцитов было показано, что ассоциация растворимых в ми юзе ламинов А и С происходит независимо от ламина В. Оказалось, чго если систему реконструкции ядерной оболочки лишить ламина В. го гамнпы Л и С свя зываются с поверхностью хромосом, но сборки я зернои оболочки не происходит. В экстракте, лишенном ламинов А и С. замни В связывается с хромосомами, но нормальная ядерная оболочка также не формируется.
_ ЧАСТЬ ЧЕТВЕРТАЯ
ЦИТОПЛАЗМА
Цитоплазма - ло тот компонент клетки, который остается, если исключить ядро. Цитоплазма может занимать у разных типов клеток различные объемы. 1ак, у лимфоцитов ес объем примерно равен объему ядра, у гепатонига, наоборот, я тро занимает всего около 69 от общего объема клегки, у нейронов эта доля в 600 раз меньше.
Так же как и ядро. цитоплазма м hoi оком попей гна. Даже с помощью световою микроскопа в цитоплазме живой клетки можно рассмотреть какие-то вкрапления, неоднородности. частички. Особенно неодноро тост ь цитоплазмы видна при изучении ее в электронном микроскопе. Формально структуру цитоплазмы подразделяют натри части, opi ане.кты, включения и гиалоилазмэ (основная плазма, или цитозоль). Органеллы обязательные для любой клетки компоненты, без которых клетка не может иодзерживагь свое существование. Включения — необя зательиые компоненты, которые прелсгамяютсобой или отложения запасных веществ (гликоген, желточные гранулы), или скоп 1енпя пролук юв метаболизма (пигменты, кристаллы солей и дрм не в растительных клетках). И ор1анеллы и включения погружены в ।тмлопчазму жидкую фазу цитоплазмы клезки. Важно напомнить, что клетка как таковая представляет собой мембранный мешочек, заполненный во хиым раствором белка. Вот примерный химический состав клегки: вола - 85%. белок 10. ДПК 0.4. РНК - 0.7. липиды 2. неорганические соли - I и иронические соединения J9- Пример но 259 от сухой массы клеточных белков приходится па белки жидкой Фазы эукариотической клетки. г.с. «иалонлазмы В бакгериалытых клетках. бедных мембранными элементами. на .юлю оелков гиалоплазмы примни гея около половины всех белков клегки
215
Рис. 114. Преждевременная конденсация хромосом и растворение ядернои оболочки в гетерокарионе
I - митотические хромосомы донорской клетки; 2 - ядро клетки-рсниписнта
.точки во время митоза. Подробно изучена судьба ламинов. Найдено, что фиброзный слой ламинов деполимеризуется параллельно распаду ядерных мембран и конденсации хроматина. Этому предшествует обильное (в 7 раз выше, чем в Интерфакс) фосфорилирование ламинов. Ламины А и С при зтом деполимеризуются до димеров и тетрамеров и. переходя в растворимое состояние, равномерно распределяются в цитоплазме вис связи с другими структурами. Ламин В тоже лено-лимсри зуется до олигомеров, ио остается связанным с мембранными пузырьками, возникшими из ялерной оболочки.
При сборке я черной оболочки в телофазе белки ламины иммунохимически начинают выявляться в центромерных и теломерных участках хромосом. Там же обнаруживаются первые признаки образования новой ялерной оболочки и накапливаются анти зела к бе «кам порового комплекса. В бесклеточной системе ниюнлазматичсского экстракта ооцитов было показано, что ассоциация растворимых в ми юзе ламп нов А и С происходит независимо от ламина В. Оказалось, чю если си стому реконструкции ялерной оболочки ЛИН1И1Ь ламина В. го «амины А и С свя зываются с поверхностью хромосом, но сборки я горной ООО" дочки не происходи г В экстракте, лишенном ламинов А и С. замни В связывается с хромосомами, но нормальная яясрная оболочка также не формируется
ЧАСТЬ ЧЕТВЕРТАЯ
ЦИТОПЛАЗМА
Цитоплазма - ло тот компонент клетки, который остается, если исключить ядро. Цитоплазма может занимать у разных типов клеток различные ооъемы. 1ак, у лимфоцитов ес объем примерно равен объему ядра, у гепатонига, наоборот, я лро занимает всего около 6% от общего объема клегки. у нейронов эта доля в 600 раз меньше.
Так же как и ятро. цитоплазма м hoi оком иопен гна. Даже с помощью световою микроскопа в цитоплазме живой клетки можно рассмотреть какие-то вкрапления, неоднородности. частички. Особенно неоднородность цитоплазмы видна при изучении се в электронном микроскопе. Формально структуру цитоплазмы подразделяют натри части, органеллы, включения и гиалоплазма (основная плазма, или цитозоль). Органеллы обязательные для любой клетки компоненты, без которых клетка не может поддерживать свое су шествование. Включения — необя «тельные компоненты, которые прелегамяют собой или отложения запасных веществ (гликоген, желточные гранулы), или скоп гения продуктов метаболизма (пигменты, кристаллы солей и ДРМ ис в растительных клетках). И органеллы и включения погружены в ।налои.чазму жидкую фазу цитоплазмы клегкн. Важно напомнить, что клетка как таковая представляет собой мембранный мешочек, заполненный во щым раствором белка. Вот примерный химический состав клегки: вола - 85%. белок К). ДНК 0.4. РНК -0.7. лшвьты 2, неорганические соли — I и органические соединения - I гс. Примерно 25% от сухой массы клеточных белков приходится на белки жидкой Фазы >укдрио1ической клетки, т.е. iналиплазмы. В бактериальны* клетках. бедных мембранными элементами. на юлю оелков гиало-ила змы приходится около половины всех белков клегки
215
Глава 11
ГИАЛОПЛАЗМА И ОРГАНЕЛЛЫ
Термины । налоияазма (от hyaline прозрачный), основная плазма, матрикс питопдйзмы, или цитозоль, обозначают очень важную часть клетки, се истиниую внутреннюю среду Гиалоплазму достаточно просто получить в виде фракции. Для этого путем дифференциального центрифугирования осаждают из гомогенатов клеток все тяжелые компоненты вплоть до рибосом. Налосалочная жидкость в этом случае и представляет собой растворимый компонент цитоплазмы цитозоль. или ।na.ion.iaту. Цитозоль - не просто разбавленный водный раствор; его состав весьма сложен, а консистенция приближается к гелю (желе). Гели - это структурированные коллоидные системы с жидкой дисперсной средой. Частины дисперсной фазы соединены между собой в рыхлую пространственную сетку, которая содержит в своих ячейках дисперсную среду, лишая текучести систему в целом. Гель гиалоплазмы, или цитозоль, относится к так называемым тиксотропным гелям, которые под воздействием внешних условий (температура, давление) или внутренних фактором (факторов стабилизации или теполи-мернзации) могут мен ять с вое агрегат и ос состояние и переходить в менее вязкую, более жидкую фазу - в золь (раствор). Такне переходы гель- золь очень характерны для гиалоплазмы. Например, при высоких гидростатических давлениях цитоплазма нс уплотняется, а обратимо разжижается. Отдельные зоны гиалоплазмы могут менять свое агрегатное состояние в зависимости от условии или от функциональной задачи. Известно, что отдельные молеку ты белков-тубулинов могут быть диспергированы в гиалоплазме, но в определенные моменты они начинают собираться и сiроить длинные трубчатые структуры -микротрубочки. Этот процесс самосборки микротрубочек обратим: при изменении условий жизни клетки (повышение давления или изменение проницаемости мембран клетки) микротрубочки распадаются до мономерных молекул тубулинов Таким же образом в бесструк турион, па первый взгляд, тиалопчазмс мотут возникать и распалять ся различные фибрил тярные. нитчатые комп тексы белковых молекул.
Подобные гель-зочь-переходы могул определяться также другими белками, например актином, количество которого в некоторых немы шечныч к тетках может доспи ат ь |(>с<. При взаимодействии фибриллярного актина с белками типа фимбрпна происходит стабичигания течя. а при связывании с белками. активность которых зависит от кон пентрации Са* (тсльгодинт. происходят фрагментация фибрилл и переход всей системы в жи ткос состояние (зодь). Таким путем может меняться состояние питон тазмы в различных участках клетки. чтообес
216
почивает движение всей клетки или отдельных ее внутриклеточных компонентов.
Функциональное значение гиалоплазмы очень велико. В ней тока-чизоваиы ферменты, участвующие в синтезе аминокислот, нуклеотидов. жирных кислот, в метаболизме сахаров. В гиалоплатме происходят синтез и окчожсние запасного полисахарида гликогена, накопление запасных жировых капель, состоящих из трианилглииерцдов. Здесь же осуществляются процессы гликолиза и синтез части АТФ. В гиалоплазмс на рибосомах и полирибосомах, несвязанных с мембранами, синтезируются белки, необходимые клеткам для поддержания се жизнедеятельности, лля построения ес органелл. Здесь же npo.ic.xo-дят активация аминокислот с помощью специфических ферментов и связывание и.х с трансферными РНК. В иптаюле также осуществляется модификация ферментов (например, фосфорилирование). приводящая к их активации или к инактивации, происходит деградация -растепление белков, с помощью специфических протеиназ и др.
В цитозоле на распо юженных там рибосомах синтезируются белки, транспортируемые в различные участки метки, а также все белки клеточного ядра, большая часть бе тков митохондрий и илистая, основные белки пероксисом. Эти группы белков имеют свои сигнальные
аминокислотные последовательности, которые узнаются соответственно я черными порами и ти мембранами, что позволяет этим белкам транспортироваться через мембраны п попадать вну грь митохондрий.
пластид, пероксисом.
Синтез секреторных белков, белков лизосом. внеклеточного мат рикса также начинается в гиалоплазме. но после контакта с мембранами гранулярного эндои мзматичеекого ретикулума комплекс рибосома- информационная PI IК пептид оказывается связанным с мембранами, а синтезирующимся (телок котрансляиионно переносится через мембрану и оказывается в полости мембранных вакуолей.
Кроме структурных белков и ферментов н пито юле в растворенном состоянии содержится oipoMiioe количество аминокислот, нуклсоти-к>н и apyinx строительных блоков биополимеров, а также множество метаболитов промежуточных npaiyктов. возникающих при синтезе
и распаде макромолекул. . ......
Гнало,, та зма со терж.п tauoc ^ол,’ЧССТ;‘;’с*о uV При
соединении, таких как Na . К . Са . CI . * с , ' п.Л1.трт-
ном кО1|11с1,транш, л..х ионовuiporoдегер.ми....р<ж.<>ак реолирует ся мембранными компоисн.ачп ыетки.
Формалыю по морфачо. ..веским признакам ° ‘ ’ .,|11ь „;1
нен.ь, ннгонла,МЫ органе., .ы. ..-.и <>P':1''»ft*“M“X.e^"ёмы
и.е группы; ..........ЫС ""^^^"’^„^ём^ин.ые .. ...у мем
.акже представлены двумя .ыр.ь1. яр|11„, с11с,е.мы JH
бранные. К первым относятся opiaiu
217
1
Рис. 115. Модель апикального района гифа гриба {по: Girbardl, 1969)
/ - naaiMaiическая мембрана, 2 эндон коматический ретикулум; 3 мембраны аппарата Гольджи; митохондрии: 5 - вимчивання в тазмагическои мембраны. Л-апикальные вакуоли. 7- микрону зырьки; Я- слои клеточной стенки
лоплазматичсскии ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы. перокси сомы и другие специализированные вакуоли, а также плазматическая мембрана. К дву мембранным органеллам относятся митохондрии и пластиды, а также клеточное ядро. К нсмембраниым ортанет-там принадлежат рибосомы, клеточный центр животных клеток, постоянно присутствующие в клетках. Выраженность элементов клеточного скелета - цитоскелета, постоянной компоненты клетки - можс! значительно меняться в течение клеточною никла: от полною исчезновения одною компонента {например, нитон ла зм.нические микротрубочки во время ми юза) то появления новых структур {веретено митоза).
Общим свойством мембранных органе 1 т является то, что они построены из липопротеидных пленок, или перепонок. — тонких слоев, замыкающихся сами па себя так. что они образуют замкнутые полости и тем самым разделяют тшюплазму на труппу различных отсеков Внутреннее содержимое них отсеков, или вакуолей, веет да отличается от содержимою тиалонлазмы. Толщина таких пленок мембран очень мала около 7 -ID нм. их масса состаилмег около 4сс от массы клетки, но очень значительна площадь клеточных биомембрлн, Ь'к-гепаюнит, имеющий и поперечнике около 20 мкм и занимающий объем около 5000 мкм’. окружен плазматической мембраной с общей
2IX
лошадью 2200 мкм< Общая плошадьего внутриклеточных мембран в 50 раз больше и составляет НО ООО мкм’ (!). В электронном мвкрХ не цитоплазма клеток прелстамяется как бы заполненной пеной из замкнутых мембранных пузырьков, имеющих разную форму: окру" лые ‘“к)10™- плоские замкнутые мешочки, извитые трубки и та (рис. 115). В гепатоците на долю плазматической мембраны приходится примерно 2 О от всех клеточных мембран, на вакуолярнею систему -.'8. на митохондрии 40, на внутреннюю мембрану ядра - около 0.2%. Из приведенных данных видно, что мембраны клетки, или биомембраны. занимают одно из ведущих мест в структурной и функнш.нать-нон организации клетки.
Глава 12
ОБЩИЕ СВОЙСТВА БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН -ЛИПОПРОТЕИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ
Все без исключения клеточные мембраны построены по общему принципу: это тонкие липопротеидные пленки, актояшие нз гнойного слоя 7ИНИ1НЫХ молокум. в который включены молекулы белка В весовом от ношении в зависимости от типа мембран на долю липидов приходится 25-60*6. на долю белков - 40- 75*2. В состав многих мембран в.хо 1ят yi денолы. количество которых может достигать 2-10%.
Двойной слой липидов - структурная основа мембран
К липидам о гносшся большая труппа органических веществ, обладающих плохой растворимостью в воде (гидрофобность) и хорошей растворимостью в органических раствори гелях (липофильность). Состав липидов, вхотяших в мембраны клетки, очень разноооразен (рис. 116). Характерными представите тями липидов, встречающихся в К-1сточных мембранах, янляются фосфолипи ты (г.ншерофосфапиы). сфингомиелины и и 1 с герои шых липидов - холестерин.
1яипсрофосфлгиды. или r.iiniepo.'iiHiibibi. представляют сооои с южные эфиры «рехатомного спирта пншерина с двумя жирными кислотами и с фосфорной кислотой, которая в свою очередь может быть святана с различными химическими группами (холин, серин, иноип. лтаноламин и др ). Например, в егрукгхру наииолее часто нс||)сч;,ю!пс1ося в мембранах г.ншеролшшда лепнгина входю «пух жирных кис ин. глицерина. фосфорном кивоты и ханша Другая «Руппа мембранных шшыов натыкается сфинюмиелин «м .
। шнсрин замешен амшикпирюм сфингозином
219
I
I
I I
I I I I
Глицеролнпиды Сфинголипиды
Рис. 116. Структурные формулы некоторых важнейших липидов
220
Из липидов, относящихся к стероидам. в мембранах больше всего холестерина. В растительных клетках холестерин нс обнаружен, его там заменяют фитостерины. У бактерий стерины отсутству ют.
Характерной особенностью липидов мембран является разделение их молекулы на дне функционально различные части: неполярные (не несущие зарядов) хвосты, состоящие из жирных кислот. и заряженные полярные головки (рис. И 7). Полярные головки несут на себе отрицательные заряды или могут быть нейтральными (в синие, если они имеют одновременно положительные и отрицательные заряды) Наличие неполярных хвостов липидов объясняет
Глицерин
Рис. 117. Схема строения молекул фосфОЛИНИДОИ
их хорошую растворимость в жирах и органических растворителях.
Рели полярные липиды смешать с водой, то образуется эмульсия, состоящая и з мицелл. При этом незаряженные (гидрофобные) хвосты будут стремиться образовывать однородную фазу в центре мицеллы, а заряженные (гидрофильные) головки буду г торчать в водную фазу. Холестерин сам по себе мицелл не образует, но легко включается в .мицеллы полярных лини (ов, н результате чего образуются мицеллы смешанного типа. Сели к липидам добавить масло, то образуются .мицеллы. как бы вывернутые наизнанку: их гидрофобные хвосты будут обращены в масляную фазу, а заряженные (гидрофильные) головки буд\т расползаться внутри мицеллы (рис. И8).
На поверхности волы рас i воры повярных .шиитов, растекаясь. об-ра 1ую1 мономсыеку лярную плевку, в которой н волную фазу будут наврав |ены заряженные (гц грофи п>ные) гочовкн. а неполярные хвосты оудут обращены в сравнительно |идрофобнук> по мутную фазу. Смешивая с водой экстра!ированные и» мембран липиды или беря смеси равных Шни юн. можно подучить бимолекулярные сдои ити ме.мора-ны толщиной около 7.5 нм, те периферические зоны слоя, с.мотря-Шис в волную фазу. будут содержать исключительно полярные голов-Mi, а не заряженные хвосты будут пора зовывать общую i илрофобную пеанральну ю зону такой образовавшейся .мембраны (рве. 119).
Э|н способность лини iob самопроизвольно образовывать .мембранные структуры определяется свойствами самих липидов, а именно наличием в их crpyKiype полярных । о. гонок и неполярных хвостов.
221
Рис. 118. Мономолекулярный слой липидов на поверхности раздета фаз вода-масло и мицеллы липидов в масле и воле
Рис. 119. Сплошном билипндныи слои, образующимся в воде при высокой концентрации липидов
В таких искусственных снеге мах липидные мипеллы и мембраны могут взаимодействовать с белками своими полярными зонами или гидрофобными хвостами, при этом образуются искусственные липопротеидные мембраны, сходные с теми .мембранами, которые можно выделить из клеток. Они имеют го.иниих около 7,5 нм. При окраске четырехоки-
сыо осмия в электронном микроскопе видна грехс.чойная структур3 искусственных мембран: два темных периферических слоя толшиной 2.5 нм и светлый, центральный. примерно такой же толщины. Естественные клеточные мембраны имеют такое же строение
Необходимо подчеркнуть, что как искусственные так и естесжен-ные мембраны не представляют собой плоские слои они всегда замк-пугы сами на себя, образуя ,,1иыс BilKyiulIi llv,Hpl>M1 „с111к,,,ы. плоские замкнутые мешки или |рубчатые образования.
222
Представленпс о том, что п основе клеточных мембран лежит двойной липидный слои, было сформулировано еще в 1920-х годах Если .экстрагировать липиды из оболочки эритроцитов. а затем поместить липиды на поверхность водного мениска, то можно рассчитать площадь, занимаемую образовавшимся монослосм липидов. Оказалось, что эта площадь вдвое больше площади, занимаемой поверхностью эритроцитов. из которых были экстрагированы липиды, было сделано
Рис. 120. Липосома: замкнутый би-лнпндный слой в виде вакуоли
предположение, что в мембранах эритроцитов липиды располагаются в два стоя. К тому же оказалось. что поверхностное натяжение мембраны клетки {I —2 лии/см’) значительно ниже, чем поверхностное натяжение искусственного липидною слоя (7-I5 дин/cm-’). Обнаружено, что при добавлении белка к липидам поверхностное натяжение снижается ло величины, характерной для поверхностного натяжения клеток.
Образовавшиеся искусственные липидные мембраны служат непроницаемым барьером для любых заряженных .молекул, даже дтя ионов солей. Эго определяет основное функциональное свойство мембран - служить npei радой для свободной диффузии через слой лини, юп. Такое свойство может быть иснольюваио для практических цена!. Например, при смешивании липидов в водной среде образуется масса полых мембранных пузырьков липосом (рис. I20). Жидкость, попавшая внутрь этих пузырьков. \же нс может свободно обмениваться с жшиюстью. находящейся снаружи. Таким способом искусственные мембраны липосом можно •зшру'зигь'» лекарственными веществами. которые могут и нужных коппентраиияж поступать к клеткам.
Мембранные белки - обязательные компоненты биологических мембран
В среднем в 1нг1опро1с|глных ме.морзнах белки по массе составляет 50%. Но количество белков в разных мембранах может быть различным. Гак. в мембранах миюхонлрии на долю белков приходится око io 75%, а в плазматической мембране клеток миелиновой оболочки - около 25% Но так как лимитные молекулы имеют небольшой Размер (около 0,5 им) и невысокую мо юкулярн)ю массу; их число в
223
Рис. 121. Мозаичная модель («липидное озеро») клеточных мембран
50 раз выше числа белковых молекул. Полому белковые молекулы как бы вкраплены в би липидный слой мембраны. Часть из них связана с липидными головками с помощью ионных (солевых) связей и полому лег ко экстрагируется из мембран раст ворами солей. Другие образуют соленые связи с полярными участками липилон через взаимодействие с ионами Mg3* гни Са2 Данные белки экстрагируются с помощью хелатных соединений, таких как версен (ЭДТА). Эти легко экстрагируемые белки большей частью расположены на мембранах со стороны цитоплазмы и в цмтоп газматическои мембране тесно связаны с белковыми структурами цитоскелета.
Большая часть белков взаимодействует с липидами в составе мембран на основе гидрофобных связей. Оказалось. что многие мембранные белки состоят как бы из двух частей, из участков, богатых полярными (несущими заряд) аминокислотами, и участков, обогащенных неполярными аминокислотами (глицином, аланином, валином. лейцином). Эти белки в липидных слоях мембран располагаются так. что их неполярные участки как бы погружены в «жирную» часть мембраны, где находятся ги трофобные участки липидов (рис. 121). Полярная (ги грофильная) часы, таких белков взаимодействует с головками лини юв и обращена в сторону волной фазы (рис. 122), поэтому эти белки. связанные с липидами путем гидрофобных взаимодействий, практически не экстра»ирумлея в водных фазах. Их можно выделить, ппнь разрушая мембрану, экстрагируя из псе липиды или органическими растворителями, или детергентами. Поэтому эти бе гки мембран и на зывают ипгс‘гра.'11»иыми.
Размер интегральных мембранных белков в среднем равен S нм. но встречаются крупные белки - до 35 нм величиной (белок тилакоидов
224
поропластов)- Обычно это очень асимметричные по своей природе белки и соответственно асимметрично локализованы в мембране (рис. 123): их разные функциональные части локализованы по обе стороны мембраны, и все белки данного типа расположены одинаково. С цитоплазматической стороны мембраны пн-гезральные белки связаны с периферическими белками.
Эти представления, полученные при изучении химии клеточных мембран, были блестя ше подтверждены морфото-] ическими исследованиями. При использовании метола замора ж и на и и я — с к ал ы ва и и я скол через мембраны может идти через центральную, лини иную, зону. В зтом случае обнажается масса глобул белковой природы, находящихся в составе лини тою слоя. Размер таких глобул около 4—S им. Эти и другие биохимические данные пос тужили основой ДЛЯ создания модели мембраны с мозаичной укладкой: мембрана состоит из неплотно упакованных популярных белков, свободное пространство между которыми заполнено липидными молекулами (см. рис. 121). При лом часть белков может быть
Белок
Рис. 122. Взаимодействие белков с
ЛИПИ 1НЫМИ стоя.ми
Л - ионные связи: />, Я гплрофп тыю-। изрифобкыс взаимодействия белков с би.,11|||ц;1ны.м&1оем
Рис. 123. Асимметричное расположение молекул белков в мембранах, определяемое расположением С- и N-конкевых и а-спиралытык участков полипептид-ных испей
ввязана только с полярными труппами липидов и находится на поверхности билипилиою слоя; другие белки моту! частично или даже полностью натружены из-за т нлрофобпых свойств своих участков в ’инндный слой: третьи — пронизывают мембрану насквозь. Иитерес-й«. ч го большая часть липидных мотску.ч (70е/») не свя тана с белками. гак что белковые молоку,ты как бы и та на к» г в «липидном озере».
225
Латеральная подвижность липидов и белков мембран
Исследование искусственных липидных бислосв показало, что эти мембраны представляют собой двумерную жидкость, обладающую вязкостью, сравнимую с вязкостью оливкового масла. В составе таких и естественных мембран молекулы липидов постоянно движутся с огромной скоростью (коэффициент диффузии для них равен Ю-8см2 с-’). достигающей 2 мкм/с.
Липидные молекулы двигаются вдоль липидного слоя, могут вращаться вокруг своей оси. а также переходить из слоя в слой, что происходит редко и с помощью специальных переносчиков. Белки, плавающие в «липидном озере», также обладают латеральной, продольной подвижностью, носкоростьих перемещения в десятки и сот пи раз ниже. Изучать перемещение белковых молекул в составе мембран на живых клетках проще на примере плазматической мембраны. Белки плазматической мембраны - гликопротеины, часто имеют олигосаха-ридные цепочки, смотрящие на внеклеточную среду.
Для исследования свойств плазматической мембраны широко используются лектины - белки растительного происхождения, которые специфически связываются с олигосахаридами мембранных белков. Так, лектин конканавалин А (КонА), выделенный из растения канаванин мечевидной, связывается с олигосахаридами. имеющими на концах глюкозу или маннозу. Лектин из бобов сои связывается с N-aue-тнлглюкозами ном, а лектин из проростков пшеницы, кроме того, и с галактозой. На поверхности белков-лектинов имеются два или более района специфического связывания с углеводами. Если лектины добавлять к взвеси эритроцитов, то это вызывает их осаждение, сопровождающееся слипанием — агглютинацией. Поэтому лектины еше называют агглютининами.
Такая реакция агглютинации эритроцитов вызвана тем, что лектин, например КонА. взаимодействуя с концевыми сахарами углеводов гликопротеидов, как бы сшивает эритроциты друг с лруюм, чем и вызывает их осаждение. Так как полисахариды есть на поверхности плазматической мембраны любых клеток, то лектины могут связываться с ними. Места посадки лектинов можно увидеть с помощью электронного микроскопа, если связать лектины с электронно-плотным белком ферритином. Болес удобно регистрировать лектины на поверхности клеток с помощью иммунофлуорссцентного метола. Исполыова нис этого метода по званью исследовать расположение белков в птос-кости мембран. Так, оказалось, что при добавлении к клеткам, поверхность которых связана с КонА. антител против КонА, меченных фЛ}' орохромом. обнаруживается свечение по всей поверхности клеткН-Эго значит, что оелки-гликопротеиды, полисахаридные цени которых образуют слои, равномерно ртбросаны ио поверхности клеюк. Одна-
226
Рис. 124. Перемещение моль плазматической мембраны связанных ЧСКГИНОВ
а первичная посадка; б - объединение к мелкие сгустки; в - образование «колпачков*
ко через некоторое время на поверхности клетки видно не сплошное свечение. а отдельные множественные пятна или точки (их назвали «заплатками» от английского patch}. Затем эти пятна собираются в одну зону - «колпачок». Следовательно, белки, связанные с лектинами, могут быстро перемещаться в п лоскости плазматической мембраны. Интересно, что «колпачок» всегда формируется нал тем местом клетки. где находятся центриоли и аппарат Гольджи. Дальнейшая судьба этою «колпачка» может быть у разных клеток различной: у фибробластов «колпачки» могут отделяться и отрываться от тела при движении клетки, у других (лимфоциты) происходит поглощение этих участков внутрь клетки (энлопнтоз) и переваривание их там (рис. 124).
Латеральную подвижность белковых (гликопротсииных) молекул плазматической мембраны можно наблюдать при изучении клеточных гибридов, имеющих разные поверхностные антигены, которые можно пометить. В этом случае в гибридной клетке антигены поверхностей сначала были разобщены, а через некоторое время они равномерно распределились по всей поверхности гетерокариоин.
Асимметричность клеточных мембран
Состав ли пилон по обе стороны мембраны различен, чю определяет асимметричность в строении билипилного слоя. Так. с помощью химическою маркирования было найдено, что 80% сфингомиелина. 75% фосфатидил.™липа и 20% фосфатилилэншоламина локализованы на наружной поверхности плазматической мембраны, на внутренней располагается весь фосфатнаилсерии и 80% фосфатидил этанол-амина. Примерно такую же композицию имеют мембраны эндоилаз-митпческого ретикулума (для них наружной надо считать ту поверхность, которая обращена внутрь полости).
227
Особенно выражена аснмме!рия мембран в отношении интегральных белков. В составе естественных мембран белки строго ориентированы Большей частью их N-концы смотрят в полость вакуолей или в случае плазматической мембраны - во внешнюю для клетки среду. Такое полярное расположение цепи белковой молекулы в липидном бислое создастся в процессе синтеза мембранного белка на рибосоме. Полу интегральны с и нримембрапные белки также асимметрично расположены в мембранах. Так. в эндоплазматическом ретикулуме белки-ферменты. синтезирующие типплы, расположены на цитозольной стороне мембран, а ферменты, пришивающие сахара к бе псовым цепочкам (гликозидазы), локализованы на внешней стороне мембраны.
Наличие углеводного компонента характерно практически для всех мембран клегки. ио особенно для мембран вакуолярной системы и плазматической мембраны. У1леводный компонент мембран представлен главным образом гликопротеинами молекулами белков, ковалентно (в отличие от нуклеопротеидов) связанных с цепочками углеводов. Как правило, веночки углеводов расположены в наружных слоях мембран (для цитоплазматических вакуолей наружными считают слои, обращенные нс к матриксу цитоплазмы. а в полость везикул или вакуолей). Они имеют ковалентные связи с интегральными белками, образуя гликопротсилы. или с липидами (гликолипиды). У| левады мембран представляют собой короткие линейные или разветвленные цепочки. Bcociau которых входят 1алактоза. манноза, фрукюза. сахароза, N-аистилглюкогамин, N-аистилгалактозамни, пентозы (арабиноза и ксилоза), а также нейраминовая (сиаловая) кислота. Значение этого компонента очень велико для функционирования плазматической мембраны.
Различные свойства разных мембран
Несмотря на поразительную схожееи» строения различных мембран, построенных но принципу липидного бислоя с вмонтированными в Не‘ го белками, физические и химические свойства разных мембран ра*' личны. Это свя зано с тем. что в разных мембранах общий состав липидов значительно различается, что определяет особые свойства меморлн-
Разиые мембраны клегки могут отличаться дру| от ipyra по количеству липидов. Так, пча {магическая мембрана содержит Зэ -40Q-, а мем бравы миюхоилрии - 27-29% липидов. Самое высокое содержание липидов в плазматической мембране шванновских клеток. обраню' ших миелиновую оболочку нервов. - до 80%
Обнаружено, что клеточные мембраны сильно отличаются ЛРУГ от яруга по составу липидов. Гак. ила{ма|ичсскис мембраны клеток жи нотных осматы холес крином (до 30%) и в mtx мало icmiiiiiia. в то нре-
228
мя как мембраны митохондрий, наоборот, богаты фосфодипиаами и бедны ходесаерниом. Из общего количества.чинило» содержание Фог фатцлилхолина (лецитина) во фракциях эндоплазматической сети со ставляет 60-70% от всех фосфолипидов, в то время как в плазматиче скоб мембране его может быть 25-35%.
В целом для пла «магической мембраны характерно высокое содержание холестерина и сфинголипидов, а также Преобладание насыщенных и мононенасыщсиных жирных кислот в составе фосфолипидов, тогда как в митохондриях, эндоплазматической сети и во многих дру-|пх цитоплазматических мембранах содержится мало холестерина и сфинголипидов и сравнительно много поли ненасыщенных жирных кислот. Видимо, в свя зи с этим мембраны цитоплазмы менее жесткие, чем плазматическая мембрана, они более «легкоплавки».
Особенно отличаются мембраны по составу белков, которые главным образом определяют функциональные свойства мембран.
По GhojOi ической роли мембранные белки можно разделить на три i руппы: ферменты, рецепторные белки и структурные белки. Набор ферментов в составе мембран может быть очень нелик и разнообразен (например, в плазматической мембране клеток печени обнаружено не менее 24 различных ферментов). В разных .мембранах существует характерный набор ферментов. Например, в плазматической мембране, как и но многих друз их. локал п зуетея (К'/На+)-занисимая АТФаза. участвующая в транспорте ионов. В митохондриях специфическими являются набор белков-переносчиков электронов и фермент АТФ-синтетаза, обеспечивающие окислительное фосфорилирование и синтез АТФ.
Рецепторные белки специфически связываются с теми или иными веществами и как бы их узнают. Эго белки-репепторы для гормонов, для у знавания поверхности соседних клеток, вирусов, фаюв у бактерии и т.д, К этой группе относятся фоторецепторные белки. Вообще же рецепторные белки ихо.тят в состав любых' мембран. Гак. на внешней мембране митохондрий расположены рецепторы, участвующие в У жавапии и транспорте митохондриальных белков, переносимых из нитозочя в митохондрии. На мембранах эндоплазматического ретикулума нахатягся рецепторы. > знающие и связывающие ршюсомы. на я lepHOii оболочке рецензоры кариофильных белков и т.д. На плазматической мембране расположены как рецепторы, узнающие сосед нис клетки или лаже отдельные ионы со ie(t (переносчики), гак и оел кн. у знающие белки нитоске. ic-та в цитоплазме.
Связь мембран с цитоплазматическими белками
Со с троны питон ызмы мс
- - - .смбр.1111.1 сыпаны через нримембрапные
сойегвенно мемГ.рниныс интецм u-иые белки е
змы К ним относятся и Первую O4L
белковыми С1 рук] у рами ШПОН Kt.
229
Рис. 125. Примсмбранные белки эритроцитов
/ - спектрин; 2 актин; 3- аккирин; 4- белок III полосы: 5- платмалемма
рель компоненты цитоскелета. Это позволяет не только сделать мем бравы более жесткими, по и обеспечивает подвижность мембран, создавая возможности для их транспортных функций. Например, жесткость плазматической мембраны безъядерных эритроцитов создается за счет связывания сети цитоплазматических белков с интегральными белками плазмалеммы. В ее состав входит белок (так называемый «белок полосы И1>). который обеспечивает транспорт ионов через би-слой, но одновременно через ряд белков связывается с сетью белков-спектринов, которые создают жесткую подмембранную сеть (рис. 125). Во многих эпителиальных клетках специальные белки плазматической мембраны связываются с элементами цитоскелета и участвуют в образовании истого ряда межклеточных соединений (десмосомы. адгезивный контакт и др.). С элементами цитоскелета связаны также оболочки клеточного ядра: внешняя ядерная мембрана тесно ассоциирована с промежуточными филаментами, которые фиксируют ядро в объеме цитоплазмы. Внутриклеточные вакуоли могут перемешаться в клетке только при взаимодействии с фибриллярными компонентами. такими как микротрубочки и микрофиламенты. Митохондрии перемешаются в клетке также га счет ассоциации с элементами цитоскелета.
Рост многих мембран за счет встраивания вакуолей
После деления клеток происходит увеличение обьсмов растущих дочерних клеток и тем самым рост клеточкой поверхности, увеличение плошали плазматической мембраны. Но это нс единственный пример быстрого роста объема и поверхности. Поверхносгь быстро растущих клеток в тычиночных нитях злаков может за I ч увеличиться в 65 раз. т.с. каждую минуту нлазмалемма нарастает на ее первоначальную веян-чину* Такую большую скорость роста плазматической мембраны можно объяснить только тем. что происходит быстрое встраивание (интеркаляция) пузырьков в растушую плазматическую мембрану. Здесь внузР11-клеточные мембранные пузырьки подходят к внутренней стороне плз*'
230
Рис. 126. Слияние клеточных мембран с мембранными вакуолями магической мембраны (возможно, их подгоняют к себе микрофиламенты кортикал иного слоя), происходитслияние мембран н тем самым увеличение поверхности плазматической мембраны (рис. 126).
Откуда же берутся эти ютовые блоки, .мембранные пузырьки? Удаюсь проследить, что первичный генезис мембран происходит в гранулярном эндоплазматическом ретикулуме, который является источником всех клеточных мембран, кроме мембран митохондрий и пластид. От мембран гранулярного ЭПР отшеп тяготея мелкие вакуоли, которые сливаются с мембранами аппарата Го.тыгжи, от которого в свою очередь отщепляются мелкие мембранные вакуоли, сливающиеся или с лизосомами. и ли с пла т.матической мембраной, пли с секреторными вакуолями.
Таким образом, наблюдается последовательный каскал переходов одних мембран в другие. Первичные же мембранные вакуоли строя гея за счет синтеза белка и липидов на мембранах гранулярного ЭПР.
Рост мембран митохондрий и пластид иного характера. Увеличение площади мембран .митохондрий происходит за счет синтеза основной массы белков и шппдов в i иалоплазме клетки, вслед за чем эгм митохондриальные белки и липиды транспортируются через мембранную оболочку митохондрии и встраиваются в их компоненты.
Глава 13
ПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА
П.газмагическая мембрана, и ш n.iawa.ieMMri. средн раиичиых клеточных мембран иннмает осоСюе место. Эю поверхностная периферическая сгруюура, or раннчниакнная клетку снаружи. чтосоуелогиги-наетее непоерслег венную свяи.с внеклеточной средой, а следовательно, со всеми веществами и стимулами, вомснствуioiUiimii на клетку.
231
Поэтому плазматическая мембрана играет роль барьера, преграды между сложно организованным внутри клеточным содержимым и ннеш-Heii средой. В этом случае плазмалемма выполняет не только роль механического барьера, но, главное. ограничивает свободный поток низко- и высокомолекулярных веществ в обе стороны чере з мембрану. Более того. плазмалемма выступает как структура, «узнающая», рсцепти-рмошая, различные химические вещества и регулирующая избира-тстыю транспорт этих веществ в клетку и из нее. Другими словами, плазматическая мембрана осуществляет функции, связанные с регулируемым избирательным трансмембранным транспортом веществ, и исполняет роль первичного клеточного анализатора В этом отношении плазмалемму можно считать клеточным органоидом. входящим r вакуолярную систему клетки. Как и другие мембраны этой системы (мембраны лизосом, эндосом, аппарата Гольджи и др.), она возникает и обновляется за счет синтетической активности эндоплазматического ретикулума и имеет сходную композицию. Как ни странно, но плазматическую мембрану можно уподобить мембране внутриклеточной вакуоли, ио вывернутой наизнанку: она нс окружена гиалоплазмой.а окружает ее.
Барьерно-транспортная роль плазмалеммы
Окружая клетку со всех сторон, плазматическая мембрана выполняет роль механическою барьера. Для того чтобы проколоть ее с помощью микроигл или мм кропи исток, требуется довольно большое усилие. При давлении на нес микроиглы она сначала сильно прогибается, а лишь затем прорывается. Искусственные липидные мембраны менее устойчивы. Эта механическая устойчивость плазматической мембраны может определяться дополнительными компонентами, такими как гликокаликс и кортикальный слой нитонщзмы (рис. 127).
1.1нкокалике представляет собой внешний по отношению к липопротеидной мембране слой, содержащий полисахаридные пеночки мембранных интегральных белков — гликопротеинов. Эти цепочки содержат такие углеводы, как манноза, глюкоза, Гч’-ацетилглкжозамнн. сиаловая кислота и др. Такие углеводные гстсроиолимсры образуют ветвящиеся цепочки, между которыми могут располагаться выделенные из клетки гликолипиды и протеогликаны. Слон г ли кокал икса сильно обводнен, имеет желе подобную консистенцию, чю значительно снижает в этой зоне скорость диффузии различных веществ. Здесь же могуч «застревать» выделенные клеткой гидро ниические ферменты. участвующие во внеклеточном расщеплении полимеров (внеклеточное пищеварение) до мономерных молекул, которые гатсм транспорт ируимся в цитоплазму через плазматическую мембрану.
232
Рис. 127. СХсма строении плазматической мембраны
Часть белков (гликопрогенлы) i/j и липидов (ыиколипкан) (Л связана п<>.1иса\ари ими i ?). обргиуя слой гтнкокаликса
Рис. 128. Стой пгикокачикса (ГК) на поиермюеш плзшатической мембраны (ИМ) микровореинчк щеточной каемки
энтср(>Ш1та
Как пока.нет электронно-микроскопические иссцелования. особенно с применением специальных методов контрастирован ня полисахаридов. I л и кокал и кс имеет вид рыхлого волокнистого слоя толщиной 3 4 нм. покрывающего всю поверхность клетки. Особенно хорошо гли кокал икс выражен в щеточной каемке клеток всасывающего эпителия кишечника (энгеропиты). однако он обнаружен практически у всех животных клеток. но степень ею выраженности разнила (рис. 128).
Мс хан 1t ч сская усто й ч и вость пла зматическои мембраны, кроме тою. обеспечивается структурой примыкающею к ней со стороны цитоплазмы кортикальною слоя и внутриклеточных фибриллярных структур.
Кор шкальный (от слова cortex — кора, Кожина) слои нию-платмы, тесно контактирующий с чипопрогеи «ной наружной мембраной, имеет ря i особенностей. Злее». в толщине 0.1 0.5 мкм отсутствуют рибо
233
Рис. 129. Кортикальный слой (пеликула) парамеции
/ - плазматическая мембрана; 2 ресничка; 3 альвеолы; 4 внутренняя мембрана альвеолы; 5 - внешняя мембрана альвеолы
сомы и мембранные пузырьки, но в большом количестве встречаются фибриллярные элементы цитоплазмы - микрофнламеиты и часто микротрубочки. Основным фибриллярным компонентом кортикального стоя является сеть актиновых микрофибрилл. Здесь же располагается ряд вспомогательных белков, необходимых для движения участков цитоплазмы (подробнее о скелстно двигательной системе клеток см. далее). Роль этих связанных с актином белков очень важна, так как она объясняет их участие в связи, в «заякоривании» интегральных белков плазматической мембраны.
У многих простейших, особенно у инфузорий, плазматическая мембрана принимает участие в образовании пелликулы жесткого слоя, часто определяющего форму клетки. К плазматической мембране здесь изнутри могут примыкать мембранные мешочки; в этом со час у поверхности клеток имеются три мембранных слоя: собственно плазматическая мембрана и две мембраны пелликулярных альвеол. V инфузории туфельки пел .тику ла образует утолщения, располагающиеся в виде шестиугольников, в центре которых находятся реснички (рис. 129). Жесткость пелликулярных образований может быть связана также с элементами цитоплазмы, подстилающими плазматическую мембрану, с кортикальным слоем. Так, в гребнях пелликулы жглены вблизи мембраны обнаруживаются кроме мембранных вакуолей Ий-
234
раллсльные пучки микротрубочек и микрофиламснтов. Такая фибриллярная периферическая арматура вместе со складчатой многослойной мембранной периферией создает жесткую структуру пелликулы.
Барьерная роль плазмалем-мы заключается также в ограничении свободной диффузии веществ. Модельные опыты на искусственных липидных мембранах показали, что они проницаемы для воды, газов, малых неполярных молекул жирорастворимых веществ, но совершенно не проницаемы для заряженных молекул (ионы) и для крупных незаряженных (сахара) (рис. 130).
Естественные мембраны также ограничивают скорость проникновения низкомолекулярных соединений в клетку.
Рис. 130, Проницаемое н> искусе гневного билипмдного слоя для различных молекул
Трансмембранный перенос ионов и низкомолекулярных соединений
Плазматическая мембрана, так же как и ipyrne лнполрогеилные мембраны клетки, является полупроницаемой. Эго значит, что через нес с различной скоростью проходят разные молекулы и чем больше размер молекул, тем меньше скорость прохождения их через мембрану )то свойство определяет плазматическую мембрану как осмот ический барьер. Максимальном проникающей способностью обладают вода и растворенные в ней газы, значительно медленнее проникают сквозь мембрану ионы (примерно в И)4 раз медленнее). Полому если клетку, например зршроцит. поместить вереду, где концентрация со-лей будет ниже, чем в клетке (гипотония), то вода снаружи устреми гея внутрь КЛС1КИ. что приведет к увеличению объема клетки л к разрыву плазматической мембраны («гипотонический iiiok”). Наоборот, при помещении зритронига в растворы солей более высокой копией гра-иип. чем в клегке, произойдет выход воды и< метки во внешнюю сре-ту. Клетка при пом сморщи гея, уменьши гея в объеме.
235
Таком пассивным транспорт волы и з клетки и в клетку нее же идет с низком скоростью. Скорость Проникновения воды через мембрану составляет около 10 4 см/с, что в 100 ООО раз меньше скорости диффузии молекул воды через водный слой толщиной 7,5 нм. В связи с этим было сделано заключение, что в клеточной мембране, в ее липопротеидном слое существуют специальные «поры» для проникновения воды и ионов. Число их не так велико: суммарная площадь при величине отдельной «поры» около 0,3-0,8 нм должна составлять лишь 0,06^ всей клеточной поверхности.
В отличие от искусственных бислойных липидных мембран естественные мембраны, в первую очередь плазматическая мембрана, способны транспортировать ионы н многие мономеры, такие как сахара, аминокислоты и др. Проницаемость для ионов .мала, причем скорость прохождения разных ионов неодинакова. Более высокая скорость прохождения для катионов (К+, Na^) и значительно ниже для анионов
Транспорт ионов через плазмалемму осуществляется за счет участия в этом процессе мембранных транспортных белков - пермеаз. Эти белки могут проводить в одном направлении одно вещество (уни-порт) или несколько веществ одновременно (симпорт), или же вместе с импортом одного вещества выводить из клетки другое (аитиггорг). Так, глюкоза может входить в клетки симпортно вместе с ионом Na*.
Транспорт ионов может происходить по градиенту копией гранив, пассивно, без дополнительной затраты энерг ии. Так. в клетку проникает ион Na* из внешней среды, где его конпен гравия выше, чем в цитоплазме. В случае пассивного транспорта некоторые мембранные транспортные белки образуют молекулярные комплексы — каналы, через которые растворенные молекулы проходят через мембрану за счет простой диффузии по градиенту копнен границ. Часть этих каналов открыта постоянно, а другая часть может закрываться или огкрывать-ся в ответ либо на свя зы ванне с сигнальными молекулами, либо на изменение внутри клеточной концентрации ионов. Вдруг их сл\чаях специальные мембранные белки-переносчики избирательно связываются с тем или иным ионом и переносят его через мембрану (облегченная диффузия) (рис 131).
Наличие таких целковых транспортных каналов и переносчиков, казалось бы, должно приводить к уравновешиванию концентраций ионов и низкомолекулярных веществ по обе стороны мембраны. На самом же деле эго не так: конпенiрання ионон в цитоплазме клеток резко отличается не только от тиковой во внешней среде, но даже от плазмы крови, омывающей клетки в организме жи венных (табл. 14 )
Как вп шо в лом случае, суммарная кон пент рация одновалентных катионов как внутри клегок, так и снаружи практически одинакова
236
Рис. 131. Схема переноса ионоп и молекул через плазматическую мембрану
/ - простая диффузия: 2 - облаченная шффузия; J канл1Ообрачуюи1ий белок; 4- белок-переносчик
(150 мМ), т.е. изоюпична. Но оказывается в цитоплазме концентрация К почти в 50 раз выше, a Na’ ниже, чем в плазме крови. При чем это различие поддерживается только в живой клетке: если клетку хбшь или по launib в ней .метаболические процессы, го через некоторое время ионные различия по обе стороны плазма!ической мембраны исчезнут Можно просто охладить клетки до +2 С. и через некоторое время концентрация К и Na+ но обе стороны от мембраны стану г одинаковыми. При нагревании клеток зго разд и мне восстанавливается. Данное явление связано с тем, чю в клетках существуют мембранные белковые переносчики, которые работаю! против iрад цента концентрации, затрачивая при этом шертю за счет г и (роли за АТФ. Такой тип работы носит название активного ipaiicnopia. и он осуществляется с помощью белковых ионных насосов. В плазма in чес коп мембране находится двухехбъединичпая молекула (K‘/Na )-пасоса. которая одновременно является и АТФа-зой. Этот насос при работе ткачи каст за отин цикл три иона Na и закачивает в клетку два иона К‘ против гралиета концентрации. При лом затрачивается одна молекула А ГФ. идущая на фосфори-трование АТФазы. в результате чего Na' переносится через мембрану из клетки. а К получает возможность связаться с белковой молекулой и затем переносится в клетку (рис. 132). В результате ак-
Таб.шца 14
концентрация ионов ши ip>i клеток и в п.шзме крови
Bm-K.ii- точная 1 lull Bin фиклеточная Впекло очная
кпнпип рання, м\1 киннсн t рання. ч.М конисигр-щия. мМ м.М
\д* К‘ 5-15 (40 145 5 С.12* CI 1-2 4 2.5-5 11U
Mg’- 30 1-2
«жжичи-яСУ ..................... «мр..ог.,
ичмк к легок cocia«.iMci 10 XI. а снаружи - Ю J М-
237
3Na
2К
Рис. 132. (K*/Na*)-Hacoc
/ участок связывания Na*;
2 — участок связывания К*; 3 — мембрана
тивного транспорта с помощью мембранных насосов происходит также регуляция в клетке концентрации и двухвалентных катионов Mg2* и Са2+, также с затратой АТФ.
Такая постоянная работа пермеаз и насосов создаст в клетке постоянную концентрацию ионов и низкомолекулярных веществ, т.е. создает так называемы!'! гомеостаз — постоянство концентраций осмотически активных веществ. Надо отметить, что примерно 80% всей АТФ клетки тратится на поддержание гомеостаза.
В сочетании с активным транспортом ионов через плазматическую мембрану происходит транспорт различных сахаров, нуклеотидов и аминокислот. Та к, активный транспорт глюкозы, которая симпортно (одновременно) проникает в клеткх вместе с потоком пассивно транспортируемого иона Na+, будет зависеть от активности (K+/Na*)-nacoca. Если этот насос заблокировать, то скоро разность концентрации Na+ по обе стороны мембраны исчезнет, сократится при этом диффузия Na+ внут рь клетки и одновременно прекратится поступление глюкозы в клетку. Как только восстановится работа (K'/Na! )-АТФазы и возникнет разность концентрации ионов, то сразу возрастут диффузный поток Na4- и одновременно транспорт глюкозы. Подобно этому осуществляется через мембрану и поток аминокислот, которые переносятся специальными белками-переносчиками, работающими как системы симпорта. перенося одновременно ионы.
Активный транспорт сахаров и аминокислот в бактериальных клетках обусловлен градиентом ионов водорода.
Само по себе участие специальных мембранных белков в пассивном или активном транспорте низкомолекулярных соединении ука зывает на высокую специфичность этого процесса. Даже в случае пассивного ионною транс пор га белки «узнают» данный ион. ими молсиствуют с ним, связываются специфически, меняют при свою конформацию и функционируют. Следовательно. уже на нри“ мере транспорта простых веществ мембраны выступают как знали заторы, как рецепторы. Особенно такая рецепторная роль проявив ется при поглощении клеткой биополимеров.
238
Везикулярный перенос: зндоцитоз и экзоцитоз
Макромолекулы, такие как белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, липопротеидные комплексы и другие, сквозь клеточные мембраны не проходят, и противовес тому, как транспортируются ионы и мономеры. Транспорт микромолекул, их комплексов, частиц внутрь клетки и из нее осуществляется совершенно иным путем - посредством везикулярного переноса. Этот термин означает, что различные макромолекулы, биополимеры или их комплексы не могут попадать в клетку сквозь плазматическую мембрану. И не только сквозь нее: любые клеточные мембраны не способны к трансмембранному переносу биополимеров, за исключением мембран, имеющих особые белковые комплексные переносчики — порины (мембраны митохондрий, пластид, пероксисом). В клетку же или из очного мембранного комнарт-мента в другой макромолекулы попадают заключенными внутри вакуолей или везикул. Такой везикулярный перенос можно разделить на два вида: экзопптоз вынос из клетки макромолекулярных продуктов, и эи допито* поглощение клеткой макромолекул (рис. 133).
При эндоцитозе определенный участок плазмалеммы захватывает, как бы обволакивает внеклеточный материал, заключает его в мем-
бранную вакуоль, возникшую за счет впячивания плазматической мембраны. В такую первичную вакуоль, или эндосому, могут попадать любые биополимеры, макромолекулярные комплексы, части клеток или лаже целые клетки, где затем и рас л адаются, де пат и мери зу ют-ся до мономеров, которые путем трансмембранного переноса попадают в гид'юплатму. Основное биологическое значение эндошпоза - это получение строительных блоков за счет вну трик. «сточного переваривания. которое осуществляется на втором лапе игаошггоза. после слияния первичной эндосомы с лиюеомон вакуо-п.ю. содержащей набор гидролитических ферментов.
°!
nnilUj^
।
пшлттж giWOl
I 41
Iе
т
О®
WitS-1' кегддпшяиншишлжюг
Рис. 133. Сравнение зн допито за (д) и экмшмтим (Ф
239
Рис. 134. Схема фагоцитоза (а) и линонитоза (6)
Эидоиитоз формально разделяют на иииоиитоз и фаюингоз (рис. I34). Фагоцитоз захват и поглощение клеткой крупных частиц (иногда даже клеток и ш их частей) был впервые описан И.И. Мечниковым. Фагоцитоз встречается как у одноклеточных (например. у амебы, некоторых хищных инфузорий), так и у многоклеточных животных. В последнем случае он осуществляется с помощью специализированных клеток. Такие клетки фаюниты, характерны как для беспозвоночных (амебоиигы крови пли полостной жидкости), так и для позвоночных животных (нсГырофилы и макрофаги). Пиионитоз вначале определялся как поглощение клеткой возы или водных растворов разных веществ. Сейчас и звссгно, что как фагоцитоз, так и пи-hoi штоз протекают очень сходно, и поэтому употребление этих терминов может от ража и, лишь различия в объемах и массе поглощенных веществ. Общее для этих процессом то. что hoi лощенные всшссгва на поверхности плазматической мембраны окружаются мембраной в виде вакуоли — эндосомы, которая перемешается внутрь клетки.
Эидоиитоз, включая пиионитоз и фаз опиток может быть нсспеии-фичсским. или конститутивным. постоянным и специфическим, оно средуемым рецепторами (pencilторным). Нсспсцифичсский миопию» (иинонитоз и фаюииюз) так называется потому, что он протекает как бы автоматически и часто может приводить к захвату и поглошениь’ совершенно чуждых или безразличных для клетки веществ, напрвмер частичек сажи или красителей
Нсспсцифичсский лщокитоз часто сопровождается первоначальной сорбцией захваiы на юте го материала ыикокаликсом плазмалсм мы. Li и кокал икс и з-за кислых ipyini своих полисахаридов имееготри
24(1
цате >ы>ы.> заряд и хорошо снизывается с различными положите-,ь„0 ЭИРЯЖСН...... гРУ,,памп белков. При гаком адсорбционном неспсш
фнчсском энлоцитозе пог.-юшаются макромовекулы и мелкие частицы (кислые белки, ферритин, антигена, вирионы, коллоидные части ,,ы) Жидкофазный пииоиитоз приводит к поглощению вместе с жидкой средой растворимых молекул, которые не связываются с плазмалсм-мой.
На следующем этапе происходит изменение морфологии клеточной поверхности: или возникают небольшие нпячивания плазматической мембраны, т.е. инвагинации, или же па поверхности клетки появляются выросты в виде складок, или « оборок» (от английского ruffle которые как бы захлестываются. складываются. отделяя небольшие объемы жи 1кой среды (рис. (35 и 136). Первый тип возникновения пиноцитозпого пузырька пиносомы. характерен для клеток кишечного эпителия, эндотелия, для амеб: второй — для фагоцитов и фибробластов. Эти процессы швисят от поступления энергии: ингибиторы дыхания блокируют эти процессы.
Вс 1ел за такой перестройкой поверхности следует процесс слипания и слияния контактирующих мембран, который приводит к образованию пиноцитозпого пузырька (пиносома). отрывающегося от клеточной поверхности и уходящего в глубь цитоплазмы. Как песне-нифический. так и рецепторный эн тони тот, приводящий к отщеплению мембранных пузырьков, происходит в специализированных участках плазматической мембраны. Это так называемые окаймленные ямки. Они называются так потому, что со стороны цитоплазмы плазматическая мембрана покрыта (одета) гонким (около 20 нм) волокнистым слоем, который на улыратопкпх срезах как бы окаймляет, покрывает небольшие виячивания - ямки (рис. 137). Эти ямки естыюч ти у всех клеток животных. они занимают около 2% клеточной поверхности. Окайм тякиний слой состоит в основном из белка к сирина. ассоциированного с ря -том дополни тельных белков. Гри молекулы к.1ат-рина вместе с тремя молекулами цизкомолскудярнотобелка образуют структуру трискслиона, напоминающею грехлучевую свастику (рис. 138). Кла триповые трискелпоны на внутренней поверхности ямок плазматической мембраны образуют рыхлую сеть, состоящую из пяти и шестиугольников, и целом напоминающую корзинку, ытри новый с юн отекает весь периметр отделяющихся первичных энлоип-тозиых вакуолей окаймленных пузырьков.
К и грин относится к одному из видон так называемых слева о и белков (СОР coaled proteins) Зги бе «II связываю гея с инте1раи.ны-мп GciK.iTOtpellelilopaMil со стороны питопяизмы и о >раоюг о unit слои по nepusreipy потакающей пиносомы. «рви II > сотою,» и, царька. ..с, «жаймкчшо.о» нЛыры». В отдален п>.пер-,<114,10,, ниюсомы участвуют также белки динамины. когорьк Поли-
241
Рис. 135. Эндонитоз (фото С.М. Коломиной)
а - пиной» юзиая ямка и вакуоли; б - пи иоин тоз на поверхносш мдкрофа’«»- вил»’1 WJ' росли шиоилалмы. обраоюншс складки Ьрафды*). I нинонмкнная ямки; 2 - ни»’0' ншшные вакуоли, 3- эндосоми; 4- идро; 5 лппарл Io.ii.jlau
242
Рис. 136. Последовательные стадии пиноцитоза
мери лютея вокруг шейки отделяющегося пузырька {рис. 139).
После того как окаймленный пузырек отделится оз пчазмалеммы и
начнет переноситься в глубь цитоплазмы. клатриновый слой распадается, диссоциирует, мембрана эндосом (липосом) приобретает обычный вид. После потери клатриново-го слоя эндосомы начинают слипаться друг с другом.
Мембраны окаймленных ямок содержат сравнительно мачо холестерина. что может определять снижение жесткости мембран и способствовать образованию пузырьков. Ьиоло! ический смысл появления клатриновой < шубы» по периферии пузырьков, возможно, заключается в том. что он обеспечивает сцепление окаймленных пузырьков с элементами цитоскелета и последующий и.х транспорт в клетке, а также
Рис. 137. Окаймленные ямки и вакуоли
Tine ic’ioiiarc 1Ы1ЫС cijuih связывания iiiiJiiaoB и образование bjkwjch: / п 1.нма1ическ.1я мембрана, ?- мэзри-новыисюй (.кайма*), » сорбнрошн-нис лиганды
препятствует их слиянию друг с другом.
Ин1енсивность жидкофазного песне пифического пинопитоза может быть очень высокой. Так. клетка эпителия тонкого кишечника оо-разуегдо 100(1 пинасом к секунду, а макрофаги - около — пиносом в минуту. Размер пинском невелик, их нижний предел составляет 60- 130 нм, но обилие их приводит к тому, что при эндошпозс плазма
243
Рис. 138. Окаймленные пузырьки
° - ПИ' со стороны иитозоля; б - трискслеоны .м поиерхиости ирнрька
I 2
Рис. 139. Пос.чсдонате'ьные стадии об-раювания и отщепления окаймленного пузырька
- плазматическая мембрана; 2 — ин ппрлзьиыс бе jkh; ?- ктиирчкнцкс бе гкопые •истины, 4 кл.ирии; 5 - лннамнн
244
лемма быстро замешается, как бы «тратится» на образование множест ва мелких вакуолей. Например, у макрофагов вся плазматическая мембрана заменяется за 30 мин, у фибробластов - за 2 ч
Дальнейшая судьба эндосом может быть различной. часть из них может возвращаться к поверхности клетки и сливаться с ней, но большая часть вступает в процесс внутриклеточного пищеварения. Первичные эндосомы содержат в основном захваченные в жидкой среде чужеродные молекулы и не содержат гидролитических ферментов. Эндосомы могут сливаться друг с другом, при этом увеличиваясь в размере. Они затем сливаются с первичными лизосомами, которые вводят в полость эндосом ферменты, гитролиз^юпше различные биополимеры. Действие этих лизосомных impetus и вызывает внутриклеточное пищеварение распад полимеров до мономеров.
Как уже указывалось. в хоте фагоцитоза и пиноиитоза клетки зеря ют большую площадь плазмалеммы (см. макрофаги), которая, однако, довольно быстро восстанавливается при рспиклизаиип мембран, за счет возвращения вакуолей и их встраивания в плазмалемму. Это происходит вследствие того, что от эндосом или вакуолей, гак же как и от ли зосом. мотут-отделяться небольшие пузырьки, которые вновь сливаются с плазм алеммой. При такой ре циклизации происходит как бы «челночный» перенос мембран; шивмалемма-пиносома-ваку-оль плазма.земма. Это ведет к восстановлен ию исходной плошали
плазматической мембраны. При таком возврате - рецикяизаиии мем браи. в оставшейся эндосоме удерживается весь поглощенный материал.
Специфический, и ли опосредуемый рецепторами, энлоиигоз имеет ряд отличий от неспецифического Главное в том. что поглощаются молекулы, для которых на плазматической мембране есть специфические рецепторы, ассоциирующиеся только с данным типом молекул. Часто такие молекулы, связывающиеся с без кам и-рецепторам и на поверхности клеток, называют лига»» ими.
Впервые опосрелусмый рецепторами энлоиигоз был описан при накоплении бе (кон и оонитах mini, бе ikii желточных гранул - вителлогенины, ешнезир)югся в раишчных тканях, по затем с током кропи иоиалают в яичники, те свяшваюгся со специальными меморанны ми рецепторами ooiihtob и затем с помощью энлопитои иоплыю внхпрь метки. । ie и iiponexo шт отложение желточных iporiyn.
Дрхчоп пример избирательного ишешитоза представляет соош транспорт в клетку холестерина. Эгот линии синтезируется в печен и в комп ICKCC с :ipyi ими <|>оефо.чи|11Ыамп и белковом молекул < •
ег так нашвасмыи iniionpoieiia низкой плотности (. . '
Секретирхегся метками печени и с кровью разносится п с. . ".
(рис. 140). Специальные рецепторы ила «магической м ) • '
фу то расположенные на поверхинсш различных клеток, узнаютосл-
24S
Рис. 140. Поступление в клетку Л НП с помощью опосредуемого рецепторами эндоиитоза
I - зпазиалеммэ; 2 частинаЛНП; 3 окаймленная ямка; 4 окиими’нный пузыре*. 5 - репетир ЛИП; б лиюсома; 7 - первичная лизосома; 8 — вторичная лизосома:
9 рсиик-тнзаиия рецепторов ТИП
ковый компонент ЛИП и образуют специфический комплекс рсисп-тор-лиганд Вслед и этим такой комплекс перемешается в 30|<> окаймленных ямок и инзернали чуется — окружается мембраной и ио гружается в глубь цитоплазмы. Покачано, что мутантные ренешоры могут связывать ЛИП, но не аккумулируются в зоне окайм |еиных ямок. Кроме рецепторов к Л1111 обнаружено более двух десятков других. участвующих в рецепторном лиюциточе различных веществ. Все они используки один и IO1 же нуль интернализации через окаймленные ямки. Вероятно, их роль заключается в накапливании рецепторов: одна и та же окайм ленная ямка может собрать около 1000 рсне1поров разного класса. Однако у фибробластов кластеры рецензоров ЛИП расположены в зоне окаймленных ямок лаже в отсутствие .ннанл» в среде.
Дальнейшая судьба поглощенной частицы ЛИП заключается в том. что она подвергается распаду в составе вторичной лизосомы. После по 246
гружения » цитоплазму окаймленного пу.ырька, нагруженного ЛИП происходит быстрая потеря кдатри,юного слоя, мембранные пузырь кн начинают слипаться друге другом, образуя эндосому - вакушь со’ держащую поглощенные ЛНП-частицы, связанные еше с рецептом ми па поверхности мембраны. Затем происходит тиссоциацня комплекса лиганд рецептор; от эндосомы отщепляются мелкие вакуоли мембраны которых содержат свободные рецепторы. Эти пузырьки ре' циклируются, включаются в плазматическую мембрану, и тем самым рецепторы возвращаются на поверхность клетки. Судьба же ЛИП состоит в том. что после слияния с лизосомами они пиролизуются до свободного холестерина, который может включаться в клеточные мембраны.
Эндосомы характеризуются более низким значением pH (4 5), бо-лес кислой средой, чем другие клеточные вакуоли. Эго связано с наличием в их мембранах белков протонного насоса, закачивающих ионы водорода с одновременной затратой АТФ (Н+-зависимая АТФаза). Кислая среда внутри эндосом играет решающую роль в диссоциации рецепторов и лшандов. Кроме того, кислая среда является оптимальной для активации гидролитических ферментов в составе лизосом. которые активируются при слиянии лизосом с эндосомами, что припо-ЯИТ к образованию эцдолиюсомы, где и происходит расщепление поглощенных биополимерв.
В некоторых случаях судьба шссопппрованны.ч лигандов нс связана с лизосомным гидролизом. Гак. в некоторых клетках после связывания рецепторов плазмалеммы с определенными белками покрытые клатрином вакуоли погружаются в цитоплазму п переносятся к другой области клетки, где сливаются снова с плазматической мембраной, а связанные белки тиссоцнируют от рецепторов. Лак осушсетвяясгся перенос цынснитозис, некоторых белков через стенку эндотелиальной клетки из плазмы крови в межклеточную среду (рис. 141). Другой пример транепмтоза перенос антитеч. Лак. у млекопитающих антитела матери могут переданаj ься детенышу через молоко. В .пом случае комн |скс рецептор- антитело остаемся в вндосомебет изменении.
Как уже говорилось, фагоцитоз является вариантом лпошпоза и связан с помещением меткой крупных трешов макромолекул, вплоть до живых или мерных клеток. Тик же как И шиюшпоз фшо-Нито, может быть неспецифическим (например. ноглошение фиоро-бласгами ii.ui макрофагами частичек коллоидного золота и ш '|“1И' ра декстрана) и специфическим, опоерсчуемым рептшорам, ). верхние? и плазматической мембраны ф;пош1тнр\юши\ клс' • ‘
1оци!озе ироисхолигобразованисбольших лыопигозных в.
гоеттм. которые «нем. сливаясь с .п.зосомаш.. ооразую. фиш, вхомы.
Па поверхности к ,егок. способных к фатошпоту (у микошпаю-3,0 "Хюфиль. „ макрофаг,,), сущее,,,уе. набор рецепторов.
247
Рис. 141. Трансшггоз - перенос (/) веществ мембранными вакуолями сквозь стенку эндотелиальной клетки
2 - пиношпозные вакуоли; 3 - просвет капилляра; 4 - нитон |азмл; 5 ядро
взаимодействующих с белками-лигандами. Так, при бактериальных инфекциях антитела к белкам бактерий связываются с поверхностью бактериальных клеток, образуя слой, в котором Рс-области антител смотрят наружу. Этот слой узнается специфическими рецепторами на поверхности макрофагов и нейтрофилов, и в местах их связывания начинается поглощение бактерии путем обволакивания се плазматической мембраной клетки (рис. I42).
Плазматическая мембрана принимает участие в выведении веществ из клетки с помощью экзопитоза — процесса, обратного эндоии-тозу (см. рис. 133). В случае экзопитоза внутриклеточные продукты, заключенные в вакуоли или пузырьки и отграниченные от гиалоплазмы мембраной, подходят к плазматической мембране. В местах их кон тактов плазматическая мембрана и мембрана вакуоли сливаются, и пузырек опустошается в окружающую среду. С помощью экзопитоза происходит процесс рецикли гании мембран, учасизгиииич в энло-цитозе.
С экзонитозом связано выделение синтезированных в клетке ра*_ нообразных веществ. ( екретируюпше, т. е. выделяющие вещества во внешнюю среду, клетки могут вы работы вин, и выбрасывать низкомолекулярные соединения (ацетилхолин. бисненные амины и др.), атак же в большинстве случаев макромолекулы (иешиды. белки, липопротеиды. пепгидопиканы и др.). Экзониток иди секреция, в большинстве случаев осуществляется в огне г на внешний сиз нал (нервный импульс, воздействие гормона, медиатора и др ), хотя в ряде случаев эк зоцитоз происходит постоянно (секреция фибронектина и кол ь’,е,1а фибробластами) Сходным образом из цитоплазмы расти тельных кяе-248
Рис. 142. Последовательность (/—/Р) захвата макрофагом бактериальная Клетки
I ~ бактерия; 2 - - макрофаг,-.? анииен поверхности бактерии; 4- аитнте ш; 5- рецепторы на ц коматическом мембране макрофага; 6 - лизосома; 7~ ла роданин бакгери-н-наюй клетки в чи зеком с
ток выводятся некоторые нолисахзрн in (юми целлюлозы). участвующие в образовании меточных стенок.
Большинство секретируемых веществ используется другими клетками многоклеточных организмов (секреция молока, пищеварительных соков. гормонов и др.). По часто клетки секретируют вещества и лля собственных нужд. Например, рост плазматической мембраны осуществляется за счет встраивания участков мембраны в составе эк-юиитозных вакуолей, часть элементов пи кока гикса выделяется клеткой в виде глнкопротеи шых молекул и т. л.
Выделенные из клеток путем экзоннтоза н< фолигичсскнесрермен-1 ы могут сорбироваться в слое глнкокаликса и обеспечивать иримем-бранное внеклеточное расщепление различных биополимеров и органических молекул. Скромное значение примембранное неклеточпос пищеварение имеет лля животных. Обнаружено, что в кишечном зпи-телии млекопитающих в зоне гак называемой щеточной каемки всасывающею эпителия, особенно богатой iликока шкеом, обнаруживается огромное КО.1ИЧССИЮ разнообразных ферментов. Часть >гих же ‘ферментов имеет панкреатическое происхождение (амилаза, типазы, различные протеиназы и tpа часть выделяется собе гиен но клетками
249
эпителия (экзотдролазы, расщепляющие преимущественно олигомеры п димеры с образованием транспортируемых продуктов).
Рецепторная роль плазмалеммы
Мы уже встречались с этой особенностью плазматической мембраны при ознакомлении с ее транспортными функциями. Белки-переносчики и насосы являются кроме всего также рецепторами, узнающими и взаимодействующими с определенными ионами Рецептор ные белки связываются с лигандами и участвуют в отборе молекул, поступающих в клетки.
В качестве таких рецепторов на поверхности клетки могут выступать белки мембраны или элементы гликокаяикса — гликопротеиды. Такие чувствительные к отдельным веществам участки могут быть разбросаны по поверхности клетки или собраны в небольшие зоны.
Разные клетки животных организмов могут обладать разными наборами рецепторов иди же разной чувствительностью одного и того же рецептора.
Роль многих клеточных рецепторов заключается нс только в связывании специфических веществ или способности реагировать на физические факторы, но и в передаче межклеточных сигналов с поверхности внутрь клетки. В настоящее время хорошо изучена система передачи сигнала клеткам с помощью некоторых гормоном, в состав которых входят пептидные цепочки. Эти гормоны связываются со специфическими рецепторами на поверхности плазматической мембраны клст кн. Рецепторы после связи с юрмоном активируют другой белок, лежащий уже в цитоплазматической части плазматической мембраны, -аде пил ат никл азу. Этот фермент синтезирует молекулу циклического АМФ из АТФ. Роль циклического АМФ (цАМФ) заключается в том. что он является вторичным мессенджером — активатором ферментов киназ, вызываюших модификации других белков-ферментов. Лак, пр” действии на печеночную клетку гормона поджелудочной железы глю-Kai она. вырабатываемою А-клеткам и островков Jlaurcpianca. он свя зывается со специфическим рецензором, что стимулирует акгиваиию аденил атцикл азы. Синтезированный цДМФ акт и ни рус г протсинкина-зуА, которая в свою очередь активирует каскад ферментов. в конечном счете расщепляющих 1ликоген (запасной полисахарид животных) до глюкозы. Действие иксу тиа заключается в обратном: он стимулирует вхождение глюкозы в печеночные клетки и отложение ее в bivic гл и koi ина
В целом неиь событий разверни кается следующим образом: гормон взаимодействует специфически с рецепторной частью этой системы И» нс проникая внутрь клетки, активируетаденилотциклазу, которая сип
250
тезирует цАМФ. Последний активирует или ингибирует внутриклеточный фермент паи группу ферментов. Таким образом, команда (сигнал от пчазматическои мембраны) перелается внутрь клетки Эффек тайность этой .ыенилатшниазной системы очень высока. Так взаимодействие одной или нескольких молекул гормона может привести за счет синтеза множества молекул цАМФ к усилению сигнала в тысячи раз. В данном случае аденилатциклазная система служит преобразова-телом внешних сигналов.
Существует и другой пуль, при котором используются другие вторичные мессенджеры, - это так называемый фосфатидилинозитольный путь. Пол действием соответствующего сигнала (некоторые нервные медиаторы и белки) активируется фермент фосфолипаза С. которая расщепляет фосфолипид фосфатплилинозитоллифюсфат. который входит в состав плазматической мембраны. Продукты гидролиза этого липида, с одной стороны, акгнвнрхют протеинкиназу С, которая вызывает активацию каскада киназ. что приводит к определенным клеточным реакциям, а с другой - приводит к освобождению ионов кальция, который регулирует целый ряд клеточных процессов.
Другой пример рецепторной активности - рецепторы ацетилхолина. важною нейромедиатора. Аиети ixojhh. освобождаясь из нервного окончания, связывается с рецептором на мышечном волокне, чго вы зывает импульсное поступление Na в клетку (деполяризация мембраны), открывая сразу около 2000 ионных канатов в зоне нервно-мы-
шечпою окончания.
Разнообразие и специфичность наборов рецепторов на поверхности клеток приводят к созданию очень сложной системы маркеров, иошодяюших отличать свои клетки (тон же особи или того же вида) от чужих. Сходные клетки вступают друг с другом во взаимодействия, приводящие к слипанию понеркностей (конъюпшия у простейших и бактерий, образование тканевых клеточных комплексов). При этом клетки, отличающиеся набором дсгерминангных маркеров или нс воспринимающие их, либо исключаются из такого взаимодействия, либо (у высших животных) уничтожаются в результате иммхнолош ie
ских реакций. .
С нлазматпчсскоп мембраной связана лока.изаиия с..ещ.ф>.чсских pencil горок, pealирутошпх на фи зичеекне факторы. Г. к. в 'с
CKOii мембране или нее производных уфогос||нгеп1чсских >ие-сине зеленых водорослей .ока».«>«..-» -
.и..). нза11молепсгвх'юшне с квотами света. I) пла.ма.1 1 ’ (
не снез11чу11СТ111пе.'1Ы.ых меток животных рас.кто• . • KOll)pi,ix
система фо.орепенгорных белков (родопсин), с ... световой сита, превращайся в химический, ч.
во-un к .сиерации электрическою импульса.
251
Межклеточное узнавание
У многоклеточных организмов за счет межклеточных взаимодействии образуются сложные клеточные ансамбли, поддержание которых может осуществляться разными путями. В зародышевых, эмбриональных тканях, особенно на ранних стадиях развития, клетки остаются в связи друг с другом за счет способности их поверхностей слипаться. Это свойство адгезии (соединения, сцепления) клеток может определяться свойствами их поверхности, которые специфически взаимодействуют друг с другом. Механизм этих связей достаточно хорошо изучен, он обеспечивается взаимодействием между гл и ко л ротондами плазматических мембран. При таком межклеточном взаимодействии клеток между плазматическими мембранами всегда остается шель шириной около 20 нм. заполненная гл и кокал иксом. Обработка ткани ферментами, нарушающими целостность гликокаликса (муказамп, действующими гидролитически на муцины, мукополисахариды) или повреждающими плазматическую мембрану (протеазами), приводит к обособлению клеток друг от друза, к их диссоциации. Однако если удалить фактор диссоциации, то клетки могут снова собираться, реаг-регироватг». Так можно диссоциировать клетки разных по окраске губок. оранжевых и желтых. Оказалось, что в смеси этих клеток образуются ига типа агрегатов: одни состоят только из желтых, другие -только из оранжевых клеток. При этом смешанные клеточные суспензии самоорганизуются, восстанавливая исходную многоклеточную структуру. Сходные результаты были получены с суспензиями разделенных клеток эмбрионов амфибий; в этом случае происходит и sGiipa тельное пространственное обособление клеток эктодермы от энтодермы и от мезенхимы. Более того, если для реагрегации используются ткани поздних стадий развития зародышей, то в пробирке самостоятельно собираются различные клеточные ансамбли, обладающие тканевой и органной специфичностью, образуются эпителиальные агрегаты, сходные с почечными канальцами, и т. д.
За агрегацию однородных клеток отвечают трансмембранные гли-колротеилы. Непосредственно за соединение — адгезию, клеток отвечают молекулы так называемых САМ-белков (cell adhesion molecules). Некоторые из них связывают клетки друге другом за счет межмолекулярных взаимодействий, друз не образуют специальные межклеточные соединения, или контакты.
Взаимодействия между адгезивными белками могут быть г°ми" фильными. когда соседние клетки связываются друг с другом с помощью однородных молекул, и гетерофильными, когда в адгезии участи* ют разного рола САМ на соседних клетках. Встречается межклеточное связывание через дополнительные линкерные мо «скулы.
252
Имеется несколько классов С'АМ-бслков: бушнополобныс N-CAM (молекулы адгезии тины, пнтегрииы.
кадгерины, иммуиогло-нервных клеток), селек-
Кздгсрины представляют собой интс|ральные фибриллярные мембранные белки, которые образуют параллельные гомодимсры Отдельные домены этих белков связаны с ионами Са2+. что придаст нм определенна ю жест кость. Насчитывают более 40 видов кадтеринов. Так. Е-калгерин характерен для клеток преимтиантировзипых эмбрионов и для эпителиальных клеток взрослых организмов. Р-кадгсрин характерен для клеток трофобласта, плаценты и эпидермиса. N-калгерин располагается на поверхности нервных клеток. клеток хрусталика, на сердечных и скелетных мышцах.
Молекулы адгезии нервных клеток (N-CAM) принадлежат к супер-семеиству иммуноглобулинов, они образуют связи между нервными клетками. Некоторые и з N-C.AM участуют в соединении синапсов, а также при адгезии клеток иммунной системы.
Се |ск!ины интегральные белки плазматической мембраны, участвуют к адгезии эндотелиальных клеток, в связывании кровяных пластинок. лейкоцитов.
Ннтстрины представляют собой 1егеролимеры. сан p-цепями. Ин-гегрнны в первую очередь осуществляют связь клеток с внеклеточными субстратами. по могут участвовать и в адгезии кле г ок друг с другом.
Как уже указывалось. на попавшие поршниз.м чужеродные макро-мотскулы (ангшены) развивается сложная комплексная реакция — иммунная реакция. Суть се заключается в том, чти часть лимфоцитов вырабатывает специальные белки-анпггеяа. которые специфически связываются с антигенами. Тик. макрофаги своими поверхностными рецензорами узнают комплексы анти ген-ан плело и поглотают их (например, поглощение бактерии при фагоцитозе).
В организме всех позвоночных, кроме гою, существует система рецепции чужеродных клеток или же своих, нос измененными белками н 1азмигичсской мембраны, например при вирусных инфекциях или при мутациях, часто связанных с опухотевым перерождением клеток.
Па поверхности всех клеток позвоночных роснозатаются белки так называемого г. га иного комплекса !нсг<>с»нмссп1мосги (MI major hisiocomp<i(ibiliiy complex). Эю hhtciрачьиые белки гликопротеины, ктеролпмеры. Очень важно запомнить, чю каждый ин ишплуум име с г свои набор таких мелков Ml К Эюсвя зано с тем. что они о иньпи •иморфны. так как н каждом инливигуме имеется бо1ыное1 ело .езьгернагнвных фирм одного и того же гена к к
имеется 7 X гокусон. кодирующих молеку 1Ы МНС «о р -тому, чю каждая югегка тайного организма, имея иао«’Р ' •
булег отличаться от кчеюк итивидуума этого же вида. Снсниазьная
25.1
Рис. 143. Атака Т-лимфошпа (/) на чужеродную клетку (2). которая подвергается лизису (3)
Рис. 144. Выделенке из вакуолей (.?) Т-лимфоцита (/) бстков-перфоринов (4). которые ветрам ваются в плазматическую мембрану клетки-митени (2) и образуют в ней каналы (5)
форма лимфоцитов - Г-лимфоциты, узнают МНС своего организма, но малейшие изменения в структуре МНС (например, связь с вирусом или результат мутации в отдельных клетках) приводят к тому, что Т лимфоциты узнают такие изменившиеся клетки и уничтожают их, но не путем фагоцитоза. Они выделяют из секреторных вакуолей специфические белки-перфорины, которые встраиваются в цитоплазматическую мембрану измененной клетки, образуют в ней трансмембранные каналы, делая плазматическую мембрану проницаемой, что и приводит к гибели измененной клетки (рис. I43 и I44).
Специальные межклеточные соединения (контакты)
Кроме таких сравнительно простых адгезивных (но специфических) свя зей (рис. I45) существует целый ряд специальных межклеточных структур - контактов, или соединений, которые выполняют опре-деленные функции. Это запирающие, заякориваюшие и коммуникационные соединения (рис. I46).
Запирающее, или iliuihoc, соединение характерно для однослойных эгипелиен. Эю юна. где внешние слои двух плазматических мембран максимально сближены. Часто видна трсхслойность мембраны и згоч контакте: два внешних осмофил иных слоя обеих мембран как бы сливаются в один общий слой толщиной 2-3 нм. Стияние мембран нр<> исходит не по всей площади плотного контакта, а представляетесю°м ряд точечных сближений мембран (рис. I47, о |4Ь).
254
a
Рис. 145. Схема простого межклеточного соединения
а - простое сое мнение. без участия снеииалышх сгрукгур; б - трансмембранные гчиконротсилы определяют связывание двух соседних меток
б
На плоскостных препаратах разломов плазматической мембраны в зоне плотного контакта с помощью метода замораживания и скалывания было обнаружено, что точки соприкосновения мембран представляют собой ряды глобул. Это белки окклулин и клаудин - специальные интегральные белки плазматической мембраны, встроенные рядами. Такие ряды глобул, или полоски, могут пересекаться гак. что образуют на поверхности скола как бы решетку, или есть. Очень характерна зга структура для зпите-лиев, особенно железистых и
кишечных. В последнем случае плотный KOHTiiKi образует сплошную зону слияния плазматических мембран, опоясывающую клетку в апикальной (верхней, смогряшеи в про
Рис. 146. Расположение различных адгезивных соединений и энтсроцнгс / простое сие шнение,- 2 - пчогное соединение. J адгезивныйпоясок;4 дссмосомз;5-по.чутесмосо.мд ; б щелевое сое nniciiiie; 7 — микроиорсннкн
255
I I I I j I I I
I j I
Рис. 147. Межклеточные специальные соединения (контакты)
а плотный кшираюшии кииым (light junction)* / пли|МЭ1ИЧс*ская мсмбрД»1*1 оЛ* mj еосчиняюшихся ктсиж. 2 сближение мембран и тоне контакта; <> * ”CKV^ меленой контакт (I) между,шумя 12и J» клр|иоми<н|иг:|ми
256
Рис. 148. Схема ilioiнего соединения
" pjcjio.ioArHne и киною соединения (нсывочидя 1ыастиик.о на метках (/) кишечною эпителия; 6 - трехмерная схема хчаегкл плотною соединения: / и м*мл1ичсекис мембраны сскч-шнх клеток. 2- глобу iu бе ты окклашна
свет кишечника) ее части <см. рис. 14S). Таким образом. каждая клетка пласта как бы обведена лентой этого контакта. Такие структуры при специальных окрасках можно видеть и в световом микроскопе. Они по IV4M.IH у .морфологов название замыкающих плаенпюк. Окупалось, что в данном случае роль замыкающего плотного контакта заключается не только в механическом соединении клеток ipvrc другом. /Этаобласть контакта плохо проницаема ця макромолекул и ионов, и тем самым она запирает, перегораживает межклеточные паюенг. изолируя их (и вместе с ними собственно внутреннюю среду орцшизма) от внешней среды (в данном с [учас просвет кишечника).
Это можно про 1смонсгрирова1ь, используя электронно-плотные кон грае геры. например раствор гидроокиси лай гап«а. Если просвет кишечника или протока какой нпбу ib железы нано,лишь раствором гидроокиси лаигана, то на срезах пол электронным микроскопом зоны, тле рас по laraeicsi это вещество, обладают высокой электронной плотное н>ю и будут темными. Оказалось, что ни зона плотного контакта, ни межклеточные нросчранет на. лежащие ниже ею. нс темнеют. Если же повредить плотные контакты (леткой фермента г инпои обработкой и hi удалением ионов Са-*’). то л.'пнан проникает и в межклеточные участки Точно так же была доказана непроницаемость плотных кон-гак гон для гемоглобина и ферритина и канальнах почек. 1аки.м обра
257
зом, п потные контакты являются барьерами не только,тля макромолекул. они непроницаемы для жидкостей и ионов.
Замыкающий. или плотный, контакт встречается между всеми типами однослойного эпителия (эндотелий, мезотелий, эпендима).
Заякоривающие, или сцепляющие, соединения, или контакты, гак называются потому, что они соединяют не только плазматические мембраны соседних клеток, но и связываются с фибриллярными элементами цитоскелета (рис. 149), Для этого рода соединений характерным является наличие двух типов белкой. Первый тип представлен трансмембранными линкерными (связующими) белками, которые участвуют или в собственно межклеточном соединении или в соединении плазмалеммы с компонентами внеклеточного матрикса (базальная мембрана эпителиев, внеклеточные структурные белки соединительной ткани).
Ко второму типу относятся вн угри клеточные белки, соединяющие, или заякоривающие, мембранные элементы такого контакта с цитоплазматическими фибриллами цитоскелета.
К заякориваюшим соединениям относятся межклеточные сцепляющие точечные контакты, сцепляющие ленты, фокальные контакты, или бляшки сцепления: все эти контакты связываются внутри клеток с актиновыми микрофнламентами. Другую группу заякориваюших межклеточных соединений составляют десмосомы и полудесмосомы; они связываются с другими элементами цитоскелета - с промежуточными филаментами.
Межклеточные точечные сцепляющие соединения обнаружены у
многих неэнителиальных тканей, но более отчетливо описана структура сцепляющих (а.исимных) лонг в однослойных эпите-лиях (рис. 150). Эта структура опоясывает весь периметр эпителиальной клетки, подобно тому как это происходи! в случае плотного соединения. Чаше всего такой поясок, или лента, лежи i ниже плотного соединения (см. рис. 146). В этом месте плазматические мембраны нс сближены, а лаже несколько ратин-нуты на расстояние 25-30 им. и между ними видна зона повЫ' шейной плотности. Эго нс что иное, как места взаимолейепши 1 раисмембранн ых 1 л и коирШ си-
Рис. 149. Схема строения таякори-ваюших адгезивных соединений / - плазматическая мембрана; 2 гране-мембранные шниерные ыикопрон.-илы; 3 - внутриклеточные белки сцепления; 4 - xicMeiiiM цитоскелета
258
Рис. 150. Адгсзинныи (сиспляющий) поясок (лента)
° рисиолплепие его в меле: « - над на уадрэтоиком «рек; а пештическое «ю ЧМДсние. / ада »кин-мембрана; 2 - слой випкуаииа; 3 актиновис микрофи пименты. 4 - тинкерныс глнкопрогенды
лов, которые специфически сцепляются друг с другом и обеспечивают механическое соединение мембран двух соседних клеток. Эти линкерные белки относятся к Е-кадгерпнам - белкам, обеспечивающим специфическое узнавание клетками однородных мембран. Разрушение зтого слоя гликопротеидов приводит к обособлению отдельных клеток и к разрушению эпителиального пласта. С ппто1иаз.матичсской стороны около мембраны видно скопление какою-то плотного вещества, к которому примыкает слой тонких (6-7 нм) филаментов, лежащих вдоль плазматической мембраны в виде пучка. идущего по всему периметру клегки. Тонкие филаменты относятся к актиновым фибриллам, они связываются с плазматической мембраной посредством белков катенина, винкулина и а-актинмнз, образующих плотный oko.iomc.m-бранный слои
Функциональное значение такого ленточного соединения заключается не только в механическом сцеплении клеток друг с другом: при сокращении аминовых филаментов влейте может изменяться форма клетки. Считается, что кооперативное сокращение актиновых фибрилл но всех клетках эпителиального пласт может вызвать изменение сю геометрии, например сворачивание в трубку, подобно тому чго происходит при образовании нервной трубки у эмбрионов позвоночных.
Фокальные контакты. или бляшки сцепления, встречаются у многих клеток и особенно хороню изучены у фибробластов. Они построены по общему плану со сиенляюшнми лентами, но выражены в виде нс-
259
2
Рис. 151. Фокальный контакт
а расположении в фибробласте. б - молекулярная схема. I п коматическая мембрана; 2- микрофи.чаменты; 3 - фибронектин; 4 рецептор фибронектина; 5-талин; 6 -винкулин; 7- а-актииин
больших участков - бляшек - на нлазмалеммс. В л ом случае трансмембранные линкерные белки-ингшрины специфически связывают-ся с белками внеклеточного матрикса (например, с фибронектином) (рис. 151). Со стороны цитоплазмы эти же гликопротеины связаны с прп.мембранными белками, кули входи г и винкулин. который в свою очередь связан с пучком актиновых филаментов. Функциональное значение фокальных контактов заключается как в закреплении клетки на внеклеточных структурах, гак и в создании механизма, позволяющею клеткам перемешаться.
Десмосомы структуры в виде бляшек или кнопок, также соединяют клетки друге другом (рис. 152 и 153, а) В межклеточном пространстве здесь также вилен пчогный слой, представленный взаимодействующими интсч рал иными мембранными кадгериззами -- десмоз леинами. которые спел шкл клезки друг с друюм. С цитоплазматической стороны к плазмалеммс прилежит с'юн белка-десмои закина. с которым связаны промежуточные филаменты цитоскелета. Десмосомы встречаются чаше всего в л вп глиях, в этом случае промежуточные фи замен гы содержа! кератины. Клет ки сердечной мышцы — карлиомиоиигы, солср-жат десминовые фибриллы в составе дес мехом. В лзлотелмн секу юн в состав чссмосом входяз виментзозовые промежуточные филаменты.
Полудесмосомы 1з принципе сходны по строению С ЛССМОСОМОЙ. |Ю представляют собой сослинсние клеток с межклеточными структурами. Гак, в эпителияхлинкерные гликопротеины (инзет рины) лссмосО' мы взаимодействуют с белками зак называемой базальной мембраны, кула входят коллазен. ламинин. протеогликаны и др.
260
Рис. 152. Дссмосома
« рас положение в клетке; б чилеку тярпая схема / 2 - леемсиличшовый слой; 3 - счий лссмоп шкива; 4 Я лес'мосочи; ПД - полу, геемосома
плазма]ичсская .мембрана; промежуточные фи имей гы.
Функциональная роль десмосом и полу.чеемосом сугубо механическая - оки сцепляют клетки друг с другом и с подлежащим внеклеточным матриксом прочно, что позволяет эпителиальным гпастам выдерживать большие механические нагрузки. Подобно атому десмосамы прочно спя зывают Тру г с другом IGICT ки сердечной мышиы. чго позволяет им выполня1ь огромную механическую нагрузку, оставаясь связанными в единую сокращающуюся структуру.
В отличие от плотного контакта вес типы сцепляющих контактов проницаемы ,ьля ночных растворов и не играют никакой роли в ограничении диффузии.
1Нс текыс контакты считаются коммуникационными соединениями клеток. Эти структуры участвуют в прямой передаче химических не-Шесгн из клетки в клетку. чго может не только трап» большую физиологическую роль при функционировании сненил'тизирокаины.х клс ток. но и обеспечивать межк (сточные взаимодействия при развитии организма, при тиффереппировкеего kiciok. Характерным для этого ины кошлкгов является сб жжение п (лзмагичсских мембран тух соседних клеюк н.1 расстояние 2 3 нм (ем рис. 147. (7и 153, о). Именно зто обстоятельство лапое время не позволяло на у.чьтратопких’ срезах отличить чанный ни г контакта от илогнок» разделитс'П.ного г замыкающего) контакта При использовании пт зроокиси лантана оы.ю замечено, чю некоторые п.гогные контакты пропускают контрастер.
261
Рис. 153. Микрофотография межклеточных соединении (контактом) в клетках печени, полученная с помощью электронного микроскопа
а - десмосомы: v щеЛевые соединения. / - илатмашчсская мембряиа: 2 медк’’С точное npoeipaiiCTBo; 3 - лссмосслы; 4 - щелевой коитакг
262
в этом случае лантан заполнял тонкую щель шириной около 3 нм между сближенными плазматическими мембранами соседних клеток. Это и послужило появлению термина щелевой контакт. Дальнейший npoipecc в расшифровке его строения был достигнут при использовании метода замораживания-скалывания. Оказалось, что на сколах мембран зоны щелевых контактов (размером от 0,5 до 5 мкм) усеяны гексагонально расположенными (с периодом 8-10 нм) частицами 7-8 нм в диаметре, имеющими в центре канал около? нм шириной. Эти частицы получили название коинсксонов (рис. 154). В зонах толевого контакта может бы гь от 10—20 до нескольких тысяч коинсксонов в зависимости от функциональных особенностей клеток. Коннексоны были выделены препаративно, они состоят из шести субъединиц копнем низ - белка с молекулярной массой около 30 тыс. Объединяясь друге другом, кои пектины образуют цилиндрический агрегат - коннексон, в центре которого располагается канал. Отдельные коннексоны встроены в плазматическую мембрану так. что прободают се насквозь. Одному коп иске о ну на плазматической мембране клегки точно противостоит
Рис. 154. Схема шехсвою соединения „„ачжгг каиаа. оОраюшикый
/ коннексон:.’ ч-енми...еекаи мем.’Гана С .рч>--
шумя КОКНСкСОНЛМИ
263
кон нексон на плазматической мембране соседней клетки, так что каналы двух коннексонов образуют единое целое. Коннексоны играют роль прямых межклеточных каналов, но которым ноны и нггзкомолеку-гярные вешесгва могут диффундировать из клетки в клетку. Коннексоны могут закрываться, изменяя диаметр внутреннего канала. и тем участвовать в регуляции транспорта молекул между клетками.
При изучении гигантских клеток слюнных желез двукрылых выяснилось, какое функциональное значение имеют щелевые контакты. В такие клетки благодаря их величине легко можно вводить мнк-роэлектроты для тою, чтобы изучать электропроводимость их мембран. Оказалось, ч ю если ввести электроды в дне соседние клетки, то их плазматические мембраны проявляют низкое электрическое сопротивление, т. с. между клетками идет ток. Более того, выявлено, что при инъекции в одну клетку флуоресцирующего красителя метка быстро обнаруживается в соседних клетках. Используя разные флуорохромы на клстка>\- культуры ткани млекопитающих. обнаружили, что через щелевые контакты могут транснор гироваз ься вещества с молекулярной массой не более 1-1.5 тыс и размером не более 1,5 нм (у насекомых через щелевой контакт могут проходить вещества с молекулярной массой до 2 тыс.). Среди этих веществ были разные ионы, аминокислоты, нуклеотиды, сахара, витамины, стероиды, гормоны, цАМФ. Ни бедки, ни нуклеиновые кислоты через щелевые контакты проходить не могут.
Такая способность щелевых контактов служить местом транспорта низкомолекулярных соединений используется в тех клеточных системах, где нужна быстрая передача электрического импульса (водны возбуждения) от клетки к клетке без участия нервного медиатора. Пак. все мышечные клетки миокарда сердца свя заны с помощью щелевых контактов (кроме тою, клетки там связаны и адгезивными контактами) (см. рис. 147, б). Эго создает условие для синхронного сокращения огромного количества клеток. При росте культуры эмбриональных сердечных мышечных клеток (миокардиоиигов) некоторые клетки в пласте начинают независимо друг от друга спонтанно сокращаться с разной частотой, и лишь после образования между ними шелевых контактов они начинают биться синхронно, как единый сокращающийся пласт клеток. Таким же способом обеспечивается совместное сокращение гладкомышечных клеток в стенке матки.
Шелсвые контакты могут служить целям метаболической кооперации между клетками, обмениваясь различными молекулами, гормонами, цАМФ или метаболитами. Примером может служить совместное кул шинирование мугангных но тимндникпшве клеток с нормальными: при возникновении шелевых кош актов между эгнми типами Клеток мутантные клетки через щелевые контакты получали от нормальных клеток т имид и нтрифосфат и могли участвовать в синтезе ДПК.
264
У ранних эмбрионов позвоночных, начиная с восьмиклеточной сталии, большинство кчсток связано другсдрхгом шслевыми контактами. По мерс дифференцировки эмбриона щелевые контакты между всеми КЛС1 ками пенеМют и остаются только между группами спеииа-лизиру юшихся клеток Например, при образовании нервной трубки связь клеток этой структуры с остальным эпидермисом прерывается и они разобщаются.
Целостность и функционирование щелевых контактов сильно зависят от уровня ионов Са2 внутри клетки. В норме кон ценз рання кальция в цитоплазме очень низка. Если Са2* инъецировать волну из клеток пласта культуры тканей, то в соседних клетках увеличения \ровня Са2‘ и цитоплазме не происходит; клетки каком разобщаются с соседями, перестают проводить электрический ток и красители. Через некоторое время, носастого как введенный кальций будет аккумулирован митохондриями, структура н функции щелевых контактов восстанавливаются. Такое свойство очень важно,для поддержания целостности и работы всего слоя клеток, так как повреждение одной из них пс передается на соседний через шелсвые контакты, которые перестают работать как межклеточные шффузнойные канаты.
Синаптический контакт (синапсы). Этот тип контактов характерен
для нервной ткани и встречается как между двумя нейрона ми. так и между нейроном и каким либо иным элементом -рецептором или эффектором (например, нервно-мышечное окончание). Синапсы - участки контактов двух клеток, специализированных тля односторонней передачи возбуждения и пт торможения от одного элемента к другому (рис. 155). В принципе подобного рода функциотфщытая натрузка. передача импульса, может осуществляться и другими типами контактов (например, щелевым контактом в сердечной мышце), однако н синаптическом связи достигается высокая эффек1ивнпсгь в реализации нервною импульса. Синапсы образуются на отростках нервных клеток ,то теР
РИС. 155. Схимя синаптического нерв hoi о соединений
/ ,iPCchh.iiiiiw«*w меморанл (мембрана о.рсктм.кршкымом.);? иоикинапп.-.,ссм>1 МСМ6Р.НМ - сниап.ическая .нс.
pHlf
26S
нивальные участки дендритов и аксонов. Межнейронные синапсы обычно имеют вид грушевидных расширений - бляшек на конце щ. ростка нервной клетки. Такое терминальное расширение отростка одной из нервных клеток может контактировать и образовывать синаптическую связь как с телом другой нервной клетки, так и с ее отростками. Периферические отростки нервных клеток (аксоны) образуют специфические контакты с клетками-эффекторами или клетками-рецепторами. Следовательно, синапс — это структура, образх юшаяся между участками двух клеток (так же как и лесмосома). Мембраны этих клеток разделены межклеточным пространством — синаптической шелью шириной около 20—30 нм. Часто в просвете этой шели виден тонковолокнистый, перпендикулярно расположенный по отношению к мембранам материал. Мембрана в области синаптического контакта одной клетки называется пресинаптической, мембрана другой клетки, воспринимающей импульс, - постсинаптической. В электронном микроскопе обе мембраны выглядят плотными, толстыми. Около пресинаптической мембраны выявляется огромное количество мелких вакуолей - синаптических пузырьков. заполненных медиаторами. Синаптические пузырьки в момент прохождения нервного импульса выбрасывают свое содержимое в синаптическую щель. Постсинаптическая мембрана часто выглядит толще обычных мембран из-за скопления около нее со стороны цитоплазмы множества тонких фибрилл.
Плазмо (семы. Этот тип межклеточных связей встречается у растений. Плазмодесмы представляют собой топкие трубчатые цитоплазматические каналы, соединяющие две соседние клетки. Диаметр этих каналов обычно составляет 20-40 нм. Ограничивающая эти канаты мембрана непосредственно переходит в плазматические мембраны соседствующих клеток. Плазмодесмы проходят сквозь клеточную стенку, разделяющую клетки (рис. 156 и 157). Таким образом, у некоторых растительных клеток плазмодесмы соединяют гиалоплазму соседних клеток, поэтому формально здесь нет полною разграничения, отделения тела одной клетки oi другой, эго скорее пре вставляет собой синцитий: объединение многих клеточных территорий с помощью цитоплазматических мостиков. Внутрь п тазмолесм мозут проникать мембранные трубчатые элементы, соединяющие цистерны эидопла змати ческою ретикулума соседних клеток. Образуются плазмодесмы в° время деления клетки. когда с троится первичная клеточная оболочка. У только мт разделившихся клеток число плазмодссм может быть очень велико (до 1000 на клетку), при старении клеток их число пади ет за счет разрывов при увеличении толщины клеточной стенки
Функциональная роль плазмонесм очень велика: с их номошью обеспечивается межклеточная циркуляция растворов. содержаШН^ питательные вещества, ионы и npyine соединения. По плазмодссмам могут перемешаться липидные капни. Через плазмодесмы происходи’
266
рис. 156, H ia iMoaccMM - межклеточные сое 1инения между двумя клстм-'41 корневой меристемы теки
К.1С1ОЧН.1Н сгснх.1. ПЛ пл;имодесм!л: ЭПР - эн юн симагическни ре1ику.1}м, мшомиирия
267
Рис. 157. Схема строения плазмодссмы
1 - птлзматнчсская мембрана: 2-мембрана леем»гтоу ты; J клеточная с гонка
заражение клеток растительными вирусами. Однако эксперименты показывают, что свободный транспорт через нлазмолесмы ограничивается часг инами с массой нс более 800 Да.
Клеточная стенка (оболочка) растений
Если выделить любую клетку из организма животного и поместить ее в волу, то через короткое время клетка после набухания лопнет, т. е. она лизируется. Эго происходит вследствие тою, что через плазмати ческуто мембрану вола поступает в цитоплазму, в зону с более высокой концентрацией сотен и органических молекул. При этом увеличивает ся внутренний объем клетки до тех пор. пока нс разорвется плазматическая мембрана В организме животных этого не происходит, потому что клетки ни зших и высших животных существуют в окружении жидкостей внутренней среды, концентрации солей и веществ в которой близка к таковой в цитоплазме. Свобо шоживущие в пресной воде од ноклеточные простейшие организмы нс тизируюгся (при отсутствии клеточной стенки) из-за того, что у них постоянно работает клеточный насос. откачивающий воду из цитоплазмы, сократительная вакуоль.
Если же мы в воду поместим клетки бактерий или растений, то они не будут лизироваться до тех пор. пока цела их клеточная стенка. Воздействием набора различных ферментов эт и стенки можно растворить В этом случае моментально происходят набухании и разрыв (лизис) клеток. Следовательно, в естественных условиях клеточная стены предотвращает этот гибельный для клетки процесс. Болес тою, наличие клеточных сгенок является одним из i .чанных факторов, ретулир' юших поступление воды в клетку. Клоки бактерии и расгиний обшл юг чаше всего в ihuoioihimcckoii водной среде, они нс имеют сокраШ-тсльных (выделите цьных) вакуолей, чтобы откачать волу, но зато пг'*1’ ная клеточная стенка предохраняет их от чрезвычайною набухания
268
По мерс поступления поды в клетке возникает внутреннее давление -тургор. который препятствует дальнейшему поступлению волы.
Интересно, что у многих низших растений, например у зеленых водорослей, клетки имеют хороню сформированною клеточную оболочку. но при наловим размножении, когда образуются подвижные зооспоры. последние теряют клеточную оболочку и у них появляются пульсирующие вакуоли.
Клеточная стенка растений формируется при участии плазматической мембраны и является экстра клеточным (внеклеточным) многослойным образованием, заипннаюшим поверхность клетки и служащим как бы наружным скелетом растительной клетки (рис. 158). Клеточная стенка растений
состоит из двух ком нонен гов: аморфного пластичного гелеобразного матрикса (основы) с высоким содержанием возы н опорной фибрил тярной системы. Допол-iiin ел ьные полимерные вещества и соли, часто входящие в состав оболочек, придают нм же егкоегь и .делают их не смачиваемыми.
В химическом отношении главные компоненты оболочек растении OIносятся к структурным по шеахарилам. В состав матрикса обо-ючек растений входят гетерогенные труппы полисахаридов, раство ряюшиеся в копнен ipn-рованных щелочах, ie-минеялюлозы и пектиновые вещества. 1еми-Ue I но юзы представляют собой ветвящиеся полимерные пени, состоящие из раз 1ичпы\ гексоз (1 нокоза, манноза. коакгоы и 1р.). пен
Рис. 158. ( хема строения клеточной стенки растении
О ерслиииая 1г.1асгинм; / пертнилн ибилочкл (лил <. ю»1 ио оое <.п»роны oi ГЛ; ~ стон нюрнчиои оболочки; 3 ipci н-иим обочочм .НМ и м jm.hu чеемн MCMoji.iii.i. В kjkuml; Я я»ро
2(»9
то! (ксилоза, арабиноза) и уроновых кислот (глюкуроновая н галакту-роновая). Эти компоненты гемицеллюлоз сочетаются между собой в разных количественных отношениях и образуют разнообразные комбинации. Цепи гемицеллюлозных молекул не кристаллизуются и не образуют элементарных фибрилл. И з-за наличия полярных групп уроновых кислот они сильно гидратированы.
Пектиновые вещества - гетерогенная группа, в которую входят разветвленные, сильно гидратированные полимеры, несущие отрицательные заряды из-за множества остатков галактуроновой кислоты. Благодаря свойствам своих компонентов матрикс представляет собой мягкую пластическую массу, укрепленную фибриллами.
Волокнистые компоненты клеточных оболочек растении состоят обычно из целлюлозы — линейного, не ветвящегося полимера глюкозы. Молекулярная масса иелтюлозы варьирует от 5-Ю4 до 5 1(Р, что соответствует ЗОО-ЗООО остаткам глюкозы. Такие линейные молекулы целлюлозы могут соединяться в пучки или волокна. В клеточной оболочке целлюлоза образует фибриллы, которые состоят из субмикро-скопнческих микрофибрилл толщиной до 25 нм, а они в свою очередь состоят из множества параллельно лежащих цепей молекул целлюлозы.
Количественные соотношения целлюлозы к веществам матрикса (гемицеллюлозы) могут быть весьма различными у разных объектов. Свыше 60% сухой массы первичных оболочек составляет их матрикс и около 30% приходится на скелетное вещество — целлюлозу. В сырых клеточных оболочках почти вся вода связана с гемицеллюлозами, поэтому масса основного вещества в набухшем состоянии достигает 80% сырой массы всей оболочки, тогда как содержание волокнистых веществ сводится всего к 12%. В волосках хлопчатника целлюлозный компонент составляет 90%; в древесине на долю целлюлозы приходится 50% от компонентов клеточной стенки.
Кроме целлюлозы, гемицеллюлозы и пектинов и состав клеточных оболочек входят дополнительные компоненты, придающие им особые свойства. Так. инкрустация (включение внутрь) оболочек лигнином (полимер кониферилового спирта) приводи г к одревеснению клеточных стенок, повышению их прочности (рис. 159). Лигнин замешает в таких оболочках пластические вещества матрикса и играет ро |ьосновного вещества, обладающего высокой прочностью. Часто млрикс укреплен минеральными веществами (SiO2, СаСО, и др ).
На поверхности клеточной оболочки могут скапливаться различные адкрустирующие вещества, например кутин и суберин, приводящие к опробковению клеток. В клетках эпидермиса на поверхности клеточных оболочек откладывается воск, коюрын образует водонепроницаемый слои, препятствующий потере клетки»! воды.
270
Рис. 159. Инкрустация клеточной оболочки
о - фнбрипярныи каркас и межфибри мирным магрикс; б- иикрус|ирсва1шзя 1нгни-ном и утерявшая способность к растяжению оболочка с остатками матрикса;к - пос тс-дующее инкрустирование фенолами и (или) минеральными веществами, приводящее к повышению твердости оболочки
Из-за своею пористого, pbivioro строения клеточная стенка растении проницаема в значительной степени для низкомолекулярных соединений. таких как вола, сахара и ноны. Но макромолекулы проникают через целлюлозные оболочки плохо: величина пор в оболочках, позволяющая свободную диффузию веществ, составляет всего лишь 3-5 нм.
Опыты с мечеными соединениями показал», что при росте клеточной оболочки выделение веществ, из которых она строится, происходит по неси поверхности клетки. Аморфные вещества матрикса, геми Целлюлозы и пектины синтезируются в вакуолях аппарата Гольджи и выделяю гея через плазмалемму путем экзоиитоза. Фибриллы целлюлозы синтезируются специальными ферментами, встроенными в плазмалемму.
Оболочки дифференцированных. зрелых. клеток обычно многослойные. в слоях фибриллы целлюлозы ориентированы по-разному, и количество их также может значительно колебаться. Обычноописыва-ют первичные, вторичные и третичные клеточные оболочки (см. рис. 158). Для юго чтобы разобраться н строении и поямении этих оболочек, необходимо познакомиться с тем. как они образуются после деле-
ния меток.
Прн делении клеток растении после расхождения хромосом в эква-ториалы<оц плоскости клеток появляется скопление мелких мембран-ны' пузырьков, которые в центральной части клеток начинают сли-нагься друг -с друг ом (рис. 160). Этот провесе слияния мелких вакуолей ’’роисхопп от петри клетки к периферии и про юл ждется го тех пор. пока мембранные пузырьки не сольемся между собой и с плазматической мембраной боковом поверхности клетки. Гак образуется клеточная пластинка, и гм фр:н монласт. В центральной части ее располагается аморфное вещество матрикса, которое наполняло сливающиеся ну-И’рьки Доказано, чго ли первичные вакуоли происходят от мембран
271
2
Рис. 160. Схема роста клеточной оболочки от се закладки при делении клетки (/) яо полного созревания (И)
I - первичная оболочка; 2 с ши глоричпой обиючьи: 3 тре|ичпая оболочка; В -взкуош; СП - средин -пая пластинка; 11X1 ишм«п ичс скис мембраны дмух сисслнмх клеток
аппарата Гольджи. В состав первичной клеточной стенки входит также небольшое количество белка (около 10%), богатого гндрокенпролином и имеющего множество короткихолнго-сахаридных испей, что определяет этот белок как гл и koi троте ид. По периферии клеточной пластинки при наблюдении ее в поляризованном свете обнаруживается заметное двойное лучепреломление, вызванное тем, что в этом месте располагаются ориентированные фибриллы целлюлозы. Таким образом, растущая первичная клеточная стенка состоит уже из трех слоев: пентрально-ю — срединная пластинка, состоящая только из аморфного матрикса, и двух периферических - первичная оболочка, содержащая i см и целлюлозу и целлюлозные фибриллы. Если срединная пластинка — эго продукт активности исходной клегки, то первичная оболочка образуется за счет выделения гемицеллюлозы и фибрилл целлюлозы двумя новыми клеточными телами. И все дальнейшее увеличение толщины клеточной (вернее, межклеточной! стенки будет происходить за счет активности двух дочерних клеток, которые С ПРОТИВОПОЛОЖНЫХ СТОРОН ВЫ1С-ляют вещества клеточной оболочки.
утолщающейся путем полелйивания все новых и новых пластов. Как и с самого начала. выделение веществ матрикса осуществляется за счет подхода к плазматической мембране пузырьков аппарата Гольджи, слияния их с мембраной и высвобождения их содержи* мою щ пределы цитоплазмы. Здесь же. вне клетки, на се пла зматической браке идет синтез и iюлиисри»111,я Целлюлозных фибрилл. Гак постепенно образуется вторичная юте i очная
272
оболочка. С достаточной точностью определить и суметь отличить первичную оболочку от вторичной трудно, так как они соединены между собой несколькими промежуточными слоями
Основную массу закончившей свое формирование клеточной стен ки составляет вторичная оболочка. Она придает клетке ее окончитезь-нуюформу. После разделения клетки иалвс дочерние происходит рост новых клеток, увеличение их объема и изменение формы: клетки часто вытя1 иваются в инну. Одновременно с чтим идут наращивание толщины клеточной оболочки и перестройка ее внутренней структуры.
При образовании первичной клеточной оболочки в ее составе еще мало целлюлозных фибрилл, н они располагаются ботее или менее перпендикулярно будущей продольной оси клетки. Позже, в период растяжения (удлинения клетки за счет роста вакуолей в цитоплазме) ориентация этих поперечно-направленных фибрилл подвергается пассивным и щенениям: фибриллы начинают размешаться под прямым м том дрх г к друг}' и в конечном счете оказываются вытянутыми более или менее параллельно продольной оси клетки. Постоянно идет процесс: в старых слоях (ближе к центру оболочки) фибриллы подвергаются пассивным сдвигам, а отложение новых фибрилл во внутренних слоях (ближайших к мембране клетки) продолжается в соответствии с исходным планом конструкции ободочки. Этот процесс создаст возможность скольжения фибрилл относительно груг друга. а перестройка арматуры клеточной оболочки возможна из-за студенистого состояния компонентов се матрикса. В дальнейшем при (вмещении в матриксе гсмицел полозы налипши подвижность фибрилл |1езко сни
жается, оболочка становится плотной, происходит одревеснение.
Часто пол вторичной оболочкой обнаруживают третичную оболом ку. которую можно рассматривать как засохший остаток дегенериро-
вавшего слоя собственно нптопла змы.
Следует отметить, что при делении клеток растений формированию первичной оболочки нс во всех случаях предшествует образование клеточной пластинки. Гак. у зеленой водоросли спирогиры новые поперечные перегородки возникаю! путем образования на боковых стенках исходной клетки выступов, которые, постепенно разрастаясь
к пен г ру к. 1и । ки, смы каются и делят кле тку надвое.
Как уже говори «ось. ес.ш и волной iипозоиическои среде лишить клетку ее оболочки, го произойдет лизис, разрыв клетки, казалось, что. подбирая ечнонеговук.шие Koi.ueirrpaiHin саки и сахаров можно уранняы. осмотчсское давление снаружи и внутри кале> . ных своих оболочек при «том такие про.....при«МХ' «г нар
видную «(юрму (С«1к|я>11лаи.а). Fc in вереде. где нахол>"е .. ди 1|||v
б\ гст достаточное количесгво ни тигельных веществ Г
ггеобхошм Са’ ). w ^гки снов., гюссганзюшиаюг. регенерируют свою
273
клеточную оболочку. Более того, они способны в присутствии гормонов (ауксинов) делиться и создавать клеточные колонии, которые мот дать начало для роста целою растения, от которого была взята клетка
Главный волокнистый компонент клеточной стенки больших групп грибов (базибиоминеты. аскоминеты, зигомицеты) - хитин; это - полисахарид, в котором основным сахаридом является N-аистия-глюкозамин. В состав клеточной стенки грибов, кроме хитина, могут входить вещества матрикса, гликопротеины и различные белки, синтезированные в цитоплазме и выделенные клеткой наружу.
Клеточные оболочки бактерий
Опорным каркасом клеточной стенки бактерий и синезеленых водорослей также служит в значительной степени однородный полимер -пептидогликан, или муреин. Жесткий каркас, окружающий бактериальную клетку, представляет собой одну гигантскую мешковидную молекулу сложного полисахарида - псп гида. Каркас этот на гы на ют муреиновым мешком. Основа структуры муреиновою мешка - сеть параллельных полисахаридных цепей, построенных из чередующихся лиса-харидов (ацетил! чюкозамин. соединенный с ацетил му рамовой кислотой), связанных многочисленными пептидными поперечными связями (рис. 161). Длина цепочек может быть огромной - до нескольких сотен лисахаридных блоков. Основу пептидной части муреина составляют тетрапеитилы, образованные различными аминокислотами.
Бактериальная стенка может составлять до 20—30% от сухой массы бактерии. Это связано с тем, что в ее состав кроме многослойного муреинового каркаса входит большое количество дополнительных компонентов, как и в матриксе стенки У / / у растений. У грамположитсльных бактерий (при окраске по Граму - окраска кристаллическим фиолетовым, обработка иолом, отмывка спиртом -бактерии по-разному воспринимают краситель: грамположительные остаются окрашенными после обработки спиртом. гра.мотрицательные обесцвечиваю гея) сопутствующими компонентами служат полимерные вещества, сложным образом вплетенные в муреиновую сеть. К ним относятся тейхоевые кислоты, полисахариды, полипептиды и белки. К «точная
Рис. 161. Муреиновая сеть N-ансти «мурампиая кислота (М) и N аиститг нокочамин (Г| соединены между собой ленты шыми мостиками
274
стенка грамположигельных бактерий обладает большой жесткостью ее муреиновая сеть многослойна.
Стенки грам отри нательных бактерий содержат однослойную муреиновую сеть, составляющую 12% сухой массы стенки. Сопутствующие компоненты составляют до 80% сухой массы. Эго липопротеины, сложные липополисахариды. Они образуют сложную наружную липопротеиновую мембрану. Следовательно, периферия грамотринательных бактерий содержит наружную мембрану, затем однослойную муреиновую сеть, ниже нее расположена плазма(ичсская мембрана (рис. 162). Наружная мембрана обеспечивает структурную целостность клетки, служит барьером, ограничивающим свободный доступ разных веществ к плазматической мембране. На ней также могут располагаться рецепторы дня бактериофагов. Она содержит белки-порл-
ны. которые участвуют в переносе многих низкомолекулярных веществ. Молекулы лорина образуют тримеры, проходящие сквозь толщу мембраны. Одна из функций этих белков - формирование и мембране । идрофилызых пор, через которые происходит диффузия молекул массой не более 900 Да. Через поры свободно проходят сахара, аминокислоты, небольшие олигосахариды и пептиды. Поры образованы раз-
ными поринамн, облазают разной проницаемостью.
Между внешней липопротеидной мембраной бактериальной стен-
ки и плазматической мембраной лежит нсриплазматмчсское пространство. или периплазма. Fe толщина обычно составляет около 10 нм. она содержит тонкий (I 3 нм) муреиновый слои и раствор, содержащий специфические белки двух типов: гидролитические ферменты и грапспортпые белки. Из-за наличия гидролаз иногда периплазму рассматривают как аналог лизосом него компартмента эукариот. Пери-плазматические транспортные белки связывают и переносят от внеш ней мембраны к плазмалеммс сахара, аминокис,юты и ip.
а 6
РИС. , 62. Схем., сроення стенки ..«ми- .....ых 1«> П™-
.... .........................
icckoc ii|KKip;in«--o*o
275
Предшественники стенок бактерий синтезируются внутри клетки сборка стенок происходит снаружи от плазматической мембраны.
Пол действием фермента лизоцима можно разорвать муреиновый каркас и растворить бактериальную ctchkv. В гипотонических условиях клетки при этом разрушаются, как разрушаются голые клетки животных и растений; в изотонических условиях образуются шаровидные протопласты, которые способны снова вырабатывать свою клеточную стенку.
Интересно, что протопласты бактерий нечувствительны к действию бактериофагов - вирусов, паразитирующих на бактериях. Следовательно. компоненты бактериальной стенки обладают антигенной специфичностью по отношению к этим вирусам.
Глава 14
ВАКУОЛЯРНАЯ СИСТЕМА ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА
Вдкуолярная система, состоящая из одномембран пых разнообразных построению и функциям органелч (эндоплазматический ретику лум. аппарат Гольджи, лизосомы, эндосомы, секреторные вакуоли), выполняет общую функцию синтеза, nepeciройки (модификации), сортировки и выведения (экспорта) из клетки биополимеров, главным образом бел ков-гли кои роте идов. а также функцию синтеза мембран этой системы и плазматической мембраны.
Необходимо отмстить, что синтез основной массы клеточных белков протекает на ио тсомах в цитозоле. Особенное 1ью белковою синтеза в цитозоле является то. что в зависимости от тина иРНК синтезируются различные белки, направтяющиеся строго к своим внутриклеточным компонентам. Эю связано е тем, что разные по назначению белки имеют определенные «сигнальные» Поспелова гельности аминокислот, как бы адреса, но которым разные белки распределяются н клетке. Так, ялериые белки имеют М_5-сигна.чы1ую последовательность, белки митохондрий, гак же как белки пню золя, цитоскелета, пластид и пероксисом, - свою сигнальную 1юсте.1онательност1.. Характерным является то, чти все типы перечне тенных белков начинают и заканчивают синтез н цитозоле и затем ноепрансляционно с помощью внутриклеточных белковых комплексов переносятся «но адресам».
В 01-ТИЧИс от л их типов белков, белки экспортного на значения и белки мембран синтезируются на рибосомах, расположенных на мембранах эн югыазмашчисмио решку [ума. и попадают внутрь вакухзяей. по мере сии lew подписи пиной пени, келранедяииинио. 5атсм ли белки \ же внутри вакуолей и in в составе мембран вакуолей транспортируются внутрь клеши
276
Общая схема функционирования вакуолярной системы
На рис. 163 представлены мембранные везикулярные компоненты. объединенные в единую функциональную систему. Вес они имеют общее свойство: они представляют собой одпомембранныс ком-парт.менты. имеющие один общий источник образования (гранулярный эндопла зматическии ретикулум). Для всей вакуолярной системы характерны кооперативность се функционирования, взаимосвязь и последовательность этапов образования, перестройки. транспорта и экспорта сип тезированных белков. Вкратце функции отдельных компонентов заключаются в следующем:
к Гранулярный эндоплазматический ретикулум: котрансля!тонный синтез растворимых внутри на куолярныч белков (секреторные бе «ки, ишролазы лизосом и лр.); котрансляииопный синтез нерастворимых бе тков. входящих в состав всех мембран вакуатяриой системы: первичная модификация растворимых и нерастворимых (мембранных) белков, их соединение с олшосахарилами - первичное глико зи шронанис синтезированных белков, образование гликопротеидов; синтез мембранных липидов и их встраивание в мембрану -«сборка мембран».
2. Отделение вакуолей, содержащих новообразованные продукты, и их переход в цис-зону аппарата Гольджи (ЭПР ЛГ -комплекс).
3. Цис зона аппарата Гочьджи: вторичная модификация гликопротеинов; синтез полисахаридов (гемицеллюлоза растении) и гсксозами-
но1 шкапов.
4. Промежуточная зона аппарата Гольджи: дополни тельные модификации гл и коп роте и лов, трансгликозилировзнис.
5. Транс Гольджи сеть: сор г ировка секреторных и ли юсомных белков: отделение вакуолей.
6. Экзонитоз (секреция).
7. Экзонитоз постоянный.
8. Отделение первичньи литоепм с i цароламми.
9. Эн юни(оз.
10. Вторичная лизосома.
II. Рейн Kin МИНЯ рецепторов ниратат.
12. Рецчк.плшия рецепторов " K.,awl,eai(l.«
13 17,^,,.. иыоп.тазм:п11чсем1и "kn ^(юш.я, я-мяеца.. ,Р. вшидов. депонирование ионов С J «с
И Граиепор* В юну.чеемшрегпку.пм.
15. Гранспоргоганна|хпа (aiuiAii в ь
277
Рис. 163. Общая схема вакуолярнои системы клетки
/ ядерная оболочка: 2 фанудярный-лиюплатматнчсский ретикулум (ЭПР): } ”с' реходная юна (ЭПР- АГкоми к-кс). 4 перепое от ЭПР к .шпарэту Пкилхи (Al г. 5 Проксима. 1ЫИ4С участки (ни<| АГ; б средняя чисть (.w4) АГ. 7 - листа смыя часть АГ; 8- /иремк-сстьАГ (TGN); V иоткрагный путь накуосси АГ; 10 - отде ссиис неркичиых тиюсом; // ностоянния экскрсния (секрецию: /2- сигидльиая сскрснн”-13 jiliohhioj; /4 jHiocoMa; 15 нторичнэя лиюсома; 16 «ошраг ihjoc<,w,,‘j' мс'мбан hTGN; 17- шнкрдг репсиюрон и на.имлическую мембрану, IX fj.viMHi hi-до1ыатма1ичсский ре иску сум
27Х
Гранулярный эндоплазматический ретиклум
Отличительной чертой вакуолярной системы является то что ат тезированные полимеры и продукты их превращений отделены от собственно цитоплазмы, от цитозоля, и становятся изолированными от цитозольных ферментов. Такое разобщение очень важно для одновременного протекания и клетке многих синтетических процессов.
Открытие этой внутриклеточной мембранной стрхктхры произошло на заре электронной микроскопии. В [945 г. К.Р. Портер с сотрудниками изучая фибробласты иын.тят с помощью электронного микроскопа. В это время еще не была разработана техника ультратонкпх срезов, поэтому авторы просматривали клетки на просвет целиком. В световом микроскопе в фнбробласгах после фиксации и окраски видно, что периферия клеток (эктоплазма) окрашивается слабо, кто время как центральная часть клеток (эндоплазма) хорошо воспринимает красители. Floprep увидел в электронном микроскопе, что зона эндоплаэмы заполнена большим числом мелких вакуолей и каналов, соединяющихся друг с другом и образующих ч го-то наподобие рыхлой сети (ретикулум). Было видно, что стопки этих вакуолей и канальцев ограничены тонкими мембранами. Так был обнаружен эндоплазма!и-ческий ретикулум, или эилотиазмагическая сеть. Позднее, в 1950-е го-
лы, при испо Пэзовании .метода ультра гон мп сре зов удалось выяснить структуру этого образования и обнаружить его неотноролность. Самым же главным оказалось, что цитоплазматический ретикулум (ЭПР) встречается практически у всех эукариот.
Подобным элс к i рои но-микроскопически и анализ позволил выделить два типа ЭПР: гранулярный (шероховатый) и гладкий.
Па ульгратонких срезах гранулярный ЭИР представлен замкнутыми мембранами, которые образуют населениях вытянутые мешки, пи-Стерны или же имеют виз х .кпх каналов (рис. 164 и 165). Ширина полостей цистерн может очень варьировать в зависимости or функциональной активное!!! клетки. Наименьшая ширина их может состав чять около 20 нм. и расширенном виде они достигают диаметра в Нс сколько микрометров. От шчительной чертой них мембран то. что они со стороны талон шзмы покрыты мелкими (около _ х 1СМНЫМИ. почти окрхг.чым!! часшнами гранулами.
Впервые эти гранулы были описаны Чж. Палли (гранулы а. . который доказал. чго он., ирсдс.авляюг собой
Генерь хор».по известно, чго эторибос'о-рибосомамп. связанными с хкх.оранами .......пких
мы расположены и пиле iiojiiicoxi (множество рига •. • ’ .
........
ГОК НИИ 1ГХ><*11'П- "?ГО рпбОШКИЦИС. CJ!H!tH!|- __
коюрыс прикрепляются к мембранам своей большой суиъе шин с»
279
Рис. 164. Гранулярный эндоплазматический ретикулум (эргастоилазма) в клетке поджелудочной железы (ультратонкий срез)
Гранулярный (пли шероховатый, в отличие от гладкого) ЭПР в клетках может быть представлен или в виде редких, разрозненных мембран, или же в виде локальных скоплений таких мембран (эргасто-плазма) (рис. 166). Первый тип гранулярною ЭПР характерен для недифференцированных клеток или клеток с низкой метаболической активностью. Эргастоилазма характерна для клеток. активно синтезирующих секреторные белки. Так. в клетках печени гранулярный ЭПР собран в отдельные зоны (тельца Берга), так же как в некоторых нервных клетках (тифоид). В клетках поджелудочной железы гранулярный ЭПР (эр| астоп.|азма) в виде плотно упакованных друз около друга мембранных цистерн занимает базальную и околоядериую зоны клетки.
Наличие полисом на мембранах однозначно говорит о том, что гранулярный ЭПР является важным местом синтеза белков.
Количество рибосом на ЭПР четко связано с его синтетической активностью. Так. на мембранах ЭПР в клетке несекрстируюшей молочной железы связывается до 25% клеточных рибосом, после стимуляции лактации их количество там возрастает ло 70%. Падение числа рибосом на мембранах ЭПР может происходить при дифференцировке клеток. Например, при частичном удалении печени у трызунов резко стимулируется деление клеток в оставшейся части. Это сопровождается рслукииеи гранулярного ЭПР и обеднением его рибосомами: число свободных рибосом, не связанных с мембранами, достигает 40% Та
2X0
2SI
Рис. 166. Схема строения каналов и полостей гранулярного эндоплазматического ретикулума
PC рибосомы, прикрепленные к мембранам со стороны гналоилазмы (Г); П - полости плоских цистерн и каналов, отделенных мембранами (М) от талон ла змы; В - ва-куо in с синтезированными продуктами, отщепляющиеся от цистерн |ракулярного эндоплазматического ретикулума. В зонах отщепления вакуолей исчезают рибосомы на мембранах
кое же уменьшение числа рибосом, связанных с ЭПР, наблюдается при различных патологических состояниях клеток (при алкаголыюм хроническом отравлении происходит уменьшение числа связанных рибосом на 25%).
Рибосомы, связанные с мембранами ЭП Р. участвуют в синтезе белков, выводимых изданной клетки, - «экспортируемых» белков.
Действительно, большое число клеток многоклеточных организмов. богатых гранулярным ЭПР, синтезирует и выводит огромное ко личество белкой. Например, клетки ацинусов поджелудочной железы синтезируют и выделяют массу белков-ферментов, участвующих ° расщеплении пищи в кишечном тракте (протеиназы, липазы, нуклеа зы и лр.). ктетки печени синтезируют альбумины крови; плазмациты — /-глобулины, клетки молочной железы — казеин, слюнной железы — пищеварительные ферменты, амилазу и РНКазу и т. л. Такая же карти-
2X2
на наблюдается у рас гении: желе «истые клетки, вылеляюшис бетко-вые вещества, богаты гранулярным ЭПР. Дру111ч1, словамв м|(ог° клеточных организмов клетки, богатые эргастоплазмой. синтезируют выводимые из этих клеток белки, необходимые или .тля работы лругич клеток, или для выполнения обптеорганизмепных функций (пишева-ригельные ферменты, белки плазмы крови, гормоны ияр.).
У одноклеточных также можно наблюдать гранулярный ЭПР, который. по-видимому, участвует в синтезе выводимых экспортируемых белков. Среди таких белков могут быть не только ферменты внеклеточного пищеварения.
Следовательно, роль гранулярного ЭПР заключается не просто в участии в синтезе белков на рибосомах его мембран, но н в процессе сегрегации, обособления этих синтезированных белков, в их изоляции от основных функционирующих белков клегки. Эта функциональная особенность 1 ранулярного ЭПР очень важна, так как она связана с целым рядом процессов, приводящих к выделению таких белков с помощью вакуолей аппарата Гольджи.
Котрансляционный транспорт растворимых белков
Пу ги синтеза белков на рибосомах ЭПР можно представить в следующем виде (рис. 167). Еще в гиалоплазме происходит связывание иРНК. кодирующей секреторный белок, с рибосомой и начинается синтез белковой цепи. Важным является то, что сначала синтезируется «сигнальная последовательность», богатая гидрофобными амино-кислотами. В нее входят 16-30 аминокислот. Эта «сигнальная последовательность» в цитозоле узнается и происходит ее связь с «узнающей сигнал частицей» (SRP-часпша). состоящей нз одном молекулы 7S РНК и шести различных пол и пептидных ценен. SRP-частина связывается после узнавания сигнального конца синтезирующейся .молекулы белка с рибосомой, что приводит к полной остановке синтеза белка. На поверхности же мембраны ЭПР. обращенной к гиалоплазме, расположены интегральные рецепторные белки, соединяющиеся с SRP-части нами. В результате SRP-частина связывается со своим рецептором, одновременно она осуществляет связь данной рибосомы с мембраной ЭПР _ „
Такая ..заякоренная» рибосома с SRP-частинсй. блокнруюшей дальнейший рост полипептилной цепи, взаимодействуете ольшпм белковым канальным комплексом - траисдакоиом. После связывания рибосомы с транслаконом происходит отделение SR -частицы и емн тезированный первичный пептид входит в канал диметром около _ нм, который образует трансяакон. После этого возобновляется синтез по липептида, он удлиняется и его сигнальная последовательность вместе
283
Рис. 167. Синтез растворимых (секреторных) белков в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР)
/ иРНК; 2 - функционирующая рибосома: 3 сш нальиыи конец синтезирующегося нети ы: /- SRP-Чнстииа, 5 SRP-4;icniiia связываемся с сипы imimb пентилом и прекращает синтез белка; 6 - рецептор SRP-част ины. 7- связь рении гора с SRP частицей. Л - каналытые белки мембраны ЭПР; V- освобождение SRP-час г и вы и продолжение роста белковом молеку ты. 10 отщепление и деградация сигнальной последовательности сип тезируемо! о белка; // продолжение росы бе гковой цени; /2 синтезированным белок в просвете вакмолк ЭПР; 13 тиссациировапкая рибосома
с растущей цепочкой оказываются внутри полости цистерны ЭПР. Таким образом, синте тируемый белок проходит сквозь мембрану ЭПР го время его синтеза, т.е. котрапсляпиошю. одновременно с его трансляцией. Внутри полости ЭПР с помощью фермента (сигнальная петида-за) сигнальная последовательность отщепляется. После окончания синтеза вся белковая молекула оказывается в полости ЭПР, н в это время рибосома отделяется от транслакона и диссоциирует. После это-ю в траггслаконе канал закрывается. Во время трансмембранного переноса растущей белковой цени происходит ее связь с олигосахарида-ми (гликозилирование). В полости цистерн ЭПР белки претерпевают ряд дополнительных изменений: образуются дисульфичные связи, происходи! их правильное сворачивание. а гакже сборка четвертичной структуры белков. Только белки с правильной конформацией в дальнейшем будут переноси! ься в зону аппарата Гольджи.
Синтез нерастворимых (мембранных) белков
В гранулярном ЭПР происходи г синтез белков, которые. встраива ясь в мембрану ЭПР. становятся интегральными мембранными белка
284
Полость эндоплазматического ретикулума
ОПР)168 СииТе3 мсм6Ранных белков в эндоплазматическом ретикулуме / иРПК. 2 - рибосома: 3- мембрана ЭПР; 4 - распиши пептид посте освобождения RP частицы. 5 канальные бе тки мембраны ЭПР; 6 - отшепленис сигнального JieiHH ia: 7- <-сгоп»-си1><ап,1{ый участок растущего пентила закрепляет его в мембране ^ПР; .V прою 1жсние роста белка в цитозольное пространство; 9 образовавшийся iiHiuip<Libi!i>Hi мембранным белок; 10- 'Ihccohhиронанная рибосома
ми (рис. 168). Начальные стадии синтеза мембранных белков похожи на таковые при синтезе растворимых белков. Здесь также участвуют SRP частицы, узнающие сигнальную последовательность, также происходит прохождение начального участка белковой цепи через транс-чакон. Однако в цепи синтезирующегося мембранного белка су шест-вхет одна или несколько аминокислотных стон-гюстсдователыгостей. которые препятстнуюг белковой цепи пересекать мембрану, и бе ток в области стоп-сит пала остается связанным с мембраной, но при этом синтез белка на рибосоме не останавливается. Это приводит к тому, что в области стоп-сигнала локализуется гидрофобный сс-спиральныи участок, а весь белок остается встроенным в мембрану. В некоторых белках число a-спиральных «заякориваюших» участков может быть от одноголо нескольких. Например, белок транспорта глюкозы (GLU Г-1) имеет 12 таких участков. Мембранные белки, так же как и растворимые, могут подвергаться различным модификациям. Наиболее характерной из них для ЭПР является первичное гликозилирование ковалентное связывание белковой пени со сложным олигосахаритом. В резучьтате этого синтезирующийся белок становится гликопротеидом.
Большинство белков. синтезированных в гранулярном ЭПР, относится к гликопротеидам. Связывание синтезирующейся белковой псин с олигосахаридами происходит также котрансляшюнно. При лом на белковую молекулу переносится готовый блок олигосахаридов, ко-
285
Рис. 169. Первичное гликозилирование в эндоплазматическом ретикулуме 1ЭПР)
/ рибосома; 2- растущий пептид; ,7 мембрана ЭПР; /- липид долихол, связанный с олигосахаридным предшественником (5); 6 связь олигосахарида с белковой исиоч кой
торый связывается с аспарагиновыми остатками белковой молекулы (рис. 169). Этот олигосахарпдный комплекс содержит две молекулы N-аиетнлгликозамина. девять молекул .маннозы и три молекулы глюкозы и связан со специальным липидом долихолом на внутренней поверхности мембраны ЭПР, смотрящей в просвет вакуоли ЭПР. По мере транслокации белковой пени во время се синтеза каждый аспарагиновый остаток связывается с олигосахар иди ым комплексом с помощью фермента, являющегося интегральным белком мембран ЭПР Первичной модификации — гликозилированию, подвергаются как растворимые, так и мембранные белки, синтезирующиеся в ЭПР-
Синтез клеточных мембран
Итак, на рибосомах ЭПР происходит синтез основной части мембранных белкой клетки. Синтез этих белков отличается от синтеза секреторных тем, что по мере синтеза мембранные белки не освобождаются от мембран, а остаются в нх составе, становясь, таким образом» или трансмембранными интегральными белками, или полу интегральными.
В ЭПР происходят синтез и сборка липидов самих мембран, включая фосфолипиды и холсстерол. Ферменты, участвующие в синтезе липидов, встроены в мембрану ЭПР со стороны цитозоля, и синтез липидов происходит на мембране гам же. Таким образом, синтезированные липиды встраиваются в мембрану ЭП Р в липидный слой со стороны цитоплазмы, но переносятся на внутреннюю сторону с помощью переносчиков фосфолипидов. Билипилныи слой мембраны растет.
286
увеличивая поверхность вакуоли или цистерны ЭПР Этот процесс идет одновременно с синтезом интегральных мембранных белков так что липопротеидная мембрана, как таковая, строится и растет за счет двух процессов: синтеза и встраивания липидов, а также синтеза и интеграции мембранных белков. Необходимо подчеркнуть, что такое «зарождение» мембран вакуоляриой системы происходит только в гра-нуляриом ЭПР.
Сегодня можно сказать, что важнейшей функцией гранулярного ЭП1, вне зависимости от специализации или тканевой принадлежности клеток, является функция образования, построения клеточных мембран, которая заключается в том. что элементы гранулярного ЭПР синтезируют все мембранные белки, синтезируют липидный компонент мембран, но, кроме того, именно в гранулярном ЭПР происходит сборка липопротеидных мембран.
Этот процесс хорошо прослежен и проанализирован на примере образования вируса везикулярного стоматита (VSV) (рис. 170). Это -РНК-солержащий вирус, построенный из небольшого числа белков и покрытый снаружи липопротеидной мембраной. В зрелой частице VSV кроме одной молекулы РНК есть белок, входящий в рнбонуклео-протеидный комплекс (N-белок). белок, крепящий этот комплекс с окружающей мембраной (М-белок), и специфический белок мембранной оболочки (G-белок). Мембранная оболочка VSV произошла от
клегки хозяина, в которой этот вирус развивается: по мере выхода РНП вируса происходит образование выроста плазматической мембраны. напоминающего короткую микроворсинку, куда включается нуклеоид (РНП) вируса, затем такой вырост отделяется от поверхности клетки, и получается готовая зрелая частица VSV. Благодаря С-белку такая частица .может специфически контактировать с незаряженной клеткой: мембрана VSV и плазматические мембраны клеток сливаются, а вирусный рибонуклеопротеид оказывается в цитоплазме клетки, где развивается инфекционный процесс. При этом останавливаются синтезы нормальных белков клетки-хозяина и начинается синтез только вирусных белков на рибосомах инфицированной клетки. Вирусная РНК кодирует только пять белковых молекул. Две из них являются ферментами, необходимыми для репликации и транскрип ции вирусного генома, третья - N-белок, четвертая кодирует i елок,
пятая — специфический гликопротеин - G-белок. Эго ишеградьныи белок мембраны, окружающий зрелую вирусную частицу. елок с стоит из 550 аминокислот и имеет дне боковые полисахаридные цепи. Он асимметрично расположен в мембране, большая ег о часть вме те углеводными цепочками торчит наружу, а 30 аминокислот до ны с цитоплазматической стороны мембраны.
При заражении клеток VSV с молекулы его РНК считывается пять разных иРНК. с помощью которых на рибосомах клетки происходит
287
синтез вирм пых Ge ikoi N-бе'юк и M (телок синтезируются па снопе пых ио.шеомах и снизываются с размножившимися молекулами вирусной РНК II с мембраной к ictkii. Синтез G белки происходит на иочтомах ipaiiy.'iHpiioio эндоплазматического ретикулума. В лом _ яучае синтез G-белка также начинается с сип теза «езн нальной» аминокислотной последовательности, которая проходит сквозь мембрану и как бы тине г за собой остальною растущую цепь аминокислот. Однако в отличие от секреторных белков G-бслок остается связанным с мембраной ЭПР. Большая сто часть находится в просвете цистерн ЭПР, где она принимает специфическую конформацию и присоединяет два первичных участка углеводных цепей. Часть молекулы G-бс 1ка погружена и проходит через билипидный слои мембраны, а небольшой участок С конца торчит иа цЛощазматической части мемб
Рис. 170. Схем., развития вируса везикулярного стоматита (VSV) в инфицированной клетке
1 вхожкние вирусной РНК в Метку: 2 - ре*икания вирусной РНК и образование информационной РНК |.Т) вируса; 4 синтез М и N-белков на рибосом.,х цитозоля: 5 синтез О-б|»ка в ИТР (. G-бе.юк на пути кнлазм.п пиеской .мембране: 7- святы гипс N бетка с вирусной РНК; X связывание М-бетка с и 1азма| пиеской мембраной: 9. 10 ог-р.т1ов.тние новой вирусной частицы и выход сё из клетки. I G-белок; II М-ос.юк; 111 - N-баяок
288
раны. Дальнейшая судьба G-белка хорошо прослежена: через 20— 30 мин после синтеза он обнаруживается в составе литеральных бел ков аппарата Гольджи. Здесь происходит дополнительный рост сю углеводных цепей. Пооке его обнаруживают в составе интегральных белков плазматической мембраны.
Из этих экспериментов следует. чго интегральные белки мембран эндоплазматического ретикулума, мембран аппарата Гольджи, секре торных вакуолей и плазматической мембраны имеют одно происхождение: они синтезируются и встраиваются в мембрану в гранулярном ЭПР.
Следовательно. гранулярный эндоплазматический ретикулум представляет собой настоящую «фабрику» клеточных мембран. От того, какие интегральные и периферические белки будут синтезироваться на рибосомах ЭПР и какие фосфолипиды будут здесь синтезироваться и включаться в мембрану, зависит тип образующегося нового участка мембраны: будет ли он компонентом гладкого ЭПР, мембран аппарата Гольджи, лизосомы или плазматической мембраны.
Транспорт между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи
рис. 171. Переходная зона эндоплазматический ретикулум—аппарат Гольджи (ЭПР-АГ)
/ - вакуоль «юг-зоны АГ; 2- ЭПР. 3 рибосомы; 4 - мембршы и вадом. покрытые СОРИ
Дистальные участки гранулярного ЭПР, которые расположены в зоне, приближенной к аппарату' Гольджи (АГ), теряют рибосомы и образуют .мембранные выступы, от которых отпочковываются .мелкие вакуоли, содержащие синтезированные в ЭПР белки. Эта юна называется ЭПР— АГ -промежуточный компартмент (ERGIC), иди везикулярно-тубулярная группа (VTC) (рис. 171). Вакуоли, оттенившиеся в этой зоне от ЭПР, — транзитные элементы. покрыты окаймляющим белковым слоем, аналогичным ю атриновом у
слою эндоцитозных вакуолей. Белки этого слоя также относятся к СОР-белкам, в данном случае отщепляющиеся вакуоли покрыты комплексом СОР II, состоящим из нескольких гетеродимеров, связанных с мембраной посредством белка Sar Ip, малой ГГФазой (рис. 172). Отделившиеся от ЭПР вакуоли становятся
289
Рис. 172. Образование отшспляюшсйся вакуоли
/ - мембране 2- рецепторный белок; 3 белок, связывающий 1ТФ; 4- белки, покрывающие вакуоль
окаймленными пузырьками, затем они теряют белковую оболочку, сливаются друг с другом и транспортируются с помощью микротрубочек к /{мс-зоне аппарата Гольджи, где и сливаются с его мембранами. Адресность и точность слияния любых вакуолей с другими мембранами определяются специальными белками SNARE (рецептор балкон, участвующих в прикреплении и слиянии мембран).
После деполимеризации окаймляющего слоя СОР И на поверхности вакуоли открываются интегральные мембранные белки -V-SNARE. Эти белки специфичны для каждого типа вакуолей, направляя их к тому участку, где они должны слиться с другими мембранами. Там они связываются с мембранными белками Т-SNARE и SNAP25 (рис. 173). В местах взаимодействия этих двух групп белков и происходит слияние мембран. Таким образом происходит транспорт синтезированных белков в зону аппарата Гольджи.
рис. 173. Процесс нахождения транспортной вакуолью (/) мембраны мишени (2). их сближение (5) и слияние (6)
3 бе Юк V-SNARE. 4 - бе «ж T-SNARE
290
Глава 15
АППАРАТ ГОЛЬДЖИ
В 1898 г. итальянским ученый К. Гольджи, используя свойства спя зывания тяжелых металлов (осмия и серебра) с клеточными структу
рами, выявил в нервных клетках сетчатые образования, которые назвал «внутренним сетчатым аппаратом» (рис. 174). Дальнейшее усовершенствование метода окраски металлами (импрегнации) дало возможность убедиться, что сетчатые структуры (аппарат Гольджи) встречаются во всех клетках любых эукариот ных организмов Обычно элементы аппарата Гольджи (АГ) расположены около ядра, вблизи клеточного центра (центриоли). Участки аппарата Гольджи, четко выявляемые методом импрегнации, имели в некоторых клетках вид сложных сетей, где
рис. 174. Внутриклеточный сетчатый аппарат ( Гольджи. IK98)
Рис. 175. Тины аппарата Гольджи „..лживый в клетках спинального
a - сетчатый и кк-тках кишечного эпитоп*; б - ДИФФ'-»’
ганглия. / -ядро; 2- аппарат Гольджи. 3— ядрышко
291
ячейки были спя ыны друг с другом или представлялись я виде отдельных темных участков, лежащих независимо друг от друга (диктносо-мы) и имеющих ни i палочек, зерен, вогнутых дисков и т. д. (рис. 175). Между сегчатом и лнффушой формой аппарата Гольджи нет принципиального различия, так как часто в одних и тех же клетках наблюдается смена форм этого органоида. Элементы аппарата Гольджи часто свяыны с вакуолями, что особенно характерно для секретирующих клеток.
Морфология Al' меняется в зависимости от стадий клеточной секреции. что послужило основанием Д.Н. Насонову (1924) выдвинуть । ипотезу о том. что АГ является органоидом, обеспечивающим сепарацию и накопление веществ в самых различных клетках.
Долгое время в растительных клетках не удавалось обнаружить элементов аппарата Гольджи обычными методами микротехники. Однако с появлением метода электронной микроскопии элементы АГ были выявлены во всех растительных клетках, |дс они расположены по периферии клетки.
Тонкое строение аппарата Гольджи
В электронном микроскопе видно, чго аппарат Гольджи представлен мембранными структурами, собранными вместе в небольшой зоне (рис. 176 и 177). Отдельная зона скопления этих мембран является ликтиосомой (рис. 178). В дпктиосомс плотно друг к другу (на расстоянии 20-25 нм) расположены в виде стопки плоские мембранные мешки. или цистерны, между которыми распола|аются тонкие прослойки гнило плазмы. Каждая отдельная цистерна имеет диаметр около I мкм и переменную толщину; в центре ее мембраны .могут быть сближены (25 нм), а на периферии иметь расширения — ампулы, ширина которых непостоянна. Количество таких мешков в стопке обычно не превышает 5—10. У некоторых одноклеточных их число может достигать 20. Кроме плотно расположенных плоских цистерн в зоне АГ наблюдается множество вакуолей. Мелкие вакуоли встречаются главным образом в периферических участках зоны АГ; иногда видно, как они отшнуровы-ваются от ампулярных расширений на краях плоских цистерн. Принято различать в зоне диктиосомы проксимальный, или формирующийся. цис-участок и дистальный, или зрелый, /и/яшс-участок (см. рис. 178)-Между ними располагается средний, или промежуточный, участок АГ.
Во время деления клеток сетчатые формы АГ распадаются до лнк-тиосо.м. которые пассивно и случайно распределяются по дочерним клеткам. При росте клеток общее количество дик гиосом увеличивается-
В секретирующих клетках обычно АГ поляризован* его проксимальная часть обращена к цитоплазме и ядру, а дистальная — к поверх-292
Рис. 176. Микрофотография аппарата Гольджи (АП. полученная с помошью элск! ровного микроскопа
и — писэсрны АГ н нокроином энигс'1пи ноги прэдопика (фото К.Е 1оиарапкого|;
6 - ликтиосома клегки эвглены (фого А В. Володина)
293
Рис. 177. Схематическое изображение сечения аппарата Гольджи
ностн клетки. В проксимальном участке к стопкам сближенных цистерн примыкает зона мелких гладких пузырьков и коротких мембранных цистерн. В образцах препаративно выделенных зон АГ при негативном контрастировании видно, что к проксимальной части ликтио-сомы при мы кает сете вид пая, или губкообразная, система мембранных полос ген. Считается, что эта система может представлять собой зону перехода элементов ЭПР и зону аппарата Гольджи (рис. 179).
В средней части диктиосомы периферия каждой цистерны также сопровождается массой мелких вакуолей около 50 нм в диаметре.
В дистальном, или тронс-участке диктиосом к последней мембранной плоской цистерне примыкает участок, состоящий из трубчатых элементов и массой мелких вакуолей, часто имеющих фибриллярную опушенность но поверхности со стороны цитоплазмы — это опушенные, или окаймленные, пузырьки такого же гнпа, как и окаймленные пузырьки при пиноиитозе. Это — так называемая /лршгс-сеть аппарата
Рис. 178. Схема строения диктиосомы П - проксимальная ц««) часть: Д - 'метальная (транс) часть; В - вакуоли; U п юскис мембранные цистерны; А - амну (Ярпые расширения цистерн
294
(Мо1^ХепР™96бГ Расти тельной метки
1олыжи (TGN), где происходят разделение и сортировка секретируемых продуктов. Еще дистальнее располагается группа более крупных вакуолей - это уже продукт слияния мелких вакуолей и образования секреторных вакуолей.
При изучении толстых срезов клеток с помощью мегавольтного электронного микроскопа было найдено, что в клетках отдельные диктосомы могут быть связаны друге другом системой вакуолей и цистерн, так что образуется рыхлая трехмерная сеть, выявляемая в световом микроскопе. В случае диффузной формы АГ каждый отдельный его участок представлен диктиосомой. У клеток растений преобладает диффузный тип организации АГ, обычно в среднем на клетку приходится около 20 ликтиосом. В клетках животных часто с зоной мембран аппарата Гольджи ассоциированы центриоли: между радиально отходящих от них пучков микротрубочек лежат группы стопок мембран и вакуолей, которые концентрически окружают клеточный центр. Эта связь, вероятно, отражает участие микротрубочек вдвижении вакуолей.
Секреторная функция аппарата Гольджи
Мембранные элементы АГ участвуют в сегрегации и накоплении продуктов, синтезированных в ЭПР, участвуют в их химических перестройках, созревании: это главным образом перестройка олигосаха-рилных компонентов гликопротеинов в составе водорастворимых секретов или в составе мембран (рис. 180).
В цистернах АГ происходит синтез полисахаридов, их взаимосвязь с белками, приводящая к образованию мукопротеинов. Но главное, с помощью элементов аппарата Гольджи происходит процесс выведения
295
Рис. 180. Схсмз связи гранулярного эндовлазматическогоретикулума (ЭПР), аппарата Гольджи (АГ) с образованием и выделением зимогена из ацинарных клеток поджелудочной железы
/ - переходная зона между ЭПР и АГ; 2 - зона созревания секреторных «ранул;отделившиеся 01 АГзимо1сновые «ранулы; 4 — их выход (экзонитоз) за пределы клс«ки
ютовых секретов за пределы клетки. Кроме того. АГ является источником клеточных лизосом.
Участие АГ в процессах выведения секреторных продуктов было очень хорошо изучено на примере экзокринных кле-гок поджелудочной железы. Для этих клеток характерно на-шчие большого числа секреторных гранул (зимогеноиых гранул), которые представляют собой мембранные пузырьки, заполненные белковым содержимым. В состав белков шмо-геновы.х । ранул входят разнообразные ферменты: протеазы, липазы, карбогидразы, нуклеазы. При секреции содержимое этих зимогеновых гранул выбрасывается из клеток в просвет железы, а затем перетекает в полость кишечника. Так как
основным продуктом, выводимым клетками поджелудочной железы, является белок, то исследовали последовательность включения радиоактивных аминокислот в различные участки клетки (рис. 181). Для этого животным вводили меченную тритием аминокислоту (чН-лейпин) и с помощью электронно-микроскопической радиоавтографии следили во времени за локализацией метки. Оказалось, что через короткий промежуток времени (3—5 мин) метка локализовалась только в базальных участках клеток, богатых |ранулярным ЭПР. Так как метка включалась в белковую цепь во время синтеза белка, то было ясно, что ин в зоне АГ, ни в самих зимогеноиых гранулах синтез белка не происходит, а он синтезируется исключительно в эргастонлазме на рибосомах. Несколько позднее (через 20-40 мин) метка кроме эргастонлазмы была обнаружена в зоне вакуолей АГ. Следовательно, после синтеза в эргастоплазме белок был транспортирован в зону АГ. Еще позднее (через 60 мин) метка обнаруживалась уже и в зоне зи.могеиовы.х «ранул. В дальнейшем метку можно было видеть в просвете ацинусов этой железы. Таким образом, стало ясно, что АГ является промежуточным звеном между собственно синтезом секретируемого белка и выведением его из клетки. Так же подробно процессы синтеза и выведения белков были изучены надРУ"
296
Рис. 181. Последовательность обнаружения (/—4) метки от 3Н-лизина при синтезе и выведении белкового секрета из клетки поджелудочной железы К - кровеносный капилляр; U питон ызма клегки; П - просвет железы. Стрелки показывают пути миграции метки
г,,х клетках (.молочная железа, бокаловидные клетки кишечника, шитовидная железа и др.). Исследованы и морфологические особенности этого процесса. Синтезированный па рибосомах экспортируемый белок отделяется и накапливается внутри цистерн ЭПР. по которым он транспортируется к зоне .мембран АГ. Здесь от гладких участков ЭПР отщепляются .мелкие вакуоли, содержащие синтезированный белок, которые поступают в зону вакуолей в проксимальной части диктиосо-Мы. В этом месте вакуоли могут сливаться друг с другом и с плоскими Чис-цистернами ликтиосомы. Таким способом белковый продукт переносится уже внутри полостей цистерн АГ
297
По мере модификации белков в цис герцах аппарат Гольджи, он» с помощью мелких вакуолей переносятся от цистерн к цистерне в дистальную час и» лнкгиосомы, пока не достигают iрубчатой мембранной сети и трине участке диктиосомы. В этом участке происходит отщепление мелких пузырьков. содержащих уже зрелый продукт. Цитоилазма-тческая поверхность таких пуларьков бывает сходна с поверхностью окаймленных пузырьков, которые наблюдаются при рецепторном ни-ионитозс. Отделившиеся мелкие пузырьки сливаются друг с другом, образуя секреторные вакуоли. После этого секреторные вакуоли начинают двигаться к поверхности клетки, соприкасаются с плазматической мембраной. с которой сливаются их мембраны, и таким образом содержимое этих вакуолей оказывается за пределами клетки. Морфологически этот процесс экструзии (выбрасывания) напоминает пипоцптоз, только с обратной последовательностью стадий. Он носит название экзоцитоз.
Такое описание событий является только общей схемой участия аппарата Гольджи в секреторных процессах. Дело усложняется тем, что одна и та же клетка может участвовать в синтезе многих выделяемых белков, может их друг от друга изолировать и направлять к клеточной поверхности пли же в состав лизосом. В аппарате Гольджи происходит не просто «перекачка» продуктов из одной полости ц другую, но н постепенно идет их «созревание», модификация белков, которая заканчивается «сортировкой» продуктов, направляющихся или к лизосомам, или к плазматической мембране, или к секреторным вакуолям.
Модификация белков в аппарате Гольджи
В цис-зону аппарата Гольджи синтезированные в ЭПР белки попадают после первичного гликозилирования и редукции там же нескольких сахаридны.х остатков. В конечном итоге все белки там имеют одинаковые олнгосахарзщные цепи, состоящие из двух молекул N-aue-тинглюкозамнна и шести молекул маннозы (рис. 182). В цис-цистернах начинается вторичная модификация олигосахаридпых цепей и их сортировка на два класса. В результате олигосахариды на гидролитических ферментах, предназначенных для лизосом (богатые маннозой олигосахариды), фосфорилируются, а олигосахариды других белков, направляемых в секреторные гранулы н.щ к плазматической мембране. подвергаются сложным превращениям, теряя ряд сахаров н присоединяя галактозу. N-ацетилглюкозамин и сиаловые кислоты.
При этом возникает специальный комплекс олигосахаридов. Такие превращения олигосахаридов осуществляются с помощью ферментов — г.тико-зилтраисфсраз, входящих в состав мембран цистерн аппарата Гольджи. Так как каждая зона в ликтиосомах имеет свой набор ферментов гликозплнр®" вания. то гликопротеины как бы по эстафете переносятся из одного мем-
298
Рис. 182. Пути гликозилирования гликолротсидов в аппарате Гольджи а - белки секреторных гран)*л и плазматической мембраны; б - белки лизосом. .Маи •манноза: Леи аспарзпш; Гл - глюкоза; СК сиолокая кислота: Га - Х-ацеппг. но-кешмнн: Гал - галактоза
299
Рис. 183. Локализация ферментов модификации бочков в аппарате Гольджи (АГ)
/ - синтез белка в ЭПР; 2 фосфорил ирона ннс .*1мзосомны\ олигосахаридов; 3 - оииеп-кние маннозы; 4 присоединение N-aite-ти нлюкозаммна: 5 присос гниение маннозы; б - присоединение сиаловой кислоты; 7 сортировка белков на рецепторах в троис-сети, 8 - лизосома; 9 - секреторная вакуоль: 10- илазмалемма
бранною огсска («этажа» н стопке цистерн дикшоеомы) в другой н в каждом подвергаются специфическому воздействию (ферментов. Так. в цис-участке происходит фос формирование манноз нлнзосом-ных ферментах и образуется особая манною-6-фосфатная ipynnn-ровка, характерная для всех гидролитических ферментов, которые потом попадут «лизосомы.
В средней части ликтиосом протекает вторичное гликозилирование секреторных белков: дополнительное удаление маннозы н присоединение N-auc-гилглюкозамина. В тронс-учъ-стке к олигосахарндной цепи присоединяются галактоза и сиаловые кислоты (рис. 183).
Эти данные были получены совершенно разными методами. С помощью дифференциального центрифугирования удалось
получить раздельные более тяжелые (цис-) и более легкие (транс ) компоненты аппарата Гольджи и определить в них наличие гликозидаз и их продуктов. В то же время, используя моноклональные антитела к различным ферментам, с помощью электронной микроскопии удалось их локализовать прямо на срезах клеток.
В ряде специализированных клеток в аппарате Гольджи осуществляется синтез собственно полисахаридов.
В аппарате Гольджи растительных клеток происходит синтез полисахаридов матрикса клеточной стенки (гемицеллюлозы, пектины). Кроме того, диктиосомы растительных клеток участвуют в синтезе и выделении слизей и муцинов, в состав которых входят также полисахариды. Синтез же основного каркасного полисахарида растительных клеточных стенок целлюлозы, происходит, как уже говорилось, на поверхности плазматической мембраны.
В аппарате Гольджи клеток животных осуществляется синтез длинных нсразветвленных полисахаридных цепей глюкозаминогликанов-Один из них — гиалуроновая кислота, входящая в состав внеклеточного матрикса соединительной ткани, содержит несколько тысяч повторяющихся лисахаритных блоков. Многие гликозаминогликаны кова-leiiTHO связаны с белками и образуют протеогликаны (муконротсн-
300
1H.I). Такие полисахаридные пени модифицируются ваппарате Гаиожи и связываются с белками, коюрые в виде прозеогтиканов секретиру ются клетками. В аппарате Гольджи происходит также сульфат ировд лие глюкозам и ном и каков и некоторых белков.
Сортировка белков в аппарате Гольджи
И гак. через аппарат Гольджи проходят, по крайней мерс, три потока синтезированных клеткой ненитозольных белков: поток гидролитических ферментов » комнартмент лизисом: поток выделяемых белков, которые накапливаются и секреторных вакуолях и выделяются из клетки только по получении специальных сигналов: поток постоянно выделяемых секреторных белков. Следовательно, должен быть какой-то специальный механизм пространстве иного разделения этих разных белков и их путей следования.
В цис- и средних зонах ликтиосом все эти белки идут вместе без разделения. они только раздельно модифицируются в зависимости от их олигосахарилных маркеров.
Собственно разделение белков, их сортировка, происходит в лгрт/нс-участкс аппарата Гольджи. Этот процесс не до конца расшифрован, но на примере сортировки лизосомных ферментов можно понять принцип отбора определенных белковых .молекул (рис. 184).
Рис. 184. Сортировка кислых гидролаз в<« - псрС|ЮС ь транс-сстъ А) / - iiociyiuiCHHc iM.'ipoaai из ЭПР; 2- фоефори ’ $ первичная шзосома; 7-
4 - связывание с рецептором: 5 - ioaip»n,0,v _ дмссо1ныиия or рецептора; 9 объединение со «поротной аизосочои, < / 7/ в0ЯфЛт (репикшзания)
лсфосфорияирование; Ш активированная -«npowa.
ренет оров
301
И ihcciho. чк> только бел ки-нрсдшествсн инки лиюсомиых пиро-кв имеют специфическую олшосахарилиую. а именно маннозную, грунт*. В -цистернах эти группировки фосфорилируются и дальше вместе с друз ими белками переносятся ог цистерны к цистерне через среднюю юиу в/я/юис-участок. Мембраны транс-сети аппарата Гольджи содержат трансмембранный бе л ок-ре нс и гор (манноза-б-фосфат-ныи рецептор, или М-6-Ф-рецептор), который узнает фосфорилированные маннозные ipyiiniipoBKH олигосахарндной цепи лпзосомны.х ферментов п связывается с ними. Это связывание происходит при нейтральных значениях pH внутри цистерн /пргше-сети. На мембранах эти М-6-Ф-ренснторныс белки образую! кластеры — группы, которые концентрируются в зонах образования мелких пузырьков, покрытых клатрнном. В транс-сстн аппарата Гольджи происходят их отделение, отпочковыванис н дальнейший перенос к эндосомам. Следовательно, М-6-Ф-рецепторы, являясь трансмембранными белками, связываясь с яизосомными !и Пролазами, отделяют их (отсортировывают) от других белков (например, секреторных, нслизосомных) и концентрируют их в окаймленных пузырьках. Оторвавшись от /лрдлс-сети, эти пузырьки быстро теряют клатриновую «шубу», сливаются с эндосомами, перенося свои лизосомиые ферменты, связанные с мембранными рецепторами, в эту вакуоль. Как уже говорилось, внутри эндосом из-за активности протонного переносчика происходит закисление среды. Начиная с pH 6 гнзосомные ферменты отделяются от М-6-Ф-рс-цепторов, активируются и начинают работать в полости эндолизосомы. Участки же мембран вместе с М-б-Ф-рецепторами возвращаются путем рсциклнзации мембранных пузырьков обратно в тринс-сегъ аппарата Гольджи.
Вероятнее всего, что та часть белков, которая накапливается в секреторных вакуолях и выводится из клетки после поступления сигнала (например, нервного или гормонального), проходит такую же процедуру отбора (сортировки) на рецепторах транс-цистерн аппарата Гольджи. Эти секреторные белки попадают сначала в .мелкие вакуоли, тоже одетые клатрнном, которые затем сливаются друг с другом. В секреторных вакуолях часто происходит агрегация накопленных белков в виде плотных секреторных гранул. Это приводит к повышению концентрации белка в этих вакуолях примерно в 200 раз по сравнению с его концентрацией и аппарате Гольджи. Затем эти белки по мере накопления в секреторных вакуолях выбрасываются из клетки путем эк-зонптоза после получения клеткой соответствующего сигнала.
От аппарата Гольджи исходит и третий поток вакуолей, связанный с постоянной (конститутивной) секрецией. Так, фибробласты выделяют большое количество гликопротеидов и муцинов, входящих в основное вещество соединительной ткани. Многие клетки постоянно выделяют оелки, способствующие связыванию их с субстратами- К
302
поверхности клетки беспрерывно илег по,ок мембранных пузырьков, несущих элементы гликокаликса и мембранных гликопротеидов. Этот ноток выделяемых клеткой компонентов нс подлежит сортировке в рецепторной троне-системе аппарата Гольджи. Первичные вакуоли этого потока также отщепляются от мембран АГ н относятся по своей структуре к окаймленным вакуолям, содержащим клатрнн (рис. 1Я5).
Заканчивая рассмотрение строения и работы такой сложной мембранной органеллы, как аппарат Гольджи, необходимо подчеркнуть, что. несмотря на кажущуюся морфологическую однородность его компонентов, вакуоли и цистерны, на самом деле, это не просто скопите пузырьков, а стройная, динамичная, сложно организованная, поляризованная система.
В АГ происходит не только транспорт везикул от ЭПР к плазматической мембране. Существует ретроградный перенос везикул. Так, от вторичных лизосом отщепляются вакуоли и возвращаются вместе с рецепторными белками в зону транс-М. Кроме того, существует поток вакуолей от трдлс-зоны к цис-зоне АГ, а также от 41/с-зоны к эндоплазматическому ретикулуму. В этих случаях вакуоли одеты белками СОР 1-комплекса. Считается, что таким путем возвращаются различные
" нАпм аппарат Гольджи (АГ) Рис. 185. Три потока транспорта быков ере реолиря-мой
I ,к, „сочный поток; 2 - коток косовиной «креп секреции
303
Рис. 186. Модели транспорта продуктов в аппарате Гольджи (АГ)
а - модель стабильных комнартментов; б - модель созревания цистерн АГ. 1 -секретируемые белки: 2 - постоянные ферменты АГ; 3 — перенос к эн иконам; 4, 5 -перенос к плазматической мембране; / ЭПР АГ-ко.мплскс; II - цис-участок АГ; 1/1 промежуточный участок АГ; /И л>/ш//с-уч.1сток АГ; V- трат -АГ-ссть
ферменты вторичного гликозилирования и рецепторные белки в составе мембран.
Эти особенности поведения транспортных везикул дали основу гипотезе о существовании двух типов транспорта компонентов АГ (рис. 186).
По одному из них, наиболее старому, в АГ существуют стабильные мембранные компоненты, к которым от ЭПР эстафстно переносятся веществ*! с помощью транспортных вакуолей. По альтернативной мо-дели. АГ является динамическим производным ЭПР‘. оттенившиеся or ЭПР мембранные вакуоли сливаются друг с другом в новую цис-цистерну, которая затем продвигается через всю зону АГ и в копие распадается на транспортные везикулы. По этой модели, ретроградные СОР I-везикулы возвращают постоянные белки АГ в более молодые цистерны. Таким образом, предполагается, что переходная зона ЭПР представляет собой «родильный дом» для аппарата Гольджи.
304
Глава 16
лизосомы
О лизосомах уже упоминалось в разделах, посвя'шеииых энлоцито зу и аппарату Гольлжи.Начичие лизосом разного типа в клетках огоа жаст процесс переноса гидролитических ферментов, необходимых для внутриклеточного расщепления экзогенных (энзопитоз) или эндоген ных (аутофагонито J) полимеров, процесс секреции, но как бы наврав-ленный «внутрь» клетки.
Сходство лизосомных вакуолей с секреторными находит свое отражение не только в общности их происхождения, но иногда и в общности конечного этапа их активности. В некоторых случаях лизосомы могуч подходить к плазматической мембране и выбрасывать свое содержимое в наружную среду. Так, у клеток гриба нейросиоры лизосомы, выбрасывая гидролазы из клетки, обеспечивают внеклеточный протеолиз. Возможно, что часть лизосом макрофагов таким же образом обеспечивает внеклеточный гидролиз при воспалительных и резорбционных процессах. При оплодотворении акросома спермия вакуоль, аналогичная лизосоме и содержащая гидролитические ферменты гиалуронидазу н протеазы, сливается с плазматической мембраной спермия и изливается на поверхность яйцеклетки. Освободившиеся из вакуоли ферменты расщепляют полисахаридные и белковые оболочки ооцита, давая возможность слиться двум половым клеткам.
Лизосомы не представляют собой в клетках самостоятельные структуры, они образуются за счет активности эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи и в этом отношении напоминают секреторные вакуоли. Основная их роль заключается в участии в процессах внутриклеточного расщепления как экзогенных, таки экзогенных биологических макромолекул.
Общая характеристика лизосом
Лизосомы как мембранные впугриклеточные частицы были открыты биохимиками (Де Дюв. 1955). При изучении легкой полфрак-ЦНИ макросом из го.могенатои печени крысы оы.то найдено,‘ подфракция (и отличие от основной фракции .к11х л)Ср.
рнальной фракции) обладает группой кислых гидр оты по.
ментов (гидролаз), расщепляющих белки, нуклеи о , <• ’
-сахариды и липиды. Создалось
Держатся в особого рода цитоплазма! i проявляют свою
Оказалось, что ферменты вшы^тся по-
активность только в том случае, если р
305
вреж (симе самих, лизосом либо во vie Не гинем осмотического шока пли детергентов, г ибо замораживанием и оттаиванием препаратов. На основании этого бы ю еде. за но заключение, чго лизосомы окружены липопротеидной мембраной, которая препятствует доступу на-холящихся снаружи субстратов к ферментам, находящимся внутри
1ИЗОСОМ-
Характерной чертой лизосом является то, что они содержат около 40 г пиролитических ферментов: протеиназы, нуклеазы, гликозидазы, фосфоритазы. фосфатазы, сульфатазы, оптимум действия которых осуществляется при pH 5. В лизосомах кислое значение среды создастся из-за наличия в их мембранах Н -помпы, зависимой от АТФ. Кроме того, в мембраны лизосом встроены бел к и-переносчики для транспорта из лизосом в гиалоплазму продуктов гидролиза: мономеров расщепленных молекул - аминокислот, сахаров, нуклеотидов и липидов. При озпаком гении с работой лизосом всегда возникает вопрос: почему же эти мембранные образования не переваривают сами себя? Вероятнее всего, мембранные элементы лизосом защищены от действия кислых гидролаз олнгосахариднымн участками, которые или нс узнаются лизосомными ферментами, либо просто мешают гидролазам взаимодействовать с ними. Так или иначе мембранные компоненты лизосом очень устойчивы к гидролазам, содержащимся внутри лизосом-ных пузырьков.
Наличие некоторых гидролаз можно выявить гистохимическими методами. Так, одной из характерных гидролаз, выявляемых с помощью как светового, так и электронного микроскопа, служит кислая фосфатаза, по наличию которой можно четко определить, является тот или иной мембранный пузырек лизосомой.
Под электронным микроскопом видно, что фракция лизосом состоит из очень пестрого класса пузырьков размером 0,2-0,4 мкм (для клеток печени), ограниченных одиночной мембраной (толщина ее около 7 нм), с очень разнородным содержанием внутри (рис. 187 и 188). Во фракции лизосом встречаются пузырьки с гомогенным, бесструктурным содержимым, а также пузырьки, заполненные плотным веществом, содержащим в свою очередь вакуоли, скопления мембран и плотных однородных частиц. Часто можно видеть внутри лизосом не только участки мембран, по и фрагменты митохондрий и ЭПР. Иными слонами, эта фракция по морфологии оказалась крайне неоднородной. несмотря на постоянство присутствия гидролаз.
Сходные по морфологии частицы были описаны еще ранее в разных тканях многих животных. Однако цитологи не могли выяснить функциональные значения этих полиморфных частиц. И только сочетание биохимических, цитохимических и электронно-микроскопических методов исследований позволило достаточно подробно разо-
306
Рис. 187. Вторичные лизосомы в клетках культуры СП ЭВ / - лизосомы; 2 - жировые капли
307
Рис. 188. Гетерогенность вторичных лизосом
браться в строении, происхождении и функционировании клеточных лизосом.
Морфологическая неоднородность лизосом
Бы ю обнаружено, что среди различных по морфологии лизосомных частиц можно выделить по крайней мере четыре типа: первичные лизосомы, вторичные лизосомы, аутофагосомы и остаточные тельца (рис. 189). Пестрота же морфологии лизосом вызвана тем. что эти частицы участвуют в процессах внутриклеточного переваривания, образуют сложные пищеварительные вакуоли как экзогенного (внеклеточного), так и эндогенного происхождения.
Первичные лизосомы представляют собой мелкие мембранные пузырьки размером около 100 им. заполненные бесструктурным веществом. содержащим набор гидролаз, в том числе кислую фосфатазу — маркерный для лизосом фермент. Эти .мелкие вакуоли — первичные лизосомы, практически очень трудно отличить от мелких вакуолей на периферии зоны аппарата Гольджи. Часть из них несет клатриновую
308
Рис. 189. Образование лизосом и их участие в клеточных процессах
/ - синтез пиролитических ферментов в ЭПР; 2 - переход их в АГ; 3- образование первичных лизосом; 4 - выброс и использование (5) гидролаз при внеклеточном расщеплении; б— экдонитозкые вакуоли: 7- слияние с ними первичных лизосом; 8-образование вторичных лизосом; 9- те.юлизосомы: 10- экскреция остаточных телек. И - первичные лизосомы принимают участие в образовании антофагосомы (/2)
оболочку. Более того, вакуоли этой периферической части также содержат кислую фосфатазу. Прослеживая процесс синтеза и лок ти зпцию этого фермента в клетках, нашли, что местом его синтез .• следовало ожидать, является гранулярный ретикулум. атем• •мент появляется в проксимальных участках днктиосом.
мелких вакуолях по периферии диктиосомы и, након ’ лизосом первичных люосомак Весь ..уть образо^ния перни- ,п ли^ом очень сходен с образованием .имогеновых гранр “ выбрасывания из лочнои железы, за исключением последнего э
клетки.
3U9
С помощью ря ли точных экспериментов усцшовили, чго в дальнейшем первичные пвосомы сливаются с фагоцитарными, или пиноци-нвными. вакуолями шдосомами, образуя вторичную лизосому, или внчтрнк icio4!ivio riiniieiupine ihiivio вакуоль При этом содержимое первичной лизосомы сливается с полостью эндоцитоjiioii вакуоли, и nt цчъызы первичной лизосомы получают доступ к субстратам, которые они и начинают расщеплять.
При слиянии первичной лизосомы с эидонитозиой вакуолью происходит диссоциация комплексов М-6-Ф-ре псп гор гидролаза вследствие кислой среды внутри вторичной лизосомы. Затем уже свободный фермент после потери фосфатной группы активируется и вступает в работу. Освоболившиеся мембранные рецепторы переходят в мелкие пузырьки, отщепляющиеся от вторичной лизосомы, и ухолят снова в /и/м/ис-участок аппарата Гольджи, г. е. осуществилоich их рецикдн-запия (см. рис. 184).
Процесс слияния первичных лизосом с энлоиито зными вакуолями прослежен очень подробно. Так. если ввести в организм мыши чужеродный белок пероксидазу, то она начинает накапливаться в эндоцн-гозных вакуолях. С помощью гистохимической реакции можно выявить пероксидазу в таких вакуолях с помощью электронного микроскопа. Бы'го замечено, что к этим вакуолям подходят первичные лизосомы. обладающие кислой фосфатазой, продукты активности которой также выявляются гистохимнческн. Затем происходит слияние мембран вакуолей, и в слившемся объеме новой вакуоли обнаруживается как пероксидазная, так и фосфагазная активность. По своей морфологии такая вакуоль представляет собой лизосому, содержащую компоненты, захваченные в процессе эндонмтоза. Это вторичная лизосома. Разнообразие но величине и по структуре клеточных лизосом связано в первую очередь с разнообразием вторичных лизосом - продуктов слияния эндоиитозных вакуолей с первичными лизосомами. Таким образом, ито'ричные лизосомы представляют собой нс что иное, как внутриклеточные пищеварительные вакуоли, ферменты которых доставлены с помощью мелких первичных лизосом. Поэтому от типа поглощенных веществ или частичек зависят размер и внутренняя структура таких лизосом.
Лизосомы могут сливаться друг с другом и таким путем увеличиваться в объеме, при этом усложняется их внутренняя структура. Так, добавляя в среду; где находится культура ткани, коллоидное железо, можно видеть, как его частички (хорошо выявляемые в электронном микроскопе) сначала появляются в фагонитозных вакуолях, а затем обнаруживаются во вюричпых лизосомах. Если через некоторое время снова клетке дать инородное вещество, например коллоидное золо-то (частички которого отличаются по морфологии от частиц коллоидною железа), то динамика его появления в лизосомах будет такая же.
310
Но появятся лизосомы. одновременно содержащие лоилиого железа, так и коллоидного золоти.
гранулы как кол
ПОГ1ОШСН11ЫС биогенные вещества. попавшие в состав зизосомы расщепляются гидролазами до мознхмеров, которыетранспортХ? ся через мембрану лнзосо.мы в состав гиадоилазмы. где они тируются, включаются в различные синтетические и обменные и'оо цессы. 1
Кроме участия в переваривании возложенных частиц и растворов лизосомы могут израть роль внутриклеточных структур, н-зменяюшнх клеточные продукты. Так. в клетках щитовидной железы в ЭПРсинте-зируется тззроглобулии - белок предшественник тирозщного гормона. Тироглобулззн с помощью АГ выводится из клегок в полость фоллику-лозз щитовидной железы. Нрзз гормональной стимуляции исыироваи-нызз тироглобу.шзз снова попадает зз железистую клетку путем пиноци-тоза. Пипоинтозпые вакуоли, содержащие тироглобулззн. сливаются с первичными лнзосо.мамн. ферменты которых вызывают частичнызз гидролиз тироз лобулизза. приводящий к образованию тироксина - ти-розздззого гормона, который затем выводится из клетки, секретируется
в попадает в кровеносное русло.
Однако расщепление, переваривание биогенных макромолекул внутри лизосом может идти в ряде клеток не до конца. В этом случае в полостях лизосом накапливаются непереваренные продукты зз осу шеетвляется переход вторичных лизосом в те.зотизосомы. или остаточные тельца. Остаточные тельца уже со зержат меньше гидролитических фермой гов, в них происходит уплотнение содержимого, его перестройка. Часто в остаточных тельцах наблюдается вторичная структуризация непере варенных липидов, которые образуют сложные слоистые структуры. Там же откладываются пигментные вещества. У человека при старении организма в клетках мозга, печени и в мышеч ных волокнах в тслолнзосома.х происходит отложение «пигмента ста-
рения» - липофусцина.
Аутолизоеомы (аутофагосомы) постоянно везречаются в простейших, растений и животных. По своей морфологии к вторичным ли зосомам, но с тем отличием, что в составе :. -
лей встречаются фрагменты или лаже целые цитопла структуры, такие как митохондрии, пластиды. азсмснтыеше МЫ. гранулы гликогена и т. д. Процесс образования недостаточно ясен. По одним представлениям. пери з зруГ с могут выстраиваться вокруг клеточной °Ргани“'“' ов цитоплазмы: зругом зз таким образом отделять ее от соседзп • . ННЬ1М внутри участок оказывается отделенным меморанои
такой сложной лизосомы (см. рис. 189). |тОза связан с отбором
Есть предположение, что процесс а>тофа,о“* ныЛ компонентов, и уничтожением измененных, «сломан»ых* **
В пом с iviae лизосомы выполняют роль внутриклеточных чистиль-iiihkob. копгро.1ирмо1них дефектные структуры. Гакой автофатипол-нертлются митохондрии печени, где время житии отдельной митохондрии составляет Юлией Интересно, что в нормальных условиях чисто аутофаюсом увеличивается при метаболических стрессах ( например. при гормональной индукции активности клеток печени). Значительно возрастает число аутофагосом ттртт различных повреждениях клеток; в этом случае автофагоцитозу могут подвергаться целые зоны внутри клеток
Лизосомные патологии
Увеличение числа лизосом в клетках при патологических процессах - обычное явление. На его основе возникло представление о том, что лизосомы могут трать активную роль при тибели клеток. Однако в большинстве случаев смерти клетки не предшествовало освобождение гидролаз из лизосом. Более того, даже при ра трыве мембраны лизосомные гидролазы должны терять свою активность, попадая в цитоплазму с нейтральным значением pH. Ферменты лизосом, несомненно. участвуют в автолизе погибших клеток, по скорее всего это вторичное явление, а нс причина гибели самих клеток.
Существует ряд врожденных заболеваний, которые называют лизо-сомнымн «болезнями накопления». Отличительным признаком этих болезней является то, что под световым микроскопом в клетках наблюдается множество вакуолей. Например, при болезни Помпе происходит накопление гликогена в лизосомах, где он не расщепляется из-за отсутствия у таких больных фермента кислой а-гликозидазы. Многие «болезни накопления» возникают вследствие первичной генной мутации, приво шшей к потере активности отдельных ферментов, участвующих в функционировании лизосом.
Сейчас, к сожалению, известно уже более 25 таких генетических заболевании, связанных с патологией лизосом.
Глава 17
ГЛАДКИЙ РЕТИКУЛУМ И ДРУГИЕ МЕМБРАННЫЕ ВАКУОЛИ
Гладкий (агранулярный) эндоплазматический ретикулум
Гладкий ЭПР представляет собой часть мембранной вакуолярнон системы. В морфологическом отношении он также представлен .мембранами, образующими мелкие вакуоли и трубки, канальцы, которые могут ветвиться, с шваться друг с другом. В отличие от гранулярного
312
Рис. 190. Зона гладкого ретикулума в интерстициальных клетках надпочечника
на мембранах гладкого ЭПР нет рибосом (рис. J90). Диаметр вакуолей и канальцев гладкого ЭПР обычно около 50—ЮО нм. Выраженность сети из этих мембранных элементов может быть неодинаковой как для различных клеток, так и внутри одной клетки. Большей частью такие гладкие канальцы образуют скопления, или зоны. Так, в клетках эпителия кишечника гладкий ЭПР локализуется главным образом в апикальной. верхней части клетки, вблизи всасывающей поверхности. В клетках печен и зоны гладкого ЭП Р часто связаны с местами отложс ния гликогена. Встречаются клетки, где гладкий ЭПР занимает ль Шую часть объема цитоплазмы (например, в интерстициальных kwt семенника, в растительных железистых терпсноидогенных юктк ^
Неоднократно была установлена непрерывность пере« _ гладкой формой ЭП Р и гранулярной его формой. Часто
Дать, как цистерна гранулярного ЭПР теряет на свое» по участок босомы и становится /гладкой. (рис. 191). Прп этом °*
Цистерны делается неровным, начинает как бы в01™] ,вают пе-трубочки и канальны гладкого ЭПР. Этот участок ч» отделяются реходным из-за того, что именно здесь ооразт ниЫебелм!й транспортные пузырьки, переносящие HOB“121JC яется вторичным липиды к зоне аппарата Гольлжи Гладкий последнего
п° отношению к гранулярному ЭПР. т.е. происх образуется Гак, у крысенка перед рождением в печеночнь пожтеиия по-болытюе количество гранулярного ЭПР. носра у
313
Рис. 191. Переход гранулярного эндопла {магического pci пкулума в гладкий в печеночной клетке
является масса трубочек гладкого ЭПР. Ряд биохимических, морфологических и радиоавтотрафвчсских данных приводит к заключению, что гранулярный ЭПР увеличивается н объеме, растет за счет синтезирующихся мембран, которые остаются в его составе, пли. потеряв рибосомы, превращается в гладкий ЭПР. Например, при использовании радиоактивных предшественников мембранных компонентов и яри получении отдельных фракций гладкого и гранулярного ЭПРбы.юоб-нархжено. что при интенсивном разрастании гладкого ЭПР метка вначале появляется в гранулярном ЭП Р и только спустя некоторое время -в гладком ЭПР.
Несмотря на топографическую связь и общность происхождения, эти два представителя ЭПР резко отличаются друг ог друга в функциональном отношении. Как уже указывалось, отсутствие рибосом на гладком ЭПР прямо говорит о его непричастности к синтезу белков. Деятельность г галкого ЭПР скорее можно связать с метаболи змом липидов и некоторых внутриклеточных полисахаридов.
Участие гладкого ЭПР в синтезе триглицеридов и липидов было показано при и «учении процессов всасывания жиров клетками кишечного эпителия. В просвете кишечника жиры распадаются до жирных кислот и моно1лицерилои. В апикальных участках клеток кишечника ВИ 1НО при этом накопление осмиофильиых гранул внутри просветов канальцев глашого ЭПР. Эго связано с ресинтезом новых rpu-г.шиеридов из поступивших в клетку предшественников с образованием липидов и липопротеидов. которые с помощью вакуолей аппарата Го и,лжи выводятся из клеток и попадают в лимфатическое русло.
314
Мелкие капли липинов иногда в комплексе с белками можно наблюдать и в клетках печени, причем эти кап ш встречаются в полостях гладкого ЭПР около юны аппарата Гольджи. Если крысам давать вещества. приводящие к образованию отложений больших капель жира (жировая дистрофия), то первые мелкие липидные капельки появляются в i лад ком ЭПР, но иногда и в полостях гранулярного ЭПР.
Гладким ЭПР особенно в большом объеме встречается в клетках, секретирующих стероиды, н час । мости в клетках коркового вещества надпочечника. Основные ферменты синтеза стероидов были обнаружены во фракциях микросом, образовавшихся при разрушении гладкого ЭПР из этих клеток. Гладким ретикулумом богаты интерстициальные клетки семенников, участвующие в синтезе стероидных юрмонов. а также клетки сальных желез в самом начале накопления жира.
Тесная tohoiрафическая связь гладкого ЭПРс отложениями гликогена (запасного внутриклеточного полисахарида животных и грибов) в гиалонлазме различных клеток говорит о его участии в метаболизме углеводов. В клетках печени, в мышечных волокнах гликоген откладывается в тонах, свободных от гранулярных цистерн ЭПР. но богатых пузырьками и канальцами гладкого ЭПР. Такие зоны гладкого ЭПР могут увеличиваться в размере как при исчезновении гликогена (например, при голодании), так и при увеличении его отложений (рис. 192 и 193).
В печени часто увеличение зон гладкого ЭПР связано с рядом патологических процессов в клетках. Так. при барбитуратных отравлениях, при действии различных канцерогенов или ядовитых веществ, при действии больших доз гормональных препаратов клетки печени теряют характерную для них базофилию цитоплазмы, в них падает содержание РНК и в цитоплазме появляются оксифильные зоны. В элек-
тронном микроскопе эти зоны представлены скоплениями гладкого ЭПР. Это явление связано с тем, чго в этих местах про исходят процессы деградации различных вредных веществ, процессы метаболической дез активации, которые осуществляются целым рядом окислительных ферментов, из которых наиболее известен белок, называемый цитохром ^-450. Этот белок участвует в присоединении гидроксильной группы к различным, потенциально опасным во.тонерасгворнмым угле-
М
Рис. 192. Отложение гликогена (Г) в юне гладкого эндоплазматического рстикхл)мз (ЭПР) гепатоцита
М - ммюхоидрин
315
I I
I
I
I
I I
I
Рис. 193. Зона мелких вакуолей гладкого эндоплазматического рстикулУ*181 гранулы гликогена в клетке печени мыши
В - вакуоли: Г - никем си: М митохондрии
316
Рис. 194. Ечадкий эндоплазматический ретикулум (саркоплазматический) в скелетных мышцах (по: Fawsen, McNuu. 1969)
° - на срезе; б - модель. Ф - миофибрпллы: М - мигохоинрии; ПМ - лтазматнчсская мембрана; 1 трабекулярные мембраны; СР - саркоплазматический ретикулум: 7 Z-нолоска
во юродам или к липофильным ядовитым веществам (например, че-чырехх.чористыи углерод), попадающим в мембранный бислои. Здесь Же другие ферменты добавляют к этим гидроксильным группам отрицательно заряженные молекулы (сульфат, глюкуроновая кислота), что делает метаболиты или вредные липофильные вещества растворимыми в воде, из-за чего они .могут выводиться из организма вместе с мочой. Разросшийся гладким ЭПР в клетках печени после удаления токсического вещества уничтожается, вероятно, с помошьюлизосом - антофа-госо.м.
В поперечно-полосатых мышцах вакуоли и каналы гладкого ЭПР (саркоплазматический ретикулум) окружают каждую мнофибриллу (рис. 194). Здесь ЭПР выполняет специальную функцию депонирования ионов кальция. В присутствии АТФ он может активно погтошать и накапливать ноны кальция, чго приводит к расслаблению мышечного волокна. Белки кальциевого насоса являются интегральными бейками мембран саркоплазматического ретикулума.
3(7
( pi nt высших плоении гладкий ретикулум встречается в клетках тканей, участвующих в chiitctc и транспорте терпенов, стероидов в НТ1НЫОИ.
Вакуоли растительных клеток
Метки как низших. так и высших растительных ортанизмовсодержат в цитоплазме вакуоли, несущие ряд важных физиологических нагрузок (рис. 195). У молодых кле ток может быть несколько мелких вакуолей, которые ио мере роста и дифференцировки клетки сливаются труте другом и образуют одну или несколько крупных вакуолей. занимающих до 90% объема всей клетки. Эти центральные вакуоли отделены от цитоплазмы одинарной мембраной, сходной по толщине с плаз-малеммой. Мембрана, от раннчннаюцтая центральные вакуоли, иосит название тонопласта. Центральные вакуоли обра зуются из мелких пузырьков, оттенившихся от аппарата Гольджи. Такне первичные вакуоли растут в объеме, сливаются друг с другом и в конце концов образу-
Рис. 395. Центральные вакуоли (ЦВ) в клетке меристемы корня (й) 11 в мс юфиле листа (6)
Я - ядро: В - вакуоли: ХП - хлоропласт
318
Ю1 одну или несколько крупных вакуолей, оттесняющих интопъвмус ядром и органоидами к периферии клетки. Полость вакуоли тапотне на гак называемым клеточным соком. представляющим собой водный раствор, в ко горни входят различные неорганические сопи сахара опта пические кислоты и ><х соли и другие низкоматекуляриые со<ы.гиеиия а также некоторые высокомолекулярные вещества (например, белки)
Центральные вакуоли растений выполняют многообразные и важные функции. Одной из главных их функций является поддержание тургорного давления клеток. Растворенные в соке вакуолей молекулы определяют его осмотическую конвентранию. Соответствующая мо-лскулярная концентрация сока вакуолей и полупроницаемые свойства как ее мембраны (тонопласта), так и плазмалем.мы способствуют тому, что вакуоли функционируют в качестве осмометра и придают клетке необходимую и|Х)чиость и тургнспентность (напряженность).
Другая функция определяется тем. чго вакуоль представляет собой большую полость, отделенную от метаболизирую! в ей гиалоплазмы мембраной (тонопластом), обладающем свойствами гиыу проницаемости. Через нее, как и через плазматическую мембрану, может идти активный транспорт различных молекул. В тонопласте обнаружен АТФ-зависимый Н 1 -насос, направленный внутрь вакуолей и участвуювшй в транспорте сахаров. Поэтому вакуоли могут" использоваться клетками в качестве накопительных резервуаров, где не только откладывают -ся запасные вещества, но и собираю!ся метаболиты, предназначенные для экскреции. Так выводятся (секретируются) из клетки все водорастворимые метаболиты. Нерастворимые в воде органические компоненты могут превращаться в растворимые глюкозиды, соединяясь с .молекулами сахаров. Перечень экскретируемых в вакуоли метаболитов очень обширен. Это различные алкалоиды (например, никотин, кофеин) и полвфеполы. В вакуолях происходит отложение многих глюкозидов, к которым относятся различные пт менты, например антоцианы.
Из неорганических веществ в вакуоляриом соке накапливаются фосфаты калия. натрия, кальция, могут запасаться соли органических кислот (оксалаты, цитраты и яр.). Это при тает вакуоляриому соку отчетливую кислую реакцию (pH от 2 до 5). Таким образом, можно считать. что тонопласт участвует в процессах экскреции.
Другой обширный ряд функций вакуолей связан с накоплением запасных веществ, таких как сахара и белки. Сахара в вакуолях солер жатся в виде растворов, встречаются и резервные полисахариды типа инулина. Ji вакуолях откладываются запасные белки. что характерно для семян. Поступление белков в вакуоли, вероятнее всею, связано со способностью вакуолей ЭН Р и АГ сливат ься с тонопластом. Запасание белков семян злаковых происходит в так называемых алейроновых вакуолях, которые заполняются альбуминами и глобулинами, после чего вакуоли обезвоживаются, превращаясь в твердые алейроновые зерна.
319
При прорастании семян ни зерна обводняются и снопа превращаются и вакуоли. И таких новообразованных вакуолях выявляется активное ib некоторых ферментов; кислой фосфатазы, ос-амилазы, глюкози-ызы. протеина >ы и РНКазы. Следовательно, алейроновые вакуоли отчасти напоминают лизосомы, где происходит переваривание запасных бе жов при прорнстатши семян.
Iилрочитичеекие ферменты были ооиаружскы не только в алейроновых вакуолях. но в мелких и крупных нейтральных вакуолях. Наблюдалась неоднократно инвагинация (впячивание) тонопласта внутрь вакуолей, при этом часть .-втянутого» материала оказывалась в полости вакуоли и там дегралировала. Возможно, так выполняется аутофагическая функция вакуолей, участвующих в гидролизе дефектных клеточных компонентов. Лизосомными свойствами обладают вакуоли дрожжей. Обнаружено, что стенки вакуолей дрожжей тоже могут образовывать внячивания внутрь, затем они отщепляются от тонопласта и растворяются внутри вакуоли.
Сферосомы
Это мембранные пузырьки, встречающиеся в клетках растений. Они окрашиваются липофильными красителями, имеют высокий коэффициент преломления и поэтому хорошо видны под световым микроскопом. Сферосомы образуются из элементов эндоплазматического ретикулума. На конце цистерны ЭПР начинает накапливаться осмио-фвльный материал, затем от этого участка отшнуровывается и начинает расти мелкий пузырек, достигающий диаметра 0,1-0,5 мкм. Это «просферосома», окруженная одинарной мембраной. Рост сферосом и перестройка их содержимого связаны с накоплением в них масла, так чтосферосома постепенно превращается в масляную каплю. Отложение липидов начинается между осмиофилызыми слоями мембраны. Кроме жиров в составе сферосом обнаруживают белки и среди них фермент липазу, расщепляющую липиды.
Пероксисомы (микротельца)
Это небольшие вакуоли (0,3—1 5 мкм), одетые одинарной мембраной. отграничивающей гранулярный матрикс, в центре которого располагается сердцевина, или нуклеоид (ничего не имеющий обще! о с нуклеоидом бактерий и вообще к ядерным структурам не относящийся).
В зоне сердцевины часто, особенно в пероксисомах печеночных клеток, видны кристаллополобные структуры, состоящие из регулярно упакованных фибрилл, или трубочек. Изолированные сердневины пероксисом содержат фермент уратоксидазу (рис. 196).
320
Рис. 196. Строение пероксисом в клетках печени (а) н листа табака (б)
Пероксисомы обнаружены у простейших (амебы, гетрах имена/, у низших грибов (дрожжи), у высших растений в некоторых эмбриональных тканях (эндосперм) и в зеленых частях, способных к фотореспирации. У высших позвоночных животных они найдены главным образом в печени и почках. В печени крыс на клетку число пероксисом колеблется от 70 до 100.
Пероксисомы часто локализуются вблизи мембран ЭПР. У зеленых растений пероксисомы часто находятся в тесном контакте с митохондриями и пластидами.
Впервые пероксисомы были выделены из печени и почек. Во фракциях пероксисом обнаруживаются ферменты, связанные с метаболизмом перекиси водорода. Это ферменты (оксидазы, уратоксидаза, оксидаза D-аминокислот) окислительного дезаминирования аминокислот, при работе которых образуется перекись вазорода (Н2О2) и каталаза. разрушающая ее. В пероксисомах печени каталаза составляет до 40% всех белков и локализована в матриксе. Так как Н2О2 является токсическим веществом .тля клеток, л о каталаза пероксисом может играть важную защитную роль. Пероксисомы в клетках цыплят и лягушек кроме уратоксидазы содержат ряд ферментов катаболизма пуринов.
У животных и некоторых растений (проростки клешевины) пероксисомы играют важную роль при превращении жиров в углеводы. Так. в клетках эндосперма клевешины в пероксисомах (глиоксисомах) содержатся ферменты глиоксалатного цикла.
Пероксисомы не содержат никаких нуклеиновых кислот, и все сетки. ИЗ которых они состоят, кодируются ядерными генами, но их относят к са-
321
M<»IX1IJMUVH!IP\мшимся органеллам. В иероксиомах происходит накопление специфических белков. которые спите тируются и цитозоле и имеют свои сигнальные участки. В мембране пероксисом есть рецепторный бс-юк. Koiopbiii ушаст транспортируемые белки. Белки мембран пероксисом. как и липиды, приходят из цитозоля. Такое накопление со тержимого и рост мембраны приводят к общему росту пероксисомы, которая затем с помощью неизвестного пока механизма делится на две, т.е. са морен нитруется.
Секреция белков и образование мембран у бактерий
В принципе рост плазматической мембраны и её производных у бактерий происходит тем же образом, что и образование мембран у эукариотических клеток.
Как известно, синтез белков у бактерий осуществляется на 70S рибосомах. которые так же. как и у клеток высших организмов, имеют двоякую локализацию. Большая часть рибосом бактериальных клеток образует полисомы в цитоплазме, около 25% рибосом связано с плазматической мембраной. Такие рибосомы участвуют как в синтезе белков .мембраны, так и в синтезе экскретируемых белком. Многие бактериальные клетки получают питательные вещества за счет деградации полимеров около бактериальной поверхности. Для этого бактерии должны выделять i идролизнруюшпе ферменты в окружающую среду. Это они делают намного проще, чем эукариотические клетки, часть их рибосом, локализованных на внутренней (цитоплазматической) поверхности плазматической мембраны, синтезирует белки. которые, подобно секреторным белкам, проходят через мембрану н оказываются вне клетки. Выделенные гидролазы застревают в компонентах муреиновой бактериальной стенки и там функционируют. На других рибосомах, связанных с мембранами, идет синтез бел ков для построения самой мембраны, подобно тому, что происходит в гранулярном ЭПР эукариотических клеток. Так что в этом отношении бактерию можно уподобить вакуоли гранулярного ЭПР, вывернутой наизнанку.
На примере бактерий хорошо изучен путь синтеза липидных компонентов меморан. Было найдено, что синтез фосфоэтидилэтанол-амина происходит с помощью ферментов, являющихся интегральны ми белками плазматической мембраны, активные участки которых находятся на цитоплазматической стороне мембраны. Синтезированные здесь липиды встраиваются во внутренний липидный слой- Оказа лось, что новое и итерированные липиды довольно быстро обнаружь каются и во внешнем слое мембраны за счет работы переносчиков — флиппаз.
322
ЧАСТЬ ПЯТАЯ
ЦИТОПЛАЗМА: СИСТЕМЕ! ЭНЕРГООБЕСПЕЧЕНИЯ
Для осуществления любых клеточных функций необходимы затраты энергии. Живые организмы получают ес. используя или внешние источники, например энергию Солнца, или энергию переноса электронов при окислении различных субстратов. В обоих случаях клетки синтезируют молекулу АТФ (аденозиитрифосфат), некую разменную «топ тинную» единицу, обладающую высокоэнергетическими фосфатными связями, при разрушении которых выделяемая энергия может тратиться на любые клеточные функции: на активный транспорт веществ, на синтетические процессы, на механическую работу и т.л. (рис. 197). В клетках животных синтез АТФ осуществляется специальными органеллами — митохондриями; в растительных клетках кроме митохондрий в энергообеспечении огромную роль играют хлоропласты — один из видов пластид. Эти два органоида имеют обший сходный план строения и выполняют сходные энергетические функции. Митохондрии и пластиды — двумембранные органонзы эукариотических клеток.
ООО
I I ।
О-р-О-Р-О-Р-О-СН2
II II II
ООО
Трнфосфат
NH2
А
J" N* H
Ю,
/с\ н н
Н Рибоза
ОН ОН______________
A-®-®"® ИЛИ
Аденозин
рис. 197. Адснозинтрифосфат (АТФ)
323
M<»IX1IJMUVH!IP\мшимся органеллам. В нероксномах происходит накопление специфических белков. которые спите тируются и цитозоле и имеют свои си1иалы|ые участки. В мембране пероксисом есть рецепторный бс-юк. Koiopi-iii ушаст транспортируемые белки. Белки мембран пероксисом. как и липиды, приходят из цитозоля. Такое накопление со тержимого и рост мембраны приводят к общему росту пероксисомы, которая затем с помощью неизвестного пока механизма делится на две, т.е. са морен нитруется.
Секреция белков и образование мембран у бактерий
В принципе рост плазматической мембраны и её производных у бактерий происходит тем же образом, что и образование мембран у эукариотических клеток.
Как известно, синтез белков у бактерий осуществляется на 70S рибосомах. которые так же, как и у клеток высших организмов, имеют двоякую локализацию. Большая часть рибосом бактериальных клеток образует полисомы в цитоплазме, около 25% рибосом связано с плазматической мембраной. Такие рибосомы участвуют как в синтезе белков .мембраны, так и в синтезе экскретируемых белком. Многие бактериальные клетки получают питательные вещества за счет деградации полимеров около бактериальной поверхности. Для этого бактерии должны выделять i идролизнруюшпе ферменты в окружающую среду. Это они делают намного проще, чем эукариотические клетки, часть их рибосом, локализованных на внутренней (цитоплазматической) поверхности плазматической мембраны, синтезирует белки, которые, подобно секреторным белкам, проходят через мембрану н оказываются вне клетки. Выделенные гидролазы застревают в компонентах муреиновой бактериальной стенки и там функционируют. На других рибосомах, связанных с мембранами, идет синтез бел ков для построения самой мембраны, подобно тому, что происходит в гранулярном ЭПР эукариотических клеток. Так что в этом отношении бактерию можно уподобить вакуоли гранулярного ЭПР, вывернутой наизнанку.
На примере бактерий хорошо изучен путь синтеза липидных компонентов меморан. Было найдено, что синтез фосфоэтидилэтанол-амина происходит с помощью ферментов, являющихся интегральны ми белками плазматической мембраны, активные участки которых находятся на цитоплазматической стороне мембраны. Синтезированные здесь липиды встраиваются во внутренний липидный слой- Оказа лось, что новое и итерированные липиды довольно быстро обнаружь каются и во внешнем слое мембраны за счет работы переносчиков — флиппаз.
322
ЧАСТЬ ПЯТАЯ
ЦИТОПЛАЗМА: СИСТЕМЕ! ЭНЕРГООБЕСПЕЧЕНИЯ
Для осуществления любых клеточных функций необходимы затраты энергии. Живые организмы получают ес. используя или внешние источники, например энергию Солнца, или энергию переноса электронов при окислении различных субстратов. В обоих случаях клетки синтезируют молекулу АТФ (аденозиитрифосфат), некую разменную «топ тинную» единицу, обладающую высокоэнергетическими фосфатными связями, при разрушении которых выделяемая энергия может тратиться на любые клеточные функции: на активный транспорт веществ, на синтетические процессы, на механическую работу и т.л. (рис. 197). В клетках животных синтез АТФ осуществляется специальными органеллами — митохондриями; в растительных клетках кроме митохондрий в энергообеспечении огромную роль играют хлоропласты — один из видов пластид. Эти два органоида имеют обший сходный план строения и выполняют сходные энергетические функции. Митохондрии и пластиды — двумембранные органонзы эукариотических клеток.
ООО
I I ।
О-р-О-Р-О-Р-О-СН2
II II II
ООО
Трнфосфат
NH2
А
К! Н
Ю,
/с\ н н
Н Рибоза
ОН ОН______________
А-®-®-® или
Аденозин
рис. 197. Адснозинтрифосфат (АТФ)
323
(М)ШНМ в их строении является то, что они отделены от цитоплазмы (IH.LTOH пимы) двумя мембранами - внешней и вну греннсй. По ном\ у митохондрии и пластид различаю г две полости (или два иро-странствд): одну ~ между' внешней и внутренней мембранами (межмем-орлнныс). вторую, основную (матрикс), ограниченную вну греннсй мембраной. Другой обшей чертой и их строении является то. что внутренняя мембрана образуетскладки, мешки, ipeOnii. глубокие впячивания, направленные внутрь матрикса. На таких мембранных 1рсбпях и ния-чиваниях локализуются активные метаболические пстры этих opia-нелч - полиферменгные комплексы, определяющие выполнение основных физиоло1пчсскнх функций (окислительное фосфорилирование для митохондрий, фотофосфорилирование для хлоропластов). В матриксе и тех, и других располагаются элементы а вторе продукции них клеточных мембранных органелл и докали зоваиы ферменты некоторых метаболических процессов. Система а вторе продуют и двумембранных органелл представлена ДНК. РНК н рибосомами, которые могут определять часть генетических, автономных свойств этих структур.
Главными функциональными нагрузками пластид и митохондрий являются процессы энергетического характера, приводящие к синтезу специфических молекул аденозннтрифосфата (АТФ), являющихся донорами энергии для любых клеточных процессов.
В митохондриях, хлоро и л астах. как и в бактериях. АТФ синтезируется одним и тем же способом: с помощью энергии, отдаваемой электронами при продвижении их по электронно-транспортной цепи белков внутренней мембраны, происходит перенос, «перекачка» протонов с внутренней стороны мембраны на внешнюю. Вследствие этого возникает электрохимический протонный градиент, энергия которого с помошыо других белков используется для синтеза АТФ.
В хлоропластах растении, кроме того, при использовании энер! ни АТФ, образованной в результате фосфорилирования, осуществляется важнейший биологический процесс - связывание СО2 и синтез углеводов.
Глава 18
МИТОХОНДРИИ: СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ
Митохондрии как органеллы синтеза АТФ характерны, за малым исключением, для всех эукариотических клеток как аутотрофпых (ф°~ тосинтсзирующис растения), так и гетеротрофных (животные, грибы) организмов. Их основная функция связана с окислением органических соединений и использованием освобождающейся при распаде этих соединений энергии в синтезе молекул АТФ. Поэтому митохондрии часто называют энергетическими станциями клетки.
324
Общая морфология
Мигоконлрии, или хоплриосомы (опрсч. milin нить, cliomlriun зернышко, soma — лсльне), представляют собой гранулярные или нитевидные органеллы, прису 1ствуюшис в цитоплазме простейших, растений и животных (рис. 198). Митохондрии можно наблюдать в живых клетках, гак как они обладаю! достаточно высокой плотностью. В живых клетках митохондрии могут двигаться, перемешаться, сливаться друг с другом. Особенно хорошо митохондрии выявляются на препаратах. окрашенных различными способами после осмиевой фиксации, которая хорошо стабилизирует липиды. Наиболее широко распространен метод окраски по Альтману, который описал эти клеточные органеллы и конце позапрошлою века, называя их «биобластамн».
Размеры митохондрий, как и их форма, очень непостоянны у разных видон (рис. 199). Все же у большинства клеток толщина этих структур относительно постоянна (около 0,5 мкм), а длина колеблется. достигая у нитчатых форм ю 7-60 мкм. Надо сказать, что изучение величины митохондрий — не простое дело. В световом микроскопе на окрашенных препаратах не всегда можно проследить за реальными размерами митохондрий (рис. 200 (см. вклейку) и 201. ai. Изучая митохондрии с помощью электронного микроскопа наультратонких срезах, трудно решить вопрос об истинной длине митохондрий, так как на
Рис. 198. Митохондрии
„ клегыч печени (риечнок Альтмана. 18*1»
Я ядро; М мктохон *рии
325
Рис. 199. Разиообрашс митохондрии (М) в клетках кишечника лягушки («) н в гепатоцитах зародыша свиньи (б)
срез попадает только незначительный объем данной митохондрии. Более того, на срезе одна извитая митохондрия может бы ть представлена несколькими сечениями (3—5), и только пространственная трехмерная рскоис1рукцня, построенная на изучении серийных срезов, может решить вопрос, имеем ли мы дело с 3-6 отдельными митохондриями ичн же с одной изогнутой или разветвленной. Выделенные митохондрии обычно повреждаются н фрагмент ируются. что также ограничивает использование этого метода для решения вопроса о величине и листе митохондрий.
В последнее время вопрос о величине и числе митохондрий занимает многих исследователей в связи с тем, что на ряде объектов показано: размеры и число митохондрий, которые видны па ультра гонких срезах, не соответствуют реальности. Так. в клетках дрожжей на срезах выявляется 5—7 сечений митохондрий; можно высчитать, что это число соответствует нескольким десяткам митохондрии. Однако при использовании высоковольтной электронной микроскопии, позволяющей исследовать объекты толщиной до нескольких микрон, было обнаружено. что в клетках дрожжей есть всего лишь несколько (1—3) сильно разветвленных митохондрий (рис. 202). Есть данные, что число митохондрий и хтя других клеток завышено из-за сложности структуры разветвленных митохондрий. Более тою, появились представления о том, что в одноклеточных организмах есть всего одна мито-хон 1рия. ио сильно разветвленная. Например, у трипаносом в клетке присутствует одна гшантская митохондрия, имеющая сложную ра*' ветвлен ну ю форму.
Гигантские одиночные митохондрии были описаны для одноклеточных кленых водорослей (Poly lamella, Euglcnu, ChlorcHa) (рис. 203)-| 326
I
Рис. 201. Митохон хрии (М) и клетке культуры ткани, окрашенные прижизненно ротамино.м (я), и выделенные внутренние мембраны митохондрии при негативном контрастировании (6). где в электронном микроскопе видны «грибовидные тельца* (ГТ) (молекулыАТФ-синтстазы) (фото Л.Е. Бакеевой) Я ядро
327
делящихся клетках дрожжей Candida albican?
Рис. 202. Митохондрии в (Тлплка. K.inbc. 1%5)
Рис. 203. Гигантская митохондрия в клетке Chlorella fusca
и — срез клетки; б- трехмерная реконструкция митохондрии. 1 - ядро: 2— хлороптл • ? - митохондрия: 4 - ииреноит, 5 - вакуоль
Длинные ветвящиеся митохондрии описаны в клетках культуры ткани млекопитающих. в клетках многих растений как в нормальных. так н в анаэробных условиях. В последнее время стал широко применяться для изучения свойств митохондрий флуорохром родамин. Этот КрЗСИ тель обладает способностью люминссциронать в фиолетовом свете, ес ли он связывается с мембранами активных митохондрий- При этом пом инеенентном микроскопе видна единая митохондриальная смете ма - митохондриальный ретикулум (см. рис. 200 (вклейка) и 201,<0-
Обычные подсчеты показывают, чго на печеночную клетку при*0 дится около 200 митохондрий. Это составляет более 20% от обшего объема цитоплазмы и около 30-35% от общего количества бедка клетке. Площадь поверхности всех митохондрии печеночной клетки
M,ITOXO'W,!“b"Mi’ ретикулум в батальной части клетки извитого канальца почки крысы (Bergeron el al„ /980)
° - срез клейки: б - грсхмсрная реконструкция. М - мигохонтрии- В -'UlKponojKlfHKli; Я ядро
4 5 раз больше поверхности ее плазматической мембраны. Больше всего митохондрий в оолитах (около 300 000) и у гигантской амебы СЛб/лт chaos (до 500 (ХЮ).
В клетках зеленых растений число митохондрий меньше, чем с клетках животных, так как часть их функций могут выполнять хлоро-пласты.
В спермиях часто присутствуют гигантские митохондрии. спирально закрученные вокруг осевой части жгутика. Отсутствуют митохондрии у кишечных энтамсб, живуши.х в условиях анаэробиоза, и у некоторых других паразитических простейших.
Локализация митохондрии в клетках может быть различной. Часто их расположение обусловлено топографией цитоплазмнтических структур и включении. Так, в шфференнированных клетках растений митохондрии большей частью расположены в периферических участках цитоплазмы, отодвинутых к плазматической мембране центральной вакуолью. В мало дифференцированных клетках меристемы растений митохондрии располагаются более или менее равномерно. В клетках эпителия почечных канальцев митохондрии ориентированы вдоль продольной оси клетки. Это связано с тем, что они располагаю: -ся между глубокими впячиваниями плазматической мембраны в базальной области клеток (рис. 204).
Обычно митохондрии скапливаются вблизи тех участков цитоплазмы, где возникает потребность в АТФ, образующейся в митохондриях. Например, в скелетных мышцах митохондрии находятся вблизи мио-
329
фибрп 11. В снсрматозои iax митохондрии образуют спиральный фуг-1«р вокрм оси лиугнка: верояню. этоевязапос необходимостью ис-но'11.юнання АТФ для движения хвоста сперматозоида. Аналогичным образом у простейших и в других клетках. снабженных ресничками, митохондрии локализуются непосредственно под клеточной мембраной у основания ресничек, для работы которых необходим АТФ. В аксонах нервных клеток митохондрии располагаются около синапсов, не происходит процесс передачи нервного импульса. В секреторных клетках, которые синтезируют большие количества белков, митохондрии тесно связаны с зонами зргасгоплазмы: вероятно, они поставляют ХТФ дпя активации аминокислот и синтеза белка на рибосомах.
Ультраструктура митохондрий
Митохондрии независимо от их величины или формы имеют универсальное строение, их ультрасгруктура однообразна. Митохондрии ограничены двумя мембранами (рис. 205). Наружкяя митохондриальная мембрана отделяет ее от гиалоплазмы. Обычно опа имеет ровные контуры, не образует впячннапий или складок. На нее приходится около 7% от плошали всех клеточных мембран. Толщина этой мембраны около 7 им. она нс бывает связана ни с какими другими мембранами цитоплазмы и замкнута сама на себя, так что представляет собой мембранный мешок. Наружную мембрану от внутренней отделяет межмембранное пространство шириной около 10 20 нм. Внутренняя мембрана (толщиной около 7 нм) ограничивает собственно внутреннее содержимое митохондрии, ее матрикс, или митоилаз.му. Характерной чертой внутренних мембран митохондрий является их способность образовывать многочисленные ипячивания внутрь митохондрий. Такие внячпвания чаще всего имеют вид плоских гребней, или крист (рис. 206 и 207, а).
Общая поверхность внутренней мембраны митохондрии в печеночной клетке составляет примерно греть поверхности всех клеточ-
Рис. 205. Схема обшей организации митохондрии
/ - внешняя мембрана; 2 внутренняя мембрана; J внячинания внутренней мембра ны - кристы; 4- места впячнявнин. виде поверхности внутренней мембраны
з.чо
Рис. 206. Микрофотография митохондрий в клетках печени, полученная с помощью электронного микроскопа
/ внешняя и внутренняя мембраны; 2- кристы; ?- ЭПР
331
Рис. 207. Микрофотографии митохондрии («> и пероксисомы 16) в клетка' печени, полученные с помощью электронного микроскопа (фото Л.Е. Баке
СВОЙ) . . 3
/ внешняя л внутренняя мембраны; 2- кристы (видна бислойность мембрзик одиночная <ираиичиваюшая мембрана пероксисомы
332
пых мембран. Митохондрии клеток сердечной мышцы содержат Bjpoe больше крист, чем печеночные митохондрии. Это может отражать различия в функциональных ншрузках митохондрий разных клеток. Расстояние между мембранами в кристе составляет около 10-20 нм. На срезах связь мембраны крист с внутренней мембраной прослеживается очень огчеглнво. но мест таких мембранных переходов немного. Это объясняется тем. что связь между мембранами осуществляется через узкую шейку, или стебелек.
Митохондриальные кристы, отходящие от внутренней мембраны и простирающиеся в сторону матрикса, обычно не полностью перегораживают полость митохондрии. не нарушают непрерывности «анолияюшего ее матрикса.
Ориентация крист по отношению к длинной оси митохондрии различна для разных клеток. Так. может быть перпендикулярная ориентация (клетки печени, почек) крист; в некоторых клетках (сердечная мышца) наблюдается продольное расположение крист. Часто кристы могут ветвиться или образовывать пальцевидные отро-
Рис. 208. Варианты строения крист митохондрий а пигсшпчзтые кристы (печены: б -перфорированные кристы Гчеыте.тыия мы in па мухи); в - трхбчзгне кристы: г-волнистые кристы /амспа)
с,Ки- изгибаться и не иметь выра-
женной ориентации (рис. 208). У простейших, одноклеточных водорослей. и некоторых клетках высших растении и животных выросты инутренней мембраны имеют вид трубок (трубчатые кристы).
Матрикс митохондрий имеет тонкозернистое гомогенное строение. в нем иногда выявляются тонкие собранные в клубок нити (около 2—3 нм) и гранулы около (5-20 нм. Известно, что нити матрикса митохондрий представляют собой молекулы ДНК в составе митохондриального нуклеоида. а мелкие гранулы — митохондриальные рибосомы. Кроме тою. в мшриксе встречаются крупные (20-40 нм) плотные гранулы. это - места отложения солей магния и кальния.
333
Функции митохондрий
Митохондрии осуществляют спитез АТ Ф, происходящий в резуль-। ле процессов окисления оргэпических субстратов и фосфорилирования АДФ. В ьлсгках окисление и выделение энергии, освобождающейся в результате зтого процесса, проходят в несколько взаимосвязанных этапов. При этом в качестве начальных субстратов используются различные углеводы, жирные кислоты, аминокислоты. Первые лапы окисления приводят кроме образования АТФ к появлению промежуточных продуктов, конечное окисление которых в митохондриях даст возможность клетке использовать этот процесс для синтеза основного количества АТФ.
Начальные этапы окисления углеводов происходят в тиалоплазмеи не требуют участия кислорода. Поэтому они называются анаэробным окислением, или гликолизом. Главным субстратом окисления при анаэробном получении энергии служат гексозы и и первую очередь глюкоза; некоторые бактерии обладают свойством извлекать энергию, окистяяя пентозы, жирные кислоты или аминокислоты. В глюкозе количество потенциальной энергии, заключенной всвязях между атомами С, Н и О, составляет около 680 ккал на I моль (т. е. на 180 г глюкозы): эта энергия освобождается при полном окислении глюкозы согласно следующей реакции:
С6Н|2О6 + 6О2 => 6Н2О + 6СО2 + 680 ккал.
В живой клетке это огромное количество энергии не освобождается одновременно, как при горении в пламени Освобождение энергии идет в виде ступенчатого процесса, управляемого целым рядом окислительных <]>ерментов. и не связано с переходом энергии химической связи в тепло, как при горении, а с переходом се в макроэнергетиче-скую связь в молекуле АТФ, которая синтезируется при использовании освобождающейся энергии из АДФ и фосфата.
В процессе гликолиза происходит неполное окисление субстрата. В результате гликолиза глюкоза распадается до трноз, при этом тратятся 2 молекулы АТФ и синтезируются 4 молекулы АТФ. Так что в конечном результате клетка «зарабатывает» всего 2 молекулы АТФ. В энергетическом отношении этот процесс малоэффективен, поэтому из 680 ккал, заключающихся в связях I моля глюкозы, освобождается менее 10% энергии. Несмотря на низкий энергетический выход, анаэробное окисление -гликолиз, широко используется в живой природе. Он является основным поставляющим энергию процессом для многих микроорганизмов, некоторых кишечных паразитических анаэробных простейших, для клеток высших организмов на ранних стадиях эмбрионального развития. для МНОГИХ опухолевых клеток, для клеток культуры ткани и др. Эритроциты
334
млекопитающих, например, получают всю необходимую им энергию та счет i лнколиза, так как у них нет митохондрий
Образоиацитсся и результате гликоли я триозы, в первую очередь пировиноградная кислота, вовлекаются в дальнейшее окис>енис осуществляющееся уже в самих мигохондриях. При этом происходив использование энергии расщепления всех химических связей что приводит к выделению СО2. к потреблению кислорода и синтезу боль того количества АТФ. Эти процессы связаны с окислительным ник лом трикарбоновых кислот и с дыхательной цепью переноса электро нов, где совершаются фосфорилирование АДФ и синтез клеточного «топлива» - молекул АТФ (рис. 209).
В цикле трикарбоноиых кислот (цикл Кребса, или никл лимонной кислоты) образовавшийся в результате гликолиза пируват сначала теряет .молекулу СО2 и, окисляясь до ацетата (двууглеролное соединение), соединяется с коферментом А. Затем аиетнлкоэнзим А, соединяясь с о кс ал ацетатом (четырехуглеродное соединение), образует шссти-углеродный цитрат (лнмоную кислоту). Далее происходит цикл окис-
ления этого шестнуглеролного соединения до четы рсху переднего ок-салацетата, который снова связывается с ацетил коэнзимом А; затем
никл повторяется. При этом окислении выделяются две молекулы СО2, а электроны, освободившиеся при окислении, переносятся на акцепторные молекулы коферментов (НАД - никотинамидаденинди-
нуклеотнд), которые вовлекают их далее в цепь переноса электронов. Следовательно, в цикле трикарбоновых кислот нет самого синтеза АТФ, а идет окисление молекул, перенос электронов на акцепторы и выделение СО2- Все описанные выше события внутри .митохондрий
происходят в и.х матриксе.
Выделенные митохондрии могут окислять пируват до СО2 и способны к синтезу АТФ. Если взвесь митохондрий подвергнуть воздействию ультразвука, то после разрыва митохондриальных мембран компоненты матрикса освобождаются и переходят в среду выделения. После такого разрушения можно осадить .мембраны митохондрий и
анализировать их функциональные активности.
Во фракции, свободно*! от мембран, представляющей сооой ком-поненты матрикса, обнаруживаются ферменты, участвующие в цикле трнкарбоновых кислот. Следовательно, в матриксе локализованы |Р^ менты этого цикла, которые находятся в свободном связаны с митохондриальными мембранами, за пекл , , ,.,т,, цатдегидрогеназы Кроме того, в состав матрикса в“" .
окисления жирных кислот; основной продукт окислск ' слот - ацстилкоэнзим А (ацетил-КоА) - тоже в матрии цикл трикарбоноиых кислот, в котором on паилр™ХХТ™е окислению до СО, и Н,О. В матриксе митохондрии происходит также
335
С'“'а "Н> “ Тр,,КарБо,1о,,’*|ir-'OT И окис».тельною фосфор..-
336
окисление некоторых аминокислот, поступающих в пик* трикарбоновых КИСЛО I.
В оетжлытых событиях, свя тайных с дальнейшим переносом ,лект-ронов и сии гезом АТФ, участвует внутренняя митохонтриальная меч бранас кристами митохондрий.
Освободившиеся в процессе окисления в цикле трикарбоновых кислот элекгроны. акцеп тированные на коферментах. переносятся затем вдыхательную цепь (цепь переноса электронов), где они соединяются с молекулярным кислородом, образуя молекулы валы.
Дыхательная цепь представляет собой ряд белковых комплексов, встроенных во внутреннюю митохон триальную мембрану (рис. 210). Существуют три главных ферментных комплекса. Первый НАД Н де нитрогеназный комплекс принимает электроны от НАДН и переносит их во второй комплекс — комплекс Л—с,, который в свою очередь переносит их на цнтохро.моксидазпый комплекс, i он их перелает на кислород, в результате чего образуется вода. На этом окисление заканчивается.
Как и полагается, окисление исходного субстрата привело к выделению СО, и воды, но при этом не выделилась тепловая энергия, как при горении, а образовались молекулы АТФ. Они были синтезированы друзой труппой белков, не связанных прямо с окислением. Было найдено, что во внутренних митохондриальных мембранах, на поверхности мембран, смотрящих в матрикс, располагаются крупные белковые комплексы, ферменты, АТФ-синтетазы. В электронном микро скопе во ({тракции внутренних митохондриальных частиц видны так называемые грибовидные тельца, сплошь выстилающие поверхность
Рис. 210. Поток электронов через три
тпи главных ферментативных комплекса Рис. 210. Поток электронов через три т.чавнь. v
при переносе электронов от НАД Н к О2 R.Kt..j. витохрочокстиатвыи ком-/ НАД 11 пент трогетыя1ыИ комплекс '",xoiup"«. 7- внутренняя миго-
। иске; 4 убихинона 5- киюхром с. 6 м-р о
хотырна.-тытая мембрана; 8 межмембрантюе ттроетранств
337
мембран, cMoipMimio в мирике. )ги зечыы имею| как бы ножку и го-юкку чплмсцюм S 9 им. Эти тельца ироде гания ют собой белковмй комн пеке. состоянии» нз 9 субъединиц. - А ГФ синтетазу. Слсдова-ie.ii.no. во внутренних мембранах мииэхондрнй локали «званы ферменты как окислительной цепи, так и синтеза АТФ (см. рис. 201,6).
Дыхательная пень эго главная система прекращения энергии в митохоитриях. I? licit последовательно окисляются и воспановлипа ются элементы дыхательной пени, и результате чего высвобождается нсбодыпимн порциями энергия. За счет згой энергии в трех точкам згой цепи из АДФ и фосфата образуется АТФ. Поэтому говорят, что окисление (перепое электронов) сопряжено с фосфорилированием (АДФ + Ф1( -> АТФ). т. с. происходи г процесс окислительного фосфорилирования.
В результате многократной оборачиваемости субстратом в цикле Кребса полностью окисляются поступившие продукты первичного гликолитического окисления. Затем в цепи окислительного фосфори-лпронация энергия, освободившаяся при окислении, максимально используется для синтеза АТФ.
Было выска зано предположение, что выделяющаяся при транспорте электронов энергия запасается в виде градиента протонов на мембране. При этом на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий возникает повышенная концентрация положительно заряженных попов водорода. Возникший при этом протонный градиент является движущей силой в синтезе АТФ (рис. 211).
Рис. 211. Обшая схема окислительного фосфорилирования ио П. Митчеллу При переносе электронов но псин окисления про топы накапливаю! ся в межмембранном про страна нс и при дос1ижепин определенною 110 TcnniiiLia возвращаю ic« в м;ирикс, при эюм на АТФ-сингезазпом комплексе происходит синтез А1Ф. / внешняя мембрана; 2 - внутренняя мембрана; Ф(| — неорганический фосфат
338
Эго предположение стало татем теорией, хечиосмотическойтсопи ей сопряжения окисления субстратов е сил гс том АТФ Как оказалось при переносе электронов в митохондриальной мембране каждый комплекс дыхательной цепи направляет свободную энергию окисления на перемещение прогонов (положительных зарядов) через мембрану из матрикса в межмембранное пространство, что приводит к образова пню разност и потенциалов на мембране: положительные заряды прс-об гадают в межмембранном пространстве, а отринателыпле - со стороны матрикса митохондрии. При достижении определенной разности потенциалов (22(1 мВ) белковый комплекс АТФ-синтетазы начи наст транспортировать протоны обратно в матрикс, при этом превращает одну форму энергии в другую: образует АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Так происходи г сопряжение окислительных пронес сов с синтетическим, с фосфорилированием АДФ Пока совершается окисление субстратен, пока осуществляется перекачка протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану, идет сопряженный с зтим сии тез А ГФ, т. е происходит окислительное фосфорилирование.
Эти два процесса можно разобщить. Для этого достаточно снять разность потенциалов на митохондриальной мембране, сделав в леи диффузионные каналы, или ее механическим нарушением, или с помощью химических соединений (например, аинитрофенола). При этом перенос электронов и окисление субстрата будут продолжаться, но синтеза АТФ уже не будет. В этом случае энергия, освобождающаяся при окислении, перейдет в тепловую энергию.
Окислительное фосфорилирование у бактерии
У прокариотических клеток, способных к окислительному фосфорилированию, элементы цикла гри-карбоновых кислот локализованы прямо в цитоплазме, а ферменты дыхательной цени и фосфорилирования связаны с клеточной, плазматической мембраной. Вначале это было показано цитохимическими методами. Так. фермент сукиинатде-гидрогеназа связан с плазматической мембраной и с ее выпячиваниями. выступающими внутрь цитоплазмы, с так называемыми .мезосомами (рис. 212). Необходимо отметить, что такие бактериальные мезо-339
рис. 212. Мезосомы <МС> бак
герналыгых меток
н - нуКЛ*0,1Я
сомы могут быть с ня мим нс только с процессами аэробного дыхания, ни у некоторых пилон участвуют в делении клеток, в процессе расире-|С?1сния ДНК но новым клеткам, в образовании клеточной стенки и г д. На ил«имл1ической мембране и мезосомах некоторых бактерий юкализуинся также факторы сопряжения окисления и снигеза АТФ. С помощью электронного микроскопа во фракциях плазматических мембран бактерий обнаружены сферические частицы, аналогичные гем, которые были найдены в митохондриях эукариотических клеток. Таким образом, у бактериальных клеток. способных к окислительному фосфорил и роваш по, плазматическая мембрана выполняет роль, аналогичную внутренней мембране митохондрий эукариотических клеток.
Увеличение числа митохондрий
Как и другие органеллы цитоплазмы, митохондрии могут увеличиваться в числе, что особенно заметно при делении клеток или при увеличении функциональной нагрузки клетки. Болес того, митохондрии постоянно обновляются. Так, в печени средняя продолжительность жизни митохондрий составляет около Юлией. Поэтому закономерно возникает вопрос: каким образом происходит это увеличение числа митохондрий, за счет каких процессов и каких структур образуются новые митохондрии?
Основная масса экспериментальных данных говорит о том, что увеличение числа митохондрии происходит путем роста и деления предшествующих митохондрий. Это предположен нс было впервые высказано Альтманом (1893), описавшим митохондрии под термином «биобласты». Позднее с помощью пейтрафериой киносъемки удалось наблюдать прижизненное деление, фрагментацию длинных митохондрий на более короткие. Особенно отчетливо виден этот процесс при делении клеток некоторых одноклеточных водорослей и низших грибов, у которых деление митохондрий скоординировано с клеточным делением. С помощью электронного микроскопа часто во многих клетках можно видеть деление митохондрий путем образования перетяжки (рис. 213). например в клетках печени (хотя без доказательств динамичности зтого процесса такие наблюдения мало убедительны). Внешне все эти картины очень напоминают бинарный способ деления бактерий.
Реальность увеличения числа митохондрий путем деления была доказана при изучении поведения митохондрий в живых клетках культуры гкани. Обнаружено, что в течение клеточного цикла митохондрии могут вырастать до нескольких микрометров, а затем фрагментироваться. гетитьея на более мелкие тельца.
340
Рис. 213. Возможные пути деления митохондрий при образовании псрего редок (о) или перетяжки (б) (по: Muhlcthalcr, 1959)
Кроме того, митохондрии могут сливаться друг с другом. Так, в культуре клеток эндотелия сердца головастика ксснопуса выявляли до 40 случаев слияния и деления митохондрии за I ч. В клетках культуры ночек эмбрионов наблюдали рост и ветвление митохондрий в S-пери оде клеточного никла. Однако уже вО2-периоде преобладали в числе мелкие митохондрии, образовавшиеся за счет деления при фрагмента инн длинных митохондрий. Таким образом, размножение митохондрий идет по принципу: omnis mitochondrion е mitochondrion.
Интересны наблюдения за судьбой митохондрий в дрожжевых клетках. В аэробных условиях дрожжевые клетки имеют типичные митохондрии с четко выраженными кристами. При переносе клеток в анаэробные условия (например, при их пересеве или при перемещении в атмосферу азота) типичные митохондрии в их цитоплазме не обнаруживаются. и вместо них видны мелкие мембранные пузырьки. Оказалось, что в анаэробных условиях дрожжевые клетки не содержат полную дыхательную цепь (отсутствуют цитохромы b и о). При аэрации культуры обнаруживается быстрая индукция биосинтеза дыхательных ферментов, резкое повышение потребления кислорода, а в Цитоплазме появляются нормальные митохондрии. Эти наблюдения привели к представлению о том, что у дрожжей в анаэробных устови ях в цитоплазме существуют промитохонлриальныс структуры с ре. у цированной системой окисления. Такне промитохондрии при п се клеток в условия аэробной среды начинают перестраиваться. исходит включение в их мембраны элементов полнои Цепи ч фосфорилирования, что сопровождается изменение* . их логин. Так, из примитивных, неактивных промитохоадрии\|НтоЧ0НД. стройки и роста образуются обычные фуикшюнирУ
Вероятно, сходные процессы протекают и при теле )icCMn сверни: увеличивается масса митохондриальных мех’“К)Че|(||я в нцх от мифическими компонентами за счет синтеза и ' часс;1 (-1елкос мат-лсльных белков — ферментов и липидов, кфес™д jOJ И1И чного-
Рикса, а затем происходит деление как бы уд красно увеличившейся структуры.
341
)тп представления получаю г поддержку со стороны фактов, касающихся организации и состава мпгохоидриального матрикса или ми-юн ьимы, в которой обнаружены 1ПК, разные тины РНК и рибосомы.
Авторепродукция митохондрий
Исследования последних лет привели к удивительным открытиям: днумембранные органеллы обладают полной системой авторсиродук-нии. ha система полная в том смысле, что в митохондриях и пластидах открыта ДНК, на которой сии тезируются информационные, трансферные и рибосомные РНК и рибосомы, осуществляющие синтез митохон триальных и пластидных белков. Однако, как оказалось, ин системы, хотя и автономны, очень ограничены по своим возможностям.
1НК в митохондриях представлена циклическими молекулами, не образующими связке гистонами, в этом отношении они напоминают бактериальные хромосомы. Размер их невелик, около 7 мкхг. в одну циклическую молекулу митохондрий животных входит 16 19 т.п.п. ДНК. У человека митохондриальная ДНК содержит 16,5 т.п.н., она полностью расшифрована. Митохондральная ДНК различных объектов очень однородна, отличие их заключается лишь в величине интронов и нетранскрибируемых участков. Все митохондриальные ДНК представлены множественными копиями, собранными в группы, -кластеры. Так, водной митохондрии печени крысы может содержаться от I до 50 циклических молекул ДНК. Общее же количество митохондриальной ДНК на клетку составляет около 1%. Синтез митохондриальных ДНК не связан с синтезом ДНК в ядре.
Как и у бактерии, митохонтральная ДНК собрана в отдельную зону — нуклеоид, его размер составляет около 0.4 мкм в диаметре. В длинных митохондриях может быть от 1 до 10 нуклеоидов. При делении дчин-иой митохондрии от нес отделяется участок, содержащий нуклеоид (сходство с бинарным делением бактерий). Количество ДН К в отдельных нуклеоидах мнгохоилрий может колебаться в 10 раз в зависимости от типа клеток.
Прижизненно нуклеоиды митохондрий могут окрашиваться специальными флуорохромами. Оказалось, что в некоторых культурах в клетках от 6 до 60% митохондрий не имеют нуклеоида, что может объясняться тем. чю деление этих органелл скорее связано с фрагментацией, а нс с распределением нуклеоидов.
Кик уже юворилось. митохондрии могут как делиться, так и сливаться лруг с другом. В обычной культуре клеток человека Нс La все М1П0Х0ШРИИ содержи нуклеоиды. Однако одна из .мутантных линий эюи культуры содержала митохондрии, в которых нуклеоиды с номо-
342
шью флуорохроиов не выявлялись. Но если эти числить с иитопласгами клеток исходного типа то „о все? WC™ обнаруживались нуклеоиды. Это шпорит о том по “О|*Р"ЯХ тохондрий друг с ярусом может происходить “X
компонсшами. «уфышими
Важно подчеркнуть, что рРНК н рибосомы митохондрии резко от лишни от таковых в цитоплазме. Если в цитоплазме выявтяклся SOS рибосомы, то рибосомы митохондрий растительных клеток ириншс жат к 70S рибосомам (состоят из 30S и 50S субъс шнин, содержат I6S и 23S РНК. характерные для прокариотических клеток) аьмнтохон ,риях клеток животных обнаружены более мелкие рибосомы (около 50S)
Рибосомные PH К мито.хоцарий синзезируюгся на митохондриальных ДНК. в митоилазме ла рибосомах идет синтез белков. Он прекращается, в отличие от синтеза ва иитоилахматическнх рибосомах. при действии антибиотика хлорамфеникола, подавляющего синтез белка у бактерий.
На митохондриальном геноме синтезируются и транспортные РНК, всего синтезируется 22 тРНК. Триплетный код митохондриальной синтетической системы отличен от такового, используемого в гделоплазме. Несмотря на наличие казалось бы всех компонентов, необходимых для синтеза белков, небольшие молекулы митохондриальной ДНК нс могут кодировать все .митохондриальные белки, а л ишь их небольшую часть. Так. ДНК размером 15 т.п.и. может кодировать белки с суммарной молекулярной массой около 6 105. В то же время суммарная молекулярная масса белков час пшы полного дыхательного ансамбля митохондрии достигает величины около 2-106. Если учесть, что кроме белков окислительного фосфорилирования в митохондрии входят ферменты цикла трикарбоновых кислот, ферменты синтеза ДНК и РНК. ферменты активации аминокислот и зругнебелки,то видно, что для кодирования этих многочисленных белков и рРНК и тРНК количества генетической информации в короткой молекуле мпгохондри альной ДНК явно не хватает. Расшифровка нуклеотидной Поспелова тслыюсти митохондриальной ДНК человека показала, что она к<^,г рует всего лишь 2 рибосомные РНК, 22 трансферные Р и вссг различных пол и пептидных цепей. . что
В настоящее время имеются убедительные доказате. ‘ большая часть белков митохондрий находится под генсти <с . троясм со стороны клеточного ялра н синтезируется вис * _
Так, цц.охром с образуется в гналоплаз». а из—
Ценен в составе АТФ-сиптетазы только одна енн - 1|Ш1Ь не.
митохондрий животных. Митохондриальная Д • мембранач
•многие митохондриальные белки. к°т°рь1е ЛОК^,И * нНЬ1е за правидь-11 представляют собой структурные белки,^огветст ^}ЬНЬ1Л функпио-НУЮ интеграцию в митохондриальных мембранах нальных компонентов.
343
Рис. 214. Схема переноса белков из цитоплазмы в митохондрии через об-засть контакта митохон триальных мембран
</ — ipaiicuopT белка в чафикс митохондрий; б- включение белка во внутреннюю .митохондриальную мембрану. / внешняя мембрана митохондрии: 2- внутренняя мембрана митохондрии: 3 - канальные белки; 4 - транспортируемый белок матрикса; 5 -сигнальный конец белка; б — белокв матриксе; 7- транспортируемым белок внутренней мембраны; 8 - второй сигнальный пентил; 9- перенос белка в матрикс: 10 втором сигнальный участок белка, встраивающийся в мембрану; 11 - встроенный белок внутреннем мембраны
Большинство митохондриальных белков синтезируется на рибосомах в цитозоле. Эти белки имеют специальные сигнальные последовательности. которые узнаются рецепторами на внешней мембране митохондрий. Эти белки могут встраиваться в них (см. аналогию с мембраной пероксисом), а затем перемешаться на внутреннюю мембрану. Этот перенос происходит в точках контакта наружной и внутренней мембран, где такой транспорт отмечен (рис. 214). Большинство липидов митохондрии так же синтезируются в цитоплазме.
Все эти открытия, показывающие относительно независимое строение и функционирование системы белкового синтеза митохондрий. возродили гипотезу о эндоснмбиотическом происхождении митохондрий. о том. что митохондрии представляют собой организмы типа бактерий, находящиеся в симбиозе с эукариотический клеткой.
Хондриом
Хондриом - это совокупность всех митохондрий в одной клетке. Оказалось, что такая совокупность может быть различной в зависимости от типа клеток. Так. во многих клетках хондриом представлен разрозненными многочисленными митохондриями, разбросанными довольно равномерно по всей цитоплазме, как, например, во многих недифференцированных клетках (рис. 215. д). В других случаях отдел ь-
344
Рис. 215. Разные форма хондриома
а - разрозненные мигохонлрии; 6 - группы митохондрий; в - митохондриальный ретикулум
ные митохондрии локализуются группами в местах интенсивной траты АТФ. как, например, в клетках анализаторов сетчатки. В обоих этих случаях митохондрии функционируют поодиночке, их кооперативная работа, возможно, координируется какими-то сигналами из цитоплазмы. Однако существует н совершенно иной тип хондриома, когда вместо мелких одиночных разрозненных митохондрии в клетке располагается одна гигантская разветвленная .митохондрия (рис. 215, в).Такие митохондрии часто встречаются у одноклеточных зеленых водорослей (например, у Chlorella). В этих случаях мы видим не отдельные митохондрии, а сложную митохондриальную систему, сеть, или.каксида ли название, митохондриальный ретикулум (reticulani mitoc °r’ Каков биологический смысл появления такой пи антской Р3’* xoli митохондриальной структуры. ^'^нХоХ^скоп внешними и внутренними мембранами. Согласно хн.
теории, возникший на поверхности внутренней
мический протонный градиент равномерно ^"^„„потенивальна .ГОСТИ внутренней мембраны митохондрии, т с нштренней
в.тюбой своей точке. Поэтому влюбой точке коверт||СИН1е)АТФ. мембраны такой разветвленной митохондрии м°*~ этои есть
Который будет постулат!, в любую точку |1,|101'‘с' _|1И могут пред-
необходимость, т. е. такие разветвленные ми
ставлять собой «электрический кабель». .оказаноэксперимен-
те. что это действительно имеет место. фибробласты, в и11
талыю. Были выбраны растущие в культуре <
345
Рис. 216. Локальное повреждении нитчатой митохондрии фибробласта лазерным ми кролу-юм, приводящее кдеэнерги гании всей митохондрии (по: Бакеева, Ченнов, 1989)
а - флуоресценция этилроламина в митохоц щиях мн гам ной клетки. Стрелка указывает на место лазерного укола; б - га же клетка после локального облучения: поврежденная митохондрии потеряла флуоресценцию: « вид мн (охоклрий гой же клетки в фазовом контрасте
тонлазме которых имеются длинные нитчатые митохондрии, достигающие 60 мкм. В живых клетках их можно наблюдать с помощью флуорохрома эгитродамииа, который накапливается в матриксе только работающих. синтезирующих АТФ, митохондрий. Если спять разность потенциалов на внутренней мембране митохондрий, воздействуя на клетки лини грофс! юл ом. то свечение этил родами на в митохондриях прекращается параллельно падению синтеза А ГФ. При этом гашение флуоресценции происходит во всех митохондриях. Это наблюдение показывает, что этнлродамин, как протонный краситель, накапливается в матриксе митохондрии только тогда, когда есть разность потен шпалов на внутренней мембране митохондрий, т.е. когда осущес i ваяется спи тез АТФ.
Но диншрофенол, встраиваясь в мембрану, создает «пробой» на всех митохондриях данной клетки. А как «выключить» одну митохондрию? Для этого используется лазерный или ультрафиолетовый микро-луч. который можно точно направить на избранную экс пери мен та тором митохондрию (рис. 216). Делается это с помощью специальной оптической системы, которая позволяет одновременно рассматривать
346
объект (и данном случае живые клетки с окрашенными „ мнюхопдрнями) и навести па избранную деталь тонкий „v ШЧ""04 или ультрафиоистового света. При облучении отдельной митХшт'Т в „еп происходит гашение флуоресценции родамина из-за “ резулыате пробоя внутренней мембраны митохондрии разиостг по" теннналов на пен падает и родамин как бы вытекает из матрикса х „ тохоилрпи При лом соседние митохондрии нс Меняют своего свече ния и продолжают синтез АТФ. Что же произойдет, если облучить небольшой участок разветвленной или же очень длинной митохондрии’ В экспернмен те одна из протяженных светящихся митохондрий фибробласта была локально поражена узким (0,5 мкм) микролучом оптического лазера. В результате этого вся длинная митохондрия потухла, в то время как соседние оставались без изменений (см. рис 216, о). Поражение микролучом участков свободной от митохонзрин цитоплазмы не приводило к тушению митохондрий. Это говоритотом,что точечный пробой мембраны митохондрии приводит к снятию разности потеннпа-тов не только вточке пробоя, по по всей длине митохон-трии. которая представляет собой проводник с эквипотенциальной поверхностью. Следовательно, такие длинные нитчатые митохондрии фибробластов могут представлять собой электрические проводники, могущие передавать разность потенциалов иа митохондриальных мембранах на большие расстояния и объединять удаленные участки цитоплазмы.
Это значит, что и в случае гит антских разветвленных митохондрий влюбой ее точке па внутренней мембране может накопиться потенциал. достаточный для того, чтобы начался синтез АТФ. С этих позиций митохондриальный ретикулум представляет собой как бы электрический проводник, кабель, соединяющий отдаленные точки такой сис темы. Митохондриальный ретикулум может оказаться очень полезным не только для мелких подвижных клеток, таких как хлорелла, но и Для более крупных, там, где требуются кооперация иенпхронизаии в работе многих структурных единиц, таких как. например, ми риалы в скелетных мышцах. „ во-
Как известно, скелетные мышцы состоят из массы мь локон - сп.мпластов, содержащих множество ядер- 1игант-
шечных волокон достигает 40 мкм прн толщине . мк । к ыс екая структура, содержащая великое множество *" ^окртщеиия к сокращаются одновременно, т. е. синхронно. Д. о6а1Ь11Юеко-каждому саркомеру м иофибрилл должно быть дос 1сГНЫХ мыши в
’ичествоАТФ. На продольных ультратонких срезах дас ме1К11С
электронном микроскопе видны многочисленны * ^рда^-рами сечения митохондрий, располагающихся в cotx |1исчцыхволокон (рис. 217). Если же исследовать поперечные срез' _ Н!1 „рстстав-
иа уровне Z-дисков, то видно, что мышечные .х
347
Рис. 217. Расположение митохондрий в поперечно-полосатой мышце диа-фра! мы крысы (поданным Л.Е. Бакеевой и Ю.С. Ченцова)
а продольный срез; 6 — ере? па уровне Z-диска. М - митохондрии; ММК межмкто-хондриальные коптела ы; МФ - миофибр пилы
ля ют собой не мелкие шарики или палочки, а как бы паукообразные структуры, отростки которых могут ветвиться и простираться на большие расстояния, иногда через весь поперечник мышечного волокна. При этом разветвления митохондрий окружают каждую миофибриллу в мышечном волокне, снабжая их АТФ. необходимого для мышечного сокращения. Следовательно, в плоскости Z-диска митохондрии представлены типичным митохондриальным ретикулумом — единой митохондриальной системой. Такой пласт, или этаж, митохондриального ретикулума повторяется дважды >га каждый саркомер, а все .мышечное волокно имеет тысячи поперечно расположенных «поэтажных» пластов митохондриального ретикулума. Обнаружено, что между «этажами» вдоль миофибрилл располагаются нитчатые мнто.хонтрин, соединяющие эти митохондриальные пласты. Тем самым создается трехмерная картина митохондриального ретикулума, проход я шего через весь объем мышечного волокна (рис. 218).
Как между ответвлениями митохондриального ретикулума, так и между ними и нитевидными продольными митохондриями существуют специальные межмитохондриальные соединения, или контакты (ММК) Они образованы плотно прилегающими наружными митохондриальными мембранами контактирующих митохондрий, меж-мембранное пространство и мембраны в этой зоне имеют повышенную электронную плотность (рис. 219). Было сделано предположение.
348
Рис. 218 Схема трехмерной организации митохондриального ретикулума в скелетной мышце
чго через эти специальные образования может происходить функи по пальнос объединение соседних митохондрий и митохондриальныхре^ тикулумов в единую, кооперативную энергетическую сиете*\ f мнофпбрц.ъ!ы в мышечном волокне сокращаются синхронно ИХ мине, следовательно, и поступление АТФ на любом участке' лот сложной машины тоже должно осуществляться синхрони, жст происходить лишь в том случае, если огромное ко. ветвленных митохондрий-проводников будет связан Клеммами-контактами (ММК). энергетическом
Доказать то. что ММК действительно участвую объединении .митохондрий друг с другом, удалось на другом типе по-йеречно-исчерчен иных мыши — на каРДиомионитах (клетках сердечных мышц). Оказалось, что хопдри-0X1 клеток сердечной мышцы не об-Рйзует ветвящихся структур, а пред-Ставлец множеством небольших ,}ытянулых митохондрий, раснола-
349
Рис. 219. Схема строения чсж.ми-тохонлриального контакта
мм к
Рис. 220. Схема расположения митохондрий в клетке сердечной .мышцы (по: Бакеева, Ченцов, 1989)
ММК межмитокоидриальные контакты;
МФ - МИОфибрИЛ 1Ы
ппошихся без особого порядка между мнофибри злами. Однако все соседние митохондрии стыкуются друг с другом с помощью митохондриальных кон тактов такого же типа, как в скелетной мышне, только их число очень велико: в среднем на одну митохондрию приходится 2-3 ММК. которые связывают митохондрии и единую цепь, где каждым июнем такой цепи (sireptio niiio-cliondrialc) является отдельная митохондрия (рис. 220). Такой тип хоидриома также может служить целям синхронного сокращения всех саркомеров в миофибриллах кардиомиоинтов. Для такой кооперативной координации митохондрий должны служить множественные межмито-хонлриальные контакты (рис. 221 и 222).
Для доказательства этой гипо
тезы были использованы кардиомиоциты эмбрионов крысы в культуре ткани. Эти клетке имеют гетерогенные по размеру и форме митохондрии, расположенные между миофибри гл а ми
(рис. 223). В электронном микроскопе между некоторыми митохондриями были видны ММК, объединяющие их в небольшие группы -
кластеры. В дальнейшем были проведены эксперименты, аналогичные тем. которые были сделаны на культуре фибробластов: митохондрии живых кардиомиоинтов окрашивали этил родами ном. а затем одну из митохондрий в группе облучали лазерным микропучком. Облучение одиночных митохондрий приводило к быстрому их гашению. В одних случаях погасала только облученная митохондрия, в других — терм ia люминесценцию вся группа митохондрий (рис. 224). Электронная микроскопия показала, что в последнем случае митохондрии н кластере были связаны друг с другом с помощью М МК. Следовательно, если одиночные митохондрии теряют этилродамин после лазерного укола вследствие электрического пробоя митохондриальной мембраны, io гашение группы митохондрий, связанных ММК, доказыва-
350
35 Г
Рис. 222. Карлномионит крысы (фото ТВ. Липиной)
Межми.охонлрилчъные контакты (ММК) объединяют ряд миюхондрий (М) в поточечною систему митохондриальною ретикулума (sireplio niilochondriale). МФ МИОфнбри 1 1Ы
352
ст. что ММК, как клеммы, объединяют в единую цепь потенциалы одиночных митохондрии. По всей вероятности, области ММК проницаемы для протонов, которые MOiyr передаваться с внутренней митохондриальной мембраны одной митохондрии на внутреннюю мембрану apyiой и тем самым объединять митохондрии в единую энергетическую систему
Как оказалось. мсжмитохоидри-альные контакты, как обязательная структура сердечных клеток, встречаются не только у крыс. Они обнаружены в кар то мио нитах как желудочков, так и предсердии всех нозионоч-ных животных: млекопитающих.
Рис. 223. Флуоресцирующие митохондрии карлиомиоиита при окраске этилродамином
птии, пресмыкающихся, амфибий и костистых рыб. Более того. ММК были выявлены (но в меньшем числе) в клетках сердца некоторых насекомых и моллюсков. Эти наблюдения говорят о чрезвычайно важной биологической роли лих crpvKryp, характеризующих митохондрии интенсивно и постоянно работающих клеток сердца.
Количество ММК в кардиомиоии-тах изменяется в зависимости от функциональной нагрузки на сердце. Так. если у крыс вызвать экспериментальное усиление работы сердечной мыш-ны, например при компенсаторном гипертрофии миокарла (частичная перевязка аорты), то количество ММК Увеличивается почти вдвое. Увеличивается число ММК и при повышении фишческих нагрузок животных. Нао борот, при ограничении подвижности животных, находящихся в тесных камерах более четырех месяцев (как в космическом корабле), при падении нагрузки на сердечную мышну происходит резкое сокращение числа ММ
353
Рис. 224. Гашение группы митохондрий карлиомиоиита после Х-ения однойиз митохондрий (показано стрелкой) (по: Бакеева, Чениов. 1989) а - ф.|\срсснируюшмс митомж щии ' -.г -пня' б — го после облук.*-10 оолучения.
лия
Ге же закономерности наблюдаются н у других животных в естественных условиях их жизни. Так, уменьшается число ММК у зимних сняшнх летучих мышей. у зимующих сурков. Резко возрастает число ММК в кардном ионитах летающих стрижей по сравнению с их птенцами до вылета нз гнезда. Из этих наблюдений можно сделать обобщение: чем выше функциональная нагрузка на карлиомиоциты, чем выше потребление энерз ин, тем большее количество ММК связывает отдельные митохондрии в единую кооперативную систему.
На рис. 225 показаны варианты организации хондриома в различных клетках. Хондриом может иметь различную композицию в зависимости от энср|етнческих потребностей клетки. И простейшем (и чаще встречающемся ) случае он может быть представлен множеством разрозненных небольших митохондрий, функционирующих независимо друг от друга и снабжающих АТФ небольшие участки цитоплазмы. В другом случае длинные и разветвленные митохондрии могут энергетически обеспечивать отдаленные друг от друга участкзз клетки. Вариантом такой протяженной системы может быть хондриом типа митохондриального ретикулума, который встречается как у одноклеточных, так и у многоклеточных организмов. Особенно сложно
Рис. 225. Схема различной организации хондриома
и митохондриатьвая сеть (relicolum niaochondnale); б — мтовоилриальная пепь tslrepiio milochondrialo; к - зппчатыс митохондрии; г - одиночные митохондрии
354
этот вид хондриома выражен в скелетных мышцах Мяековигаюпш где тру»пы гшаитских ра.ветвленных митохондрий ctutZ.,™ '
другом С помошью ММК. Вообще же наличие ММК характепно^ ° хотшриомов сократимых структур. Особенно обмыто ММК поезст ни в клетках сердечных мышц, тле они функционатьносвязывают жестиенные отдельные митохондрии в единую разве.пленную цепь
Глава 19
Пластиды
Пластиды — это мембранные органоиды, встречающиеся у фото-сшггезируюших эукариотических организмов (высшие растения, низшие водоросли, некоторые одноклеточные организмы). Подобно мито-
рис. 226. Строение хлоропласта то), лейкопласта (Л амилопласта та) и мх
«""ластам ,, „^(строим:а-
внешняя мембрана; 2- внутренняя мемораиа. J 1 пигментами
««: з- тратта; «Хлакошт; 7 ч»хмалыюеа- тхпм-ама»
355
хон триям. пластиды окружены /шумя мембранами, в их матриксе имеется собственная геномная система. функции пластид связаны с энергообеспечением клетки, идущим па нужды фотосинтеза. У высших растении H.iiricn целый набор различных пластид (хлоропласт, лейкопласт, ами юпласг. хромопласт), представляющих собой ряд взаимных превращений одного вила пластиды в яругой. Основной структурой, которая осуществляет фотосинтетические процессы, являстси хлоропласт (рис. 226, а).
Хлоропласт
Как уже указывалось, строение хлоропласта в принципе напоминает строение митохондрии. Обычно это структуры удлиненном формы с шириной 2—4 мкм и протяженностью 5-10 мкм. У зеленых водорослей встречаются гигантские хлоропласты (хромагофоры), достигающие длины 50 мкм. Количество хлоропластов в клетках разных растений не стандартно. Так, у зеленых водорослей может быть по одному хлоропласту на клетку. Обычно на клетку высших растений приходится в среднем 10—30 хлоро пластов. Встречаются клетки с огромным количеством хлоропластов. Например, в гигантских клетках палисадной ткани махорки обнаружено около 1000 хлоро пластов.
Хлоропласты представляют собой структуры, ограниченные двумя мембранами — внутренней и внешней. Внешняя мембрана, как и внутренняя, имеет толщину около 7 мкм, они отделены друг от друга межмембранным пространством около 20—30 нм. Внутренняя мембрана хлоронластов отделяет строму пластиды, аналогичную матриксу митохондрий. В строме зрелого хлоропласта высших растений видны два типа внутренних мембран. Это — мембраны, образующие плоские. протяженные ламеллы стромы, и мембраны тилакоидов - плоских дисковидных вакуолей, или мешков.
Ламеллы стромы (толщиной около 20 мкм) представляют собой плоские полые мешки или же имеют вид сети из разветвленных и связанных друг с другом каналов, располагающихся в одной плоскости. Обычно ламеллы стромы внутри хлоропласта лежат параллельно друг другу и не образуют связей между собой.
Кроме мембран стромы в хлоропласгах обнаруживаются мембранные тилакоиды. Эго плоские замкнутые мембранные мешки, имеющие форму диска. Величина межмембраниого пространства у них также около 20—30 им. Такие тилакоиды образуют стопки наподобие столбика монет, называемые гранами (рис. 227). Число тилакоидов па отну грану очень варьирует: от нескольких плукдо 50 и более. Размер щкич стопок может достигать 0,5 мкм. поэтому граны видны в неко
356
торых обьектах в световом микроскопе. Количество граи в хло-ропластих высших растений может достигать 40—6(1. Тилакоиды в гране сближены друг с другом так, что внешние слои их мембран тесно соединяются; в месте соединения мембран тилакоидов образуется плотный слой толщиной около 2 нм. В состав граны кроме замкнутых камер тилакоидов обычно входят и участки ла-мелл, которые в местах контакта их мембран с мембранами тилакоидов тоже образуют плотные слои толщиной 2 нм. Ламеллы стромы, таким образом, как бы связывают .между собой отдельные граны хлоропласта. Однако полости камер тилакоидов всегда замкнуты и не переходят в камеры межмембранного про странства ламелл стромы. Ла-
fl
б
Рис. 227. Строение граны
а - обший вил: 6 - схема разреза: / -тилакоид; 2 - ламелла стромы; 3- участок спаренных мембран
мелям стромы и мембраны тила-
коидов образуются путем отделения от внутренней мембраны при на-
чальных этапах развития пластид.
В матриксе (строме) хлоропластов обнаруживаются молекулы (НК, рибосомы: там же происходит первичное отложение запасного полисахарида — крахмала. в виде крахмальных зерен.
Функции хлоропластов
Хлоропласты - это структуры, и которых Kj“^вязыва-синтетнчсскне процессы приводящие в копе, .сахаооа Нию углекислоты к выделению кислорода » синтезе пип|е1пов
Характерным для хлоропластов является нал»1 с е|()|ям При хлорофиллов, которые н придают окраску зелен _ юса1нечно-помощи хлорофилла зеленые растения поглотают спета с опреле-’о света и превращают ее в химическую Пог ю к1^.ре молекулы ленной длиной волны приводит к изменению активированное ’сюрофилла, при этом она переходит в воз ужа 1 ’ ч1Орофи.тга состояние. Освобождающаяся энергия активнрова
357
мере j ряд промежуточных этапов передастся определенным синтетическим процессам, приводящим к синтезу АТФ н к восстанонленню акцептора электронов НАДФН (никотинами шденишшнуклсотид-феюфат) до НАДФН. которые тратятся в реакции связывания СО2 и синтезе сахаров.
Суммарная реакция фотосинтеза может быть выражена следующим обратом:
с ист
//СО2 + лН2О------5- (СН2О)/1 + //О2.
хлорофилл
Таким образом, главный итоговый процесс здесь — связывание двуокиси углерода с использованием воды для образования различных углеводов и выделение кислорода. Молекула кислорода, который выделяется в процессе фотосинтеза у растений, образуется за счет гидролиза молекулы воды. Следовательно, процесс фотосинтеза включает в себя процесс гидролиза воды, которая служит одним из источников электронов или атомов водорода. Биохимические исследования показали. что процесс фотосинтеза представляет собой сложную пень событий, заключающую в себе две фазы: световую и темновую. Первая, протекающая только на свечу, связана с поглощением света хлорофиллами и с проведением фотохимической реакции (реакция Хилла). Во второй фазе, которая может идти в темноте, происходят фиксация и восстановление СО2, приводящие к синтезу углеводов.
В результате световой фазы осуществляются фотофосфорилирование. синтез АТФ из АДФ и фосфата с использованием цепи переноса электронов, а также восстановление кофермента НАДФ в НАДФ-Н, происходящее при гидролизе и ионизации воды. В этой фазе фотосинтеза энергия солнечного света возбуждает электроны в молекулах хлорофилла, которые расположены в мембранах тилакоидов. Эти возбужденные электроны переносятся по компонентам окислительной цепи в тилакоидной мембране, подобно тому как электроны транспортируются по дыхательной цепи в мембране митохондрий. Энергия, освобождающаяся при таком переносе электронов, используется для перекачивания протонов через тилакоидную мембрану внутрь тилакоидов, что приводит к возрастанию разности потенциалов между стромой и пространством внутри тилакоида. Как и в мембранах крист митохондрий. в мембранах тилакоидов встроены молекулярные комплексы АТФ-синтетазы. которые начинают затем транспортировать протоны обратно в матрикс хлоропласта. или строму, и параллельно этому фосфорилировать АДФ. т.е. синтезировать АТФ (рис. 228 и 229).
Таким образом, в результате световой фазы происходят синтез АТФ и восстановление НАДФ, которые затем используются при восстановлении СО2, в синтезе углеводов уже в темновой фазе фотосинтеза.
358
В темновой (не ш вис я шей от потока фотонов) стадии фотосинтеза за счет восстановленного НАДФ и энергии АТФ осуществляется связывание атмосферного СО2, что приводит к образованию углеводов. Процесс фиксации СО2 и образования углеводов состоит из многих этапов, в которых участвует большое число ферментов (никл Кальвина). Биохимическими исследованиями
Рис. 22В. Схема основных функций хлоропласта
Световые реакции локализованы в тилакоидах (/), темновые — в матриксе (2)
показано, что ферменты, участвующие в темновых реакциях, содержатся в водорастворимой фракции хлоропластов, содержащей компоненты
матрикса-стромы этих пластид.
Процесс восстановления СО2 начинается с его присоединения к рибулозодифосфату — углеводу, состоящему из пяти атомов углерода, с образованием короткоживущего С6-соединения. которое сразу распадается на два С3-соединсння. на две молекулы глицерид-3-фосфата.
Именно на этом этапе при карбоксилировании рибулозодифосфа-та и происходит связывание СО2. Дальнейшие реакции превращения глицернд-3-фосфата приводят к синтезу различных гексоз и пентоз, к регенерации рибулозодифосфата и к его новому вовлечению в цикл реакций связывания СО2. В конечном счете в хлоропласте из шести
Рис. 229. Поток протонов и синтез АТФ в тилакоида*
Цистах митохонлри й (б) ма (м37рнко; * - тихою;
" внешняя мембрана; 2 - внутренняя мембрана, j ч* • 1
5~ криста
359
молем i (’(h образуется одна молекула ic-ксозы. Для згою процесса цк’буется 12 молекул НАДФ-Н н 1И молекул АТФ. поступающих из световых реакций фотосинтеза. Образовавшийся в результате темно-вон реакции фруктоза -6 фосфат лает начало сахарам, полисахаридам (крахмал) и пуикюлипп/шм. В строме хлоропластов, кроме того, из части глицерил-3- фосфата образуются жирные кислоты, аминокислоты н крахмал. Синтез сахарозы завершается в цитоплазме.
1? строме хяоропласгов происходит восстановление нитритов до аммиака за счет энергии электронов, активированных снегом; в растениях этот аммнак служит источником азота при синтезе аминокислот и нуклеотидов.
Онтогенез и функциональные перестройки пластид
Многих исследователей занимал вопрос о происхождении пластид и о путях их образования. Еще в конце позапрошлого столетия было найдено, что у нитчатой зеленой водоросли спирогиры деление клеток при вегетативном размножении сопровождается делением иххромато-фора путем перетяжки. Подробно исследована судьба хлоропласта у зеленой водоросли хламидомонады (рис. 230). Оказалось, что при бесполом. вегетативном, размножении сразу вслед за делением ядра наступает перешнуровка гигантского хроматофора на две части, каждая из которых попадает в одну из дочерних клеток, где дорастает до исходной величины. Такое же равное разделение хлоропласта происходит и при формировании зооспор. При образовании зиготы после слияния гамет, каждая из которых содержала хлоропласт, после объединения ядер хлоропласты сначала соединяю гея тонкой перемычкой, а затем их содержимое сливается в одну крупную пластиду.
У высших растений также встречается деление зрелых хлоропластов, но очень редко. Увеличение числа хлоропластов и образование других форм пластид (лейкопластов и хромопластов) следует рассматривать как путь превращения структур-предшественников — пропластид. Весь же процесс развития различных пластид можно представить в виде монотропного (идущего в одном направлении) ряда смены форм:
Пропластида —> Лейкопласт —> Хлоропласт —> Хромопласт
Амилопласт---------------------—
Многими исследованиями был установлен необратимый характер онтогенетических переходов пластид. У высших растений возиикно-
360
Рис. 230. Деление хлоропласта (хроматофора) хламидомонады при вегетативном делении клетки
/-7- стадии деления хлоропласта
веине и развитие хлоропластов происходят через изменения про
Пропластиды представляют собой мелкие (0.4 1 ^т^Йх-дн-бранные пузырьки, внутреннее строение которых.неим бо отличительных черт. По сравнению с вакуоля. )е мемб-
более плотное содержимое и имеются две отгран ' н ,-ц дрол^е-раны - внешняя и внутренняя (наподобие промт о ьшцс с1лалки вых клеток). Внутренняя мембрана может давать вс1реча-
ити образовывать меИкие вакуоли. Г!Р°пласт11дь1,корня..листьев, ются в делящихся тканях растений (клетки мер, с |ичение ихчис-вточке роста стеблей и др.). По всей вероятна : 01Те.тапро-
за происходит пу гем деления или почковани пластиды мелких двумембранных пузырьков. В|1Т11Я растений.
Судьба таких пропластид зависит от уел ша(07СЯ в хлоропла-При норма.н.ном освещении пропластиды пр
361
Строма
Инициальная частица
5 мкм Полностью развитой
хлоропласт
Рис. 231. Онтогенез хлоропластом (по: Muhlcthalcr, Fray-Wyssling, 1959) GieBd - нормальное разни гнс хлоропластов на свету, справа разни гис их в темноте
сты. Сначала они растут, при этом происходит образование продольно расположенных мембранных складок от внутренней мембраны. Одни из них простираются по всей длине пластиды и формируют ламеллы стромы; другие образуют ламеллы тилакоидов, которые выстраиваются в виде стопки и создают граны зрелых хлоро пластов.
Несколько иначе развитие пластид происходит в темноте. У этиолированных проростков вначале увеличивается объем пластид (этиопластов), но система внутренних мембран не строит ламеллярные структуры, а образует массу мелких пузырьков, которые скапливаются в отдельные зоны п даже могут формировать сложные решетчатые структуры (проламелляриые тела). В мембранах этиопластов содержится протохлорофилл — предшественник хлорофилла желтого шве га. По (де»1ствие.м света из этиопластов образуются хлоропласты, прото-хлорофи 1.1 превращается в хлорофилл, происходит синтез новых мем-
362
бран. фотосинтетических ферментов и компонентов пени переноса электронов. г
При освещении клеток мембранные пузырьки и трубочк,, быстро реорганизуются, из них развивается полная система ламелл и тилако-идов. характерная для нормального хлоропласта.
Лейкопласты отличаются от хлоропластов отсутствием развитой ламеллярной системы (рис. 226. б). Встречаются они в клетках запасающих тканей. Из-за их неопределенной морфологии лейкопласты трудно отличить от пропластид, а иногда и от митохондрии. Они. как и пропластиды, бедны ламедлами, но тем не менее способны к образованию под влиянием света нормальных тилакоидных структур и к приобретению зеленой окраски. В темноте лейкопласты могут накапливать в прола меллярных телах различные запасные вещества, а в строме лейкопластов откладываются зерна вторичного крахмала. Если в хлоропластах откладывается так называемый транзиторныи крахмал, который присутствует здесь лишь во время ассимиляции СО2, то в лейкопластах может происходить истинное запасание крахмала. В некоторых тканях (эндосперм злаков, корневища и клубни) накопление крахмала в лейкопластах приводит к образованию амилопластов.
сплошь заполненных гранулами запасного крахмала, расположенных в строме пластиды (см. рис. 226. в).
Другой формой пластид у высших растений является хромопласт, окрашивающийся обычно в желтый свет в результате накопления в
нем каротиноидов (см. рис. 226, г). Хромопласты образуются из хлоропластов и значительно реже из лейкопластов (например, в корне моркови). Процесс обесцвечивания и изменения хлоропластов легко наблюдать прн развитии лепестков или при созревании плодов. Прн этом в пластидах могут накапливаться окрашенные в желтый цвет капельки (глобулы) или в них появляются тела в форме кристаллов. Эти процессы сопряжены с постепенным уменьшением числа мембран в пластиде, с исчезновением хлорофилла и крахмала. Процессе разова ния окрашенных глобул объясняется тем, что при разрушении ламелл хлоропластов выделяются липидные капли, в которых хорошо расти ряются различные пигменты (например, каротиноиды), аким' _ зом, хромопласты представляют собой дегенерируй^ ормы пластид, подвергнутые липофанерозу распаду лил пр
плексон.
Фотосинтезирующие структуры низших эукариотических прокариотических клеток
Строение пластид у низших нь,е. бурые и красные тений в обших чертах сходно. Их мембранные 363
(|мно’кнс1ви1с’|ып.1с ии1мснгы. Хлороилисты зеленых и бурых поло-рос ни (иши да их нл шпаки хрома i офора ми) имеют также внешнюю и них ipeiHiKHO мембраны; последняя образует плоские мешки, располагающиеся параллельными слоями, граны у них форм не вс|речают-ся (рис. 232). У зеленых водорослей и состав .хроматофора входят пиреноиды. представляющие соСюй окруженные .мелким» вакуолями зону, вокруг которой происходит отложение крахмала (рис. 233).
Форма хлоронластов у зеленых водорослей очень разнообразна: это ил» /шинные спиральные ленты ISpirotfra), сети (Oedogpnium), или мелкие округлые образования, похожие на хлоропласты высших растений (рис. 234).
Среди прокариотических ор!анизмов многие группы обладают фотосинтетическими аппаратами и имеют в связи с этим особое строение. Для фотосинтезирующих микроорганизмов (синсзсленые водоросли н многие бактерии) характерно, что их фоточувствитсльиые
Рис. 232. Хроматофор (хлоропласт) эвглены
Граны отсутствуют: спаренные тилакоиды являются основной мембранной структурой Я ядро; М митохондрии; ЛГ дик-гпосомв: П - пелликула: Т — ппаконд
Рис. 233, Схема строения клетки хламидомонады
П — пиреноид; К — крахмал; КС - клеточная стенка: НМ - плазмалемма; ОХ - внешняя мембрана хромат офора; Т - тилакоиды; С - глазок, ст hi мд; М митохон прим; Д - ликтиосомы: Р -рибосомы; ЭПР зидонлазматическип ретикулум: Я ядро; Ж - жп гики
364
ши менты локализуются в плазматической мембране или в ее выростах. направленных в глубь клетки.
В мембранах сине зеленых водорослей кроме хлорофилла находятся пш менты фикобилины. Фотосинтезирующие мембраны синезеленых водорослей образуют плоские мешки (ламеллы). которые распо-ла1аются параллельно друг нал другом, иногда образуя стопки или спирали. Все эти мембранные структуры создаются за счет инвагинаций плазматической мембраны.
У фотосинтезирующих бактерий (Chromatium) мембраны образуют мелкие пузырьки, число которых так велико, что они заполняют практически большую чаезь цитоплазмы. Можно видеть, как эти пузырьки образуются за счет впячиванпя н последующего роста плазма тической мембраны. Эти мембранные пузырьки (нх также называют хроматофорами) содержат фоточувствительный пигмент бактериохлорофилл, каротиноиды. компоненты фотосинтетической системы переноса электронов и фотофосфорилирования. Некоторые пурпурные
Рис. 234. Вилы
.офоро". К1речаюш»««
у водорослей
365
3
Рис. 235. Строение фотосинтетического аппарата у некоторых прокариотических клеток
а — с ине зеленая водоросль Anahenaz б — серная пурпурная бактерия Chromatium minutis-simumi в — нссерная пурпурная бактерия Rhodopseudomonas viridis.
1 клеточная стенка: 2 — плазматическая мембрана; 3 - нуклеоид; 4 — тилакоиды; 5 -чроматофоры (вакуоли)
бактерии имеет систему мембран, образующих правильные стопки, наподобие тилакоидов в гранах хлоропластов (рис. 235).
Геном пластид
Подобно митохондриям, хлоропласты имеют собственную генетическую систему, обеспечивающую синтез ряда белков внутри самих пластид. В матриксе хлоропластов обнаруживаются ДНК, разные РНК и рибосомы. Оказалось, что ДНК хлоропластов резко отличается от ДНК ядра. Она представлена циклическими молекулами длиной до 40-60 мкм, имеющими молекулярную массу 0,8—1.3 I О8 Да. В одном хлоропласте может быть множество копий ДНК. Так, в индивидуальном хлоропласте кукурузы присутствует 20-40 копий .молекул ДНК. Длительность цикла и скорость репликации ядерной и хлоропластной ДНК, как было показано на клетках зеленых водорослей, не совпадают. ДНК хлоропластов нс состоит в комплексе с гистонами. Все эти характеристики ДНК хлоропластов близки к характеристикам ДНК прокариотических клеток. Более того, сходство ДНК хлоропластов и бактерий подкрепляется еще и тем. чго основные регуляторные последовательности транскрипции (промоторы, терминаторы) у них одинаковы. На ДНК хлоропластов синтезируются все вилы РНК (информационная, трансферная, рибосомная). ДНК хлоропластов кодирует рРНК, входящую в состав рибосом этих пластид, которые относятся к
366
прокариотическому 70S типу (содержат I6S и 23S рРНК). Рибосомы хлоропластом чувствительны к антибиотику хлорамфениколу подавляющему синтез белка у прокариотических клеток.
В хлоропластах, как и в митохондриях, мы вновь сталкиваемся с существованием особой системы синтеза белка, отличной от таковой в клетке. Эти открытия вновь пробудили интерес к теории симбиотического происхождения хлоропластов. Идея о том. что хлоропласты воз никли за счет объединения клеток-гетеротрофов с прокариотическими сииезелеными водорослями, высказанная на рубеже XIX и XX ив, А.С. Фемининным и К С. Мережковским, вновь находит свое подтверждение. В пользу этой теории говорит удивительное сходство строения в функциональных свойств хлоропластов в синезеленых водорослей, в первую очередь их способность к фотосинтетическим процессам
Известны многочисленные факты истинного эндоси.мбиоза синс-
зеленых водорослей с клетками низших растений и простейших, где они функционируют и снабжают клетку-хозяина продуктами фотосинтеза. Оказалось, что выделенные хлоропласты могут также отбираться некоторыми клетками и использоваться ими как эндосимбион-ты. У многих беспозвоночных (коловратки, моллюски), питаюшнхея высшим» водорослями, которые они переваривают, интактные хлоро-пласты оказываются внутри клеток пищеварительных желез. Так, у некоторых растительноядных моллюсков в клетках найдены интактные хлоропласты с функционирующими фотосинтетическими системами, •й активностью которых следили по включению ,4СО2.
Как оказалось, хлоропласты могут быть введены в цитоплазму клеток культуры фибробластов мыши п}тсм пиноиитоза Однако они не подвергались атаке гидролаз. Такие клетки, включившие зеленые хяо-ропласты, могли делиться в течение пяти генераций, а хлоропласты при этом оставались интактными и проводили фотосинтетические реакции. Были предприняты попытки культивировать хлоро пласты в искусственных средах: хлоропласты могли фотосинтезировать, в них шел синтез РНК, они оставались интактными 100 ч, у них даже в течение 24 ч наблюдались деления. Но затем происходило падение активности хлоропластов, и они погибали. ™
Эти наблюдения и целый ряд биохимических работ показалъ что те черты автономии, которыми обладают точны для длительного поддержания их ф>ик
воспро,введения. полностью расшифровать всю последова-
в последнее время 'Оческой молекулы ДНК хлоропла-
телыюетьнуклеотидоввсосм*:ии кшироватьло (20 reH01I. cpeJ1I
стов высших растений Эта Л НК felKOB VTOp0„ 1астоа. re-
них: гены 4 рибосомных РНК, ы поропластов. несколько
вы некоторых субъединии Р , ц АТф_с„нтетазы, части бел-белков lull фотосистем, 9 из 12 > ?
ков комплексов цепи переноса элемронсш. одной из субъединиц рибу-ю«» шфосф.и карбоксилазы (ключевой фермент связывания СО-,), 10 mojckvi тГНК в еще 40 вока неизвестных белков. Интересно, что счо шый набор генов в ЛИК хлоропластом обнаружен у таких далеко отстоящих предстали гелей высших растений, как табак и печеночный мох.
Основная же масса белков хлоропластов контролируется якорным iciiomom. Оказалось. что ряд важнейших белков, ферментов, а соот-ветс1вснно. и метаболические процессы хлоропластов находятся пол 1енетическпм контролем ядра. Так, клеточное ядро кош рокирует отдельные этапы синтеза хлорофилла, каротиноидов, липидов, крахмала. Под ядерным контролем находятся многие энзимы темновой сталии фотосинтеза и другие ферменты, в том числе некоторые компоненты цепи транспорта электронов. Ядсрные гены кодируют ДНК-по-лимсразу и аминоапил-тРНК-синтстазу Х-юропластов. Пот контролем ядерных генов находится большая часть рибосомных белков. Все эти данные заставляют говорить о хлоропластах, так же как и о митохондриях, как о структурах с oi ран пленной автономией.
Транспорт белков и з цитоплазмы в пластиды происходит в принципе сходно с таковым у митохондрий. Здесь также в местах сближения внешней и внутренней мембран хлоропласта располагаются каиалооб-разукэшис интегральные белки, которые узнают сигнальные последовательности хлоропластных белков, синтезированных в цитоплазме, и транспортируют их в матрикс-строму. И з стромы импортируемые белки, согласно дополнительным сигнальным последовательностям, могут включаться в мембраны пластиды (тилакои 1Ы. ламеллы стромы, внешняя и внутренняя мембраны) или локализоваться и строме, входя в состав рибосом, ферментных комплексов цикла Кальвина и др.
Удивительное сходство структуры и энергетических процессов у бактерий и митохондрий, с одной стороны, и у синезеленых воторос-лей и Viоропластов - с другой, служит веским аргументом в пользу теории симбиотического происхождения этих органелл. Со|ласно этой теории, возникновение эукариотической клетки прошло через несколько этанов симбиоза с другими клетками. На первой стадии клетки типа анаэробных гетеротрофных бактерий включили в себя аэробные бактерии, пре врат в виз неся в .митохондрии. Параллельно этому в клетке-хозяине прокариотический геноЦюр формируется в обособленное от цитоплазмы ятро. Так могли возникну гь гетеротрофные эукариотические клетки. Повторные эндоснмбиотические взаимоотношения между первичными эукариотическими клетками и си-исзелепыми водорослями привели к появлению в них структур типа хлоро пластов, позволяющих клеткам осуществлять аутосинтетичсские процессы и не зависеть от наличия органических субстратов (рис. 236). В процессе становления такой составной живой системы часть it нети -ческой информации митохондрий и пластид могла изменяться, пере-
368
м
Рис. 236. Гипотетическая схема симбиотического происхождения эукариотических клеток
а образование клеточною ядра из нуклеоида у гетеротрофной клетки; б - образование многохромосомного ядра за счет слияния клеток; в - прокариотическая гетеротрофная клетка; г - прокариотическая автотрофная (фотосинтсзнрхюшая) ктетка; <?- эукариотическая гетеротрофная клетка (тип клетки животных); е- эукариотическая автотрофная клетка (тип клетки растений). Я - ядро; М - митохондрия; X - хлоропласт нестись в ядро. Так, две трети из 60 рибосомных белков хлоропластов кодируется в ядре и синтезируется в цитоплазме, а потом встраивается в рибосомы хлоропластов, имеюише все свойства прокариотических рибосом. Такое перемещение большой части прокариотических генов и ядро привело к тому, что эти клеточные органеллы, сохранив часть былой автономии, попали пол контроль клеточного ядра, определяющего в большей степени все главные клеточные функции.
ЧАСТЬ ШЕСТАЯ
ЦИТОПЛАЗМА: ОПОРНО-ДВИГАТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА (ЦИТОСКЕЛЕТ)
В предыдущих главах уже много и часто говорилось о движении: движутся хромосомы к полюсам клетки во время митоза, перемещаются вакуоли клеточных органелл, движется клеточная поверхность. Кроме того, в клетках растений и животных наблюдаются токи цнто-плазмы (например, в растительных клетках или у амебы). Более того, отдельные клетки (своболноживущпе одноклеточные организмы или специфические типы клеток в многоклеточных животных организмах) обладают способностью активно перемешаться, «ползать» (рис. 237, см. вклейку). Некоторые клетки имеют специализированные структуры, реснички или жгутики, которые позволяют нм или самым перемешаться. или перемешать окружающую их жидкость. Наконец, у мно-।©клеточных животных организмов есть специализированные клетки, мышечная работа которых позволяет производить различные движения органов, отдельных его частей и всего организма. В основе всех этих многочисленных двизательных реакции лежат общие молекулярные механизмы. Кроме того, наличие каких-либо двигательных аппаратов должно сочетаться и структурно связываться с существованием опорных, каркасных или скелетных внутриклеточных образований. Поэтому можно говорить (описывать и изучать) об опорно-двигательной системе клеток.
Само понятие о цитоскелете или скелетных компонентах цитоплазмы разных клеток было высказано Н. К.Кольцовым, выдающимся русским цитологом еще в начале XX века. К сожалению, они были забыты и только в конце 1950-х годов с помощью электронного микроскопа эта скелетная система было переоткрыта.
Огромный вклад в изучение цитоскелета внес метод иммунофлуоресценции, который помог разобраться в химии и динамике этого чрезвычайно важного компонента клетки. Цитоскелетныс компоненты представлены нитевидными, иеветвящимися белковыми комплексами. или филаментами (тонкими нитями).
Существуют три системы филаментов, различающихся по химическому составу, ультраструктуре и функциональным свойствам. Самые
370
р”с. 238. Микрофотография элементом пнтоскмста. полученная с поошью электронного микроскопа
' - НГ.КИ микрофилзмекюв; 2- микротр^"*- фихаю<ты.
4 ~ н.лззмагическая мембрана: 5- ядро
371
KHIKHI- ИНГИ no микрофиламснты: их диаметр соегавляет около 6 им II cocioin они II основном из белка актина. К другой группе нитчатых структур относятся микротрубочки, которые имеют диаметр 25 нм и состоят в основном из белка |убулнна. Третья группа представлена про-межу (ОЧНЫМИ фи |амсптами с диметром около 10 нм (промежуточный ио сравнению с 6 и 25 нм), образующимися из разных, но родственных белков (рис. 2.3Х и 239).
Вес зги фибриллярные структуры могут участвовать в качестве составных частей в процессе физического перемещения клеточных компонентов пли лаже целых клеток, кроме того, в ряде случаев они выполняют сугубо каркасную скелетную роль. Элементы цитоскелета встречаются во всех без исключения эукариотических клетках; анало-III этих фибриллярных структур встречаются и у прокариот. Степень выраженности их в разных клетках может быть различной. Например, клетки эпидермиса кожи особенно богаты промежуточными филаментами, мышечные клетки - актиновыми микрофиламентами, особенно много микротрубочек в пигментных клетках, меланоцитах, в отростках нервных клеток и т.д.
Общим для элементов цитоскелета является то, что все они представляют собой белковые, невствяшиеся фибриллярные полимеры, нестабильные, способные к полимеризации и деполимеризации. Такая нестабильность может приводить к некоторым вариантам клеточной подвижности, например к изменению формы клетки. Некоторые компоненты цитоскелета при участии специальных дополнительных
Рис. 239. Схематическое изображение цитоскслетных компонентов клеток 1 минрофиВамеиня; 2~ микротрубочки; I промежуточные филаменты; 4- плазматическая мембрана; 5— ядро; б—митохондрии; 7 рибосомы
372
белкой могут с.абили.пропяться или образовывать сложные а к лярныс ансамбли и шрать только каркасную радь. При взаимо^' виг. с другими специальными белками-транслокаторами (или ИЫМИ белками) они могут участвовать в разнообразных клетоттХ движениях. “
По споим свойствам и функциям элементы цитоскелета можно ра мелить на две группы: только каркасные фибриллы - промежуточные филаменты, а также опорно-двигательные, например актиновые мпкрофпламенты, ггзацмодействуюшие с моторными белками - миозинами. и тубулиновые микротрубочки, взаимодействующие с моторными белками динеинами и кииезинамн.
Причем во второй группе фибрилл цитоскелета (микрофиламенты в микротрубочки) могут происходить два принципиально различных способа движения. Первый из них основан на способности основного белка микрофиламентов - актина, и основного белка микротрубочек -тубулина, к полимеризации и деполимеризации, что при связи этих белков с плазматической мембраной может вы зывать ее морфо.зопгче-ские изменения в виде образования выростов (псевдоподий и ламелло-11ОДИЙ) на краю клетки. Псевдоподии и тонкие выросты (филоподии) могут или втягиваться обратно в клетку, или закрепляться на поверхности клетки и затем участвовать в перемещении клетки по субстрату.
При другом способе передвижения фибриллы актина (микрофила-менты) или тубулина (микротрубочки) являются направляющими структурами, по которым перемешаются специальные подвижные белки -моторы. Последние могут связываться с мембранными или фибриллярными компонентами клетки и тем самым участвовать в их перемещении.
Глава 20
ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ФИЛАМЕНТЫ
Промежуточные филаменты (ПФ) строятся из ф№р ачен.
номеров. Поэтому основная конструкция промежу тов напоминает канат, имеющий толщину около кахф^рпдд.
лнзуются главным образом в околояасриой зоне отходящих к периферии клеток и располагarouiic <- ЧСА(ТОЧ1)ые скои мембраной (рис. 238. 240 и 241). обильны
филаменты во всех тинах клеток животных, ио сйсгвиям: клет-Втех клетках, которые подвержены механ,1'<еСК"1ер.)енмые мышечные К|г эпидермиса, нервные отростки, гладкие и г клетки. В клетках растении ПФ не обнаружены ыцЗЯ группа изо-
Н состав промежуточных филаментов BXO jellITbна четыре ти-
белков (родегвенных белков), которую можн
373
Рис. 240. Промежуточные филаменты (ПФ) фибробласта в культуре ткани, окрашенные флуоресцирующими антителами к виментину |фото Л А. Горгидэе)
Я - я ipo
374
па. Перни и тин составляют кера 1 ины, кислые и нейтральные. встречающиеся в эпителиальных клетках; они образуют re геро полимеры из этих двух подтипов. Кера।ины, кроме того, имеют некоторую гетерогенность. зависящую о! тканевою источника. Так, в эпителиях встречается до 20 форм кератинов. 10
М
Рис. 241. Расположение промежуточных физа-ментов в клетках эпителия
М - мигоз; Я - ядро
форм других кератинов найдено в волосах в ногтях. Молекулярная масса кератинов колеблется от 40 до 70 тыс.
Второй тип белков ПФ включает в себя три вида белков, имевших сходную молекулярную массу (45 -53 тыс.). Это - виментип. характерный для клеток мезенхимного происхождения, входящий в состав ци-
тоскелета клеток соединительной ткани, эндотелия, клеток крови. Десмин характерен для мышечных клеток, как гладких, гак и исчерченных. Глиальный фибриллярный белок входит в состав ПФ некоторых клеток нервной глин — в астроциты и некоторые шванновские клетки. Периферии входит в состав периферических и центральных нейронов.
Третий тип — белки нейрофИ-чамептов (молекулярная масса от 60 до 130 тыс.), встречается и аксонах нервных клеток.
И наконец, четвертый тип - белки ялерной ламины. Хотя эти пос ледние имеют вдернуто локализацию, они сходны но строению и свои ствам со всеми белками промежуточныхфиламентов. „.лн-
Как уже говори чось. промежуточные филаменты построеныi Сриллярных белков наподобие каната. При этом некоторые к. гУт образовывать сополимеры, например виментин с дес. виментин с глиальными белками. сходной амино-
Всс белки промежуточных филаментов оо. тппьнон части кислотной последовательностью из 130 остатков вне” строением. фибриллярной молекулы, которая обладает а<п,,^)вате1ЬН0Стиами-Коицевые же участки молекул имеют разные пос ie ндецчне чокнелот, разную длину и не имеют а-спиральног молекулам обра-протяженных а-спиральных участков позволяет • (CXOJIIT D моле 3°вьщать двойную спираль, подобно том) как э 131ЮГо димера куле миозина, что приводит к образованию п
375
Рис. 242. Этапы полимеризации белков (1-5) н промежуточных филаментов
/ - отдельная молекула; 2 - ли мер: 3- тетрамер-протофиламент; 4, 5 - полимеризация протофиламентов;
6 - сформированный промежуточный филамент
промежуточные филаменты относятся к са-
। ihiioh около 4X им. Дна димера, объедини ясь бок о бок. обра »у ют короткий протофила-мент тетрамер, толщиной около 3 им. Такне нрогофиламенты Moiyr объединяться в более толстые н длинные фибриллы, и н конечном нто1 с образуется промежуточный полный филамент, состоящим из восьми продольных протофн-чаментов (рис. 242).
Иначе полимеризуются белки ядерной ламины: они образуют димеры с головками на одном конце и полимеризуются. создавая рыхлую прямоугольную решетку. Такне слои ламины быстро разрушаются во время митоза прн фосфорилировании ламинов.
Нито п л азмат ич сск не
мым стабильным и долгоживущим элементам цитоскелета. Однако in vivo наблюдается включение инъецированных меченых молекул кератина в состав ПФ эпителиальных клеток. ПФ устойчивы к действию солен низкой и высокой концентрации, разрушаются только после воздействия денатурирующих растворов, таких как мочевина.
Такая структура и химическая устойчивость промежуточных филаментов. вероятно, определяют и их физическую устойчивость. Они служат как бы истинно опорной системой в клетках, подвергающихся значительным физическим на|рузкам. В клетках кожного эпидермиса промежуточные филаменты образуют пучки (тонофнламенты), связанные с дес.мосомамн, и создают жесткую внутриклеточную сеть (рис. 243). Так. в нервных аксонах, простирающихся на многие десятки сантиметров. ПФ. или нейрофиламепты, создают жесткую основу, обеспечивающую гибкость и целостность тонких ц и го плазматических отростков нервных клеток. В поперечно исчерченных мышечных
376
Рис. 243. Клетка шиповатого слоя эпидермиса кожи / дссмосомы; 2 кератиновые промежуточные филаменты
клетках десминовые филаменты входят в состав Z-дисков и связывают их друг с другом как в составе саркомера, так и в соседних миофнбрнл-лах, а также с плазматической мембраной.
Специфических ингибиторов полимеризации белков промежуточ ных филаментов пока еще не найдено. Поэтому остается неясным сам процесс сборки и разборки этих элементов цитоскелета в живой клетке. Вероятнее всего, что они подобно ламинам деполнмерп^ю101 ПР" действии цитоплазматических киназ, приводящих к их фосфорил ро нацию. Выделенные промежуточные филаменты под действ с форилаз могут распадат ься на ^<°номсры. лепоз1,мер,,зоват •
Топографически г. клетке расположение промеж^-ныхф.^ тон поггторяет расположение микротрубочек, она ка п так на-бок. При разрушении микротрубочек колмгиииом р ’ тся в Питаемый коллапс промежуточных фптаменго нопои сст" плотные пучки или кольца вокруг ядра. ^"^Хого^гпра. промежуточных филаментов начинается от з нугстеашш
Эю наводит на мысль, что центром их подимериз могуч быть центры, общие с микротрубочками.
377
Глава 21
МИКРОФИЛАМЕНТЫ
Общие свойства
Мнкрофиламенты (МФ) встречаются во всех клетках эукариот. Особенно они обн’н.ны в высокоспсцнализнрованных мышечных во-юкна\ и клетках. выполняющих функции сокращения мышц. Микро-филаменты входят также в состав специальных клеточных компонеи-юв. таких как мпкроиорсинкн. чей точные соединения эпителиальных клеток. всоставсгереоцияий чувстиительных клеток. Микрофичамен-ты образуют пучки в цитоплазме подвижных клеток животных и слои пот плазматической мембраной — кортикальный слон (рис. 244, о и 245 - см. вклепку). У многих растительных клеток и клеток низших 1рибовон!> располагаются в слоях движущейся цитоплазмы.
Основным белком мнкрофиламентои является актин. Это неоднородный белок, в различных клетках могут быть разные его варианты или изоформы, каждая из которых кодируется своим геном. Так, у млекопитающих есть шесть различных актинов: один в скелетных мышцах, один в сердечной мышце, два типа в гладких мышцах (один нз них в сосудах) и два немышечных цитоплазматических актина являются универсальным компонентом любых клеток млекопитающих. Все эти изоформы актина очень сходны по аминокислотным последовательностям. вариантными в них являются концевые участки, которые определяют скорость полимеризации, но не влияют на сокращение. Такое сходство активов, несмотря на некоторые отличия, определяет их общие свойства. Актин имеет молекулярную массу около 42 тыс. и в мономерной форме имеет вид глобулы (G-актнн), содержащей в споем составе молекулу АТФ. При его полимеризации образуется тонкая фибрилла (F-актин) толщиной 8 нм, представляющая собой пологую спиральную ленту. Актиновые мнкрофиламенты нолярны по своим свойствам. При достаточной концентрации G-актнн начинает самопроизвольно полимеризоваться. При такой спонтанной полимеризации актина на образовавшейся нити микрофиламента один из ее концов быстро связывается с G-актино.м (плюс-конец микрофила-мента) и поэтому растет быстрее, чем противоположный (.минус-коней) (рис. 246). Если концентрация G-актина будет недостаточной, то образовавшиеся фибриллы F-актпна начинают деполимеризоваться. В растворах. содержащих так называемую критическую концентрацию Ci-акщца. будет устанавливаться динамическое равновесие между но-димеризацией и деполимеризацией, в результате чего фибрилла F-ак-тина будет иметь постоянную длину (рис. 247). Из этого следует, что актиновые мнкрофиламенты представляют собой очень динамичны6
378
Рис. 244. Микрофотография элементов шггоск
По-1>чсиная е помощью электронного микроскопа <х)чм1, мп
микрофи <аме|пы (МФ) и зоне лаж. и>оп мзмы. > мнк
379
о о
Рис. 246. Полимеризация актинового микрофиламента На плюс-коипе филамента включение мономерного актина происходит быстрее
структуры, которые могут возникать И расти или же, наоборот. разбираться и исчезал г. и зависимости от наличия глобулярного актина. На растущем конце нити актина встраиваются мономеры содержащие АТФ. По .мерс нарастания полимера происходит гидролиз АТФ, и мономеры остаются связанными е АДФ. Молекулы актина, соединенные с АТФ прочнее взаимодействуют друг с другом, чем мономеры, связанные с АДФ.
В клетках такая, казалось бы, неустойчивая фибриллярная система стаби лизируется массой специфических бел ков, ассоциирующих с F-актином. Так, белок I'lioiioMHOiitii, взаимодействуя с микрофиламентами, придает им необходимую жесткость. Целый ряд белков, например фи.гамгнг и а-актинин. образует поперечные скрепки между нитями F-актина, что приводит к образованию сложной трехмерной сети, придающей
гелеобразное состояние цитоплазме. Другие дополнительные белки могут связывать филаменты в пучки (фимбрии) ит. д. Кроме того, существуют белки, взаимодействующие с концами микрофиламентои, предотвращая их разборку, они стабилизируют их. Взаимодействие F-актииа со всей этой группой белков ре-
гулирует агрегатное состояние микрофиламентов, их рыхлое или. иа-
Рис. 247. Скорость роста актиновых мик-рофимментов при различных концентрациях свободного актина
оборот, тесное расположе иггс, связь их с другими компонентами. Особую роль при взаимодействии с актином играют белки миозинового типа, которые вместе с актином образуют комплекс, способный к сокращению при расщеплении АТФ (см. рис. 262).
Таким образом, микро филаменты представляют собой фибриллы полимеризованного актина, связанного с многими дрУги" ми белками В принципе
380
микрофиламситы 1,0 |1ССХ чсмышечных клетках могут ocvmw „О крайней мере дна ряда функций: быть частью сократитель^Т „арата, взаимодействуя с мо горными белками (миозин) или вать в формировании скелетных структур, способных к собственвомё движению за счет процессов полимеризации и деполимеризаиии актина.
Особенно много сведений о цитоскелете и омикрофиламентахпоточено при изучении фибробластов в культуре ткани, обладающих способностью к амебоидному движению. Эти клетки не имеют ответственных за движение постоянных фибриллярных структур, их фибриллярный аппарат все время находится в реорганизации: частьфиб-риллярных элементов разбирается в одних участках клетки и иовооб-разуется в друтих.
Обычно пол зущии по поверхности субстрата фибробласт поляризован: у него есть движущийся конец и «хвостовой» отдел (рис. 248 и 249 -см. вклейку). На движущемся конце, который часто более распластан по субстрату, чем боковые и хвостовые участки фибробласта, постоянно возникают и убираются тонкие нитевидные или пластинчатые выросты - ламеллоио ши. Это - ведущий край клетки (ламелто-пчазма). который и обеспечиваетдиижение фибробласта вперед. В таком движущемся фибробласте с помощью антител можно узнать места расположения актина. Он будет распределяться по трем основным частям клетки: в виде тонкого слоя (/) он располагается по всему периметру клетки под плазматической мембраной. Это кортикальный
(cortex - кора) слой. Обильно актин выявляется в выростах цитоплазмы ведущего края клетки (2) и (5) в пучках актиновых фи ламентов, отходящих от ведущего края в глубь клетки (см. рис. 245).
Кортикальный слой состоит из плотной трехмерной сети актиновых филаментов. ассоциированных с плазматической мембра пой. Он обеспечивает ме ханическую устойчивость поверхностному слою цитоплазмы и создает усло-в|,я, позволяющие клетке 11’Менять свою форму и Двигаться. Этот слой по-
РИС. 248. йй^рофи^менты подаянного движушегост, ; сяьзк.
! - .тамеллопашн зн’ж.'ш ||?ади ииц»-
„.новых КОРП.КМЫ1О-
381
стояние mchhci снос агрегатное состояние, переходя из состояния стр\кг\риро1шнно1о геля н жидкий золь. Такие переходы гель-золь связаны с н вменениями в структуре кортикального слоя. Здесь и ассоциации с актиновыми филаментами находятся фибриллярные белки-стябил и заторы (например, филамип), которые образуют сшивки в местах пересечения филаментов, что придаст жесткость всему кортикальному слою. Однако эта жесткость может быть легко снята за счет взаимодействия с другими белками, такими как гель зол ин, которые вызывают фрагментацию в разборку филаментов и тем самым разжижают гель. Такая перестройка полмембранного слоя особенно выражена в ведущем крае, что позволяет быстро менять форму его поверхности, образовывать ламелл ополии и двигаться вперед. В то же время сеть актиновых филаментов способна к сокращению, так как в ней обнаружены короткие миозиновые агрегаты. Эго приводит к втягиванию заметлоподий или к подтаскиванию клеток вперед. Сеть актиновых филаментов в ведущем крае организована более определенно, чем в остальном корте ксе. Здесь о г небольших начальных выростов плазма-леммы внутрь клетки отходят пучки актиновых филаментов, оканчивающихся своими илюс-концами на плазматической мембране.
Сам процесс образования актиновых филаментов и их роста в зоне ламеялоплазмы зависит от ряда регуляторных белков. Один из них. белок WASp/Scar, связывается с плазматической мембраной. В его составе есть участки, скрепляющиеся с актином. Другой специальный белковый комплекс Агр2/3 соединяется с минус-концом растущей цепи полимера, препятствуя его деполимеризации. Такие сложные взаимодействия двух групп регуляторных белков приводят к тому, что на границе с плазматической мембраной происходит надстраивание растущих филаментов, которые могут прогибать плазматическую мембрану так, что возникает топкий вырост - филоподия (рис. 250).
Иначе происходит полимеризация актина при образовании ламел-лопочий. Здесь также ведущую роль играют белки WASp/Scar, которые закрепляются на плазматической мембране, связываются с комплексом Агр2/3и прикрепляют его к боковой поверхности уже готовой актиновой фибриллы. Комплекс Агр2/3 инициирует полимеризацию но-вой актиновой фибриллы, которая начинает расти под углом около 70 по отношению к первичной нити актина и закрепляется на плазматической мембране. Таких новых белковых цепей возникает несколько, и они как бы веером простираются к плазматической мембране и толкают ее вперед. Так образуется псевдоподия, или ламеллоподия (рис. 251). за счет наращивания актиновых филаментов на п.чюс-концах. Одновременное этим происходит деполимеризация тех минус-кониов филаментов, которые не заблокированы комплексами Агр2/3 и подвергаются воздействию белков, способствующих деполимеризации микрофи тментов.
382
.4
Рис. 251. Образование ламс.гзопояии Обозначения см. рис. 250. 5 - кзпнр^юпшй белок
Рис. 250. Образование филоподии
/ - плазматическая мембрана; 2 — актиновый микрофи за мент; 5- бс-зок Лтр 2/3: 4 - белок WASp
Таким образом, сложный процесс роста микрофиламеигов приводит к перемещению в прос гранстве края движущейся клетки. По мере возникновения ламеллоподнй их плазматическая мембрана с помощью белков-интегрннов образует с субстратом фокальные контакты, от которых отходят пучки актиновых филаментов, участвующие уже в другой форме подвижности, связанной со взаимодействиями между актиновыми филаментами и моторными белками-миозинами.
Миозины являются одним из составных компонентов микрофила ментов. Основная работа по перемещению клеток пли их вн'7Ре™ компонентов с помощью микрофиламентов происходит засче ты актомиозинового комплекса, где актиновые фибриллы игра Р°• • направляюпгнх («рельсы»), а миозины „е
миозиновый комплекс представляет собой А осуществляется за счет энергии гидролиза АТФ. Увсехиз
Миозины представляют собой семейство сходны актпи-
Hiix есть головная (моторная ) часть, отвечающая за ^.^ориы-«ость комплекса, шейка, которая связана с нескол каждого гимн белковыми субъединицами, и хвост, харакгерн, вкдегке Суше-па миозина, определяющего специфичность функ ин у яВ.тяются явуют три основных типа миозинов. Миозин ogp.13,CT сверхспи-Димерамп, у которых а-спиральный участок хвотак1яСТсобой моно-Ральный палочковидный участок. Миозин пре МОГзтассовии-мсРиую молекулу (рис. 252). Две молекулы мв' ибриллу.уэаству-
Ровать друг с другом, образуя биполярную то
283
Рис. 252. Типы миозинов а — миозин I; б — миозин V; в миозин II
в
юшую в мышечном сокращении, при сокращении внутриклеточных лучков мнкрофиламентов и при делении клетки. Миозины I и Утипа
Рис. 253. Последовательность актомиозинового движения
° ~ исходное положение: головка миозина (ц связана с актиновым фииамситом < 2): б — г оловка миозина о сходит от актинового филамента; я - готовка миозина связывается с другой субьслиниисй актина; г головка миозина переходи I в исходное положение: перемещение актиновою филамента
участвуют во взаимодействиях между элементами цитоскелета в мембранами, например в транспорте везикул.
Механизм работы актомиозиновых комплексов очень сходен, независимо от типа миозина: он начинается со связи миозиновой головки с актиновым филаментом, ее изгибанием и последующим откреплением. За каждый цикл миозиновая головка перс мешается в направлении плюс-конца актинового филамента на 5-25 нм при гидролизе одной молекулы АТФ. Таким образом происходит однонаправленное смешение или скольжение микро-филаментов относительно молекул миозина (рис. 253).
Актомиозиновые комплексы немышечных клеток
Актомиозиновые комплексы участвуют в движении ламелло-плазмы. Так, молекулы миозина I были выявлены на ведущем крае движущихся амебных форм дик-тиостелиума, в то время как миозин II типа обнаруживался в теле и конце клетки. Миозин I типа
384
THVCT В движении микроворсинок зптсроиитов. Мпкроворсинки >Ч .„ставляют собой тонкие (0.1 мкм) и длинные (около I мкм) выро-л .rccll0 расположенные друг около друга, наподобие густой тетки, СТЫ ываюнтей всю поверхность клетки, смотрящую в просвет кишеч-"°КР На каждой клетке кишечного эпителия насчитывается несколы НИКа сяч микроворспнок, которые увеличивают всасывающую по-К° ™ ть в десятки раз. Внутри каждой мпкроворсники располагает. ВСрХИ ннй пучок из 20 30 актиновых мпкрофпламентов. Актиновые СЯ ПЛ -пепчены своими плюс-кониами к вершине мнкроворсинки. »J,TI* ' ь всего пучка определяется рядом белков, связывающих ак-Жесткост связкамп _ фимбрщюм п фасиииом (рис 254). Ниж-
Г,1Н "четь актинового пучка вплетена в сеть нз .молекул спектрина -.бпанного белка. Такая фибриллярная арматура делает тонкие Хроворсиики жесткими и прочными. В этом проявляется каркас-пая. скелетная роль микрофиламсн-тов Но оказалось. что в составе ми-кроворсинок обнаруживается также миозин, относящийся к миозину 1, содержащему только одну головку и короткий хвост, которым он связан с плазматической мембраной. Io-ловки миозина 1 связываются с актиновыми филаментами и могут вызывать укорачивание или удлинение микроворспнок по принципу сколь-ЗЯЦЦ1Х нитей.
Миозин I также вовлекается в транспорт вакуолей. Например, в клетках кишечного эпителия мио знн I связан с некоторыми везпку ламп аппарата Гольджи. С везикула ми аппарата Гольджи в клетках моз га позвоночных связан миозин V типа.
Наиболее широко представлен в актомиозиновых комплексах мио зпп 11 типа. Он входит в состав пуч ков мпкрофпламентов как в веду •кем крае фибробластов, так и в ИУ4 кахмнкрофиламецтои и теле клетки-Считается, чго сокращение этих комплексов приводит к подтягива нию клетки вперед (рис. 255) Акги новые HV4KH в комплексе с мнози-385
РИС. 254. Строея^
новые '•"1;Роф,Х'1,„)чмчФч*" свягы»а">1“"с * . я .пипоты-.
и.....
.тлтермьныс Р.«”> спектр»»®"фя.ижх'0’ С ТОЙ про™*-
3
Рис. 255. Перемещение фибробласта по субстрату
I - ламеллопоаии; 2 фокальный контакт; 3- пучок микрофиламентов. I-IV - статин перемещения пучков мпкрофнламепгов
ном II особенно хорошо выявляются в остановившихся фибробластах,
где они исполняют совсем другую роль. Эти фибриллярные пучки (они носят название напряженных нитей, или стрссс-фибрилл) тоже содержат все компоненты мышечных тканей (рис. 256 и 257, см. вклейку). Они крепятся с помощью фокальных контактов на плазматической мембране и при сокращении их вызывают вне клетки натя
жение на фибриллах матрикса(коллагеновые волокна), что, вероятно, способствует ориентированной полимеризации компонентой внеклеточного матрикса. Это доказывается тем, ч то если фибробласты посадить на тонкие пленочные подложки, то после образования стресс-фнбрилл пленка около клеток начинает морщиться, собираться в
Рис. 256. Стрссс-фибримы фибробласта
складки.
Другие примеры связи актиновых микрофиламентов с плазматической
3S6
Рис. 258. Разделение тела (шзтотомия) клетки с помощью кольцевого пучка микрофиламентов (а) и блокада этого процесса с помощью цитохалазинаIff) мембраной были приведены при описании клеточных контактов таких как адгезионный поясок в клетках кишечного эпителия и фокальный контакт фибробластов. Адгезивный поясок контактируете циркулярным пучком микрофнламептов, в составе которых кроме актина есть и миозиновые молекулы. При акте сокращения этот циркулярный периферический пучок может сжимать клетку, изменять её форму.
Во время митоза в нормальных условиях клетки животных делятся путем образования перетяжки, или борозды деления Это происходит пслезствие того, что в делящейся клетке в её кортикальном слое образуется скопление иаралелльно идущих актиновых фибрилл, образующих под плазмалеммой сократимое кольцо. В состав кольца кроме актина входит миозин 11 и другие мышечные белки, сокращение кольца приводит к возникновению перетяжки на исходной клетке. что в конце концов обусловливает деление к!зегки надвое (рис. 258).
Цитохалазин — ингибитор полимеризации актина, вызывает деполимеризацию актина в сократимом кольце, шпотомии не происходит, в результате возникает двуядерная клетка, так как при этом расхожде ние хромосом не нарушается.
Актиновые микрофиламепы являются одним из динамичных . ментов цитоскелета, который подвержен быстрым персстро ж '. беино в движущихся клетках.
Мышечные клетки
Специализированные мышечные клетки 1 мнофи-
ных организмов имеют в цитоплазме сократимые ечнЫЧклетках
бриллы. Особенно много мнофибрплл в скелетны Скелетные 11 клетках сердечной мышцы, в гладкомышечных в0 ЮЮи. сим-Мышиы состоят не из отдельных клеток, а из мы клеток - миоб.та-иластов, образовавшихся За счет слияния ',и1ие , 6„(£г1ы имеют ха-стов. В скелетной и сердечной мускулатуре м
387
рактсрную особенность они выглядят исчерченными или нопсреч-нотиосагымн (шеища и нажнше - поперечнополосатая мышечная ткань) (рис. 259 и 260). В снитоноЛ микроскоп видно, чго пучки мио-фибрилл окрашиваются неравномерно: через равные промежутки длины в них видно чередование темных и светлых участков. Темные участки называю! ся анизотропными дисками (А-дискамм), а светлые изотропные (I-диски). Светлый 1-диск пересекается полоской Z. Таким образом, миофнбрилла представляет собой пить (толщиной 1- 2 мкм) с чередующимися участками:
А + 1/2 1+ Z+ 1/2 I + А + 1/2 I + Z + ... и т. л.
Оказалось. чго единицей строения и функционирования является саркомер участок между двумя Z-дискам и. Величина саркомеров в расслабленном состоянии всегда одинакова (1,8 2,8 мкм в зависимости от вида животных). Подробности строения саркомера были получены только прн изучении ммофнбрилл в электронном микроскопе. Оказалось, что мпофнбрнлла подразделяется на ряд более тонких -нротофибрилл. Их диаметр в разных частях саркомера различный. В I-дисках встречаются тонкие (около 8 нм) нити длиной около I мкм, а в А-днсках кроме гонких присутствуют толстые (около 16 нм толщиной) нити длиной До 1.5 мкм. Все >ти нити, протофибриллы, располагаются паралелльно друг другу и друг в друга не переходят. Если рассматривать строение саркомера более подробно, то видно, что вдоль него располагаются три участка нротофибрилл: тонкие, связанные с Z-диском, затем толстые и снова тонкие, связанные со следующим Z-диском (см. рис. 260). В зоне A-дисков кроме толстых фибрилл располагаются КОННЫ топких, идущих от двух Z -дисков.
Была выяснена химическая природа всех компонентов миофнб-рнлл. Оказалось, что тонкие нити состоят в основном из белка актина, а толстые — из белка миозина 11. Z -диски имеют в своем составе белок а-актинин и десмин. В топких нитях кроме актина находятся белки тропомиозин и тропонин.
Миозин, входящий в состав толстых нитей, — очень крупный белок (молекулярная масса 500 тыс.), состоящий из шести цепей: двух длинных. спирально обвивающихся одна вокруг другой (тяжелые цени), и четырех коротких (легкие цепи), которые связываются с глобулярными головками длинных пеней. Последние обладают АТФазной активностью. могут реагировать с фибриллярным актином, образуя актомиозиновый комплекс, способный к сокращению. Толщина миозиновых фибрилл связана с тем, что длинные (150 нм) молекулы миозина агрегируют так. что образуют пучки, в которые входит около 300 таких молекул. В миозиновых толстых (|6 нм) протофнбриллах длинные молекулы лежат «хвост к хвосту» так, что головки миозина располагаются на концах таких нитей, в средней их части головок ист (рис. 261)-
388
.апДИО.'ПЮиИ'-» КР«СЫ-рис. 259. Микрофотография миофиори™ тв Л11ПиноЛ| полученная с помощью электронного мчкроскшм^
. У1-1Ю.1ОСКЗ
с~ саркомер: Z Z-полоска: А - анизотропным л
389
м
Рис. 260. Строение миофибрилл поперечно-полосатой мышечной ткани а - строение одиночной миофибриллы: А - анизотропным диск. Z - Z-диск; б - схема строения саркомера: А актиновые (тонкие, лротофибриллы. М — миозиновые (толстые) протофибриллы. Z — диск, содержащий «х-актинин
Головки образуют поперечные мостики, связывающие между собой актиновые и миозиновые нити.
За счет такой связи головок миозина с актином возникают актомиозиновые комплексы, активность которых н сотни раз выше, чем АТФазная активность одних миозинов.
Актиновые лротофибриллы связаны па одном копие с Z-диском, который состоит из палочковидных, биполярных молекул белка а-актинн-па, который соединяет актиновые фибриллы в пучки. С двух сторон kZ-диску прикрегыяются плюс-конны актиновых нитей соседних саркомеров. Функция Z-дисков заключается как бы в связывании соседних саркомеров друг с другом: Z-диски нс являются сократимыми структурами.
Рис. 261. Молекула миозина {а) и миозиновым протофиламент (б)
390
Толстые, миозиновые, протофиламенты также связаны с Z диском: конны толстых протофи-ламсптов также заякорены в Z диске с помощью длинных и гибких фибриллярных белков - ти тинов. Миозиновые нити в поперечнике миофибриллы располагаются в гексагональном порядке, гак, что каждая миозиновая нить окружается шестью актиновыми нитями (рис. 262). В мышце нет сокращающихся, уменьшающих свою длину молекул. Сокращение происходит за счет уменьшения расстояния между Z дисками, т. е. за счет умеиьшс-
о
тмм
й
® 0
Рис. 262. Взаимное расположение актиновых(/) и .миозиновых (2) молекул в анизотропной области саркомера
ТУМ - готовки миозина II
ния длины саркомеров примерно на 20%. Механизм мышечного сокращения заключается в кооперативном укорачивании всех саркомеров по веси длине миофибриллы. Г. Хаксли показал, что в основе сокращения лежит перемешение относительно друг друга тонких и толстых нитей. При этом толстые миозиновые нити как бы входят в пространства между актиновыми нитями, приближая друг к другу Z-дискл. Эта модель скользящих нитей может объяснить не только сокращение поперечнополосатых мышц, но и любых сократимых структур (рис. 263).
В гладких мышечных клетках также имеются актиновые и миозиновые нити, но они не так правильно расположены, как в исчерченных мышцах. Здесь нет саркомеров, а среди пучков актиновых прото-
Вис. 263. Схема мышечного соКрашеимя зз счет вз
"итей .-2-тонкие ни^<акт",,)
о - расслабление; б — сокращение. I - толстые нити (ми
39)
Рис. 264. Схема гладкомышечной клетки
/ актомиоишовыс пучки: 2 плотные примембраиные и ни гопаазматическис тельца
фибрилл без особого порядка располагаются миозиновые молекулы, которые не образуют толстых агрегатов как в случае соматических мыши, а представляют собой комплексы из 15-20 миозиновых молекул (рис. 264).
Глава 22
МИКРОТРУБОЧКИ
Общая характеристика
Тб
Рис. 266. Строение микротрубочки
Тб - субъединица. лимер тубу.шиа
Одним из обязательных компонентов цитоскелета эукариот являются микротрубочки (рис. 265.СМ. вклейку). Это нитчатые неветвяшпеся структуры толщиной 25 нм, состоящие из белков-ту-булипов и ассоциированных с ними белков. Тубулины микротрубочек при полимеризации образуют полые трубки, откуда и их название. Длина их может достигать нескольких микрометров; самые длинные микротрубочки встречаются в составе аксонемы хвостов снсрмнев.
Микротрубочки обнаруживаются в цитоплазме нптерфазных клеток, где они располагаются поодиночке пли не
392
большими рыхлыми пучками, или в виде lUOHioynaKouau,..,.
трубочек и составе центриолей, батальныхтелси ивресни '",К₽0‘ тиках. При делении клеток большая часть микротрубочек " жгу’ Д»т в состав вере гена деления **аки вхо-
В морфоло. нческом отношении микротрубочки представляют со бои длинные полые цилиндры с внешним диаметром 25 нм (рие 2661 Стенки микротрубочек состоит из полимеризованных молекул белка тубулина. При полимеризации молекулы тубулина образуют 13 продольных протофиламентов. которые скручиваются в полую трубку (рис. 267). Размер мономера тубулина составляет около 5 нм, равного толшнне стенки микротрубочки, в поперечном сечеиии которой видны 13 глобулярных молекул.
Молекула тубулина представляет собой гетеролимср. состоящий из двух разных субъеании: из а-тубулина и р-тубулина. которые при ассоциации образуют собственно белок тубулин, изначально поляризованный. Обе субъсдннипы мономера тубулина связаны с ГТФ. однако наа-субъдиннце ГТФ не подвергается гидролизу, в отличие от ГТФ на р-субъедншнте. где при полимеризации происходит гидролиз ГГФ до ГДФ. При полимеризации молекулы тубулина объединяются таким образом, что с Р-субъединицей одного белка ассоциируется о-субье-динииа следующего белка и т.д. Следовательно, отдельные протофнб-ри.тлы возникают как полярные нити, и соответственно вся микротру-
Рис. 267. Сталии самосборки микротрубочек
393
(=И+)
ин
Рис. 268. Полимеризация тубулинов
На плюс-копие микротрубочки происходит включение димеров тубулинов, связанных с ГГФ. на мипус-конис преобладает диссоциация тубулинов
бочка тоже является полярной структурой имеющей быстро растущий плюс-конец и медленно расту шнй минус- конец (рис. 268)
При достаточной концентрации белка полимеризация происходит спонтанно. Прн спонтанной полимеризации тубулинов осуществляется гидролиз одной молекулы ГГФ связанной с Р-тубулином. Во время наращивания длины микротрубочки связывание тубулинов идет с большей скоростью на растущем плюс-коице. Но при недостаточной концентрации тубулина микротрубочки могут разбираться с обоих концов. Разборке микротрубочек способствуют понижение температуры и наличие ионов Са24.
Существует ряд веществ, которые влияют на полимеризацию тубулина. Так, алка лонд колхицин, содержащийся в безвременнике осеннем (Cokhicum autumnal?), связывается с отдельными молекулами тубулина и предотвращает их полимеризацию. Это приводит к палению концентра
ции свободно!о тубулина, способного к полимеризации, что вызывает быструю разборку цитоплазматических микротрубочек и микротрубочек веретена деления. Таким же действием обладают колцемил и ноко-
дозол, при отмывании которых происходит полное восстановление микротрубочек.
Стабилизирующим действием на микротрубочки обладает таксол, который способствует полимеризаций тубулина даже при его низких
концентрациях.
Все это показывает, что микротрубочки являются очень динамичными структурами, которые могут достаточно быстро возникать и разбираться.
В составе выделенных микротрубочек обнаруживаются ассоциированные с ними дополнительные белки, так называемые МАР-беякв (МАР — microtubule associated proteins). Эти белки, стабилизируя микротрубочки, ускоряют процесс полимеризации тубулина (рис. 269).
В последнее время процесс сборки и разборки микротрубочек ста ли наблюдать в живых клетках. После введения в клетку меченных флуорохромами антител к тубулину и при использовании электронных систем усиления сшнала в световом микроскопе можно видеть, что в живой клетке микротрубочки растут, укорачиваются, исчезают, т.е. постоянно находятся в динамической нестабильности. Оказалось, что среднее время полу жизни цитоплазматических микротрубочек со-
394
яавляет всею лишь 5 мин. Так, за 15 мин около 80% всей популяции микротрубочек обновляется. При этом отдельные микротрубочки могут на растушсм конце медленно (4-7 мкм/мпн) удлиняться, а затем достаточно быстро (14-17 мкм/мин) укорачиваться. В живых клетках микротрубочки в составе веретена деления имеют время жизни около 15-20 с. Считается, что динамическая нестабильность цитоплазматических микротрубочек связана с задержкой гилроли-
Рис. 269. Стабилизация микротрубочек с помощью МАП
за ГГФ, это приводит к тому, что на нлюс-конце микротрубочки образуется зона, содержащая нет ндролизовангтые нуклеотиды (••ГТФ-колпачок-). В этой зоне молекулы тубулина связываются с большим сродством друг к пруту, и, следова те чьно, скорость роста микротрубочки возрастает. Наоборот, при нот ере этого участка, микротрубочки начинают укорачиваться.
Однако 10-20% микротрубочек остаются относительно стабильными достаточно долгое время (до нескольких часов). Такая стабилизация наблюдается в большой степени в дифференцированных клетках. Стабилизация микротрубочек связана или с модификацией тубулинов или с их связыванием с дополнительными (М/УР) белками мик
ротрубочек и с другими клеточными компонентами.
Ацетилирование лизина в составе тубулинов значительно увеличивает стабильность микрол рубочек. Другим примером модификации тубулинов может быть удаление терминального тирозина, что также характерно для стабильных микротрубочек Эти модификации обратимы.
Сами микротрубочки неспособны к сокращению, однако они яв ляются обязательными компонентами многих движущими клетотных структур, таких как реснички и жгутики, как веретено клетки iво р митоза, как микротрубочки цитоплазмы, которыеобязатеть лого ряда внутриклеточных транспортов, таких как экзоии
нис митохондрий и др. „,™>.ick может быть
В целом же роль цитоплазматических м11^™ С1а.1е1Ная, кар-сведена к двум функциям: скелетной идвигат . крогр>бочек в касиая, роль заключается в том. что располож ( „икротру-
чиюплазме стабилизирует форму клетки; при ‘ 5рестн форМу бочек клетки, имевшие сложную форму, стре. не1ОльКО в том. шара. Двигательная роль микротрубочек зактю' доения. Мик-
чго они создают упорядоченную, векторную. с л чсскимт1 ассоипи-ротрубочки цитоплазмы в ассоциации со со нь1е комплексы, спо-Рованными моторными белками образуют ‘ ы собные приводить в движение клеточные ком
395
а б в
Рис. 270. Расположение микротрубочек в цитоплазме фибробласта (о), меланоцита (6) и нейрона (в)
Практически во всех эукариотических клетках в гиалоплазме можно видеть длинные невствяшнеся микротрубочки. В больших количествах они обнаруживаются в цитоплазматических отростках нервных клеток, в отростках меланоцитов, амеб и других изменяющих свою форму клетках (рис. 270). Они могут быть выделены сами или же можно выделить их образующие белки: это те же тубулины со всеми их свойствами.
Центры организации микротрубочек
Рост микротрубочек цитоплазмы происходит полярно: наращивается плюс-конец микротрубочки. Так как время жизни микротрубочек очень коротко, то должно постоянно происходить образование новых микротрубочек. Процесс начала полимеризации тубулинов — нуклеация, происходит в четко ограниченных участках клетки, в так называемых центрах организации микро! рубочек (ЦОМТ). В зонах ЦОМТ осуществляется закладка коротких микротрубочек, обращенных своими ми нус-кои нами к ЦОМТ. Считается, что в зонах ЦОМТ минус-кониы заблокированы специальными белками, предотвращающими или ограничивающими деполимеризацию тубулинов. Поэтому при достаточном количестве свободного тубулина будет наращиваться длина микротрубочек, отходящих от ЦОМТ В качестве ЦОМТ в клетках живот пых участвуют главным образом клеточные центры, содержащие центриоли, о чем будет сказано позже. Кроме того, в качестве ЦОМТ может служить ядерная зона и во время митоза полюса веретена деления.
Наличие центров организации микротрубочек доказывается прямыми экспериментами. Так, если в живых клетках полностью деполи-
396
чернзонам, микротрубочки или с помощью ко шечила даждения клеток. то после снятия воздействия первые и™ W“’ явления микротрубочек будут проявляться в виде радимь, п шихся лучей, О1Х0ДЯ1НИХ oi одного места (иитастер, Обычно животною происхождения иитастер возникает в зоне меточного вГ тра. После такой первичной нуклсанни .мнкротртбочки начинаю™ растать от НОМ I и заполнять всю цитоплазму. Слиоытетьно оастч' шие периферические концы микротрубочек будут всегда плюс-коипа-мн. а мпнус-конны будут располагаться в зоне ЦОМТ(рис. 271 и 272)
Цитоплазматические микротрубочки возникают и расходятся от одного клеточною центра, с которым mhoi не теряют связь, могут быстро разбираться или. наоборот, стабилизироваться при ассоциации с дополи нтсл ьн ы м и бел кам и.
Ошо из функциональных назначении микротрубочек цитоплазмы заключается в создании эластичного, но одновременно устойчивого внутриклеточного скелета, необходимого для поддержания формы клетки. У дисковидных по форме эритроцитов амфибий по периферии клетки лежит жгут циркулярно уложенных микротрубочек; пучки микротрубочек характерны для различных выростов цитоплазмы (ак-соподни простейших, аксоны нервных клеток и т. д.).
Действие колхицина, вызывающего деполимеризацию тубулинов, сильно меняет форму клетки. Так, если огросчатую и плоскую клетку в культуре фиброблас гов обработать колхицином, то она теряет пазяр-ность. Точно таким же образом ведут себя другие клетки: колхицин прекращает рост клеток хрусталика, отростков нервных клеток, обра-
Рис- 271. Динамика восстановления мпкротрубо ?1НИЯ кхтки; «<-,,ода*' (‘~ искилныи фибробласт; б -исчезновение МТ n0CJ‘ _гоцентрат- *с'хтан0К''С ,1Ис первых микротрубочек я виде иигастера и зоне кл
КИс ,,ито1*лазматически\ микротрубочек
397
Рис. 272. Полярность в расположении микротрубочек (МТ) в цитоплазме Все плюс копны МТ «вправлены от центра к периферии клетки
зевание мышечных трубок и т. д. Так как при этом не исчезают элементарные формы присущего клеткам движения, такие как пиноцигоз, ундулируютцпе движения мембран, образование мелких псевдоподий, то роль микротрубочек заключается в образовании каркаса для поддержания клеточного тела, для стабилизации и укрепления клеточных выростов. Кроме того, микротрубочки участвуют в процессах роста клеток. Например, у растении в процессе растяжения клеток, когда за счет увеличения центральной вакуоли происходит значительный рост объема клеток, большие количества микротрубочек появляются в периферических слоях цитоплазмы. В этом случае микротрубочки, так же как и растущая в это время клеточная стенка, как бы армируют, механически укрепляют цитоплазму.
Создавая такой внутриклеточный скелет, микротрубочки могут быть факторами ориентированного движения внутриклеточных компонентов, задавать своим расположением пространства для направленных потоков разных веществ и для перемещения крупных структур. Так, в случае меланофоров (клетки, содержащие пигмент меланин) рыб при росте клеточных отростков гранулы пигмента передвигаются вдоль пучков микротрубочек. Разрушение микротрубочек колхицином приводит к нарушению транспорта веществ в аксонах нервных клеток, к прекращению экзонитоза и блокаде секреции. При разрушении микротрубочек цитоплазмы происходит фрагментация и разбегание по цитоплазме аппарата Гольджи, разрушение митохондриального ретикулума.
Динеины и кинезины - моторные белки
Долгое время считалось, что участие микротрубочек в движении цитоплазматических компонентов заключается лишь в том. что они сотдают систему упорядоченного движения. Иногда в популярной литературе цитоплазматические микротрубочки сравнивают с железнодорожными рельсами, без которых движение поездов невозможно, ио которые сами по себе ничего нс двигают. Одно время предполагали,
398
чт0 двигателем. локомотивом, может быть система актиновых Лита ментов. но оказалось. что механизм внутриклеточного nepc4c,^ раздач.... мембранных и псмембранных компонентов связан с Zn
пой иных белков.
Прогресс был достигнут при изучении так называемого аксональ кого транспорта в пи антских нейронах кальмара. Аксоны - отростки нервных клеток, могут иметь большую длину и заполнены большим числом микротрубочек и нейрофи лимен гов. В аксонах живых нервных клеток можно наблюдать перемещение различных мелких вакуолей и гранул, которые двигаются как от тела клетки к нервному окончанию (антероградный транспорт), гак и в противоположном направлении (ретроградный транспорт). Если аксон перетянуть тонкой лигатурой, тотакон транспорт приведет к скоплению мелких вакуолей по обе стороны от перетяжки. Вакуоли, двигающиеся антероградно, содержат различные медиаторы, в том же направлении могут двигаться и митохондрии. Ретроградно двигаются вакуоли, образовавшиеся в результате зндоиитоза при рециклировании мембранных участков. Эти движения происходят с относительно высокой скоростью: от тела нейрона -400мм в сутки, в направлении к нейрону - 200-300мм в сутки (рис. 273).
Оказалось, что нз отрезка т игантского аксона кальмара можно выделить аксоплазму, содержимое аксона. В капле выделенной аксоплазмы продолжается движение мелких вакуолей и гранул. С помошью ви-деоконтрастного устройства можно видеть, чго движение мелких пузырьков п роисхолит вдоль тонких нитчатых структур, вдоль микротрубочек. Из этих препаратов были выделены белки, ответственные за движение вакуолей. Одни из них кипезии, белок с молекулярной массой около 300 тыс. Он состоит из двух сходных тяжелых поляпептнд-ных цепей и нескольких легких. Каждая тяжелая иепь образует глобулярную головку, которая при ассоциации с микротрубочкой обладает АТФазной активностью, в то время как легкие цепи связываются с мембраной пузырьков или других частиц (рис. 274). При пиролизе А1Ф изменяется конформация молекулы кинезпна и генерируется рс.мешенне частицы в направлении к плюс-кониу микротру
?ИС' 2^3. Схема движения частиц в аксоне г^пюградный транспорт.
5 " тело “сирона; 2 ~ аксон; 3 - нервное окончание; И
антсРО1рз дн ый транспорт
399
Оказалось возможным приклеить, иммобилизовать молекулы киисзи-н.| ил поверхности стекла; сечи к такому пренаразу в присутствии АТФ иямвить свобо тыс микротрубочки, то последние начинают двигаться Наоборот, можно иммобилизовать микротрубочки, но если добавить к ним мембранные пузырьки, связанные с кпнезиио.м. пузырьки начпзыюг двигаться вдоль микротрубочек.
Существует целое семейство киисзипов. обладающих сходными моторными головками, но отличающихся хвостовыми доменами. Так, цитозольные кинезнны участвуют в транспорте по микротрубочкам везикул, лизосом и других мембраиых органелл. Многие из кинетинов связываются специфически со своими грузами. Некоторые участвуют в переносе только митохондрий, другие - только синаптических пузырьков. Кписзины связываются с мембранами через мембранные белковые комплексы - киискгины. Кипезины веретена деления участвуют в образовании этой структуры и в расхождении хромосом.
Рис. 274. Внутриклеточное перемещение вакуоли е помощью кинетина и направлении к влюс-конну микротрубочки (МТ)
о - молеку та кинетина: 1 - тяжелее пени. 2 лежне лепи: 6 — участие кинетина в транспорте: 1 - кинетин, J мембранный груз. 4 — кинектин
400
За рстршралныи транспорт в аксоне отвечает л™тй г плазматический динеин (рис. 275). Он состоит издвм™ “ ~ "то головок, взаимодействующих с микротрубочками неско * „точных и легких пеней, которые связываются с мемб™ П”°Ме куплями. Цитоплазматический динеин является м.лоп|щиТИ переносящим грузы к минус концу микротрубочек Динеины т °4' лятся на два класса: интоюлытые, участвующие в переносе хромосом, и аксонсмные, отвсчаюншс за Движение ресничек нжгетГ "
Цитоплазматические динеины и кпиезины были обнаружены практически во всех типах клеток животных и растений
Таким образом, и в цитоплазме движение осуществляется но прш, пипу скользящих нитей, только вдоль микротрубочек перемешаются не нити, а короткие молекулы - «движители», свя инные с персмеша-ЮВИ1МИСЯ клеточными компонентами. Сходство с актомиозиновым комплексом этой системы внутриклеточного транспорта заключается в том, что образуется двойной комплекс (микротрубочка + «движитель»), обладающий высокой АТФазной активностью.
^Ис
т,|яесйчп внутриклеточное перемещение вакуоли с помошью цитоплазма
“ мот. ,., ди’,сина к минус-концу микротрубочки
.^^«ннеива: / тяжелые иепв. 2- кв. непи;учюиелиннво.тЯ*
ди,|еин, мембранный rpjj. 4- шиактин
401
Рис о 276. Ориентация движения внутриклеточных мембранных компонентов
/- микротрубочки: 2, 4— движение к центру клетки, к минус-копнам МТ за счет динеинов; 3, 5- шнжснис к периферии клетки, к плюс-конпам М Г за счет кинсзинон
Как мы видим, микротрубочки образуют в клетке радиально расходящиеся поляризованные фибриллы, нлюи-кониы которых направлены от центра клетки к периферии. Наличие же плюс- к минус-направ-ленных моторных белков (кинезинов и динеинов) создает возможность для переноса в клетке её компонентов как от периферии к центру (энлоцитозныс вакуоли, рециклизация вакуолей ЭПР и аппарата Гольджи и др), так и от центра к периферии (вакуоли ЭПР, лизосомы, секреторные вакуоли и др) (рис. 276). Такая полярность транспорта создается за счет организации системы микротрубочек, возникающих в центрах их организации, в клеточном центре.
Глава 23
КЛЕТОЧНЫЙ ЦЕНТР
Итак, в клетках животных, растений и одноклеточных микротрубочки (МТ) поляризованы, так что большей частью их растущие плюс-конны направлены к периферии клетки. Это связано с тем, что МТ начинают свои рост от специальных участков в клетке, от центров организации микротрубочек (ЦОМТ). Некоторые из ЦОМТ имеют сложную морфологическую организацию, другие устроены иначе. Различные ЦОМТ можно разделить на несколько групп: центросом ные клеточные центры и центры организации микротрубочек, не имеющие четкой локализации.
402
Цапример, в клетках высших растении rm,,,,,... .
ходит по периферии клеточного ядра, от котоп^мт"''* МТ В₽01,с дпально. Сходная картина наблюзиется при регенетишж ^?ИТСЯ В‘' ckiix клетках слюнных желездвукрылых, I) ™ зеслХ» "/ига,'т-
Н1,е МТ, их закладка, нуклеация могут осутттестияться^ХпХ вне связи со специальными зонами или структурами и",огаа™е
Но в большинстве случаев в интерфазиых клетках животных опта низмен образование и рост МТ происходят от клеточного иенттм со держащего специальные образования - центросомы, которые болт,-шей частью могут содержать сложно организованные центриоли ши же не иметь их.
Центросомы и центриоли
Центросомы были обнаружены и описаны бодее сто лет назад (Флемминг, 1875; Бенеден, 1876). Это очень мелкие тельца, размер которых находится на границе разрешающей способности светового микроскопа. обычно они располагаются в геометрическом центре клетки, откуда них название. В некоторых объектах удавалось видеть, чго мелкие плотные тельца (центриоли) обычно в паре (диплосоча), окружены зоной более светлой цитоплазмы (собственно центросома), от которой отходят разная ьно тонкие фибриллы (центросфера) (рис. 277).
Центросомы характерны и обязательны дтя клеток животных, их нет у высших растений, у низших грибов и некоторых простейших. Центросомы в делящихся клетках принимают участие в формировании веретена деления и располагаются на ею полюсах. В недетяшихся клетках центросомы часто определяют полярность клеток эпителия и располагаются вблизи аппарата Гольджи. Такая связь центросом с ап паратом Гольджи характерна для многих клеток, в том числе дтя кле ток крови и нервных клеток. Часто центросомы лежат рядом с ядро. . располагаясь в зонах его впячиттания. Например, в пачтюрфныхлеш кошках (нейтрофилах) центросома лежит внутри полк “чячивания ядра (рис. 278). _ ,.„т R клетках животных.
Типичное строение клеточный центр имеет „окохжаюшей Он представляет собой зону, состоят) ю из иентрвол случаев в со-их аморфной фибриллярной массы, или матрикса. • эта фябрит-сгав клеточного центра, или центросомы, входит •тарная масса, от которой отходят .микротрубочк11.
Наиболее часто кроме матрикса в состав кает «ентриоли как мелкие тельца, с трудом наолюдаем
Роскопе. ТО1ЬКО с помошью
Тонкое строение центриолей удалось изучи' 01ей СОСпзк1яют
электронного микроскопа. Основу строени
403
з центра входят световом мик-
Рис. 277. Клеточный центр в спср-
матогонии саламандры (по: Hcidcnbain. 1907)
/ центриоль. 2- прилегающий к центриоли участок iiitToiumxMbi (иер1шскгрн-отчрный участок); 3- центросфера (аст-росфера); 4 - ядро
расположенные по окружности лепят ь триплетов микротрубочек образующих таким образом полый нн.'Шнлр (рис. 279. см. вклейку). Его ширина околоО. 15 мкм, а длина такого цилиндра 0,3-0,5 мкм (хотя встречаются центриоли, достигающие в длину несколько микрон) (рис. 280).
Первая микротрубочка триплета (А микротрубочка) имеет диаметр около 25 нм и толщину стенки 5 нм, которая состоит из 13 глобулярных субъединиц. Длина каждого триплета равна длине центриоли. Вторая и третья (В и С) микротрубочки отличаются от А-микротрубочки тем, что они являются неполными, содержат 11 субъединиц и вплотную примыкают к своим соседям. Каждый триплет располагается к радиусу такого цилиндра под углом около 40°. Кроме микротрубочек в состав центриоли входит ряд дополни-
тельных структур. От микротрубочки А отходят так называемые «ручки», т.е. выросты, один из которых (внешний) направлен к микротрубочке С соседнего триплета, а другой (внутренний) — к центру цилиндра.
Обычно в ннтерфазных клетках всегда присутствуют две центриоли. располагающиеся рядом друге другом, образуя дуплет центриолей, или диплосому (рис. 281). В диплосоме центриоли располагаются под
Рис. 278. Расположение центросомы в различных клетках о нстрифил; б шмфоинт;« — фибробласг
404
Рис. 280. Строение центриоли в клетках позвоночных
а - зрсхмериая mw «.«./- поперечные срезы проксииньиозо конца (-), средней части и дистального (+)-конца
прямым умом по отношению друг к другу. Из двух центриолей различают «материнскую» и « дочернюю», продольная ось последней перпендикулярна продольной оси материнской центриоли. Обе центриоли сближены своими концами так. чго проксимальный конец дочерней центриоли как бы смотрит на поверхность материнской. В лис-
405
Рис. 281. Схема строении диплосочы лейкоцита аксолотля
МЦ материмсая исигрпоаь; ДЦ - дочерние неитртими: НС - ножка сателлита; ГС -головы caie’i'nrr.i; ФСМТ - фокусы схождения микротрубочек: МЛ - микротрубочки
тальном участке материнской центриоли располагается аморфный материал и виде ныростов или шпор - это придатки. Их нет на дочерней центриоли.
Дочерняя центриоль несколько отличается от материнской. Центральная часть цилиндра центриоли занята структурой, напоминающей тележное колесо; она имеет центральную «втулку» диаметром около 25 нм и 9 спиц, направленных по одной к А-ммкротрубочке каждого из триплетов. Такие структуры внутри центриоли расположены в одном из её концов, проксимальном, что делает строение цилиндра центриоли полярным. На дистальном конце центриоли внутри сё нет таких структур. Объем, занимаемый внутри центриоли втулкой со спинами, может составлять у разных клеток от 3/4 до 1/5 длины центриоли У некоторых видов втулка отсутствует или заменена скоплением аморфного материала. Торцы нентриоляриого цилиндра, кроме системы втулки и спиц на проксимальном конце, ничем не закрыты.
Систему микротрубочек центриоли обычно описывают формулой (9x3) + 0. подчеркивая отсутствие микротрубочек в сё центральной части.
Вокруг каждой цеюрполи расположен бесструктурный, или тонковолокнистый. матрикс. Сами микротрубочки триплетов погружены и аморфный материал, так называемые муфты, или оправы. Если выделенные центриоли обработать 0.6М раствором NaCl, то произойдет полная экстракция микротрубочек, но центриоль как таковая не рас-
406
творится: вместо нее останется нилиилрическаи структура, имеющая девять полых отверстий, некогда занимавшихся триплетами микротрубочек. Поэтому все схемы центриолей н этой кише, как и во многих друт их, значительно упрощены и не включают материал муфты веитрнолярного цилиндра.
Часто около центриолей и в связи с ним можно обнаружить несколько дополнительных структу-р: сателлиты, фокусы схождения микротрубочек, исчерченные волокнистые корешки, дополнительные .микротрубочки, образующие особую зону центросферу, вокруг центриоли (рис. 282).
При исследовании в электронном микроскопе интерфазных центриолей было найдено, что лучистое сияние центросферы, обнаруживаемое в световом микроскопе, представляет собой большое число микротрубочек. радиально расходящихся от зоны лиилосомы. В дипло-соме лить одни из центриолей, материнская, содержит ряд дополни тельных структур. Одни из них, перицентриолярные сателлиты, состоят из имеющей топкое фибриллярное строение конусовидной ножки, расположенной на стенке центриоли, и головки, заканчивающейся на этой ножке. Ножки сателлитов часто имеют поперечную исчерчен-вость (рис. 283). Количество таких перииеитриолярныхсателлитов непостоянно, они могут располагаться на разных уровнях полтине центриоли. Кроме этих структур рядом с диплосомой, но не связанные с
Рис. 282. Клеточный центр в клетках позвоночных в интьрфазе (Воробьев.
Надеждина. 1987)
UHMT - венгр нуклеации микротрубочек
407
Рис. 283. Микрофотографии интерфазной центриоли, полученные с помощью электронного микроскопа
а - центриоль в Gj-фазе; 6- центриоль it S-фазе. / - сателлит; 2 юловка сателлита;
J — микротрубочки; 4- ироиентриолъ
408
ней структурно, могут располагаться плотные мелкие (20 40 нм) тельца, к которым подходят одна или несколько микротрубочек (фокусы схождения микрогрубочек). Микротрубочки отходят и от головок са темнтон. Эти центросом ные микротрубочки не огходят непосредственно от микротрубочек нллиидрон центриолей, а связаны иди с сателлитами, или с матриксом. Такие микротрубочки и образуют как бы лучистую сферу (центросферу) вокруг центриоли, где .минус-конны МТ связаны с ЦОМТ, а ллюс-копиы радиально расходятся на тгерифе-рию клетки При образовании центросферы в интерфазной клетке толь-ко специальные структуры центриоли — сателлиты и матрикс, каким-то образом сиязаны с образованнсм микротрубочек; микротрубочки самих центриолей в этом процессе не участвуют. Восстановление приненгрио-лярных микротрубочек после их деполимеризации на холоду происходит за счет появления новых микротрубочек, отходящих от головок сателлитов. Таким образом, можно считать, что эти дополнительные
структуры являются центрами, на которых осуществляется сборка микротрубочек из тубулинов ( центры организации микротрубочек — U0MT).
Химия центриолей изучена слабо, потом)' ч то еще не разработаны методы получения этой структуры в виде чистой фракции. Трудности биохимического изучения центриолей связаны с тем, что это одиночная клеточная структура, имеющая объем всего 0,03 мкм5. Для сравнения вспомним, что в клетке имеется: около тысячи штук митохондрий. около миллиона рибосом, около сотни хромосом, около 1 мхг мембран.
Есть все основания говорить о том. что в состав микротрубочек центриолей входят тубулины. Это доказывается тем. чго колхицин прекращает рост микротрубочек в процентриолях, возникающих вблизи материнской центриоли. Предположения о возможной химической природе остальных элементов центриоли основаны главным образом на данных, полученных из химии ресничек и жгугпков. имеющих много сходных черт строения с центриолям)!
Данные о химическом строении центриолей получены главным об Разом с помощью имменохпмическцх методов. В изолированных базальных тельцах простейшего хламидомонады оонаружено оолее 200 раз ичных белков, средн которых выявлены четыре вида ^>™нов в гом числе ^тубулин ггентрин, пергшентрпн. белок р-10 и многие дру гне.
В интсрфазиых Метках центрист. с ядром ис я.=
мембраной При выделении ядер практически все центриоли клеток печени селезе кн крыс оказываются в этой фракции. Связь центриолей с яшюм Хгестиляется главных, образом промежуточными Филям. с , ' ,и»е клетки подвергнуть ультраггентрифугггрова-йамегпахги. Если живы центробеж||ОМу полюсу вместе с яд-
нию, то центриоли опускаются н
Рами.
409
Центросомный цикл
Ctросине и активность центросом меняются в зависимости от периода клеточного цикла. в течение которого клеточный центр претерпевает тоже циклические изменения (рис. 284).
Целесообразнее начать рассмотрение циклических изменений в шруктхре центросом с митоза. Начиная с профазы и кончая телофазой. центросомы имеют сходное cipoeiuie, несмотря па то что за время митоза происходит ряд существенных клеточных перестроек: коп деисапия хромосом, разрушение ядерной оболочки, образование ве-
Рис. 284. Центросомный цикл
" - дипюсома во время митотв (М): б - центриоль я начале G,-периода: в — петришь в G,-периоде, г - иентриотн в S-периате. удвоение центриолей; д — iicnipuo.ni в ^2* периоде
410
ретена деления, расхождение хромосом. В митозе в клеточных центрах (их два, по одному па каждый полюс клетки) находится иолиплосоме Как полагается, дочерняя центриоль своим концом направлена на материнскую. Материнская центриоль на всех стадиях митоза окружена довольно широкой (до 0.3 мкм) зоной тонких фибрилл - неитриоляр-ное фибриллярное гало (рис. 279). От этою гало радиально отходят микротрубочки. Важно подчеркнуть, что у дочерних центриолей ни гало, нн отходящих от центриолей микротрубочек нет. В это время происходит формирование веретена ми готического аппарата, состоящего из микротрубочек. Эта структура действительно имеет форму веретена, где на концах его на полюсах клетки располагаются диплосомы, окруженные радиальными микротрубочками (центросфера) В данном случае можно говорить о т ом, что зоны диплосом. клеточные центры, являются центрами организации (полимеризации) микротрубочек. В пользу этого говорят следующие факты: после исчезновения микротрубочек вере гена и цент росферы, которое происходит при действии холода или колхицина, новые микротрубочки возникают главным образом в районе материнских центриолей, диплосом. в каждохт пз полюсов клегки. Интересно, чго рост новых микротрубочек не связан с микротрубочками триплетов ценгрнолярного цилиндра, они начинают отрастать от зоны гало, расположенной на материнской центриоли. Важно отметить, что в это время на материнских центриолях (как и на дочерних) нет сателлитов, и л это же время цитоплазма теряет микротрубочки: микротрубочки цитоплазмы разбираются, а пул освободившихся тубулиновых мономеров идет на образование микротрубочек веретена и центросферы, которые образуются на фибриллярном гало, как на ЦОМТ Этот процесс полимеризация митотических микротрубочек отражает первую форму активности цеитриолярного аппарата (см. рис. 284). Если в профазе облучить центриоль лазерным микролу-чо.м, то образование веретена останавливается.
Примерно сходное строение имеют клеточные центры на всех стадиях митоза, но к телофазе толщина фибриллярного гало уменьшается.
К концу телофазы, когда произошло разделение клетки надвое, а хромосомы начали деконде нспроваться и образовывать новые интерфазные ядра, идет разрушение веретена деления, его микротрубочки Деполимеризуются. Клеточные центры при этом меняют свою струк туру. Материнская н дочерняя центриоли теряют взаимно перпендикулярное расположение и отходят дру г от друга на неоатьшие W.t-2 МКМ) расстояния, но все же держатся водном месте. Вокруг материнской центриоли гало и микротрубочки не выявляются. В это время микротрубочек в цитоплазме также практически нет.
В Йачтче G -периода на поверхности материнской центриоли возникают еггеллнты, имеющие ножку и головку, от которой радиально отходят .микротрубочки, которые начинают расти в длину и заполнять
411
собой union ыгму (см. рис. 284, о). Следовательно. вторая форма активности клеточного ueiiipa образование цитоплазматических микротрубочек в интерфазных клетках. Пало подчеркнуть, что активной ттссь является только материнская центриоль, которую легко узнать но придаткам в ее дисгальной частя.
Гечн считать клеточные центры основными (если не единственными) местами образования цитоплазматических микротрубочек, то общее количество последних должно быть равно числу микротрубочек, отходящих от центриолей. При исследовании в электронном микроскопе оказалось. что от клеточных центров в пнтерфнзе отходит всего iiiiiib несколько десятков микротрубочек, а в цитоплазме их так много. что с помощью иммуиофлуоресттсцтиого метода их трудно подсчитать. Эго даст основание предполагать, что по мере роста микротрубочек часть из них теряет связь с областью центриолей и может находиться в цитоплазме долгое время. Центросомы же индуцируют полимеризацию новых микротрубочек, которые приходят па смену постепенно деполпмерпзуюшимся старым. Вероятно, в цитоплазме есть несколько генераций микротрубочек: «старые», не связанные с клеточным центром, и новые, растущие от центросом. Гакпм образом, в клетке происходят как бы конвейерная смена и репродукция цитоплазматических микротрубочек.
Если клеткам запретить переходить в S-период, они могут существовать в фазе клеточного покоя (60-псрпод) (рис. 285, см. вклейку). В это время материнская центриоль продолжает функционировать как центр образования микротрубочек цитоскелета. Но одновременно опа может проявить еще одну форму активности — образовать ресничку, вырост плазматической мембраны, заполненный аксопемой (осевой нитью), состоящей из девяти дублетов микротрубочек. Эти микротрубочки отрастают, как от затравок, от А- и В-микротрубочек триплетов материнской центриоли в дистальной се части. Это - третья форма активности центриолей как центров организации микротрубочек .
При наступлении S-периода (или в середине его) клеточный центр приступает к четвертой <]х>рме своей активности: происходит удвоение числа нентрнотей. В это время около каждой из разошедшихся сше в конце телофазы центриолей, материнской и дочерней, идет закладка новых цснтриолярных цилиндров — ироцеитриолей (рис. 284, 6). В районе проксимальных концов каждой центриоли перпендикулярно длинной осп закладываются сначала девять синглетов (одиночных) микротрубочек, затем они преобразуются в девять дуплетов, а потом - в девять триплетов растущих микротрубочек новых центрнолярных цилиндров.
Закладка проиентриолеи происходит на проксимальных концах центриолей: в этом месте растут новые поколения центриолей, тоже с проксимального конца. Во время роста проиентриолей здесь можно виде! ь центральную «втулку» со спицами.
4(2
Благодаря такому росту структур образуется сначала короткая .то-черняя iieinpiio.ii.. т. с. процситриоль, которая затем дорастает лора i-мера материнской. Этот способ увеличения числа центриолей был назван дупликацией. Важно отметить, что размножение центриолей не связано с их делением, почкованием или фрагментацией, а происходит путем образования зачатка (процентриоли) вблизи и перпендику ярпо к исходной цент риоли. Правла, после злее условие соблюдается не во всех обьсктах, у некоторых оомипетоп при дупликации цеитрпо-ш осуществляются сначала расхождение центриолей. рост втулки, затем рост микротрубочек вдоль продолжения оси исходной нептрполи, н центриоли располагаются конец в конец. Интересно, что триплеты в таких новых центриолях имеют угол наклона. противоположный тако кому в материнской центриоли.
Факт удвоения центриолей привел некоторых исследователей к
предположению, что нептрполи. так же как митохондрии и плистиды, принадлежат к са.морелуплицируюшимся компонентам цитоплазмы.
хотя прямых данных о наличии ДНК в составе центриолей нет.
В S-псриоде ио время удвоения (дупликации) центриолей материнская проявляет вторую форму активности: она продолжает быть центром образования цитоплазматических микротрубочек.
В результате процесса дупликации около каждой центриоли вырастает новая дочерняя центриоль (первая материнская центриоль и дочерняя на бывшей дочерней центриоли могут считаться как бы бабушкой и внучкой). Поэтому в клетке после завершения S-периода нахо-
дятся уже две диплосомы (а всего четыре центриолярных цилиндра) (рис. 286, см. вклейку).
После этого наступает следующий период клеточного никла —
постсиитетичсский (G2-nepHoa), когда в клетке начинается подготовка к очередному делению. В это время исчезают сателлиты на материнской диплосоме (так можно назвать старую материнскую центриоль с новой дочерней), а обе материнские центриоли в обеих диплосо-мах покрываются фибриллярным гало, от которого в профазе начинают отрастать митотические микротрубочки Параллельно этому в цитоплазме происходит исчезновение микротрубочек, н клетка стремится приобрести шаровидную форму. Вся такая последовательность событий повторяется от цикла к циклу у клеток, способных капительному размножению. В большинстве случаев клетки организма находятся в O..-периоде поэтому у них центриоль участвует в полимеризации Цитоплазматических микротрубочек н в образовашш реснички (пли множества ресничек). В последнем случае она входит в сое гав так на
зы паем ого базального тельца.
Обычно в клетку после деления попадают два центриолярных ин шндра В составе диплосомы. В различных экспериментальных усто-виях можно прекратить разделение клетки надвое и получить метки с
413
х (военным мне юм хромосом (полиплоидные клетки). Совершенно очевидно. ню в таких клетках будет и удвоенное число центриолей К истки могут снова вступать в клеточный цикл, при этом будет удвап-ватьсм как количество ТНК, так и число центриолей. У тетраплондных (с четырехкратным набором хромосом) клеток печени в С0-периоде в цитоплазме видны не два. а четыре нентриолярпых цилиндра, а в поносах при делении таких клеток было обнаружено по две диплосомы в каждом. Аналогичная ситуация замечена и у других полиплоидных клеток (мегакариоциты костного мозга, полиплоидные гибридные клетки и др.) В святи с этим предположили, что между числом илоид-ностн клетки (числом хромосомных наборов) и числом центриолей существует прямая связь.
Нарушения иентрнолярного никла могут вызвать ряд патологических изменений клеток, в первую очередь появление многополюсных митозов. Так. при действии p-меркаптоэтанола происходит блокада нормального митоза, при этом диплосомы расходятся на отдельные центриоли. При отмывании от этого вещества клетка снова приступает к делению, но в этом случае каждая центриоль активируется и образует полюс веретена. Таким образом, возникают грех или четырехпо-зюсиые митозы, обусловливающие неравномерное распределение хромосом между дочерними клетками. Это в свою очередь приводит к изменению числа хромосом (анэунлоилия), которое часто вызывает гибель клетки. Иногда при образовании многополюсник митозов в некоторых полюсах отсутствуют центриоли: в полюсе располагается тошко фибриллярный материал центросомы (бесцеитрнолярные полюса).
Итак, в подавляющем большинстве клеток млекопитающих центросомы участвуют в полимеризации тубулинов и являются структурами. играющими роль центров организации микротрубочек. Микротрубочки самих центриолей служат затравками для полимеризации тубулинов только в одном случае — при росте аксоиемы реснички, когда центриоль становится базальным тельцем. Это временное состояние: при переходе клеток к делению реснички могут исчезать, а базальное тельце снова может выполнять роль центриоли, участвуя н организации цитогьтазматческих микротрубочек или микротрубочек митотического веретена. Только и этих случаях центрами организации микротрубочек являются не сами центриолярныс цилиндры, а перицентрн-отярный материал (головка сателлитов, околоиентрполярный матрикс, гало и т. д.). Следовательно, центриоль как таковую нужно рассматривать как одни из компонентов более сложной структуры - клеточного центра, или центросомы. Эта оговорка связана с тем. что У всех высших растений ЦОМТ не содержит центриолей. Более того, в раннем эмбриогене зе позвоночных животных образуются веретена деления. не имеющие центриолей в полюсах. По всей вероятности, в по
414
следних случаях центриоли возникают позже запило, а не образуются путем «репликации». Вопрос о процессе образования центриолей далек от решения. Остается неясным процесс появления пронеитрио-лей. В процессе эмбриогенеза отмечены случаи возникновения центриолей de novo у морского ежа. у моллюсков, у .мышей. Так, в эмбриогенезе мыши центриоли появляются только после 1-2 делении клеток бластулы, несмотря на то что сами клеточные деления плуг нормально, та исключением того, чго в полюсах деления в зоне бесструктурной центросомы центриоли отсутствуют. В то же время если в соматических клетках культуры ткани уничтожить центросому с центриолью с по.мо шьюмпкрооблучения, то новые центриоли не возникают.
Базальные тельца, строение и движение ресничек и жгутиков
Как уже указывалось, у многих клеток животных, вышедших из меточного цикла, в С0-стадии центриоли принимают участие в образовании аппарата движения - ресничек. Их две группы: кинетшшлии. характерные тля специальных эпител пев (ресничные эпителии трахеи, яйцеводов) или свободно плавающих клеток (сперматозоиды, простейшие), и так называемые первичные реснички, встречающиеся во .многих клетках, не обладающих способностью к движению.
Вначале рассмотрим строение кинетоцнлей - подвижных ресничек и жгутиков. В световом микроскопе эти структуры видны как тонкие выросты клетки, в их основании в цитоплазме видны хорошо красящиеся мелкие гранулы — базальные тельца, аналоги центриолей (рис. 287). Клетки, имеющие реснички пли жгутики, обладают способ-
ностью двигаться, будучи в свободном состоянии, пли же перемещать жидкости в случае, если клетки неподвижны. Своболноживушпс одноклеточные организмы, снабженные одним или несколькими жгутиками, обычно движутся тем концом вперед, который несет жгутики. Иной способ движения можно видеть у сперм не в некоторых животных: жгутик, располагаясь сзади, толкает тело клетки вперед. Скорость движения клеток за счет работы жгутиков может достигать очень большой величины (до 5 мм/мин).
Рис. 287. Миогорядный мерцательный эпителий трахеи / - реснички; 2- базальные тельца
415
Множественные реснички также мот обеспечивать движение снобозпожнвмннх клеток, таких как инфузории или некоторые жгутиконосцы. Реснички эпителиальных клеток многих беспозвоночных и позвоночных животных обеспечивают поток жидкостей вдоль поверхности таких клеток. Число ресничек на клетку может достигать 300 в эпителии трахеи; у инфузории туфельки на клетку приходится JO-14 тыс. рядами расположенных ресничек.
При движении ресничек и жгутиков не происходит уменьшения их длины, иоэюму неправильно называть это движение сокращением. Траектория движения ресничек очень разнообразна (рис. 288). В различных клетках эго движение может быть маятникообразным, крючкообразным, воронкообразным или волнообразным.
У многоресничных клеток (инфузории, клетки ресничного эпителия) движение ресничек не хаотично, а строго упорядочено. В этом случае реснички расположены рядами. В продольном ряду отдельные реснички начинают движение и проходят отдельные его фазы по очереди, метахронно. В поперечном же ряду все реснички находятся водной фазе движения (синхронны). Это создает движущую волну по поверхности клетки (рис. 289).
Общая архитектура реснички представлена на рис. 290 и 291. Ресничка представляет собой топкий цилиндрический вырост цитоплазмы с постоянным диаметром 300 нм. Этот вырост от основания до самой его верхушки покрыт плазматической мембраной. Внутри вырос та расположена аксоиема — сложная структура, состоящая в основном из микротрубочек. Нижняя, проксимальная часть реснички — базальное тельце — погружена в цитоплазму Диаметры аксонемы и базального тельца одинаковы (около 200 нм).
Па поперечном сечении реснички видна плазматическая мембрана, окружающая аксоне-му. Аксонема в своем составе имеет девять дублетов микротрубочек, образующих внешнюю стенку цилиндра аксонемы. Дублеты микротрубочек слегка повернуты (около 10°) по отношению к радиусу аксонемы. Кроме периферических дублетов микротрубочек в центре аксонемы располагается пара центральных микротрубочек.
Рис. 288. Траектории движения ресничек
о мант пилообразное; 6 — крюкообразное; в - воронкообразное; г - волнообразное
Рис. 289. Волны, пробегающие но поверхности мерцательного эпителия, покрытого ресничками
416
Рис. 290. Ресничка жгутиконосца Burbulanimphasp. (а) (фото Н.А. Перова) и бактериальный жгутик Escherichia coli{б, в) (фото А.Л. Митлинои)
' ресничка; ПМ — плазматическая мембрана; БТ ~ базальное тельие: М - митохондрия. / плазматическая мембрана бактерии; 2 наружная мембрана; 3 — бактериальный жгутик; 4- базлтыюе тельце
417
Н нс «ом систему микротрубочек реснички описывают как (9x2) + 2 Н дупчсмх микротрубочек также различают Амнкротрубочку, состоящую ш И схбьединиц. u И микротрубочку, неполную, содержащую 11 субъединиц. А микротрубочка несет на себе «ручки», которые на-нр.нтлены к 13 микротрубочке соседнего дуплета. От А-микротру-бочкн к центру аксонемы отходит радиальная связка, или спина, оканчивающаяся iплойкой. присоединяющейся к центральной муф-ie имеющей диаметр около 70 нм. окружающей две центральные микротрубочки. Последние лежат отдельно друг от друга на расстоянии около 25 нм Таким образом, в акеонеме располагается 20 про-юльиых микротрубочек, в то время как в базальном тельце их 27 (рис. 291 и 292).
батальное телыте состоит из девяти т риплетов микротрубочек (как и центриоль), имеет «ручки», втулку и спицы, расположенные в проксимальной (нижней) ее части. На участке базального тельца, примыкающем к плазматической мембране, есть девять придатков (высту ион), идущих от каждого триплета микротрубочек к плазматической мембране п связывающих его с клеточной поверхностью.
Базальное тельце и аксонсма структурно связаны друг с другом и составляют единое целое: А- и В-микрогрубочки триплетов базального тельца продолжаются в А- я В-микротрубочках дуплетов аксонемы. Однако внутренние части аксонемы и базального тельца значительно отличны друг от друга. Часто в зоне перехода базального тела в аксоне-му наблюдают аморфную поперечную пластинку, которая как бы отделяет эти две части. Центральные микротрубочки аксонемы начинаются от этой пластинки так же. как в этом месте начинается и централь пая муфта (капсула) (см. рис. 290).
В основании ресничек и жгутиков часто встречаются исчерченные корешки, или кииетодесмы, представляющие собой пучки тонких (6 нм) фибрилл, обладающих поперечной испорченностью (рис. 293). Часто такие исчерченные кииетодесмы простираются от базальных телец в глубь цитоплазмы по направлению к ядру. Роль этих структур не ясна. Они не изменяются при действии колхицина, могут встречаться и в составе центриолей интерфазных клеток, не принимающих участия в образовании ресничек.
При движении ресничек не происходит изменения их длины, они не «сокращаются», а изгибаются, бьются. Оказалось, что механически отделенные реснички способны к биению в присутствии АТФ. При отделении ресничек базальные тельца остаются в теле клетки. Это означает, чго для механической работы ресничек базальное тело не нужно. а только аксонсма участвует в генерации движения. Удалось показать, что за движение ресничек отвечают «ручки», сидящие на А .микротрубочках. При экстракции компонентов «ручек» реснички пере стают биться н присутствии АТФ.
418
В состан « ручек» входя г белки линейны Это большие белковые ком повеиты. состоящие из 9 12 иоли-пентилиых iicneii. содержащие 2-3 глобулярные головки. связанные в общий корешок гибкими хвостами (рис. 294). Каждая головка динеина обладает АТФазпой активностью, которая возрастает примерно в 6 раз при ассоциации с микротрубочка ми. В состав каждой ««ручки» входит один белковый комплекс, одна молекула динеина. Так как экстракция «ручек» прекращает биение ресничек, то можно считать, что именно динеин ответствен за это движение, т.е. динеин яиляется .мотором, или двигателем, при биении ресничек. Но каков механизм этого движения?
Этот вопрос был решен при использовании выделенных ресничек, лишенных плазматической мембраны. радиальных спиц и связок после частичной обработки аксоном протеазами. Оказалось, что такие аксо-
Рис. 291. Общее строение реснички
а - продольный срез; б - иолсрсчныи срез тела реснички: в, г - срезы базального тела. / - плазматическая мембрана; 2 - микротрубочки; 3 -
немы, содержащие ДИНСПИОНЫС луагеты микротрубочек (А и В): «РУЧКИ», при добавлении К НИМ АТФ ^-тр»’пзеты микротрубочек (А. В и С) начинают увеличиваться в длину почти до девяти ра < и одновременно
утончаются. В электронном микроскопе видно, что такая аксонема увеличилась в длину за счет смешения пар микротрубочек одна относительно другой (рнс. 295). Другими словами, произошло продольное скольжение дуплетов один относительно другого, аналогично тому; что происходит при сокращении саркомеров в мышце: скольжение миозиновых нитей относительно актиновых. В случае динеина повторные циклы ассоциации с субъедин и нами тубулина, изменения конформации при связывании АТФ и его гидролизе. вызывают перемещение головок вдоль микротрубочки от плюс-кониа к мннус-концу При этом соседний дуплет двигается к верхушке реснички. Когда ресничка содержит все компоненты и дуплеты микротрубочек связаны Друг с другом и с центральной парой микротрубочек, такие кооперативные смешения дуплетов микротрубочек приводят не к угзинению реснички, а к ее изгибу (рнс. 296). Как регулируется последоватечьное перемещение дуплетов один относительно другого, еще не ясно.
419
Рис. 292. Схема поперечного разреза реснички Объяснения см. в тексте
а
б
Рис. 293. Исчерченные корешки ресничек. или кинетодесмы (/)
d — в световом микроскопе; б в электронном микроскопе. 2 пяазмале.мма; 3 - базальное тельце
Рост ресничек, удлинение микротрубочек их аксоном осуществляется на вершине реснички. Следовательно, там локализованы плюс-кон-пы микротрубочек.
Образование аксоиемы ресничек происходит за счет роста А- и В-микротрубочек нентрио.чей, которые в этом случае становятся базальным тельцем. В простейшем случае при образовании одиночных ресничек или так называемых первичных ресничек материнская центриоль подходит к плазматической мембране своим дистальным торном, связывается с ней своими придатками. В это время начинается рост микротрубочек на плюс-коииах
420
А и В-микротрубочек триплетов. Возникают девять дублетов микротрубочек аксоиемы, которые, наращиваясь с плюс-концов на верхушке аксоиемы, как бы вытягивают плаз магическую мембрану, образуя вы рост - ресничку (рис. 297). Две центральные микротрубочки возникают в связи с плотным веществом, лежащим на границе бывшей центриоли и выроста плазматической мембраны (см. ряс. 290, а).
При образовании многорсснич-иых клеток происходит многочис
Рис. 294. Динсиновые ручки (/) на А-микротрубочке дублета ресничек
ленная репликация центриолей образование многочисленных ресничек.
В ресничном эпителии позвоночных множественные базаль ные тельца возникают вокруг так называемых дептеросо.м — аморфных электронно-плотных структур размером от 60 до 700 нм. по периферии которых происходит закладка множественных зачатков базальных телец. Вокруг одной дейтеросомы образуются
Рис. 295. Изолированная аксонс-ма (I) после добавления АТФ 12) Дублеты микротрубочек сместились относительно друг яруга
новых базальных телец.
до десятка
Рис. 296. смешение дублетов при.“Х^Хыьно
О -дублеты незакрепленных .микротр>боч<ж, <5 они ж р
гру. адт"“ - МГФЧ-С-'"**"ко,пых микротрубочек
421
1 Рис. 297. Два способа (а. 6) роста микротрубочек аксонемы реснички от 6а-I зхчыюго тельца
ПМ - плазматическая мембрана; Р--ресничка: БТ базальное тельце; L1B - цитоплаз-I «этическая вакуоль: ВГ1 выроет ютлзмалеммы. /-7—Этапы роста ресничек
! Они затем мигрируют к плазматической мембране и принимают уча-’ стие в образовании аксоном (рис. 298).
Необходимо отметить, что клетки с множеством ресничек теряют I способность к делению и не могут выходить из О0-стадии клеточного । цикла. На смену им из эпителиального пласта приходят стволовые не-' дифференцированные клетки, которые могут делиться и давать новые ] поколении многоресничных клеток.
Микротрубочки аксонемы устойчивы к действию колхицина, ио ' при росте реснички колхицин полностью прекращает включение новых молекул тубулина, что приводит к торможению роста ресничек.
Вторая категория ресничных клеток позвоночных животных — । клетки с так называемыми первичными ресничками, ис обладающими 1 способностью к движению. Практически все типы клеток, за исклю-I чением клеток крови, мышц и кишечного эпителия, в С0-псрноле об-I разуют первичные реснички, которые отличаются от настоящих ресничек, или киноиичии, гем, что они не имеют пары центральных ми-। кротрубочек и не способны к движению. Они образуются в результате [ того, что диплосома подходит к плазматической мембране и от мате-। римской центриоли начинается рост аксонемы, по без двух централь-I ных микротрубочек. Если клетки культуры фибробластов, обладаю-, шпх в <э()-периоде такими ресничками, стимулировать к делению, то I эти реснички исчезают, а базальное тельце-центриоль начинает свой цикл как обычная центриоль в клетках, способных к делению.
Функциональное значение этих первичных ресничек не ясно. Но [ интересно отметить, что при развитии сенсорных клеток сетчатки их [ наружные cel менты палочек и колбочек возникают сначала за счет об-
422
Рис. 298. Образование множественных ресничек
! ~ размножение центриолей; 2 — возникновение базальных гелейоколо зеитеросом
Р^зоваимя первичных ресничек. Возможно, что у нереиепторнык клеток, имеющих такие первичные реснички, последние выполняют Функции внешних анализаторов. являются как бы «антеннами», на поверхности которых рецепторные молекулы плазматической мембраны могут регистрировать механические и химические сигналы. поступающие из внешней межклеточной среды.
423
ЧАСТЬ СЕДЬМАЯ
МЕХАНИЗМЫ КЛЕТОЧНОГО ДЕЛЕНИЯ
Глава 24
МИТОТИЧЕСКОЕ ДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК
Общая организация митоза
Как постулирует клеточная теория, увеличение числа клеток происходит исключительно за счет деления исходной клетки, предварительно удвоившей свой генетический материал. Это — главное событие в жизни клетки как таковой, а именно завершение воспроизведения себе подобного. Вся «интерфазная» жизнь клеток направлена на полное осуществление клеточного никла, заканчивающегося клеточным делением. Само же деление клетки — процесс неслучайный, строго генетически детерминированный, где в последовательный ряд выстроена целая цепочка событий.
Как уже указывалось, деление прокариотических клеток протекает без конденсации хромосом, хотя должен существовать ряд метаболических процессов и, в первую очередь, синтезов ряда специфических белков, участвующих в «простом» делении бактериальной клетки надвое.
Деление всех эукариотических клеток связано с конденсацией удвоенных (реплицированных) хромосом, которые приобретают вид плотных нитчатых структур. Эти нитчатые хромосомы переносятся в дочерние клетки специальной структурой — веретеном деления. Такой тип деления эукариотических клеток - митоз (от греч. milos - нити), или кариокинез, или непрямое деление — является единственным полноценным способом увеличения числа ютеток. Прямое деление клеток. или ампгоз, достоверно описано только при делении полиплоид*
424
пых макропуклеусоп инфуюрни. их мпкропуклеусы делятся только митотическим путем.
Деление всех эукариотических клеток сиямно с обра шванием спе ниалыюго аппарата клеточного деления. При удвоения клеток проис холят два события: расхождение реплицированных хромосом и разделение клеточного тела - шногомия. Первая часть события у эукариот осуществляется с помощью так называемого веретена деления, состоя шего из микротрубочек, а вторая часть происходит за счет участия актомиозиновых комплексов, вызывающих образование перетяжки у клеток животного происхождения или за счет участия микротрубочек н актиновых филаментов в образовании фрагмогыаста. первичной клеточной перегородки у клеток растений.
В образовании веретена деления у всех эукариотических клеток принимают участие два рода структур: полярные тельна (полюсы) веретена и кинетохоры хромосом. Полярные тельца, или центросомы, являются центрами организации (млн нуклеации) микротрубочек. От них своими плюс-концами отрастают микротрубочки, образующие пучки, тянущиеся к хромосомам. У клеток животных центросомы включают в свой состав и центриоли. Но у многих эукариот центриолей нет, а центры организации микротрубочек присутствуют в виде бесструктурных аморфных зон, от которых отходят многочисленные микротрубочки. Как правило, при организации аппарата деления участвуют две центросомы или два полярных тельца, находящиеся на противоположных концах сложного, веретенообразного тела, состоящего из микротрубочек. Второй структурой, характерной для митотического деления клеток, связывающей микротрубочки веретена с хромосомой. являются кинетохоры. Именно кинетохоры, взаимодействуя с микротрубочками, ответственны за перемещение хромосом при клеточном делении.
Все эти компоненты, а именно: полярные тельца (центросомы), микротрубочки веретена и кинетохоры хромосом, встречаются у всех эукариотических клеток, начиная с дрожжей и кончая млекопитающими, и обеспечивают сложный процесс расхождения реплицированных хромосом.
Различные типы митоза эукариот
Описанное выше деление клеток животных и растений - не един-огненная форма непрямого деления клеток (рис. 299). Наиболее простой тип митоза - плевромитоз. Он в какой-то степени напоминает бинарное деление прокариотических клеток, у которых нуклеоиды после репликации остаются связанными с плазматической мембраной, которая начинает как бы расти между точками связывания ДНК и тем
425
Рис. 299. Типы митотического деления клеток эукариотических организмов а - плевромитоз цюжжевоп клетки; б - ортомитоз закрытый; в — ортомитоз полузакрытый; г-е - ортомитоз открытый: г - ми юз живо! ной клетки, д - миюз клетки высших растений, с ~ митоз амебы
самым как бы разносит хромосомы в разные участки клетки (о делении прокариот см. далее). После этого при образовании клеточной перетяжки каждая из молекул ДНК окажется в новой отдельной клетке.
Как уже говорилось, характерным для деления эукариотических клеток является образование веретена, построенного из микротрубочек (рис. 300). При закрытом плеврой итозе (закрытым он называется потому, чго расхождение хромосом происходит без нарушения ядерной оболочки) в качестве центров организации микротрубочек (UOMT) участвуют не центриоли, а другие структуры, находящиеся па внутренней стороне ядерной мембраны. Это так называемые полярные тельца неопределенной морфологии, от которых отходят микротрубочки. Этих т елец два, они расходят ся друг от друга, не теряя связи с ядерной оболочкой, и в результате этого образуются два полуверетена, святайные с хромосомами. Весь процесс образования митотического аппарата и расхождения хромосом происходит в этом случае под ядерной оболочкой. Такой тип митоза встречается среди простейших, он широко распространен у грибов (хитридисвые. зигомгшеты, ДРО>К" жи. оомииеты, аскомицеты, миксомицсты и др.). Встречаются формы полузакрытого плевро митоза, когда на полюсах сформированного вс' ретена ядерная оболочка разрушается.
426
Рис. 300. Схема строения веретена деления
/ - хромосомы: 2 — полюса веретена, центросомы; 3 - межяолюсиыс микротрубочки. 4~ кииетохорныс микротрубочки; 5-астральные микротрубочки
Другой <|юрмой митоза является ортомитоз. В этом случае ЦОМТ Располагаются в цитоплазме, с самого начала идет образование не по-луьерстен. а двухполюсного веретена. Существуют три формы ортомитоза: открытый (обычный митоз), полузакрытый и закрытый. При полузакрытом ортомитозе образуется бисп.ммстрнчное веретено с помощью расположенных в цитоплазме ЦОМТ, ядерная оболочка сохраняется в течение всего митоза, за исключением полярных зон. В качестве ЦОМТ здесь могут обнаруживаться массы гранулярного материала пли лаже центриоли. Эта форма митоза встречается \г зооспор зеленых, бурых, красных водоросчей, у некоторых низших грибов и грегарнн. При закрытом ортомитозе полностью сохраняется ядерная оболочка, иод которой образуется настоящее веретено. Микротрубочки формируются в кариоплазме, реже отрастают от внутриядерного ЦОМТ. не связанного (в отличие от плевромитоза) с ядерной оболочкой. Такого типа митозы характерны для деления мнкронуклеусов инфузорий. но встречаются и у других простейших. При открытом орто.митозе ядерная оболочка полностью распадается. Этот тип деления клеток харак-
427
б
Рис. 301. Астральный (о) и анастральный (<5) типы веретена деления в мета-фате открытого ортомитоза
/ - астер - лучистое сияние вокруг центриолей на полюсе веретена; 2 - аморфная полярная «шапочка* на полюсе веретена: 3 — кинетохорные .микротрубочки; 4 - мелво-люсиые микротрубочки
терен мя животных организмов, некоторых простейших и для клеток высших растений. Эта форма митоза в свою очередь представлена астральным п анастралытым типами (рис. 30I).
Из этого краткого рассмотрения видно, что главной особенностью митоза вообще является возникновение структур веретена деления, образующегося в связи с разнообразными по своему строению LIOM '
Морфология митотическои фигуры
Как уже говорились, митотический аппарат наиболее подроопо изучен у клеток высших растений и животных. Особенно хорошо он бывает выражен на стадии метафазы митоза (см. рис. 300). В живых или фиксированных клетках в метафазе в экваториальной плоскости клетки располагаются хромосомы, от которых в противоположных направлениях тянутся так называемые нити веретена, сходящиеся на двух разных полюсах митотической фигуры. Так что митотическое веретено - это совокупность хромосом, полюсов и волокон Волокна веретена представляют собой одиночные микротрубочки или их пучки. Начинаются микротрубочки от полюсов веретена, и часть из них направляется к центромерам, где расположены кинетохоры хромосом
428
(кпнетохорные микротрубочки), часть проходит дальше по направлению к противоположному полюсу, но ДО него не доходит - «межполюсные микротрубочки». Кроме тою, от полюсов отходит труппа Ра Лнальиых микротрубочек, образуя вокруг них как бы «лучистое сияние» - это астральные микротрубочки.
По обшей морфологии мп готические фигуры делятся па два типа: астральный и анастралытый (см. рис. 301).
Астральный тип веретена (или конвергентный) характеризуется ТСМ, ЧТО СГО ПОЛЮСЫ ПредСТЗВЛенЫ НСООЛЬШОЙ ЗОНОЙ, К KOTopOfi схо-дятся (конвергируют) микротрубочки. Обычно в полюсах астральных веретен располагаются центросомы, содержащие центриоли. Хотя известны случаи беснснтрнолярных астральных митозов (при мейозе некоторых беспозвоночных). От полюсов, кроме того, расходятся радиальные микротрубочки, не входящие в состав веретена, а образующие звездчатые зоны - цп гастсры. В целом же такой тип митотического веретена напоминает скорее гантель (см. рис. 301. а).
Ашстралытый тип митотической фигуры не имеет на полюсах ни-тастеров. Полярные области веретена здесь широкие, их называют полярными шапочками, в их состав не входят центриоли. Волокна веретена в дан ном случае не отходят от одной точки, а расходятся широким фронтом (дивергируют) от всей зоны полярных шапочек. Этот т ин веретена характерен для делящихся клеток высших растений, хотя иногда встречается и у высших животных. Так. в раннем эмбриогенезе млекопитающих при делении созревания ооцита и при I и II делении зиготы наблюдаются бесцентриолярные (дивергентные) митозы. Но уже начиная с третьего клеточного деления и во всех последующих клетки делятся при участии астральных веретен, в полюсах которых всегда обнаруживаются центриоли.
В целом же для всех форм митоза общими структурами остаются хромосомы с их кинетохорамп, полярные тельца (центросомы) и волокна веретена.
Центромеры и кинетохоры
Пен громеры как участки связывания хромосом с микротрубочками могут иметь различную локализацию по длине хромосом Например, голоцентрические центромеры встречаются в том случае, когда микротрубочки связываются подлине всей хромосомы (некоторые насекомые, нематоды, некоторые растения), а моиоиеитричсские центромеры - когда микротрубочки связаны с хромосомами в одном участке (рис. 302). Моноиентричсскис центромеры могут быть точечными (напри мер, у некоторых почкующихся дрожжей), когда к кинетохору подходит всего лишь одна микротрубочка, п зональными, где к сложному ки-
429
Рис. 302. Кинетохоры в центромерном районе хромосом
/ КИНСТОХОр: 2 - ПУЧОК ккнетохорных микротрубочек: 3 хроматида
ПСТОХОру ПОДХОДИТ пучок мик-рогрубочек. Несмотря па разнообразие зон центромер, все они связаны со сложной структурой киисюхора, имеющего принципиальное сходство строения в функций у всех эукариот.
Проше всего строение мопо-пентрического кпнетохора у клеток пекарских дрожжей (Sacchuromyccs cerevisiae). Он связан со специальным участком ДНК на хромосоме (центро-мерный или CEN-локус). Этот участ ок состоит и з трех элементов ДНК: СОЕ I. CDE II, CDE III. Интересно, что последовательности нуклеотидов в CDE I
и CDE III очень консервативны и сходны с таковыми у дрозофиллы. Участок CDE II может быть разной величины и обогащен А—Т-парами. За связь с микротрубочками у 5. ccrevisia отвечает участок CDE III.
взаимодействующий с целым рядом белков.
Зональные центромеры состоят из многократно повторяющихся CEN-локусов, обогащенных участками конститутивного гетерохроматина. содержащего сателлитную ДНК. связанную с кинстохорами.
Кинетохоры - специальные белковые структуры, большей частью располагающиеся в зонах центромер хромосом (см. рис. 302). Кинето-хоры лучше изучены у высших организмов. Кинетохоры — это сложные комплексы, состоящие из мношх белков. Морфологически они очень сходны, имеют одинаковое строение, начиная от диатомовых водорослей, кончая человеком. Кинетохоры представляют собой трех-слоимые структуры (рис. 303): внутренний плотный слой, примыкаю щпй к телу хромосомы, средний рыхлый слои и внешний плотный слой. От внешнего слоя отходят множество фибрилл, образуя так называемую фиброзную корону кпнетохора (рис. 304).
В обшей форме кинетохоры имеют вид пластинок или дисков, лежащих в зоне первичной перетяжки хромосомы, в центромере. На каждую хроматиду (хромосому) обычно приходится по одному кпнето-хару До анафаия кинетохоры на каждой сестринской хроматиде рас полагаются оппозитно, связываясь каждый со своим пучком микротрубочек. У некоторых растений кинетохор имеет вид не пластинок, а полусфер.
430
Рис. 303. Микрофотографии кпнетохора. полеченные с помошью электронного микроскопа
я кинетохор мегафазнои хромосомы клетки ку ivrypu СПЭВ: / — микротрубочки. 2-хнещний слой. 3 — промежуточная зона. 4 - внутренний стой. 5— хромосома: б — Окраска клеток культуры СПЭВ ялгрпым флуорохромом Dapi (фото И.С. Кудрявцева!: f хромосомы 1сляшс(1ся клетки. 2- ннтсрфазмыс ядра; в — окраска тех же клеток auntie «.ши к кинетохорному белкх CENP-Л. Вичны двойные светящиеся точки в иентро-мерах хромосом (/) и в шперфденых ядрах (21 (фото И.С. Ку фявнека)
431
Рис. 304. Схема ультраструктуры кине-тохора
1 — анифазная хроматида; 2 — трехслой и ый ки-нсгохор; 3 — кииетохормые микротрубочки
Кннстохоры представляют собой сложные комплексы, где кроме специфической ДНК участвует множество к инетохорных белков (CENP-белки) (рис. 305). В участке центромеры хромосомы под трехслойным кинетохором расположен участок гетерохроматина, обогащенного а-сателлитной ДНК. Здесь же обнаруживается ряд белков: CENP-B, который связывается с а-ДНК; МСАК -кинезиноподобный белок; а также белки, ответственные за спаривание сестринских хромосом (когезины). Во внутреннем слое кинетохорн выявлены следующие белки: CENP-A — вариант гистона НЗ, который, вероятно, связывается с CDE II участком ДНК; CENP-G, свя-
зывающийся с белками ядерного матрикса; консервативный белок CENP-C. с неизвестной пока функцией. В среднем рыхлом слое
Рис. 305. Схема локализация центромерных белков и ДНК
/ хромосома; 2 — центромера; 3 — микротрубочки; 4 - фиброзная корона: CENP-E-шиеииы; 5 внешний слой: CENP-E. CENP-F; 6 - промежуточная зона; 1 ~ внутренний слой: CFNP-C. ДНК; 8 - центромерный гетерохроматин: и-сателлитная ДНК. CENP-B. МСАК. INC ENP(когезии)
432
Рис. 200. Флуоресцирующие митохондрии (М) в клетке культуры ткани при окраске родамином (фото А.А. Минина)
Я - ядро
Рис. 237. Поляризованные движущиеся фибробласты в культуре ткани (фото И.С. Григорьева) / - замеллоя лазма; 2 — ядро
РИС. 245- Пучки ахтиноиых «фото
ткани, окрашенных Ф-’>°РС‘-
окрашенных
А. В. Буракова) Ядра - фиолетовые
Рис. 249. Поляризованный
И.С. Григорьева)
Движущийся фибробласт (фото
Красным инетом окрашены миммхЬн пм.-.гг...
D\>oujHMii антнп-1 .ми v- Р «‘Менты и и\ п}чкм. связанные с флчореени-
Р?н'шимн антителами к актину зеленим-....»-, - '
ми ктлб\-ш>1\ 1 j , ЫМ МИКРО|РУ°ОЧКИ.окрашенныеантитела-
ми к г\о> шну / ммеллоплазма: 2- ялро
Рис. 257. Стресс-фибриллы. окрашенные клетке кулыуры ткани (фото А.В. Буракова)
антителами к актину, в
Рис. 265. Ми крот р> бочки фибробласт, окрашенные антителами к тубулин} (фото А. В. Буракова)
Я - ядро: KL1 - неточный пен гр
Рис. 279. Микрофотография центросомы в клетке СП ЭВ во время митоза. полученная с помощью электронного микроскопа (фото И. А. Воробьева)
Видны триплеты микротрубочек на поперечном срезе центриоли. / - материнская центриоль; 2 — дочерняя центриоль: 3 - иентросомнос гало: 4 - микротрубочки цитат гера
Рис. 285. Сеть микротрубочек, окрашенная мечеными антителами к п'бу.'ишу в клетке Куль гуры ткани в G,-периоде (фото А.В. Буракова) В клеточном центре же пым окрашена иентриоль. связанная с антителами ку Т)-б)ЛИН). Я ядро
Рис. 286. Клетка кулыуры гканм в S-G2-nepiione (фото
А.В. Буракова)
Окраска та же. что ><а рис. 285. Видны две ресиииировамные центриоли
Рис. 307. Интерфазная клетка культуры легочной ткани тритона (фото АЛ Ходякова)
Ml — микротрубочки (желтые), окрашенные мечеными антителами к тубулину: KLI клеточный центр; Я - ядро
Рис. 308. Митотические клетки культуры легочной ткани тритона в профазе (фото АЛ. Ходякова)
Видны расходящиеся клеточные центры (KU) Зеленым цветом обозначены микротрубочки. окрашенные антителами к тубулину голубым - хромосомы (ХС), окрашенные флуорохромом
Рис. 309. Митотические клетки культуры легочной ткани тритона в метафазе (фото А.Л. Холякова)
Микротрубочки веретена (В) и клеточные центры (КЦ) обозначены желтым цветом, хромосомы (ХС| голубые, красным обозначены промежуточные филаменты
Рис. 310. Митотические клетки анафазе (фото А.Л. Ходякова) Обозначения см. рис. 309
культуры легочной ткани тритона в
Рис. 311. Митотические клетки культуры легочной ткани тритона в ранней телофазе (фото А.Л. Хомякова)
Обозначения см. рис. 309
Рис. 312. Митотические клетки культуры легочной ткани тритона в поздней телофазе (цитотомия) (фото А. Л. Ходякова)
П - перетяжка. Остальные обозначения см. рис. 309
Рис. 325. Выявление микротрубочек антителами к тубулину при Д«* тении клеток растении (фото Е..А. Смирновой)
а профаза; й - метафаза: в - анафаза: г — телофаза; г) - цитокинез, образование фразмопласта. а. б - клетки корневой меристемы ишенииы; е.г.б клетки эндосперма гемаитуса
Рис. 306. Модель строения кинетохора (no: Zinkowski etal., 1991) о - лекоцдепецровацная центромера: б - частично конденсированная центромера; в ~ полностью конденсированная центромера. 1 - участок ДНК с белковыми сегментами, связывающими микротрубочки; 2 - линкерный участок ДНК; 3 - сформированный кинстохор; 4 — микротрубочки; 5 - плечи хромосом
обнаружен белок 3F3/2, который, по-видимому, как-то регистрирует натяжение пучков микротрубочек. Во внешнем плотном слое киието-хора выявлены белки CENP-E и CENP-E участвующие в связывании микротрубочек. Кроме того, здесь имеются белки семейства цитоплазматических динеинов.
Функциональная роль кинетохоров заключается в связывании между собой сестринских хроматид, в закреплении митотических микротрубочек, в регуляции разъединения хромосом и в собственно движении хромосом во время митоза при участии .микротрубочек.
К кинето.хорам подходят микротрубочки, растущие оз полюсов, от центросом. Минимальное их число у дрожжей — одна микротрубочка на каждую хромосому. У высших растений это число достигает 20—40. В последнее время удалось показать, что сложные кинетохоры высших организмов представляют собой структуру, состоящую из повторяющихся субъединиц, каждая из которых способна образовывать связи с микротрубочками (рис. 306). По одной из моделей строения центромерного участка хромосомы (Зинковски, Мейне, Бринкли. 1991)
433
пре иожсно. чю в ннзерфа ic на специфических jмаечках ДНК расположены с\б1.с шнппы кнпетохора. содержащие нее характерные бочки. По мере конденсации хромосом в профазе эти субъединицы труп-пирукнея таким образом, что со «лается зона, ofioiamcmiaa этими белковыми комплексами. — кнпетохор.
Кпнетохоры. белковые в общем структуры, удваиваются в S-nepn-oic. нара-тлсльио улвосиню .хромосом. По их белки присутствуют на хромосомах во всех периодах к легочного цикла (см. рис. 303).
Динамика митоза
Во многих разделах данной книги мы уже касались повеления различных клеточных компонентов (хромосом, ядрышек, ядерной оболочки и цр.) ври клеточном делении. Но вернемся кратко к этим важнейшим процессам, чтобы разобраться в них уже в целом.
У клеток, вступивших в цикл деления, фаза собственно митоза, непрямого деления, занимает относительно короткое время, всего около 0.1 времени клеточного никла. Так, у делящихся клеток меристемы корней иитерфаза может составлять 16-30 ч, а митоз занимать всего 1-3 ч Пикл эпителиальных клеток кишечника мыши длится около 20-22 ч. на митоз же приходится всего I ч. При дроблении яйцеклеток весь клеточный период, включая митоз, может быть меньше часа.
Процесс митотического деления клеток принято подразделять на несколько основных фаз: профаза, прометафаза, метафаза, анафаза, тезофаза (рис. 307-312, см. вклейку). Границы между этими фазами установить точно очень трудно, потому что сам митоз представляет собой непрерывный процесс и смена фаз происходит очень постепенно: одна их них незаметно переходит в другую. Единственная фаза, которая имеет реальное начало, это анафаза — начало движения хромосом к полюсам. Длительность отдельных фаз митоза различна, наиболее короткая по времени анафаза (табл. 15).
Таблица /5
Длительность фаз митоза в различных клетках
Объект
Продолжительность. мин
профазы метафазы апафазы телофазы
Саркома Иосила 14 31 4 21
Кчльтура селезенки мыши 20-35 6-15 8-14 9-26
>ндоспсрм гороха 40 20 12 НО
Эндосперм ириса 40-65 10-30 12-22 40-75
434
Определяется время отдельных фаз митоза зучше всею при прямом наблюдении за делением живых клеток в специальных камерах Зп 1Я время митоза, можно рассчитать ллнтелзикхль отдельных фаз по r,tx>-центу их вс|речаемост среди делящихся клеток.
Профаза. Уже в конце (>2-иериодн в клетке начинают происходить значительные перестройки. Точно определить, когда наступает профаза, невозможно. Лучшим критерием для начала этой фазы митоза может служить появление в ядрах нитчатых структур - митотических хромосом. Этому событию предшествует повышение активности фосфорилаз, модифицирующих гистоны, в первую очередь, гистон Н|. В профазе сестринские хроматиды связаны друг с другом бок о бок с помощью белков-коге чинов, которые образуют эти связи еще в S-nepno-де, во время удвоения хромосом. К поздней профазе связь между сестринскими хроматидами сохраняется только в зоне кипетохоров. В профазных хромосомах уже можно наблюдать зрелые кинетохоры, которые не имеют никаких связей с микротрубочками.
Конденсация хромосом в профазном ядре совпадает с резким уменьшением транскрипционной активности хроматина, которая полностью исчезает к середине профазы. В связи с палением синтеза РНК и конденсацией хроматина происходит инактивация и ядрышковых генов. При этом отдельные фибриллярные центры сливаются так, что превращаются в ядрышкообразуюшяе участки хромосом, в ядрышковые организаторы. Большая часть ядрышковых белков диссоциирует и в свободном виде встречается в цитоплазме клетки или связывается с поверхностью хромосом.
Одновременно с этим происходит фосфорилирование ряда белков ламины — ядерной оболочки, которая распадается. При этом теряется связь ядерной оболочки с хромосомами. Затем ядерная оболочка фрагментируется на мелкие вакуоли, а поровые комплексы исчезают.
Параллельно этим процессам наблюдается активация клеточных центров. В начале профазы разбираются микротрубочки в цитоплазме я начинается бурный рост множества астральных микротрубочек вокруг каждой из удвоившихся днплосом (рис. 308, см. вклейку). Скорость роста микротрубочек в профазе почти в два раза выше роста пн-терфазных микротрубочек, но лабильность их в 5—10 раз выше цитоплазматических. Так, если время полужизни микротрубочек в цитоплазме составляет около 5 мин, то во время первой половины митоза -всего лишь 15 с Здесь еще в большей степени проявляется динамическая нестабильность микротрубочек. Все микротрубочки, отходящие от центросом, растут вперед своими плюс-кониами.
Активированные центросомы - будущие полюсы веретена деления -начинают расходиться друг от друга на некоторое расстояние. Механизм такого профазного расхождения полюсов заключается в следующем: идущие навстречу друг другу антипараллеяызые микротрубочки взаи-
435
Рис. 313. Механизм расталкивания полюсов за счет стабилизации анти параллельных микротрубочек, отходящих от разных полюсов
Профаза:« - ранняя, б - средняя, в - поздняя. Стрелки указывают направление роста микротрубочек. их (f )-коипы
модсйсгвуки между собой, что приводит к их большей стабилизации и ристалкиканню полюсов (рис. 3I3). Это происходит за счет взаимодействия с микротрубочками дипеи неподобных белков, которые в центральной части веретена выстраивают межполюсные микротрубочки параллельно друг другу. Одновременно с этим продолжаются их полимеризация и рост, которые сопровождаются их расталкиванием в направлении к полюсам за счет работы кинезино-подобиых белков (рис. 3I4). В это время при образовании веретена микротрубочки с кинето-хорами хромосом еще не связаны.
В профазе одновременно с разборкой цитоплазматических микротрубочек происходит дез
организация эндоплазматического ретикулума (он распадается на мелкие вакуоли, лежащие по периферии клетки) и аппарата Гольджи,
Рис. 314. Участие моторных белков в расталкивании полюсов и образовании вере гена
а - ранняя с юаня: / - астральные микрофубочкн (МТ), 2 - межполосные МТ. 3-iHHvMHiio’iooHhif белки: б — поздняя стадия: 4 — плазматическая мембрана. "
КИНС ЗИН и
436
который теряет спою околоядсрную локалиэипию. разделяются и<< отдельные дпктиосомы, беспорядочно разбросанные в цитоплазме.
Про.метафаза. После разрушения ядерной оболочки митотические хромосомы без особого порядка лежат в зоне бывшего ядра. В иромс тафазе начинаются их движение и перемещение, которые в конечном итоге приводят к образованию экваториальной хромосомной «ила-стинки». к упорядоченному расположению хромосом в центральной части веретена уже н метафазе. В прометафазе наблюдается постоянное движение хромосом, или мета к и не з, при котором они то приближаются к полюсам, то уходят от них к центру веретена, пока не займут среднее положение, характерное для метафазы (конгрессия хромосом).
В начале прометафазы хромосомы, лежашие ближе к одному из полюсов образующегося веретена, начинают быстро к нему приближаться. Эго происходит нс одномоментно, а занимает определенное время. Найдено, что такой первичный асинхронный дрейф хромосом к разным полюсам осуществляется с помощью микротрубочек. Используя видсоэлектронное усиление фазового контраста в световом микроскопе. удалось на живых клетках наблюдать, что отдельные отходящие от полюсов микротрубочки случайно достигают одного из кинетохоров .хромосомы и связываются с ним, «захватываются» кинетохором. После этого происходит быстрое, со скоростью около 25 мкм/мин, скольжение хромосомы вдоль микротрубочки по направлению к её минус-конну. Это приводит к тому, что хромосома приближается к полюсу, от которого произошла эта микротрубочка (рис. 3J5). Важно отметить, что кинетохоры могут контактировать с боковой поверхностью таких микротрубочек. Во время такого движения хромосомы микротрубочки нс разбираются. Вероятнее всего, что за такое быстрое перемещение хромосом отвечает моторный белок, аналогичный цитоплазматическому динеину, обнаруженному в короне кинетохоров.
В результате такого первичного прометафазного движения хромосомы оказываются случайным образом приближены к полюсам веретена. где продолжает происходить образование новых микротрубочек. Очевидно, что чем ближе к центросоме будет находиться хромосомный кинетохор, тем будет выше случайность его взаимодействия с другими микротрубочками. В этом случае новые, растущие плюс-концы микротрубочек «захватываются» зоной короны кпнетохора; теперь с кинетохором оказывается связанным пучок из микротрубочек, рост которых продолжается на их плюс-конце. При росте такою пучка кинетохор. а вместе с ним и хромосома, должен перемешаться к центру веретена, удаляться от полюса. Но к этому времени от противоположного полюса ко второму кине гохору другой сестринской хроматиды подрастают свои микротрубочки, пучок которых начинает тянуть хромосому к противоположному полюсу. Наличие такой тянущей силы
437
Рис. 315. Схема митотических движений хромосом
о - профаза: дрейф сдвоенных хроматид к полюсам веретена; б - прометафаза: дрейф сдвоенных хроматид в экваториальную область веретена; в - метафаза; г - анафаза А: расхождение хроматид к полюсам; д-анафаза Б: расхождение полюсов. Топкие стрсяки покатывают поток мономеров тубулина; толыые стрелки указывают нанравясние движения хромосом
43Н
Рис. 316. Динамическая нестабильность локализации хромосом в про.мстафазс
Перерезка пучка кмнетохориых микротрубочек (показано стрелкой) вызмюет движение хромосом к лрогивопо.южному полюсу.« - исходная позиция хромо сом; б - позиция хромосом после перерезки
доказывается тем, что если лазерным микролучом перерезать пучок микротрубочек у одного нз кинетохоров. то хромосома начинает двигаться к противоположному полюсу (рнс. 316). В нормальных же условиях хромосома, совершая небольшие перемещения в сторон} то одного, то другого полюса, в результате постепенно занимает срединное положение в веретене. В процессе прометафазного дрейфа хромосом происходит удлинение, наращивание микротрубочек на плюс-коицах, когда кинетохор движется от полюса, и разборка, укорачивание микротрубочек тоже на пл юс-кон ие, когда сестринский кинетохор движется по направлению к полюсу.
Эти переменные движения хромосом то туда, то сюда приводят к тому, что они в конце концов оказываются в экваторе веретена и выстраиваются в метафазную пластинку (см. рис. 315).
Метафаза (рис. 309, см. вклейку). В метафазе, так же как и в других фазах митоза, несмотря на некоторую стабилизацию пучков микротрубочек, продолжается нх постоянное обновление за счет сборки и разборки тубулинов. Во время метафазы хромосомы располагаются так. что их кинетохоры обращены к противоположным полюсам. В это же время происходит постоянная переборка и межполюсных микротрубочек. число которых в метафазе достигает максимума. Если на метафазную клетку посмотреть со стороны полюса, то можно видеть, что хромосомы располагаются так, что их центромерные участки обращены к центру веретена, а плечи — к периферии. Такое расположение хромосом носит название «материнской звезды* и характерно для кле-гок животных (рис. 317). У растений часто в метафазе хромосомы лежат в экваториальной плоскости веретена без строгого порядка.
439
Рис. 318. Анафазное расхождение хромосом е - анафаза A; б- анафаза В
Рис. 317. Вид метлфазнои хромосомной пчастинки саламандры с полюса
К концу метафазы завершается процесс обособления друг от друга сестринских хроматид. Их плечи лежат параллельно друг другу, между ними хорошо видна их разделяющая щель. Последним местом, где контакт между хроматидами сохраняется, является центромера; вплоть до самого конца метафазы хроматиды во всех хромосомах остаются связанными в центромерных участках.
Анафаза начинается внезапно, что хорошо можно наблюдать при витальном исследовании. Анафаза начинается с разъединения всех сразу хромосом в центромерных участках. В это время происходит одновременная деградация центромерных когезииов, которые связывали до этого времени сестринские хроматиды. Такое одновременное отделение хроматид позволяет начать их синхронное расхождение. Хромосомы все вдруг теряют центромерные связки и синхронно начинают удаляться друг от друга ио направлению к противоположным полюсам веретена (рис. ЗЮ (см. вклейку) и 318). Скорость движения хромосом равномерная, она может достигать 0,5-2 мкм/мип. Анафаза -самая короткая стадия митоза (несколько процентов от всего времени). но за это время происходит целый ряд событий. Главными из них являются сегрегация двух идентичных наборов хромосом и транспорт их в противоположные концы клетки.
При движении хромосомы меняют свою ориентацию и часто принимают V-образную форму. Вершина их направлена в сторону полюсов деления, а плечи как бы откинуты к центру веретена. Если перед анафазой произошел разрыв плеча хромосомы, то во время анафазы оно не будет участвовать в движении хромосом н останется в центральной зоне. Эти наблюдения показали, что именно центромерный участок имеете с кинетохором отвечает за движение хромосом. Созда-
440
етсм впечатление, что за нейгромеру хромосома оттягивается к полю су. У некоторых высших растений (ожика; „ст выраженной вентро мерное перетяжки, и волокна веретена контактируют со многими точками на поверхности хромосом (полицентрические и голопеитриче ские хромосомы). В этом случае хромосомы располагаются поперек волокон веретена.
Собственно расхождение хромосом слагается из двух процессов: I — расхождение хромосом за счет кинетохорных пучков микротрубочек, 2 — расхождение хромосом вместе с полюсами за счет удлинения межполюсных микротрубочек. Первый из этих процессов носит название «анафаза А». второй - «анафаза В» (см. рис. 318).
Во время анафазы А, когда группы хромосом начинают двигаться по направлению к полюсам, происходит укорачивание кинетохорных пучков микротрубочек. Можно было ожидать, что в этом случае деполимеризация микротрубочек должна осуществляться на их мтгнус-концах, т.е. коттах, ближайших к полюсу. Однако было доказано, что микротрубочки действительно разбираются, но большей частью (80%) с плюс-кониов. прилежащих к кинетохорам. В эксперименте в живые клетки культуры ткани с помощью метода микроинъекции был введен тубулин, связанный с флуорохромом. Это позволяло витально видеть микротрубочки в составе веретена деления. В начале анафазы пучок веретена одной из хромосом был облучен световым микролучом примерно посередине между полюсом и хромосомой. При таком воздействии исчезает флуоресценция в облученном месте. Наблюдения показали, что облученный участок к полюсу не приближается, но хромосома достигает его при укорачивании кинетохорного пучка (рис. 3(9). Следовательно, разборка микротрубочек кинетохорного пучка происходит в основном с плюс-конца, в месте его соединения с кинетохором. а хромосома движется по направлению к минус-концу микротрубочек, который расположен в зоне центросомы. Оказалось. чго такое движение хромосом зависит от присутствия АТФ и от наличия достаточной концентрации ионов Са2+. То, что в составе короны кинетохо-ра, и которую вмонтированы плюс-кон цы микротрубочек, обнаружен белок динеин, позволило считать, что именно он является мотором, который подтягивает хромосому к полюсу. Одновременно с этим происходит деполимеризация кинетохорных микротруоочек на плюс-конце (рис. 320).
После остановки хромосом у полюсов наблюдается дополнительное их расхождение за счет удаления полюсов друг от друга (анафаза В) Показано что при этом происходит наращивание плюс-кониов межполюсных микротрубочек, которые могут значительно увеличиваться в длину. Взаимодействие между этими антипараллельными микротрубочками. приводящее к их скольжению Друг относительно друга. определяется другими моторными кинезинподобными ое.тками.
44)
Рис. 319. Расхождение хромосом в анафазе, обусловленное деполимеризацией микротрубочек в районе кинстохоров
а - обссивсчпиание пучка флуоресцирующих микротрубочек (показано стрелком к б - хромосома приближается к обученному участку
Рис. 320. Схема участия динеино-вых молекул в подтягивании хромосомы к полюсу при одноирсменной разборке микротрубочек (указано стрелками)
i к и и с то хор; 2 пшсииовые ручки; 3 микротрубочка: 4 - и к-чи хромосомы; 5 клеточный центр
Криме того. полюса дополнительно нодтягинаютси к периферии клетки та счет изанмодсисгвия с астральными микротрубочками дннеиио-иодобных белков на плазматической мембране.
Последовательность анафаз А и В н их вклад в процесс расхождения хромосом могут быть различными у разных объектов. Так. у млекопитающих стадии А и В протекают практически одновременно. У простейших анафаза В может приводить к 15-кратному увеличению длины веретена. В растительных клетках стадия В отсутствует.
Телофаза начинается с остановки хромосом (ранняя телофаза, поздняя анафаза) (рис. 311 и 312. см. вклейку) и кончается началом реконструкции нового интерфаз-иого ядра (ранний Gj-период) и разделением исходной клетки на дне дочерние (цитокинез).
В ранней телофазе хромосомы, не меняя своей ориентации (центромерные участки — к полюсу, теломерные - к центру веретена), начинают дскондснсиронаться и увеличиваться в объеме. В местах их контактов с мембранными пузырьками цитоплазмы начинает строиться новая ядерная оболочка, которая раньше всего образуется на латеральных поверхностях хромосом и позже - в центромерных и теломерных участках. После замыкания ядерной оболочки начинается формирование новых ядрышек. Клетка переходит в С(-период новой интерфазы.
В телофазе начинается и заканчивается процесс разрушения митотического аппарата - разборка 442
микротрубочек. Он ндегог полк,сон к экватору бывшей клетки имен но в средней части веретена микротрубочки сохраняются лотыпе псе го (остаточное тельце).
Одно из главных событий телофазы разделение клеточного гела т.е. шлотомия, или гипокинез. Выше уже творилось, что у растений ле' лепне клетки происходит путем внутриклеточного образования клеточной перегородки, а у клеток животных — путем перетяжки, впячи пиния плазматической мембраны внутрь клетки.
Митоз не всегда заканчивается разделением гела клетки. Так, в эн досперме многих растений некоторое время могут идти множественные процессы митотическою деления ядер без деления цитоплазмы: образуется гигантский многоядерный симпласт. Так же. без цитото-мин, синхронно делятся многочисленные ядра плазмодиев мпкеомиие-тов. На ранних этапах развития зародышей некоторых насекомых также осучиесглястся неоднократное деление ядер без деления цитоплазмы.
Н большинстве случаев закладка перетяжки при делении клеток животных происходит строго в экваториальной плоскости веретена. Здесь в конце анафазы, в начале телофазы, возникает кортикальное скопление микрофиламеитов, которые образуют сократимое кольцо (см. рис. 258). В состав мпкрофпламентов кольца вхо,гят актиновые фибриллы и короткие палочковидные молекулы из полимеризованного миозина II. Взаимное скольжение этих компонентов приводит к уменьшению диаметра кольца и к появлению вдавления плазматической мембраны, что в конце обусловливает перетяжку исходной клетки надвое.
После цитотомии две новые (дочерние) клетки переходят в сталию G, клеточного периода. К этому времени возобновляются цитоплазматические синтезы, происходит реставрация вакуолярной системы, Диктиосомы аппарата Гольджи снова концентрируются в околоядер-ной зоне в ассоциации с центросомой. От центросомы начинается отрастание цитоплазматических микротрубочек и восстановление интерфазного цитоскелета.
Самоорганизация системы микротрубочек
Обзор становления митотического аппарата показывает, что для процесса сборки сложного ансамбля микротрубочек необходимо наличие как центров организации микротрубочек, гак и
Однако существует ряд примеров, показывающих, что р нитастеров и веретен может идти независимо, путем самоорган гза нии Если с помощью микроманипулятора отрезать часть цитонл ' фибробласта, в которой не была бы расположена центриоль то происходит спонтанная реорганизация системы микротруоочек. Вначазс
443
Рис. 321. Спонтанное образование цитастсра (Ц) из микротрубочек (МТ) в клеточном фрагменте (иитолластс), лишенном клеточного центра
в отрезанном фрагменте они располагаются хаотически, но через некоторое время они собираются своими концами в звездоподобиую структуру — цнтастер. где на периферии клеточного фрагмента находятся плюс-концы микротрубочек (рис. 321). Сходная картина наблюдается у бесцентриолярных фрагментов меланофоров — пигментных клеток, несущих фа пулы пигментамеланина. В этом случае происходит не только самосборка иитастера, но и рост микротрубочек от гранул пигмента, собранного в центре клеточного фрагмента.
В других случаях самосборка микротрубочек может приводить к образованию митотических веретен. Так, в одном из экспериментов был выделен цитозоль из делящихся яиц ксенопуса. Если в такой препарат поместить мелкие шарики, облепленные фаговой ДНК, то возникает митотическая фигура, где место хромосом занимают эти шарики ДНК, не имеющие кинетохорных последовательностей, а к ним примыкают два полуверетена, в полюсах которых нет никаких ЦОМТ.
Сходные картины наблюдаются и в естественных условиях. Например. при делении яйцеклетки дрозофилы при отсутствии центриолей вокруг группы прометафазных хромосом начинают хаотически полимеризоваться микротрубочки, которые затем перестраиваются в биполярное веретено и связываются с кннетохорами. Аналогичная картина отмечается во время мейотического деления яйцеклетки ксенопуса.
Рис. 322. Спонтанное образование веретена деления в мейозе ооцита Лелорш (по;; Vernos, Karscnti. 1995)
I микротрубочки; 2 — хромосомы
444
3
Рис. 323. Схема процесса организации веретена за счет хромокинсгинее, связывающих хромосомы и микротрубочки. и за счет динеинов, локализованных на везикулярных частицах
1 - микротрубочки; 2- хромокиисзины; 3 - хромосомы: 4-динеины на везикулах Здесь также вначале происходит спонтанная организация не ориентированных микротрубочек вокруг группы хромосом, а позже образуется нормальное биполярное веретено, в полюсах которого также отсутствуют центросомы (рис. 322).
Эти наблюдения привели к выводам, что в самоорганизации микротрубочек принимают участие .моторные белки, кинезинопоболные и Динеииоподобиыс. Были обнаружены моторные плюс-кониевыс белки - хромокииезины. которые связывают хромосомы с микротрубочками и заставляют последние двигаться в направлении минус-конца. что приводит к образованию конвергентной структуры типа полюса веретена. С другой стороны, динеинподобные моторы, связанные с вакуолями или гранулами, могут перемещать микротрубочки так, что их ми-нус-концы будут стремиться образовывать конусовидные пучки, будут сходиться в центре полуверетен (рис. 323). Похожие процессы происходят при образовании митотических веретен в растительных клетках.
Митоз растительной клетки
Митотическое деление клеток высших растений имеет ряд характерных особенностей, которые касаются начала и конца этого процесса В интерфазных клетках различных меристем растений микротрубочки располагаются в кортикальном подмембранном слое цитоплазмы, образуя кольцевые пучки микротрубочек (рис. 324). Периферические микротрубочки контактируют с ферментами, образующими фибриллы целлюлозы, с целлюлозосинтетазами, которые являются интегральными белками плазматической мембраны. Они синтезируют Целлюлозу на поверхности плазматической мембраны. Считается, что в процессе роста целлюлозной фибриллы эти ферменты передвигаются вдоль подмембранных микротрубочек.
Митотическая перестройка элементов цитоскелета происходит в начале профазы. При этом исчезают .микротрубочки в перифериче-
445
Рис. 324. Стадии митоза растительной клетки
« микротрубочки и кортикальном слое цитоплазмы иигерфазкой растительной клетки; б - преирофазнос кольцо .микротрубочек; в - профаза, образование веретена; е-метафаза. д - анафаза; с - телофаза, образование фрагмоииаста: ж — переход к иизерфа-зе; з- ингерфаза
3
скнх слоях цитоплазмы, но в примембранном слое цитоплазмы в экваториальной зоне клетки возникает кольцевидный пучок микротрубочек - преирофазнос кольцо, в которое входит более 100 микротрубочек (рис. 325. см. вменку). Иммуиохимическн в этом кольце обнаружен также актин. Важно отметить, что прспрофазное кольцо микротрубочек располагается там, где и телофазе будет образовываться клеточная перегородка, разделяющая дне новые клетки. Позднее в профазе это кольцо начинает исчезать, и новые микротрубочки появляются но периферии профазного ядра. Их число больше в полярных зонах ядер, они как бы оплетают всю ядерную периферию. При переходе к прометафазе возникает биполярное веретено, микротрубочки которого подходят к так называемым полярным шапочкам, в составе которых наблюдаются лишь мелкие вакуоли и неопределенной морфологии тонкие фибриллы; никаких признаков центриолей в этих полярных зонах не обнаруживается. Так формируется анастральное веретено.
В прометафазе при делении растительных клеток также наблюдается сложный дрейф хромосом, их осцилляция и перемещение такого же типа, какие встречаются в прометафазе клеток животных. События в анафазе схожи с таковыми в астральном митозе. После расхождения
446
326. Сравнение цитотомии клеток высших растении (а) и животных (6)
хромосом возникают новые ядра, также за счет деконденсации хромосом и образования новой ядерной оболочки.
Процесс же цитотомии растительных клеток резко отличается отделения перетяжкой клеток животного происхождения (рис. 326). В данном случае в конце телофазы также происходит разборка микротрубочек веретена в полярных областях. Но микротрубочки основной части веретена между двумя новыми ядрами остаются, более того, здесь образуются новые микротрубочки. Так создаются пучки микротрубочек, с которыми связаны многочисленные мелкие вакуоли. Эти вакуоли произошли от вакуолей аппарата Гольджи и содержат пектиновые вещества. С помощью микротрубочек .многочисленные вакуоли движутся к экваториальном зо
не клетки, где сливаются друг с друтом и образуют в середине клетки плоскую вакуоль — фрагмопласт. который разрастается к периферии клетки, включая все новые и новые вакуоли (рис. 324, 325 и 327).
Так создается первичная клеточная стенка. В койне концов, мемо-раны фрагмопласта сливаются с плазматической мембраной, происходит обособление двух новых клеток, разделенных новообразованной клеточной стенкой. По мере расширения фрагмопласта пучки микротрубочек перемешаются все больше к периферии клетки, ероятно. что процессу растяжения фрагмопласта. отодвигания на периферию пучков микротрубочек способствуют пучки актиновых филаменто . отходящих от кортикального слоя цитоплазмы в гом месте, где )>.
прспрофазное кольцо.
После разделения клетки микротрубочки, участвовавшие в транспорте мелких вакуолей, исчезают. Новое поколение иитерфазных микротрубочек образуется на периферии ядра, а затем располагается в
кортикальном примембранном слое цитоплазмы.
Таково общее описание деления растительных клеток, однако этот процесс изучен крайне недостаточно. В полярных зонах веретен не обнаружены белки, входящие в состав ЦОМТ животных клеток. Было выявлено, что в растительных клетках в этой роли может выступать
447
Рис. 327. Последовательные стадии (а, б, в) образования фрагмопласта / - вакуоли; 2- микротрубочки; 3 — аппарат 1ольджи; 4- слияние вакуолей; 5 — фраг-мопласт; 6- апдоптазматический ретикулум
ядерная оболочка, от которой плюс-концы микротрубочек направлены к периферии клетки, а минус-концы - к ядерной оболочке. При образовании же веретена кинетохорные пучки ориентированы минус-концом к полюсу, а плюс-кониом к кииетохора.м. Как происходит такая переориентация микротрубочек, остается не выясненным.
При переходе к профазе вокруг ядра появляется плотная сеть микротрубочек, напоминающая корзинку, которая затем по форме начинает напоминать веретено. При этом микротрубочки образуют ряд сходящихся пучков, направленных в сторону полюсов. Позднее в про-мстафазе происходит связь микротрубочек с кпнетохорами. В метафазе кинетохорные фибриллы могут формировать общий центр схождения миннполюса веретена, или центры конвергенции микротрубо
448
чек. Вероятнее всего, образование таких мззззззззолзосон осуществляет ся за счет объединения минус-концов микротрубочек, связанных с ки иетохорами. По-видимому, в клетках ныезиззх растении процесс реор ганизацнп цитоскелета, в том числе п образование митотического не ретена, связан с самоорганизацией микротрубочек. которая, как и в клетках животных, происходит при участии моторных белков.
Движение и деление бактериальных клеток
Многие бактерии способны к быстрому движению с помощью своеобразных бактериальных жгутиков, или флагелл. Основная форма движения бактерий — с помощью жгутика. Жгутики бактерии принципиально отличаются от жгутиков эукариотических клеток. По числу жгузикозз их делят на. монотрнхи — с одним жгутиком, политрихи -с пучком жзутиков. пери-трихи — с множеством жгутикозз зз разньзх участках поверхности (рис. 328).
Жзутззкзз бактерий имеют очень сложное строение; онзз состоят ззз трех основных частей: внешняя длинная волнистая нззть (собственно жгутик). крючок, базальное теззьие (рззе. 329).
Жзутпковая нить построена из белка флагеллина. Его молекулярная масса колеблется в •зависимости от вида бактерий (40-60 тыс.). Глобулярные субъединицы флагеллина полимеризуются в спирально закрученные ззнтзз так. что образуется трубчатая структура (не путать с микротрубочками эукариот!) с диаметром 12—25 нм. полая изнутри. Флагелл из зы зге способны к движенззю. Оззи могут спонтанно полимеризоваться зз нити с постояззныхз шагом волны, характерным аля каждого зззз'га. В живых бактериальных клетках нарастание жгутиков происходит на ззх дистальном конце; вероятно, транспорт флагедтинов осузцсствлястся через полую середину жгутика.
Вблнззз зелеточной поверхности жгутиковая нить, флагелла, пере ходит к более широкому участку. у
так называемому крючку. Он у
имеет длину около 45 нм зз состо- д '-w-vr-
ит из другого белка В г Д
Бактериальное базальное В тельце не имеет ничего общего с У И) ( (.
базальным тельцем эукариотиче- (. уУ) (
скоп клетки (см. рис. 290. <>. в). ( \\\\
Оно состоит ззз стержня, связан- д
кого с крючком, и четырех ко- а
Лезз — дисков. Два верхних кольца рис 328. Формы жгутиковых бак-лиска. имеющихся у грамогрзша- терни
тельных бактерий, локализованы о _ монстрик: б - .юфотрзп: • - трзприх зз клеточной стенке: одно кольцо
449
Рис. 329. Схема строения бактериального жгутика грамотрииатслыюй бактерии (Jones. Macmib. 1990)
UM - внешняя мембрана; ЦМ пигоптаамагическая мембрана: П — першматма
(L) погружено в лппосахарилную мембрану, а второе (Р) - в муреиновый слой. Двя других кольца — белковый комплекс S-статор и М-ро-тор. локализованы в плазматической мембране. К этому комплексу со стороны плазматической мембраны примыкает кольцевой ряд белков Mot А и В.
В базальных тельцах грамположнтсльных бактерий имеются только дна нижних кольца, связанных с плазматической мембраной. Базальные тельца вместе с крючками можно выделить. Оказалось, что они содержат в споем составе около 12 различных белков.
Принцип движения бактериальных жгутиков совершенно иной, чем у эукариот. Если у эукариот жгутики движутся за счет продольного скольжения дуплетов микротрубочек, то у бактерий движение жгутиков происходит за счет вращения базального тельца (а именно S- и М тисков) вокруг своей оси в плоскости плазматической мембраны.
Эго было доказано рядом экспериментов. Так. закрепляя жгутики на подложке с помощью антител к флагеллину, исследователи наблюдали вращение бактерий. Отмечено, что многочисленные мутации по флагеллннам (изменение изгиба нити, «-курчавость» и т. д.) нс сказываются на способности клеток к движению. Мутации же по белкам вагального комплекса часто приводят к потере движения.
450
Движение бактериальных жгутиков ис зависит от Л1Ф. а осуществляется благодаря трансмембранному градиенту ионов яо-зорота на поверхности плазматической мембраны Прн лом происхозиг вращение М-лиска.
В окружении М-диска Mot-бслкн способны к переносу ионов водорода из перннлазматнческого пространства в нитон мзму (за один оборот переносится до 1000 ионов водорода). При этом жзутикзз вращаются с озромнозз скоростью — 5—100 об/с, что дает возможность бактериальной клетке перемещаться на 25-100 мкм/с.
Обычно деление бактериальных клеток описывается как «бинарное»: после удвоения нуклеоиды, связанные с плазматической мембраной, расходятся за счет растяжения .мембраны между нуклеоидами, а затем образуется перетяжка, или сента, делящая клетку надвое. Этот тип деления приводит к очень точному распределению генетического материала, практически без ошибок (менее 0,03 % дефектных клеток) Напомним, что ялерный аппарат бактерии, нуклеоид, представляет собой циклическую гигантскузо (1.6 мм) молекулу ДНК, образующую многочззеленные ззетлевые домены в состоянии сверхспирализаззизз,
порядок укладки петлевых доменов неизвестен.
Среднее время между делениями бактеризезьных клеток составляет 20-30 мин. В этот период должен произойти целый ряд событий: репликация ДНК нуклеоида, сегрегация, отделение сестринских нуклеоидов, их дальнейшее расхожденззс, цитотомия за счет образования септы, делящей исходную клетку ровно пополам.
Все эти процессы зз ззоследнззе годы интенсивно ззсслеловалззсь. в результате были получены важные и неожиданные наблюдения. Так, оказалось, что в начале синтеза ДНК, который начинается с точкзз ре-нлик.шизз (origin), обе растущие молекулы ДНК изначально остаются связанными с плазматической мембраной (рис. 330). Одновременное синтезом ДНК происходит процесс снятия еззерхеппрализацизз как старых. так зз реплицирующихся петлевых доменов за счет ислозо ряда ферментов (топоизомеразы, гззразы. лигазы зз др), что приводит к фи зпческо.му обособлению двух дочерних (илзз сестринских) хром м
Рис. ЗЗО. Удвоение бактериальной хромосомы «емозмиоч <Л Г -
Точка ШРШ.Ы репликации <23 оепвз.ся евяМ-иоЗ. с пззтметвчееков жмораиои сестринские peiijiimipot«a>ifibic хромосомы
451
Рис. 331. Расхождение бактериальных хромосом
I 1НК реплицированных кхклеоилок; 2- моторный белок Мик В; 3 - фибриллярный ос юк Gif A; 4 н i.bm.h нисская мембрана. С грелки показываю г направления расхож-1сния бактериальных хромосом
нуклеоидов, которые еще находятся в гесном контакте друг с другом. После такой сегрегации нуклеоиды расходятся от центра клетки, от меси их бывшего расположения. Причем это расхождение очень точное: на четверть длины клегки в двух противоположных направлениях. В результате этого в клегке располагаются два новых нуклеоида. Каков механизм этого расхождения? Делались предположения (Деламатер. 1953). что деление бактериальных клеток аналогично митозу эукариот, однако данных в пользу этого предположения долгое время нс появлялось.
Новые сведения о механизмах деления бактериальных клеток были получены при изучении мутантов, в которых происходили нарушения клеточного деления.
Было обнаружено, что в процессе расхождения нуклеоидов принимают участие несколько групп специальных белков. Один из них - белок Мок В, представляет собой гигантский гомодимер (мол. масса около 180 кДа, длина 60 нм), состоящий из центрального спирального участка и конневых глобулярных участков, напоминающий по структуре нитевидные белки эукариот (цепь миозина II, кннезина). На N-KOime Muk В связывается с ГТФ и АТФ, а на С-коинс — с молекулой ДНК. Эти свойства Muk В дают основания считать его моторным белком, участвующим в расхождении нуклеоидов. Мутации этого белка приводят к нарушениям расхождения нуклеоидов: в мутантной популяции появляется большое количество безъядерных клеток.
Кроме белка Muk В в расхождении нуклеоидов, но-видимому, участвуют пучки фибрилл, содержащих белок Caf А. ко горы й может связываться с тяжелыми цепями миозина, подобно актину (рис. 331).
Образование перетяжки, пли септы, также в общих чертах напоминает цитотомню животных клеток. В данном случае в создании септ принимают участие белки семейства Fis (фибриллярные термочувствительные). В эту ipyniiy входят несколько белков, среди которых наиболее н тучен белок FfsZ. Он сходен у большинства бактерий, архибак-
452
a
Рис. 332. Участие белка Fis-Z в образовании клеточной перетяжки при делении бактерии
а в интерфазе белок Fis-Z диффузно распределен в шгтопяазме I /), при делении он концентрируется в области перетяжки (2), 3- разделившаяся бактериальная клетка: б-в зоне перетяжки белок Fls-Z образует сократимое кольцо (/). 2 - плазматическая мембрана. 3 - клеточная а емка
терий. его обнаруживают в микоплазмах и хлоропластах. Это глобулярный белок, схожий по своей аминокислотной последовательности с тубулином. При взаимодействии с ГТФ in vitro он способен образовывать длинные нитчатые протофиламеиты. В пнтерфазе FtsZ диффузно локализуется в цитоплазме, его количество очень велико (5-20 тыс. мономеров на клетку). Во время деления клетки весь этот белок локализуется в зоне септы, образуя сократимое кольцо, очень напоминающее актомиозиновое кольцо при делении клеток животного происхождения (рис. 332). Муганн и по этому белку приводят к прекращению деления клеток: возникают длинные клетки, содержащие множество нуклеоидов. Эти наблюдения показывают прямую зависимость деления бактериальных клеток от наличия Fts-белков.
Относительно механизма образования септ существует несколько гипотез, постулирующих сокращение кольца в зоне септы, приводящее к разделению исходной клетки надвое. По одной из них протофи-ламенты должны скользить один относительно другого с помощью неизвестных еше моторных белков, по другой — сокращение диаметра септы может происходить за счет деполимеризации заякоренных на плазматической мембране FtsZ (рис. 333).
Параллельно образованию септы идет наращивание муреинового слоя бактериальной клеточной стенки за счет работы полифермен гати иного комплекса РВР-3. синтезирующего пептидогликаны.
Таким образом, при делении бактериальных клеток осуществляются процессы, во многом сходные с делением эукариот, расхождение хромосом (нуклеондон) за счет взаимодействия моторных и фибриллярных белков, образование перетяжки за счет фибриллярных белков,
453
Рис. ЗЗЗ. Гипотезы механизма сокращения козьца при делении бактерий а - за счет работы гипотетического моторного белка (.?) молекулы белка Fts-Z (4) сбли-Ж.1Ю1СЯ и деполимеризуются: I — плазматическая мембрана. 2 - интегральные белки, енязынаюшие Fis-Z; б- деполимеризация белка Fis-Z (3) сопроиожлаегся сближением иитегра.1Ы1Ых белков (2) плазматической мембраны
создающих сократимое кольцо. У бактерии в отличие от эукариот в тих процессах принимают участие совсем иные белки, но принципы организации отдельных этапов клеточного деления очень сходны.
Глава 25
МЕЙОЗ
Мейоз (от греч. meivsts - уменьшение) - особый способ деления клеток, деление созревания, в результате которого происходят редукция (уменьшение) числа хромосом и переход клеток из диплоидного состояния в гаплоидное. Мейоз - это особый тин дифференцировки, специализации клеток, который приводит к образованию половых клеток. Этот процесс занимает два клеточных цикла при отсутствии синтеза ДНК во втором мейотическом делении. Необходимо отметить, что мейоз представляет собой универсальное явление, характерное для всех эукариотических организмов. При мейозс происходит не только ред\ кипя числа хромосом до гаплоидного их числа, но и осуществляется чрезвычайно важный генетический процесс - обмен участками между гомологичными хромосомами, процесс, получивший название кроссииговера.
Существует несколько разновидностей мейоза. При зиготном типе меиоза, характерном для аскомицетов, базимииетов, некоторых водорослей. споровиков и др., для которых в жизненном цикле преобладает га-
454
моидиая фаза. лис клетки - гаметы - сливаются, образуя «.годе твои ным (диплоидным) набором хромосом. В таком виде люпоидная зигота (покоящаяся спора) приступает к мейозу; дважды делится в результате об' разуются четыре гаплоидные клетки, которые продолжают размножаться
Споровый тип мейоза встречается у высших растений, клетки кото рых имеют диплоидный набор хромосом. В данном случае в органах размножения растений образовавшиеся после мейоза гаплоидные клетки сшс несколько раз делятся. Другой тип мейоза. гаметный. про исходит во время созревания гамет — предшественников зрелых половых клеток. Он встречается у многоклеточных животных, среди некоторых низших растений.
В случае гамстного мейоза при развитии организма происходит выделение клонов герминативных клеток, которые впоследствии будут дифференцироваться в половые клетки. И только клетки этих клонов будут при созревания подвергаться мейозу и превращаться в половые клетки. Следовательно, все клетки развивающихся многоклеточных животных организмов можно разделить на две группы: соматические, из которых будут образовываться клетки всех тканей и органов, и герминативные, которые дадут начало половым клеткам.
Такое выделение герминативных клеток (гононитов) обычно происходит на ранних стадиях эмбрионального развития (рис. 334). Так, детерминация гоноиитов у рачка циклопа осуществляется уже на первом делении зиготы: одна из двух клеток дает начало герминальным клеткам. У аскариды герминативные клетки, или клетки «зародышевого пути» (А.Вейсман), выделяются на стадии 16 бластомеров, У дрозофилы - на стадии бластоцисты, у человека первичные половые клетки (Тонобласты) появляются на третьей неделе эмбрионального развития в стенке желточного мешка в каудальном отделе эмбриона.
Как и все клетки развивающегося организма, клетки зародышевого пути диплоидны. Они могут увеличиваться в числе путем митоза, повторяя все стадии обычного клеточного цикла, где происходит чередование уровней количества ДНК и хромосом на клетку.
2л (2с) -> S-период -* 4л (4с) -> 2 клетки 2л (2с) и г. д.
Однако на определенных стадиях развития при половом созрева нии особей этот обычный ход смены событии меняется, ерминатнв ные клетки превращаются в гениальные (оогонии — женские и спер матогонии — мужские клетки-предшественники), и они вступают в процесс мейоза. При этом как для женских, так и для мужских клегок наступает первый цикл мейоза. На этой и следующей стадии половые клетки получили название сперматоцитов и оокитов (I и порядка).
455
Ауксоциты
(сперматоциты, Мейотичсское или ооциты), Первичные «роды-
деление период роста Гонки шевые клетки
Рис. 334. Общая схема зародышевою пути (Wilson, 1925)
456
В первом кле точном цикле меноз., происходит целый ряд событии которые его значительно отличают от обычного клеточного никла.' После вступления в I цикл созревания и сперматоциты I и ооциты I порядков синее тируют ДНК. ес количество удваивается, так же как удваивается за счет репликации количество хромосом. Следовательно, после S-периода эти клетки нужно считать (гак же как и соматические клетки после синтеза ДНК) тетраплоидными. После короткого G, периода наступает профаза I мейотическото деления, которая ре тки отличается от обычной мсйотический профазы.
Особенности профазы I мейотическото деления
Во-первых, эта ст алия занимает большой отрезок времени (от суток до нескольких лет !). Во-вторых, она состоит из нескольких структурно-функциональных фаз (лептотена. знготена, пахптена, диплотена, диакинез). Далее, в этот период происходит объединение - конъюгация, гомологичных (родительских) удвоенных в результате репликации хроматид, при этом образуются гак называемые тетрады, т. е. хромосомные комплексы, состоящие из четырех хроматид (удвоенные материнские и удвоенные отцовские), которые соединены вместе с помощью специальной структуры - синаптонемного комплекса. В это же время осуществляется обмен участками между хроматидами гомологичных хромосом (но не между сестринскими хроматидами одного гомолога) — кроесииговер Кроме того, в процессе конъюгации и обмена происходит синтез примерно 1,5% хромосомной ДНК.
В профазе I мейотическото деления наблюдается рост объема ооип-тов, в которых накапливаются запасные вещества, обеспечивающие ранние стадии развития будущего зародыша.
Эта профаза отличается также длительностью во времени, необходимого для прохождения перечисленных выше событий- Обычная соматическая профаза длится 0,5—1,5 ч. Меметическая профаза сперматоцита I порядка у самцов мыши длится 12 сут, у человека - 24 дня (плюс еще около двух месяцев до полного созревания сперматозоида). Среди женских половых клеток профаза I порядка тритона обыкновенного длится около 1 гола, у мыши — от 4 месяцев до 3 лет, у челове ка профаза I ооцитов начинается на третьем месяце вн\ гриутр него развития и может продолжаться до 50-летнего возраста женщины, ри этом у человека происходит постепенная гибель заложенных ооцитов, у трехмесячного эмбриона их около 7 10 клеток, к рождению ре енка их остается около 2I06, к половому созреванию — , всего же с
зреваст (овулируют) примерно 5 10- ооцитов.
Другой особенностью профазы I меойза является го, что в от.ш ше от обычного митоза хромосомы сохраняют ряд функциональных на грузок: они способны к синтезу РНК. частичному синтезу Д . пр -
457
icpiiciuiKn ря i структурных перестроек. Другими словами, ирофатиые хромосомы I меиот оческою деления нс находятся в состоянии функциональною покоя, а участвуют в целом ряде событий.
Стадии профазы I меметического деления
Вся профам I меио|нческо1о деления состоит из нескольких сталии: лечногена - сталия тонких нитей (хромосом), зиготсна - стадия с нныкшнхея (объединяющихся, конъюгирующих) нитей, пахнтена -стадия толстых нитей, диплотсна — сталия двойных нитей, диакивез -стадия расходящихся нитей (рис. 335).
Итвссхстадий профазы I самой длительной является сталия пахи-тены. в ряде случаев она занимает до 50% времени.
Рис. 335. Схематическое и юбраженнс мейоза при 2/1 = 6 числе хромосом о 1ептотена; б /игогена; « нахигеиа с тремя бияа.тснгами; г - липлегтепа: д-тиакивез; е метафаза 1: х - анафаза 1: з - метафаза II; « - анафаза II. ХЦ — хромоиентр - место локализации теломерных участков хромосом в «букете-; ХМ -хромомсры; ХИ - хиазма
458
Так. у .словска при спермногене.е стадии лептотеиы с зиппеной занимают 6.5 сут, нахи гена - 15, диплоте,.а и лиакииез 0 8 у мыши леитотена с зиготе,,ой длятся „коло 3 сут, пахитена - 7 сут. диплотсна с днакинезом около 2 сут; у тритона леитотена занимает 5 сут зию-тена - 8. пахитена - 4-5, диплотсна - 2 сут; у доманн.егосверчка леп-тотена и шготена занимают 2-3 сут, пахитена - 6-9. диплотсна - 2 По сравнению с обычным митозом продолжительность деления клеток и процессе мейоза несравнимо длительнее. Это особенно наглядно видно при созревании женских половых клеток v животных, у которых яйцеклетки могут останавливаться в развитии'на несколько месяцев и даже лет в стадии диплотены профазы I мейогического деления.
У растений мейоз также намного длиннее митоза по времени. Так. у традесканции весь мейоз занимает около 5 сут, из которых на профа-зу I деления приходится 4 сут. но встречаются вилы, у которых мейоз вдет со скоростью, соизмеримой с митозом
Леитотена. или сталия тонких нитей, морфологически напоминает раннюю профазу митоза, но отличается тем, что при мейозе ядра обычно крупнее и хромосомы очень тонкие, так что проследить их во всей длине очень трудно (см. рис. 335, о).
Длина каждой меметической хромосомы на ранних стадиях мейоза может быть в 10-100 раз больше длины соответствующих митотических хромосом. Следовательно, мейотнческие хромосомы имеют меныпую степень компактизации, он,, примерно в 30 раз менее компактны, чем хромосомы в метафазе мейоза. В лептотене хромосомы удвоены, но сестринские хроматиды в них далеко не всегда удается различить (так же как в хромосомах в ранней профазе митоза). Таким обра зо,м, в лептотене содержится диплоидное количество (2л) сдвоенных сестринских хроматид, обшее количество последних, как и при митозе, равно 4л вследствие редупликации в S-периоде.
Расположение хромосом в лептотене часто повторяет телофазную поляризацию ядра. При этом у некоторых животных хромосомы образуют так называемую фигуру «букета» - дугообразно изогнутые с ли-женпые хромосомы, связанные своими теломерами с ядерно, оло, кой. У некоторых растений в конце лептотеиы хромосомы собирают-
ся в клубок (синсзис). ,
Характерным для лептотены является появление на тонких хромосомах сгустков хроматина - хромомеров, которые как ы нанизаны в виде бусинок и располагаются по все,, длине хромосомы, и . . р мер и расположение таких хромомерных участков характер ь • каждой хромосомы. Это позволяет составлять морфологические карты хромосом и использовать их для цитолог „веского аналн . хромомеров различно у разных объектов: всего у тритона на -. р ло сомах- их 2.5 тыс., у сверчка - около 200. у риса на 24 хромосомы - 64л.
459
Рис. 336. Строение бивалента (Кикналзс. Высоцкая. 1975) а,- а, и АГА, сестринские хроматиды / - плоскости расхождения хроматид в I леicHitit; 2- то же во II делении
В ленто гене начинает выявляться следующий. чрезвычайно важный и характерный для мейоза процесс коннотации гомологичных хромосом, их сближение, которое начинается в теломерных участках, связанных с ядерной оболочкой. В этих местах образуется сложная специальная структура - тяж белковой природы, сипантонемный комплекс, который позже, в зпготе-
fie. свяжет гомологичные удвоенные хроматиды по всей их длине.
Зиготе на — стадия прохождения конъюгации гомологичных хромосом (синапсис). При этом гомологичные хромосомы (уже двойные
после S-псрпода) сближаются и образуют новый хромосомный ансамбль. никогда до этого ис встречающийся при клеточном делении. -бивалент (рис. 336). Биваленты — это парные соединения удвоенных гомологичных хромосом, т. е. каждый бивалент состоит из четырех хроматид. Таким образом, число бивалентов на ядро будет равно гаплоидному числу хромосом. Такой порядок объединения виден и наследующей, пахитенноп стадии, а на стадии зиготепы он только начинается,
и. видимо, именно эта стадия как-то определяет течение данного процесса. во многом еще непонятного. Действительно, как в пространстве ядра хромосомы находят fie просто соседа, а только одного специфического гомолога, как они располагаются один около другого - эти вопросы еще до конца не выяснены.
Однако было найдено, что. в отличие от митоза, в профазе мейоза, а именно на знготенной стадии, синтезируется небольшое (0.3% от всей ДНК клетки) количество специфической ДНК, получившей название /ДНК. У лилейных /ДНК обогащена Г-Ц-парами, состоит из уникальных последовательностей нуклеотидов. Эта ДНК распределена небольшими участками по всей длине хромосом лилии. При обычном митотическом цикле она синтезируется одновременно с основной массой ДНК. но прп мейозе — только в зиготенной стадии. Было обнаружено, что если на стадии зиготены подавить с помощью ингибиторов этот небольшой дополнительный синтез ДНК, то конъюгация хромосом прекратится. На основании полученных данных было сделано предположение, что специфические по своему строен if ю участки /ДНК на гомологичных хромосомах еще на G^-стадии пнтерфазы ооцита «узнают» друг друга и на некоторое время образуют стабильные связи, необходимые для закрепления хромосом одна вдоль другой.
460
Рис. 337. Синаптонсмный комплекс (СК)
а ~ вил в электронном микроскопе; б - схема; в - модель. 1 - хроматин сестринских хромосом; 2~ осевой элемент; _? - боковые элементы
Позднее эта связь осуществляется уже с помощью иной структуры, а именно с помощью синаитонемиого комплекса (рис. 337). Объединение гомологов чаше всего начинается в теломерах и центромерах. В этих местах, а позднее и в других по всей длине соединяющихся хромосом происходит сближение осевых тяжей на расстояние около 100 нм. ме-
461
жду ними образуются связки. Так идет формирование полной структуры ciiiianroHeMiioi'o комплекса. По мерс сближения и связывания гомологов этот комплекс растет подобно тому, как действует застежка «молния»: две ленты объединяются в одну. 13 копие знготеиы все гомологи не только нашли друг друга, но и объединились с помощью еннаптоием-ной структуры (рнс, 338).
Синаптонсмный комплекс (СК) встречается практически у всех представителей эукариот, которые обладают половым процессом. Он обнаружен у простейших, водорослей, низших и высших грибов, у высших растений н у животных. По своей морфологии он имеет вид трехслойной ленты, состоящей из двух боковых компонентов - тяжей (толщиной 30-60 нм), и центрального осевого элемента (толщиной 10—40 нм); боковые компоненты отстоят друг от друга на 60-120 нм, общая ширина
комплекса 160-240 нм (рнс. 339). Материал хромосом располагается снаружи от боковых элементов. Каждый боковой элемент связав с петлями двуос сестринских хроматид одного гомолога. Большая часть 7НК этих хроматид находится вне СК, и лишь менее 5% геномной 1UK входит в его состав, прочно ассоциируясь с белками СК. В состав этой ДНК входят уникальные и умеренно повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Белковый состав СК сложен, он состоит более чем из десяти мажорных белков с молекулярными массами от 26 до 190 кДа.
Полное сближение бивалентов и их скрепление с помощью СК происходят на следующей стадии, на стадии пахитены.
Пахитеиа — стадия толстых нитей. Называется так потому, что благо гаря полной конъюгации гомологов профазиые хромосомы как бы увеличились в толщине. Число таких толстых пахитепных хромосом гаплоидно (1л). ио они состоят из двух объединившихся гомологов, каждый из которых имеет по две сестринские хроматиды. Следовательно. и здесь количество ДНК равно 4с, а число хроматид — 4л.
Па этой стадии происходит второе, чрезвычайно важное событие, характерное для мейоза кроссинговер, взаимный обмен идентичны-
462
Рис. 339. Меметические хромосомы
а — микрофотография участка ди плотен нон хромосомы. полученная с помощью световою микроскопа: / - ось хромосомы, 2 - боковые петли: о - микрофогитрдфия участка с и пап тонемного комп |скеа (СК), полученная с помощью электронного микроскопа* 1 - астральный элемент. 2 - боковой элемент. 3 - СК при косом срезе.
4 хромосомные участки. 5- ядерная оболочка
463
ми vh.ictkjmh но Limit unio винческнх хромосом. Генетическим следствием кроссишоиср- является рекомбинация сцепленных генов Здесь возникаю! 01 in шме от исходных хромосомы, содержащие от и- 1Ы1ЫС у читки. пришедшие oi их юмологон. Морфологически этот процесс и naxiiieue улови гьнсльзя. Но и дальней тем. вдиплотене. ко-। ы начинают расходиться биваленты, они остаются связанными и нс-
CKOH.KUX точках, хиазмах, которые считают соответствующими местам обмена (рис. 341».
В пахнтсие также происходит синтез небольшого количества ДНК (IS- от генома), отличающейся тем, что она содержит повторяющиеся нос |етователы|остп нуклеотидов. Но этот синтез репаратнпсн. в рс-зу плате его не образуются дополнительные или недостающие количества .ДНК. а происходит восстановление утраченных. Весь процесс объединения и обмена между ДНК несестрннски.х хроматид гомологов можно представить следующим образом. По длине хромосомы разбросаны участки повторяющихся последовательностей ДНК, которые при разрывах с помощью специальных ферментов легко могут образовать гибридные молекулы. Сшивание п восстановление целостности молекул с помощью специальных репаративных ферментов приводят к включению предшественников в ДН К на стадии пахитены. По всей вероятности, в этом процессе принимает участие так называемый рекомбинационный узелок большой белковый ансамбль величиной около 90 нм. Он располагает-° с--------- ----------- 1 ся в еннантоне.мном компле-
ксе между гомологичными б хромосомами, его располо-
женне совпадает с местами
хиазм, где происходит крос-синговер. В конечном результате в мейозе после второго деления произойдет не только образование гамет с гаплоидным числом хромосом, но в каждой гамете могут быть хромосомы иных свойств, чем в исходных клетках.
В пахитенпон стадии начинается активация транскрипционной активности хромосом. Именно в это время в женских половых клетках осуществляется амплификация рибосомных генов.
Рис. 340. Схема кроесинговсра
а - парные гоматсни. аежашие отчетьно'. б- их Спира гшаиия в пахшене; в - расположение хром-чил в inn loieiic; i - лиакииез. Стрелки ук.мывикп на места кроссинг онера, на хиазмы. Ц in нтромсры
464
ЧТО приводит к появлению дополнительных ядрышек. На этой же ста дни начинают активироваться некоторые хромомеры и изменяется структура хромосом; они приобретают вил «ламповых шеток» («ерши ков» для чистки посуды). Особенно отчетливо эти изменения видны на сталии диплотсны.
Диплотсна — стадия двойных нитей (см. рис. 339). На этой стадии мсйоза происходит отталкивание гомологов друг от друга, которое часто начинается в зоне центромер. Но при этом пары сестринских хро матид каждой гомологичной хромосомы остаются соединенными между собой в центромерных районах и но всей длине. В это время сестринские хроматиды отчетливо выявляются в световом микроскопе. По мере отталкивания хромосом в бивалентах хорошо видны хиазмы - места перекреста и сцепления хромосом. Только в этих участках сохраняется структура синаптоне.много комгьчекса; в разошедшихся районах он исчезает. Расположение хиазм может быть различным у разных видов на разных хромосомах. Более длинные хромосомы имеют больше хиазм, чем короткие, но и самые короткие могут иметь одну
хиазму на бивалент. Если есть одна точка контакта, то бивалент приобретает вид креста, если две. то вид петли или ряда петель при наличии более двух хиазм (см. рис. 340).
В диилотеппой стадии происходит некоторое укорачивание и конденсация хромосом, в результате чего отчетливо выявляется их четырех-нитчатая структура. В зоне хиазм при этом видно, что в перекрест вовлекаются только две хроматиды из четырех — по одной от каждого гомолога (рис. 341).
На этой стадии хромосомы приобретают вид «ламповых шеток» (см. рис. 104). На выделенных хромосомах этой стадии видно, что каждый гомолог в биваленте окружен как бы войлоком, состоящим из петлистых нитчатых структур. При этом было обнаружено, что петли парноевм-метрттчны И каждая пара отходит от хромомера, расположенного на хромосомной оси. Эта ось ие что иное, как две спаренные сестринские хроматиды, а хромомеры - этодвойные
465
Рис. 341. Сваренные гомологичные хромосомы перед I мспотиче-ским делением
В результате образования двух хиазм (X) и кроссин севера образовались четыре разные хроматиды. АА' и ал' - сестринские хроматизм разных гомологов; Ц - центромера
Рис. 342. Расхождение хромосом в I (и) и во II (о) делении мейоза I - кинетохор и ею микротрубочки; 2 хил |ч.к 3 - сестринские хроматиды
участки конденсированною хроматина. петли же чредеганлиют собой декондепсированные участки активного, функционирующею хромаиша. Характерным является то, чю они содержат большие количества РНК которая здесь же и синтезируется. Эта РНК относится но своим характеристикам к информационной.
Наличие активных хромосом в диплотсне резко отличает мейоз от митоза, где. начиная с профазы, полностью прекращается синтез РНК. Активация транскрипции в пахитсне и особенно в диплотеие часто совпадает с ростом формирующихся половых клеток, что особенно характерно для ооцитов. Как раз в это время клетка интенсивно синтезирует и запасает белки, необходимые для обеспечения ранних стадий развития зародыша. Для этого происходит синтез огромного количества рибосом на амплифпцпрованных ядрышках и информационной РНК Набоковых петлях хромосом.
Диакинсз характеризуется уменьшением числа хиазм, укорочением бивалентов, потерей ядрышек. Биваленты приобретают более компактную форму, места соединения гомологичных хромосом
оказываются расположенными на их концах терминально. Хромосомы теряют связи с ялерной оболочкой. Эта стадия является переходной к собственно делению клетки, В метафазе I деления мейоза биваленты выстраиваются (как и полагается для метафазы) в экваториальной плоскости веретена.
В анафазе I деления совершается еще одно важнейшее событие — расхождение хромосом. Но, в отличие оз митоза, расходятся нс сестринские хроматиды, а гомологичные хромосомы, состоящие из двух сестринских хроматид (рис. 342). Если оценивать события этой фазы.
466
то вини), Ч1О при анасЬпе но пазиым к 1,™,.. «
гены, расиола.аюпшеся в разных гомологах.' 1>аспрелелепи^“ логов „о клеткам совершенно случайное, так что происходит смете' вне. иерекомбниания хромосом нз разных пар. Ее оценивать об'а-•зонавшисся хромосомные наборы, от оба он,, содержат по 2с количе-с гва ДИКи ио 2л числа хроматид, ибо каждая хромосома в парс гомо-лоюв состоит из двух хроматид. В этом отношении редукции чиста хромосом (хроматид) еще не произошло, но в два раза уменьшилась генетическая разнородность, так как теперь в каждом хромосомном наоорс нет аллельных генов.
Второе мейотическое деление
Вслед за телофазой I деления следует короткая интерфаза, в кото-рой не происходит синтеза ДНК, и клетки приступают к следующему делению, которое по морфологи и последовательности не отличается от митотического деления: парные сестринские хроматиды, связанные в центромерных участках, проходят профазу и метафазу: в анафазе они разъединяются и расходятся по одной в дочерние клетки. Таким образом, при 11 мсйотнческом делении клетка с 2с количеством ДНК и 2л числом
хроматид, делясь, дает начало двум клеткам с гаплоидным содержанием ДНК и хромосом. В отношении числа структурных единиц, хроматид, И деление мейоза является редукционным. Однако термин «редукцион-
ный» употребляется также и в обшегенегическом смысле и относится к растеплению аллелей, и в этом смысле редукционным является I деление мейоза, когда в клетки попадает по одной из аллелей (рис. 343).
В результате всего процесса мейоза после двух делений из одной клетки образуются четыре гаплоидных, каждая из которых отличается по своей генетической конституции (рис. 344).
Как во время митоза, так и при расхождении хромосом в I и II делении мейоза происходит случайное распределение хромосом по дочерним клеткам. Это и создает генетическое разнообразие в возникающих гаплоидных половых клетках. Так, в диплоидных клетках с числом хромосом, равным двум, после мейоза образуются четыре различные клетки, т.е. число вариантов будет равно 2п. У человека же после меойза может возникнуть несколько миллионов различающихся клеток, даже если будет исключен кроссинговер, который увеличит это
разнообразие еше во много раз.
Завершение мейоза для мужских и женских гоноиитов различное. Пои мейозе снсрматогониев возникают четыре одинаковых по размеру сперматоцита, которые затем дифференцируются в сперматозоиды.
Ппи мейозе оогоний картина иная. Первое деление созревания (I мейотйческое деление) приводит к тому что от большого ооцита от-
467
Рис. 343. Сравнение клеточных делений при «митозе (а) и мейозе (6)
Мейоз oi 1ичзс1см / - растянутой во времени профазой I деления, 2 — конъюгацией lOMo.ioiiviHbix хромосом (сдвоенных), 3 кросс ин говором - обменом участками между нтмологами, 4 - ак1инаиисЯ транскрипции, 5 - расхождением гомологичных двойных хромосом в анафазе I ле тения, б - отсутствием S-периода во II цикле, 7— образованием (апшюных клеток. с количество ДПК: 1с соответствует гаплоидному набору хромосом. 2с - дин иоианом). 4с - те1рацлоилному. S — период синтеза ДНК
468
Митоз
Рис. 344. Распределение гомологичных хромосом (А и а) в митозе и мейозе S - синтез ДНК; СК - синаптонемный комплекс; I - первое мейотмчсское деление. 11 - второе мейотичсское ле кине: (-) - центромерные связи сестринских хромосом (хромагид); я - плоилность
дсляется мелкая клетка - направительное тельце. При И делении происходит также неравное деление, от ооцита отделяется второе направительное тельце, а первое также делится. Поэтому возникают четыре клетки: крупная зрелая яйцеклетка и три мелких направительных тельца, которые быстро дегенерируют.
469
Глава 26
РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
К icioniii.iu никл представляет собой однонаправленный процесс, где клетка посыедоватечьио проходит разные его периоды, без их прописка или вогврзга к предыдущим спешим. Вступив в клеточный цикл, ккгкаего такапчив.тетсинтезом Д11К и делением клетки (рис. 345).
Однако, как уже говорилось, клегки могут выходить из цикла, переходить н сталию покоя, или в О0-ст;тдию. В многоклеточных орга-UII тмах многие клетки теряют способность к пролиферации, к размножению, теряют способность переходить из стадии покоя в новую стащи пролиферации, в О^сталию. которая начинает путь клетки к ее делению. К таким клеткам относятся нейроны, кардиомиопиты, клетки хрусталика и многие другие. Существуют также органы с редко де-ляи|нмися клетками так, например, клетки печени мотут входить в клеточный цикл через несколько месяцев покоя. Быстро размножающиеся клетки взрослых организмов, такие как кроветворные, или базальные клетки эпидермиса и тонкой кишки, могут входить в клеточный цикл каждые 12 36 ч. Самые короткие клеточные циклы, около 30 мин. наблюдаются при быстром дроблении яиц низших организмов (иглокожие, земноводные). В экспериментальных условиях короткий (20 ч) клеточный никл имеют многие линии клеточных культур.
Что определяет вступление клеток в пролиферацию п что определяет закономерную последовательность смены периодов клеточного цикла - эти вопросы долгое время оставались бет ответа.
Считалось, что для начала вступления в клеточный цикл необхо-шмы рост живой массы клетки, образование веществ для деления, в частности ДНК и белка, создание определенного уровня энергетических запасов и т. д.
Фактор стимуляции митоза
Рис. 345. Схема клеточного цикла
Расшифровка регуляции процессов клеточного деления началась в 70-е годы прошлого века, когда были найдены методы слияния разных клеток, методы получения гетерокарионов (см. главу 2). Оказалось, что можно получить слияние не только нитерфазных клеток с интертразны-ми. но и интерфазных с митотическими клетками (см. рис. 114). При этом обнаружилось удивительное 470
жиспие: в такой , ибр.шкой клетке, где был,, митотические хромосомы одной и) „сходных клеток, в ядрах от иитерфазиых клеток начина лась конденсация хромосом, ра«рушиласьядерная оболочка и обла ю
сомы (ПКХ или РСС - preliminary condenced chromosomes). Причем структура ПКХ «висела от стадии интерфазиого ядра: в ядре от G -клетки появлялись однонитчатые длинные ПКХ, в ядре от G,-клетки ПКХ были двойными (так как после S-периода хромосомы удан-|ись). Эти наблюдения наводили на мысль, что при слиянии таких клеток на интерфазные ядра действуют какие-то факторы, содержащиеся в ми готических клетках. Для проверки этого предположения были поставлены опыты со слиянием клеток на разных стадиях клеточного цикла, что представлено ниже.
Исходные клетки
G2 + G,->
S +G,^
s + g2-»
M +G~-»
M +S ->
M +G2->
Ге i срока риов Нет влияния Синтез ДНК Нел влияния М(ПКХ) М (ПКХ)
М (ПКХ)
Эти эксперименты были дополнены те.м, что часть цитоплазмы мн-тозной клетки инъецировали в цитоплазму Gl-интерфазной клетки. Это приводило к появлению в ядре интерфазной клетки ПКХ. Из этих наблюдений был сделан ввод о том. что в цитоплазме митотической клетки есть фактор (или факторы), стимулируюшис митоз (ФСМ, или MPF — mitosis promoting factor). Этот фактор вызывает не только конденсацию хромосом, но и приводит к распаду ядерной оболочки, т. е. переводит интерфазную клетку, даже без синтеза ДНК, в митотическое состояние (конечно, дальше появления конденсированных хромосом развитие митоза не идет).
Параллельно с этими наблюдениями были проведены эксперименты на созревающих и дробящихся яйцеклетках лягушек XJaevis (рис. 346). _
Оошп X.taevis после репликации ДНК и короткой С2-стадни переходит в мейотическую профазу I. но время которой в течение восьми месяцев происходя г рост и созревание ооцита, он дорастает до размера зрелой икринки. При спаривании овариальные клетки самки выделяют гормон прогестерон, который стимулирует переход из профазы в I менозическое деление (митоз I). затем после короткой интерфазы наступает II мейотнческое деление, которое на некоторое время оста навливается на стадия метафазы (стадия яйпа). При оплодотворении спермнем метафаза завершается, происходит второе деление мсоПза.
471
Рис. 346. Обнаружение фактора стимуляции созревания (MPF) ооцита Xenopus
а нормальное развитие: / ооцит ил сталии профазы I деления 2 — оошп из стадии I метафазы. 3 ооцит на стадии 11 метафазы. 4 зигота. 5 I деление дробления; ПР стимуляция прогестероном; ОП - оплодотворение; б инъекция цитоплазмы из иеле 1яшеися яйцеклетки в такую же ис вызывает созревания перехода в метафазу: в -инъекция шпоп.лазмы из мезафазиозТ клетки в пепелящуюся индуцирует ес переход в метафазу (созревание ооцита)
после чего гаплоидное ядро яйцеклетки слипается с ядром спермия и образуется диплоидная зигота. После этих событий следуют через каждые 30 мин многочисленные деления клеток развивающейся бластулы (см. рис. 346. а).
Если взять с помощью микроманипулятора небольшую часть цитоплазмы из ооцига на стадии метафазы II мейотическото деления и инъецировать ее в цитоплазму не стимулированного прогестероном ооцита, то произойдет повторение описанного выше процесса: ооцит вступит в I деление мейоза, азатем и во II деление, т. е. произойдет его созревание (см. рис. 346. в). Таким образом было найдено, что в ооците на стадии метафазы II деления в цитоплазме существует фактор (или факторы), стимулирующий созревание яйцеклетки (ФСС, или MPF -maturation promoting factor).
Оказалось. что этот фактор (будем называть сто MPF) присутствует в клетках только во время митотического состояния. Он обнаруживается также и во время дробления яйцеклетки (рис 347) Таким обратом. уровень MPF в интерфазных клетках низкий, а в митотических высокий
Далее было найдено, что при инъекции цитоплазмы из митотических клеток культуры ткани в нестимулированиый ооцит X. loevk происходи! созревание ооцита. Следовательно, фактор, стимулирующий митоз, и фактор, стимулирующий созревание ооцитов, — одно и то же.
472
11 1 2 3
Время развития -----------------
Рис. 347. Колебание уровня фактора стимуляции созревания TMPF. » я~“кв^К,'Х" ''ИТОП,"“КИ'<“ЙиДРоблении Хин? ИЛЯ"И" прогесгср°"0* 0П - оплохопюрсиие. I меззфаза I мейотическото деления. И - длительная метафаза и меишического лсяеипя. /. 2 3 - тетеняя дробления зиготы
Этот фактор - МРЕ был выделен и охарактеризован. Это гетеродимерный комплекс, состоящий из белка циклима (см. далее) и зависимой от циклима протеин-киназы (cyclin dependent kinase -Cdk). фермента, относящегося к фосфорилазам, который модифицирует белки, перенося фосфатную группу от АТФ иа аминокислоты серин и треонин. Следовательно, MPF состоит из двух субъединиц: каталитической
(Cdk) и регуляторной (ииклин) (рис. 348).
Рис. 348. Структура фактора, стимулирующего митоз (MPF)
/ - ииклин; 2- зависимая от иикзина неактивная протеинкнназа; 3 - активный MPF
Циклины
Циклим был обнаружен при изучении включения меченых аминокислот в синхронно дробящиеся яйца морского ежа. В одном из оел-ковых пиков на электрофореграммах метка периодически то появляется, то исчезает: ома появлялась после клеточного деления, постепенно возрастала к митозу, а затем ее уровень падал после анафазы, и потом снова начинал возрастать в следующей интерфазе. Этот белок был назван циклимом. Он постоянно синтезируется в течение эмбрионального клеточного цикла и резко разрушается при вступлении в анафазу. Подобный митотический ииклин В был обнаружен у всех эукариот, в том числе и у X laevis.
473
В pan .. v эморншеиезе. т. с. при дроблении яиц X. /аепч. первые 12 •к тении и В । ipyi за ipjioM при чинима'U.UOH величине G,- и G,-uc-рио юн и возрастание у ровня М PF происходит во время каждого деления. Интересно, чю дробление яиц и циклические изменения активно! in MPI осушеств шются также без viacTiia ядер Это значит, что ня появления активности MPF не нужна транскрипция информационных PUf В лот вернот все клеточные белковые синтезы идут на толюживуших матричных РНК. синтезированных еще во время роста ооцитов в мсйотическои профазе.
Расшифровка природы активности МРЕ была получена па модельных эк, периметах с использованием цитоплазматических экстрактов акт ивпроваииых яиц V. luevts. В этих экстрактах были все компоненты для поддержания клеточного цикла: ферменты и предшественники дня синтеза ДПК. гистоны н другие белки и лиииды для образования я 'ериоч оболочки, так же как и iil’HK, необходимая для синтеза белков. и в том числе iiHK’Hiiia В.
Если к такому экстракту добавить хроматин из снер.мнев X. laevis, то вокруг хроматина образуется ядерная оболочка, затем происходит синтез ДНК, конденсация хромосом, разрушается ядерная оболочка, образуется митотическая фигура и потом наступает интерфаза, цикл повторяется черет каждые 20 мин. По мере прохождения каждого цикла сначала в пнтерфазе нарастал циклив В параллельно возрастанию активности МРЕ В митозе после анафазы количество циклина В и активность MPF падали, те. наблюдалось циклическое изменение двух параметров (рнс. 349). По мере возрастания уровня MPF при повышении активное гк Cdk происходила конденсация хромосом за счет фосфорилирования конденсинов и гистона Н1. распад ядерной оболочки при фосфорилировании ламинов, образование веретена деления, г. е. все атрибуты митотического аппарата.
По швление синтеза белка циклогекенмидом или разрушение всей иРНК с помощью РНКазы полностью снимало циклику MPF и циклима В. Если после действия РНКазы и при последующем ее удалении ввести в экстракты иРНК только для циклима В, то периодические изменения уровней MPF и циклина В восстанавливаются (см. рис. 349. в). Эти данные говорят о том, что в системе МРЕтолько циклнн В синтезируется в ннтерфазе и деградирует в анафазе. В то время как второй компонент, а именно протсинкиназа Cdk. существует долгое время и активируется при появлении циклина В.
Деградация циклина В в анафазе вызывается сложной цепочкой белковых -заимодействий которые приводят к его расщеплению с помощью сложных белковых протеолитических комплексов - протсо-сом Кроме того, в начальных этапах деградации циклина участвует сложный белковый комплекс АРС (комплекс, стимулирующий анафа-iyУ. которым не только подготавливает циклин к деградации, но одно-
474
Рис. 349. Динамика MPF и циклина в цитоплазматических экстрактах ксенопуса
а циклические возрастания уронией MPF (?) и циклина В (J) посте активации хроматина спсрмием (ХР). при этом в экстракте образуются митотические фигуры (/), s РНКаитая деградация лРПК и экстракте приводит к исчезновению цикличности MPF и циклина В. в - добавление к экстракту новой иРНК циклина В (показано стрел ко»») возобновляет характерную динамику' циклирования MPF
Рис. 350. Регуляция митотического циклина в постоянно дезяшихся (циклирующих) клетках эмбрионов
Ни клин В (С) и ииклинзависимая протеинкиназз (CdkJ образуют фактор, цтиму.шрую-пши мигоз (MPF). / - метафаза; 2 - иолиубикитиинзаиия циклина В.его деградация; 4- поздняя анафаза; 5 - те юфаза; 6 - ишерфата; 7- новый синтез циклина В; 8 - профаза; 9- неактивны»! белковый комплекс, стимулирхюший анафазу; Ю - его
ак1имшш
временно приводит к аградации когезинов. удерживающие хроматиды друг с лруюм вплоть до анафазы.
Обшая схема регуляции митотического циклина В и MPF в циклирующих клетках может быть представлена на рис 350.
475
Регуляция клеточного цикла у млекопитающих
На пре лялущей схеме рассмотрены только конечные звенья цепи событий. заканчивающихся делением клетки. Олнако, как уже говори юсь. деление клетки обязательно связано с репликацией ДНК. Сле-товательно. должны существовать механизмы, регулирующие запуск синтеза ШК. а этому должны предшествовать события G,-периода, подготавливающие начало S-периода. Оказалось, что комплексы Cdk -митотический ннклнн В - это только конечный этап регуляции клеточного цикла. На самом же деле or начала вхождения в клеточный пикт до его завершения в клетке работает каскад комплексов Cdk — ннклнн. Так, у дрожжей один и тот же Cdk отвечает за прохождение цикла ио па разных его стадиях он взаимодействует с разными никли памп, характерными для каждой стадии клеточного цикла.
У млекопитающих в реализации всего цикла участвуют девять различных циклннов н семь разных Cdk (рис. 351). Но что является пусковым механизмом для вхождения клеток в цикл и з состояния покоя, hi Gj-CTaflnir.’ Мы видели, чго для активации клеточного цикла ооци та A. taevis необходимо первоначальное воздействие гормона прогестерона. который и данном случае является фактором роста (ФР. или GF) пли пролиферации.
Было найдено, что существует множество факторов роста, побуждающих клетки к размножению. Они могут быть собственными про дуктями данных клеток (аутокринная стимуляция) или других соседних (паракринная стимуляция), или даже клеток других органов (гормональная стимуляция). Так. фактор роста из тромбоцитов (PDGF) стимулирует пролиферацию клеток соединительной ткани, эпидермальный ФР (EGF) - размножение многих типов клеток, работает как сигнальный белок при эмбриональном развитии; ФР нервов (NGF) вызывает рост отдельных типов нейронов; эритропоэтин — пролиферацию предшественников эритроцитов II т. д.
Хорошим примером зависимости пролиферации клеток от факторов роста могут служить клеточные культуры. Было найдено, что для размножения многих клеточных культур, кроме питательных сред, необходимо добавление сывороток 476
Рис. 351. Участие в цикле млекопитающих ииминов и циклинзавясимых кина!
1 циклив Д~ Cdk 4. Cdk 6: 2 пикник Е Cdk' J ииктикА • Cdk2; 4- пи киш В A Cdk I
клеточном различных
Рис. 352. Общая схема регуляции цикла эукариотической клетки
/ - сборка ДНК-ревликативных комплексов; 2— Gr Cdk-комплекс инактивирует АРС (комплекс, стимулирующий анафазу); 3 - G, Cdk-комплекс активирует транскрипцию Cdk-комплскса S-фазы; 4 - G, Cdk-компаекс фосфорилирует ингибитор Cdk-комплекса S-фазы; 5 — лефалаиия этого ингибитора; 6 - Cdk-комплскс S-фазы активирует репликативные комплексы; 7 - митотический Cdk-комплекс (М Cdk) активирует конденсацию хромосом, разрыв ядерной оболочки, сборку веретена деления; S - активирование АРС. 9 - АРС разрушает анафазный ингибитор, что приводит к расхождению хромосом в анафазе; 10 - АРС вызывает деградацию митотического пиклина с помощью протеосом; // - телофаза и цитокинез
крови или эмбриональных экстрактов. Окаталось, что именно в этих добавках содержатся ФР. Без них клетки переходят в С0-стадию, а затем погибают. Для роста нервных клеток в культуре требуется добавление в среду фактора роста нервов (NGF).
Эти разные ФР связываются на поверхности клеток со своими рецепторами и передают сигнал через вторичные мессенджеры (например. цАМФ) на систему внутриклеточного каскада нротеинкиннз (фосфорилаз), связанных с запуском клеточного никла. Сначала активируются гены раннего ответа, белки которых индуцируют транскрипцию генов отложенного ответа, некоторые из них сами являются факторами транскрипции, а также индуцируют синтез ряда цнклннов и Cdk. которые отсутствовали в С0-периоде.
Так, вначале синтезируются белки Cdk и циклоны. характерные для G -сталии. затем для S-фазы и потом для митоза (рис. 352). В G,-стадни комплекс Cdk-циклин (G,-CDK) фосфорилирует факторы транскрипции, необходимые для активации экспрессии генов, ответственных за образование синтетического комплекса S--CDK. который после образования инактивируется специальным ингибитором. В кои
477
не G, uepno.i.i комплекс <;,-CDK фосфорилирует этот ингибитор, который 01 ic ineicii 01 комплекса S CDK, гем самым его активируя При лом в иервоиача н.иом комплексе Ci,— CDK ни клин деградирует. Активированный S- С DK-комплекс индуцирует S-фазу. фосфорпли-руя белки реп (игорного участка 'llIK. связанных с точками начала реп тканин. Затем ииклин в'л ом комплексе также деградирует. После активации S периода пронсхолит репликация ДНК. Ио время S-ne-puo та и в начале С2 периода происходит синтез нового ми готического комплекса М CDK. определяющего вхождение клетки в митоз. О гнако до окончания синтеза ДН К он находится в неактивном состоянии и активируется путем дефосфорнлированпя. После активации ною комплекса он участвует и фосфорилировании белков хроматина, что приводит к конденсации хромосом, белков ламины, которые лепо-тимс-рпзуются. и при этом разрушается ядерная оболочка, фосфорилирует ряд белков, ассоциированных с микротрубочками при образовании веретена деления После ассоциации микротрубочек с хромосомами происходит активация АРС (комплекс стимуляции анафазы), деградация когезннов. вслед за чем наступает анафаза и активация протеолиза митотических циклиион. После расхождения хромосом и нптотомпи в раннем Gg-периоле следующего цикла новые комплексы G,-CDK фосфорилируют АРС инактивируя их, что способствует впоследствии накоплению митотических циклиион.
Контрольные точки клеточного цикла
Наличие контрольных точек в клеточном цикле необходимо для определения завершения его каждой фазы. Остановка клеточного цикла происходит при повреждении ДНК в G, периоде, при неполной репликации ДНК в S-фазе. при повреждении ДНК в Gj-периоде и при нарушении связи веретена деления с хромосомами.
Одним из контрольных пунктов в клеточном цикле является собственно митоз, который не переходит в анафазу при неправильной сборке веретена и при отсутствии полных связей микротрубочек с кинето-хорами В этом случае не происходит активации АРС-комплекса, не происходит деградации когезннов, соединяющих сестринские хроматиды, н деградации митотических циклпнов что необходимо для перехода в анафа зу.
Повреждения ДНК препятствуют вхождению клеток в S-период или в митоз. Если эти повреждения не катастрофические и могут быть восстановлены за сче г репаративного синтеза ДНК. то блок клеточного цикла снимается. и цикл доходит до своего завершения. Если же повреждения ДНК значительные, то каким-то образом происходят ста битнзанпя и накопление белка р53. концентрация которого в норме
478
Рис. 353. Остановка клеточного цикла в результате нарушения синтеза ДНК или ее повреждения, что ведет к возрастанию синтеза белка р53 который в свою очередь индуцирует синтез белка р21 - ингибитора клеточного цикла
очень низкая из-за его нестабильности. Белок р53 является одним из факторов транскрипции, который стимулирует синтез белка р21, являющегося ингибитором комплекса CDK-циклин. Это приводит к тому, что клеточный никл останавливается на стадии G, или G,. При блоке в С|-исриоле клетка с повреждением ДНК не вступает в S-фазу, так как это могло бы привести к появлению мутантных клеток, среди которых могут быть и опухолевые клетки. Блокада в С,-перноде также предотвращает процесс митоза клеток с повреждениями ДНК. Такие клетки, с блокированным клеточны м никлом, в дальнейшем погибают путем апоптоза, программированной клеточной гибели (рис. 353).
При мутациях, приводящих к потере генов белка р53, или при их изменениях, блокады клеточного цикла не происходит, клетки вступают в митоз, что приводит к появлению мутантных клеток, большая часть из которых нежизнеспособна, другая - дает начало злокачественным клеткам.
Глава 27
КЛЕТОЧНАЯ ГИБЕЛЬ
Гибель (смерть) отдельных клеток или целых их групп постоянно встречается у многоклеточных организмов, так же как гибель одноклеточных организмов. Причины гибели, процессы морфологического и биохимического характера развития клеточной смерти могут быть различными Но все же их можно четко разделить на две категории: некроз (от греч. nekrosis - омертвление) и апоптоз (от греч. корней, означающих «отпадение» или «распадение..), который часто называют программируемой клеточной смертью (ПКС) или даже клеточным самоубийством (рис. 354).
479
Рис. 354. Два пути клеточной гибели
« люнгов I программированная клеточная смерть}: / - специфическое сжатие клетки и коиленсания хроматина. 2- фра1 мешания ядра, 3 - фрагментация тела клетки на ряд атипических тс leu: б - некроз: / набухание клетки. вакуолярпых компонентов, конденсация хроматина (кариорсксис). 2 - дальнейшее набухание мембранных органоидов. лизис хроматина ядра (кариолизис), 3- разрыв мембранных компонентов клетки - лизис клетки
480
Некроз
Это. вид кле годной смерти обычно связывается с нарушением вну триклеточиого гомеостаза в результате нарушения проницаем™™ клеточных мемораи. приводящим к изменению концентрации hohobZ клетке, с необратимыми изменениями митохондрий, что сразу приво днт к прекращению всех жизненных функций, включая синтез макромолекул. Некроз вызывают повреждения плазматической мембраны подавление активности мембранных насосов иод действием многих ядов, а также необратимые изменения энергетики при недостатке кислорода (при ишемии происходит закупорка кровеносного сосуда) или отравлении митохондриальных ферментов (действие цианидов). При этом при повышении проницаемости плазматической мембраны клетка набухает за счет ее обводнения, в цитоплазме происходит увеличение концентрации ионов Na+ и Са2+, закисление цитоплазмы, набухание вакуолярпых компонентов и разрыв их мембран, прекращение синтеза белков в цитозоле, освобождение лизосомных гидролаз и лизис клетки. Одновременно с этими изменениями в цитоплазме изменяются и клеточные ядра: вначале они компактизируюгся (пикноз ядер), ио по мере набухания ядра и разрыва его оболочки пограничный слой хроматина распадается на мелкие .массы (кариорексис), а затем наступает кариолизис - растворение ядра. Особенностью некроза является то, что такой гибели подвергаются большие группы клеток (например, при инфаркте миокарда из-за прекращения снабжения кислородом участка сердечной мышцы). Обычным является то, что участок некроза подвергается атаке лейкоцитов и в зоне некроза развивается воспалительная реакция (см. рис. 354).
Апоптоз
В процессе развития организмов и их функционировании в° лом состоянии часть клеток постоянно гибнет, но без или химического повреждения, происходит какоы их*ел смерть. Гибель клеток наблюдается практич_ски на все. . (я генеза. Многочисленны примеры отмирания ^ето^ мюч1еРова ка-при эмбриогенезе. Так, отмирают клетки^®“Ь*““ОНОЧНЬ|Х' погибает налов при развитии мочеполовой спсте. ' орфозахнасекомых часть нейробластов и гонадонитов. клетки пр г тт1|1Тона) и т.д.
и амфибий (резорбция хвоста у головастика и ж „спонтанная.
Во взрослом организме также постоянно неГ1Трофн лы.
гибель клеток. Миллионами погиоают _ энтероцвты.
клетки эпидермиса кожи, клетки тонкого юг ову1яи1щ, клетки Погибают фолликулярные клетки янчни
481
молочной желе ил после ji,ikt.iiiiiii. TIikiix нримерои мною Особенно мною iipinu рои |цбелн клеток бсч непосредственного их повреждения ври раз шчиых патологических процессах. Например, кастрация (удаление семенников) вызывает гибель клеток простатической желе-гы уда ichiic гипофиза приводит к гибели клеток надпочечником. Дру-|оп пример - гибель шванновских клеток при дегенерации аксона. Шваиновские клетки в поврежденном периферическом нерве взрос-юго животного, так же как и клетки-сателлиты и чувствительные нейроны в соответствующих спинномозговых узлах, погибают.
Эти наблюдения наводят на мысль, что клеточная смерть регулируется межклеточными взаимодействиями различным образом. Множество клегок многоклеточного организма нуждается в сигналах с тем, чтобы оставаться живыми. В отсутствие таких сигналов или трофических факторов в кле.ках развивается программа «самоубийства» или программируемой смерит. Например, клетки культуры нейронов погибают при отсутствии фактора роста нейронов (NGF), клетки простаты гибнут в отсутствие андрогенов семенника, клетки молочной железы — при падении уровня гормона прогестерона и т. д. В то же время клетки могут получать сигналы, которые в метках-мишенях запускают процессы, приводящие к гибели по типу апоптоза. Так, гидрокортизон вызывает гибель лимфоцитов, а глютамат — нервных клеток в культуре ткани, фактор некроза опухоли (TNF) вызывает гибель самых различных клеток. Тироксин (гормон щитовидной железы) вызывает апоптоз клеток хвоста головастиков. Кроме этого существуют ситуации, когда апоптическая гибель клетки вызывается внешними факторами, например радиацией.
Понятие «апоптоз» было введено при изучении гибели части клеток печени при неполной перевязке портальной вены. При этом наблюдается своеобразная картина клеточной смерти, которая затрагивает лишь отдельные клетки в паренхиме печени. Процесс начинается с того, что соседние клетки теряют контакты, они как бы сморщиваются (первоначальное название этой формы гибели shrinkage necrosis - некроз сжатием клетки), в ядрах ио их периферии происходит специфическая конденсация хроматина, за тем ядро фрагментируется на отдельные части, вслед за этим сама клетка фрагментируется на отдельные зельца, отграниченные плазматической мембраной, - апоптические тельца. Апоптоз — процесс, привсцящий не к лизису, не к растворению клетки, а к ее фрагментации. распаду. Судьба апоптически.х телец тоже необычна: они фагоцитируются маг рофагамп или даже нормальными соседними клетками. При этом не развивается воспалительная реакция.
Важно отметить, что во всех случаях апоптоза — во время ли эмбрионального развития, во взрослом ли организме, в норме или при паточогических процессах — морфология процесса гибели клеток очень сходна. Эю может говорить об общности процессов апоптоза в ратных организмах и в разных органах,
482
Исследования на разных объектах показали, что аП0ПТ()3 ССт, зультат реализации генетически запро.раммированной бели. Первые доказательстзза наличия генетической „пог™ точной смерти (ИКС) были получены „р„ изучении рХ^еХ ды CaenorhabdUK elegant,. Этот червь развивается всего за трое X „ его малые размеры позволяют проследить за судьбой всех его клеток начиная с ранних этапов дробления до половозрелого орзанизма ’
Оказалось, что при развитии C.elegansобразуется всего 1090 клеток из которых часть нервных клеток в количестве 131 штуки спонтанно погибает путем апоптоза и в организме остается 959 клеток. Были обнаружены мутанты, у которых процесс элиминации 131 клетки был нарушен. Были выявлены два гена ced-З и ced-4, продукты которых вызывают апоптоз 131 клегки. Если у мутантных C.elegans эти гены отсутствуют или изменены, то апоптоз не наступает и взрослый организм состоит из 1090 клеток. Был найден и другой ген - ced-9. который является супрессором апоптоза: при мутации ced-9 все 1090 клеток погибают. Аналог этого гена был обнаружен у человека: ген hcl-2 также является супрессором апоптоза различных клеток Оказалось, что оба белка, кодируемые этими генами, — Ced-9 и Вс1-2, имеют один трансмембранный домен и локализуются во внешней мембране митохондрии, ядер и эндоплазматического ретикулума.
Система развития апоптоза оказалась очень сходной у нематоды и позвоночных животных, она состоит из трех звеньев: регулятора, адаптера и эффектора. У C.elegans регулятором является Ced-9. который блокирует адаптерный белок Ced-4. который в свою очередь не активирует эффекторный белок Ced-З, протеазу, которая действует иа белки цитоскелета и ядра (табл. 16).
У позвоночных система П КС более сложная. Здесь регулятором является белок Вс1-2, который ингибирует адаптерный белок Apaf-I, стимулирующий каскад активации специальных протеиназ — каспаз.
Каспазы - цистеиновые протеазы, которые расщепляют белки по аспарагиновой кислоте. В клетке каспазы синтезиру юте.. в форме ла тентиых предшественников - прокаспаз. Существуют инициирующие и эффекторные каспазы. Инициирующие каспазы активируют латез т иые формы эффекторных каспаз. Субстратами для действ г
' 41 Табмиа 16
Развитие процесса программированной ютеточнойсмертЧ^
Объект Регулятор Адаптер Эффектор Результат результат
C.elegans Позвоночные Примечание. Зи Ced-9 - Bcl-2 — ак означает —1 Ced-4 - —} Apaf-1 - горможенле + Ced-З -J -> Casp9 - pouccca. —> гэПКС -> Casp 3 - - стимуляцию пкс проиессз.
483
роклниых ыснаэ служат более 60 р пличных белков. Это, например, кина ia фокальных .онезионных структур, инактивация которой припилит к оэдеш ниюанонтических клеток от соседей; это ламины, которые при лене гвии каспаз разбираю гея; это иитоскелетпые белки (промежуточные фпламешы. актин, гсльзолии), инактивация которых приводит к изменению формы к..стки и к появлению на ес поверхности пезырс и. которые дают начало ашэптнческим тельцам; это активируемая протеаза СA.D. котор bi расщепляет ДНК па олигонуклеотндиые нуклео-coxHiMi фрагменты, это ферменты репарации ДНК, подавление которых нрелотвращает восстановление структуры ДН К, и многие другие.
Одним из примеров разворачивания апоптозного ответа может являться реакция клетки па отсутствие сигнала от необходимого трофического фактора. например фактора роста нервов (NGF), или андрогена (рис. 355).
В цитоплазме клеток в присутствии трофических факторов находится в неактивной форме еще один участник реакции — фосфорилированный белок Bad. В отсутствие трофического фактора этот белок дефосфорнлируется и связывается с белком Вс1-2 на внешней митохондриальной мембране и этим ингибируш его антиапоптозные свойства. После этого активируется мембранный проапоптический белок Вах открывая путь ионам, входящим в митохондрию. В это же время из митохондрия । через образовавшиеся в мембране поры в цитоплазму выходит цитохром с. который связывается с адаптерным белком Apaf-I, который в свою очередь активирует прокаспазу' 9. Активированная каспаза 9 запускает каскад других прокаспаз, в том числе каспазу 3, которые, будучи протеиназами, начинают переваривать мешенные белки (ламины. белки цитоскелета и др.), что вызывает апоптическую смерть клетки, ее распад на части, на апоптические тельца.
Апоптические тельца, окруженные плазматической мембраной разрушенной клетки, привлекают отдельные макрофаги, которые их поглощают н переваривают с помощью своих лизосом. Макрофаги не реагируют на соседние нормальные клетки, но узнают апоптические. Это свя зано с тем. что при апоптозе нарушается асимметрия плазматической мембраны и на ее поверхности появляется фосфатидилсерпн, HeiaTHBuo заряженный фосфолипид, который в норме располагается в цитозольной части билипидной плазматической мембраны. Таким образом путем избирательного фагоцитоза ткани как бы очищаются от погибших апоптозных клеток.
Как указывалось выше, апоптоз может быть вызван целым рядом внешних факторов, таких как радиация, действие некоторых токсинов. ингибиторов клеточного метаболизма. Необратимые повреждения ДНК вызывают апоптоз. Это связано с тем, что накапливающийся транскрипционный фактор — белок р53, не только активирует белок
484
3
Рис. 355. Одна из моделей развитая апоптоза при отсутствии трофического фактора
/ плазматическая мембрана; 2 — внешняя мембрана митохондрии; 3 - трофический факюр; 4 — рецептор трофического фактора; 5-яефосфорилнровакис лроапоптозного белка Bad; 6 — бе ток Bad инактивирует антиапонтозный белок Bcl-2; 1 - выход цитохрома с в цитозоль; 8 - активация апоптозного белка Вад. открывание ионных каналов; 9 — цитохром с активирует адаптерный белок Apaf I; 10 - активация прокаспазы 9; / / - активация каспазы 9; /2- активация каспазы 3; 13- конденсация и Деградация хроматина; 14 - деградация ядерной ламины; 15 - деградация цитоскелета p2i, который ингибирует зависящую от циклима киназу и останавливает клеточный цикл в G}- или Gj-фазе (см. рис. 353), но и активирует экспрессию гена box, продукт которого запускает апоптоз.
Избирательные повреждения митохондрий, при которых в цитоплазму высвобождается цитохром с, также являются частой причиной развития апоптоза. Особенно митохондрии и другие клеточные компоненты страдают при образовании токсически активных форм кислорода (АТК), под действием которых во внутренней мембране митохондрий образуются неспеиифические каналы с высокой проницаемостью для ионов, в результате чего матрикс митохондрий набухает, а 485
внешняя мембрана ратрыпастся. Пр» лом растворенные в межмем-брннном Bpocipanciifc белки вместе с ши «хромом с выходят в цито-н 1<нм\. Срс in освободившихся белков есть факторы, активирующие анонтоз, и ирокасиаза Ф
Многие токсины (рппнн, лифтерийиый токсин и лр.), а также ан-гпмеыболиты могут вызывать гибель клеток путем апоптоза. При нарушении синтеза белка в эндоплазматическом ретикулуме в развитии апоптоза участвует локализованная там прокаспаза 12, которая активирует ряд других каспаз, и в том числе каспазу 3.
Элиминация — удаление отдельных клеток путем апоптоза, наблюдается п у растений. Здесь апоптоз включает в себя, так же как у животных клеток. фазу индукции, эффекторную фазу и фазу деградации. Морфология гибели клеток растений сходна с изменениями клеток животных: конденсация хроматина и фрагментация ядра, олигонук-леотндная деградация ДНК, сжатие протопласта, его дробление на везикулы, разрыв плазмодесм и т. д. Однако везикулы протопласта разрушаются гидролазами самих везикул, так как у растении нет клеток, аналогичных фагоцитам. Так, ПКС происходит при росте клеток корневого чекл и ка, при формировании перфораций у листьев, при образовании ксилемы к флоэмы. Опадание листьев связано с избирательной гибелью клеток определенной зоны черенка.
Биологическая роль апоп тоза, или программированной смерти клеток, очень велика: это удаление отработавших свое или ненужных на данном этапе развития клеток, а также удаление измененных или патологических клеток, особенно мутантных или зараженных вирусами.
Итак, для тою чтобы клетки в многоклеточном организме существовали, нужны сигналы на их выживание — трофические факторы, сигнальные молекулы. Эти сигналы могут быть переданы на расстояние и уловлены соответствующими рецепторными молекулами на клетках-мишенях (гормональная, эндокринная сигнализация), это может быть паракринная связь, когда сигнал передается на соседнюю клетку (например, передача нейромедиатора). При отсутствии таких трофических факторов реализуется программа апоптоза. В то же время апоптоз может вызываться сигнальными молекулами, например при резорбции хвоста головастиков под действием тироксина. Кроме того, действие ряда токсинов, влияющих на отдельные звенья метаболизма клетки, также может стать причиной клеточной гибели посредством апоптоза.
486
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Альберте Б.. БрейД., Льюис Дж.. Руфф М._ ро6ерж угтс0„ лярная биология клетки: В 5 т. М.: Мир. 1986.
Альберте Б.. БрейД.. Льюис Дж.. Руфф М„ Робертс К.. Уотсон Дж. Моле-кулярная биология клетки: В Зт. М.: Мир,1994.
Босток К.. Самнер Э. Хромосома эукариотическом клетки. М.: Мир. 1981.
Вермелъ Е.М. История учения о клетке. М.: Наука, 1970.
Вирхов Р Целлюлярная патология. СПб., 1859.
Волъкенштейн М.В. Молекулы и жизнь. М.: Наука, 1965.
Воробьев И.А.. Надеждина Е.С. Центриолярный аппарат и его роль в организации микротрубочек. М., 1987. (Итоги науки и техники. Общие проблемы физико-химической биологии; Т. 7).
Георгиев Г.П. Гены высших организмов и их экспрессия. М.: Наука. 1989.
Епифанова О.Н. Лекции о клеточном цикле. КМ К Scientific press, 1997.
Заварзин А.А., Харазова А.Д., Молитвин М.Н. Биология клетки: обшая цитология. СПб.: Изд-во СПб. ун-та, 1992.
Збарский Н.Б.. Кузьмина С.Н. Скелетные структуры клеточного ядра. М.: Наука, 1991.
Практикум по нитологии/Под рсд. Ю. С. Ченцова. М.: Изд-во МГУ, 1988.
Свенсон К., Уэбстер /7. Клетка. М.: Мир, 1980.
Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989.
Ченцов Ю.С.. Поляков ВЮ. Утьтраструктура клеточного ядра- -М.: Наука.
1974.
Athens В., Bray D. Lewis J.. RuffM.. Roberts K-. Watson J.D. Molecular biology ofthe cell. 3rd cd. N.Y: L : Garland Publ . 1994.
Mens B.. Bray D.. Levis J. Raff M. Robens A'.. Watson J. D. Molecular biology al the cell. 4th cd. N.Y.; L : Garland Publ.. 2001
Karp C. Cell and molecular biology: 2nd cd. N.Y. etc.: John i cy a '"LfeA H.. Besk A.. Zipursky S.L.. Matsudaira P-. BaLsintore D.. Darnell J Molecular cell biology. 4th ed. L : Freeman. 2000.
Tabtn A.J.. Murel R E. Asking about cells. Saunders college publ.. 199
487
ЧАСТЬ ВТОРАЯ
СТРОЕНИЕ И ХИМИЯ КЛЕТОЧНОГО ЯДРА
ОГЛАВЛЕНИЕ
Глава 3. Центральная догма молекулярной биологии ............ ......
ПРЕДИСЛОВИЕ ........................... 3
ЧАСТЬ ПЕРВАЯ
ВВЕДЕНИЕ. ПРЕДМЕТ КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ
Глава 1. Клеточная теория............................. 7
Клетка — элементарная единица живого ................. 8
Клетка — единая система сопряженных функциональных единиц.................................................|5
Гомологичность клеток................................ |6
Клетка от клетки .................................... |8
Клетка и многоклеточный организм..................... I9
Тотипотентность клеток............................... 2I
Глава 2. Методы клеточной биологии................... 23
Световая микроскопия................................. 23
Витальное (прижизненное) изучение клеток............. 26
Изучение фиксированных клеток........................ 30
Электронная микроскопия.............................. 36
Контрастирование корпускулярных объектов.......... 39
Ультрамикротомия.................................. 4I
Другие специальные методы электронной микроскопии биологических объектов............................. 44
Фракционирование клеток.............................. 45
Глава 4. Морфология ядерных структур .................6П
Роль ядерных структур в жизнедеятельности клетки .....60
Ядериыс компоненты прокариот .........................61
Ядро эукариотических клегок 67
Эухроматин и гетерохроматин..........................72
Хромосомный цикл.....................................75
Общая морфология митотических хромосом... .......... 76
Клеточный цикл эукариот ............................ 83
Эндорепродукция и полиплоидия........................88
Пространственное расположение хромосом в интерфазном ядре . 96
Глава 5. Структура и химия хроматина................. Ич
nLII. 102
ДНК хроматина....................................
Репликация эукариотических ДНК.......................
Основные белки хроматина — гистоны..........-........ *
... 116 Функциональные свойства гистонов ................
Первый уровень компактизации ДНК: структурная роль нуклеосом........................................... |7|
Нуклеосомы при репликации и транскрипции
Второй уровень компактизации ДНК-фибрилла |22
диаметром 30 нм ............................... р5
Не гистоновые белки......................
Петлевые домены ДНК — третий уровень структур!.......
организации хроматина • ......
......130
Глава 6. Ядерный белковый матрик ................
Общий состав ядерного матрикса.................... 135
ДН К ядерного белкового матрикса.........
489
488
Глава 7. Хромонемный (четвертый) уровень упаковки хроматина................................. 139
Общая организация ми гот ических хромосом ......... 143
ЧАСТЬ ТРЕТЬЯ
ЯДЕРНЫЕ ТРАНСКРИПТЫ И ИХ ТРАНСПОРТ
Глава 8. Ядрышко - источник рибосом ............... 152
Строение рибосом................................... 153
Чем определяется число ядрышек в клетке............ 156
Множественность рибосомных генов 158
Амплифииированныс ядрышки ..................... 159
Строение и функционирование генов рРНК............. 160
Структура ядрышка.................................. 166
Фибриллярный центр и ядрышковый организатор ....... 170
Структурные типы ядрышек .......................... 173
Белки ядрышек..................................... 175
Общая схема работы ядрышка как специального локуса синтеза рибосом ................................... 176
Новые, неканонические функции ядрышек ............. 177
Ядрышко во время митоза; периферический хромосомный материал........................................... 178
Глава 9. Нерибосомные продукты клеточного ядра 185
Транскрипция нерибосомных генов.................... 185
Морфология РНП-компонентов ядра ................... 187
Синтез РНК в пуфах политенных хромосом ............ 191
Транскрипция на мейотических хромосомах ........... 194
Морфология транскрипции индивидуальных генов . 197
Синтез транспортных РНК ........................... 197
Глава 10. Ядерная оболочка 198
Компонент ы ядерной оболочки ...................... I98
Роль ядерной оболочки в ядерно-цнтоплазматическом обмене . 206
490
Импор, кариофи льиых белков
Экспорт из ядра в цитоплазму ....
Динамика ядерной оболочки в митозе 209
..... 211
ЧАСТЬ ЧЕТВЕРТАЯ
ЦИТОПЛАЗМА
Глава 11. Гиалоплазма и органеллы 2I6
Глава 12. Общие свойства биологических
мембран - липопротеидных комплексов 219
Двойной слой липидов - структурная основа мембран .219
Мембранные белки - обязательные компоненты биологических мембран ......................................... 223
Латеральная подвижность липидов и белков мембран... 226
Асимметричность клеточных мембран................... 227
Различные свойства разных мембран................... 228
Связь мембран с цитоплазматическими белками ....... 229
Рост многих мембран за счет встраивания вакуолей.... 230
Глава 13. Плазматическая мембрана .................. 231
Барьерно-транспортная рать плазмалеммы.............. 232
Трансмембранный перенос ионов и низкомолекулярных соединений ............................................
239
Везикулярный перенос: эндоцитоз и экзодитоз........
Рецепторная роль плазмалеммы.....................
Межклеточное узнавание.............................
Специальные межклеточные соединения (контакты) ....
.... зов
Клеточная стенка (оболочка) растении .......
Клеточные оболочки бактерий ................
Глава 14. Вакуолярная система внутриклеточно транспорта ........................... ,,
Общая схема функционирования вакуолярнои сист Гранулярный эндоплазматический ретикулум..
Korpjnc itiuiioiihmb i pancuopi растворимых 6l jkob. ... 283
Синтез Hcpai.iкоримых (мембранных) белков.............284
Синтез клеточных мембран .............................286
Транспорт между эндопл.вмац1чсскнм ретикулумом и аппаратом Гольджи ....................................289
Глава 15. Аппарат Гольджи.............................291
Тонкое строение аппарата Гольджи 292
Секреторная функция аппарата Гольджи .................295
Модификации белков в аппарате Гольджи.................298
Сортировка белков в аппарате Гольджи .................301
Глава 16. Лизосомы................................... 305
Общая характеристика лизосом..........................305
Морфологическая неоднородность лизосом................308
Лнзосо.мные патологии.................................3I2
Глава 17. Гладкий ретикулум и другие мембранные вакуоли...............................................3I2
Гладкий (агранулярный) эндоплазматический ретикулум ..3I2
Вакуоли растительных клеток ..........................3I8
Сферосомы.............................................320
Пероксисомы (микротельца).............................320
Секреция белков и образование мембран у бактерий......322
ЧАСТЬ ПЯТАЯ
ЦИТОПЛАЗМА: СИСТЕМЫ ЭНЕРГООБЕСПЕЧЕНИЯ КЛЕТКИ
Глава 18. Митохондрии: строение и функции ............324
Общая морфология......................................325
У (ьтраструктура митохондрий..........................330
Функции митохондрий...................................334
Окислительное фосфорилирование у бактерий.............339
Увеличение числа митохондрий...................... ...340
Акптрепродукция митохондрий...........................342
Хондриом 344
492
Глава 19. Пластиды
Хлоропласт .................
Функции хлоропластен......
0НТО1СИСЗ и функциональные перестройки пластид збо
Фотосинтезирующие структуры низших эукариотических и
прокариотических клеток ... 364
Геном пластид ........................
ЧАСТЬ ШЕСТАЯ
ЦИТОПЛАЗМА: ОПОРНО-ДВИГАТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА (ЦИТОСКЕЛЕТ)
Глава 20. Промежуточные филаменты .......373
Глава 21. Микрофиламенты ..................... 378
Общие свойства .................................378
Актомиозиновые комплексы немышечпых клеток.. 384
Мышечные клетки .................................
Глава 22. Микротрубочки ....................... 392
392 Общая характеристика .......................
Центры организации микротрубочек ................
Динеины и кинезины — моторные белки..............
.... 402
Глава 23. Клеточный центр
403 Центросомы и центриоли...................
Цснтросомный цикл......................"
Базальные тельца, строение и движение ресни тек и жгу
ЧАСТЬ СЕДЬМАЯ
МЕХАНИЗМЫ КЛЕТОЧНОГО ДЕЛЕНИЯ
424
Глава 24. Митотическое деление клето
... - "*24
Общая организация митоза .........'" ..._ _ 425
Различные типы митоза эукариот ...
Морфо имия митотической фигуры ....... .. 428
I 1ентромсры ii киищокоры . ..........................429
Динамика митоза.......................................434
CaMoopianiiaamw системы микротрубочек.................443
Митоз растительной клетки.............................445
Днижеиис и деление бактериальных клеток............... . 449
Глава 25. Мейоз ......................... . 454
Особенности профазы I мейотического деления.......... 457
Стадии профазы I мейотического деления... 458
Второе мейотическос деление...........................467
Глава 26. Регуляция клеточного цикла .................470
Фактор стимуляции митозов ............................470
Цнклины ..............................................473
Регуляция клеточного деления у млекопитающих 476
Контрольные точки клеточного цикла ... . 478
Глава 27. Клеточная гибель 479
Некроз ............. ... .............................481
Апоптоз ..............................................481
Рекомендуемая литература..............................487
Учебное издание
Ченцов Юрии Сергеевич
ВВЕДЕНИЕ В КЛЕТОЧНУЮ БИОЛОГИЮ
Издание четвертое, переработанное и дополненное
Редактор Т И. Бе.юва
Художник АС Скороход
Дизайнер обложки С.В. Машин
Дизайнер О.И. Баяника
Корректоры Р.В. Молоканова, Т.Н. Шеповалова
Компьютерный дизайн и верстка С. fl. Лаврентьева
ИД №04284 от 15.03.2001.
Подписано в печать 17.11.2003. Формат 6(1x90/16. Гарнитура NeuionC.
Печать офсетная. Леч. л. 32. Тираж 3000 экз. Тип. зак. 729
Между! (аролная академм чсская
издательская компания «Наука/Интерпсриодика»
Издательско-книготорговый центр «Академкнига*
117997, Москва. Профсоюзная ул., 90
Ип вопроса ч поставок обращаться
в отде t реаииоции И КН-Академкнига»
Гы./факс: (045) 334 73- IS
e-maii: hrmkreaH? maik.ru, web-site: http:// tnuik.ru
Отпечатано в ООО «Внсшторгиздат-полиграф*
127576, Москва, ул. Илимская, 7